Título

Métodos de enumeración para la Determinación de Densidad de

Comunidades Microbianas.

Introducción

En ocasiones, se requiere determinar el número de microorganismos

presente en una unidad dada de volumen. Para ello existe diversidad de métodos

que nos permiten examinar y estimar las densidades poblacionales,

especialmente cuando no se puede determinar la cantidad exacta de un solo

microorganismo debido a la heterogeneidad del ambiente. Estos métodos tienen

como principio el crecimiento como indicador de densidad. Entre los mas

importantes se encuentra el método del numero mas probable (MPN). Esta

técnica es la mas utilizada para estimar poblaciones microbianas en suelos, aguas

y productos agrícolas. Este método se basa en la determinación de la presencia y

ausencia de atributos particulares de microorganismos presentes en una muestra.

Lo importancia de este método radica en la necesidad de poder conocer los

atributos específicos de una población en el medio de cultivo que se va a utilizar.

En este experimento se utilizaron varios métodos para poder determinar la

densidad de bacterias que hay en una muestra. Se compararan dichos métodos

en términos de sus atributos (eficiencia, facilidad de ejecución y recursos

necesarios). También se utilizara como referencia el potencial de estas bacterias

para formar colonias en medios sólidos y líquidos.

Materiales y Métodos

Para realizar este experimento se utilizó cultivo fresco de Serratia

marcencens previamente cultivado en caldo Tryptic Soy Broth (TSB) por el

personal de laboratorio. Una vez obtenida la muestra se procedió a realizar una

serie de diluciones que consistieron en extraer con una pipeta estéril 1mL de la

muestra original y se diluyó a 99 ml de agua salina. Esto ocurrió de forma

consecutiva hasta llegar a la dilución deseada

10-10. Ya obtenidas las diluciones pertinentes se procedió a filtrar la muestra. El

filtrado consistió en remover asépticamente una membrana de nitrocelulosa de

0.45µm de su envoltura, con pinzas previamente esterilizadas en alcohol y

pasadas por un mechero, y transferir la misma al porta membranas del equipo de

filtración. Hecho esto, se ensambló la unidad de filtración y se aseguró la misma

con una grapa. Una vez se ensambló la unidad se procedió a añadir 10 ml de

agua estéril sobre la membrana como blanco. Ya realizado esto se procedió a

filtrar 10 ml de la muestra previamente diluida. Ya filtrada la muestra se procedió

a desmontar el equipo de filtrado y se extrajo la membrana con las pinzas

previamente esterilizadas. La membrana fue colocada en unas placas pequeñas

de TSA.
 Una vez se terminó la filtración se procedió a realizar el método de “pour

plate”. Este consistió en transferir 1ml de la muestra diluida a una placa de

cultivo vacía y estéril , una vez transferida la muestra diluida a la placa se

procedió a verter el contenido de un tubo de agar profundo derretido de TSA en la

placa. Hecho esto se procedió a rotar la placa de izquierda a derecha y de

derecha a izquierda en forma circular hasta que el agar cubriese la placa.

Finalmente se dejó reposar hasta que el agar TSA secara. El próximo método a

usarse lo fue el “spread plate”. Este método consistió en transferir 0.1ml de la

muestra diluida en cuestión al centro de las placas de TSA previamente

preparadas y con una fibra de cristal en forma de L se procedió a dispersar de

manera uniforme por la placa la muestra. Para crear el movimiento circular de la

placa se utilizo un “turn table”.

Una vez hecho esto se, se prosiguió con una dilución en agar. Este método

consistió en sembrar 10µl de la muestra diluida en unas placas cuadradas de

TSA. La muestra diluida fue inoculada en el centro de los cuadrantes superiores

de la placa, dejando uno vacio entre muestra. Hecho esto se inclinó la placa de

manera que las gotas inoculadas se deslizaran lo mas derecho posible. Finalizado

este proceso se procedió a realizar el proceso de MPN en agar. Se dividieron 3

placas grande de TSA en cuatro cuadrantes utilizando un lápiz de cera (la marca

se realizo por la parte posterior de la placa). Ya marcados los cuadrantes, en cada

uno de estos se marcaron 5 puntos equidistantes. Luego se procedió a inocular 5

µl de la muestra diluida en posición a cada punto marcado. El siguiente método a

ser realizado lo fue el MPN líquido. Para este método se inocularon 0.1ml replicas
de 5 tubos con un”loop” previamente esterilizado. Ya inoculados se procedió a

agitarse cada uno de ellos.

Finalmente se realizó el método de “rolling chips”. Para este método se

vertieron 0.1 ml de la muestra diluida en el centro de la placa de agar. De

manera aséptica se transfirieron ocho “boiling chips“estériles dentro dela placa.

Luego se rotó la placa sobre un punto en el banco de trabajo 10 veces de

izquierda a derecha y 10 veces de derecha a izquierda. Finalmente, de manera

aséptica, se removieron los “boiling chips” vertiendo los mismos rápidamente a

un envase con desinfectante (alcohol).

Para cada método se realizaron las técnicas asépticas correspondientes

(mecheros, desinfectantes, asepsia entre otros). Al cabo de siete días se

verificaron las placas obteniendo los siguientes resultados.

Resultados

Al realizar las observaciones se determinó la cantidad de colonias por

dilución. En la gran mayoría de las diluciones la cantidad de organismos era

demasiado grande para ser contabilizada. A medida que se aumentaba el factor

de dilución, la cantidad de organismos seguía siendo muy grande, pero al llegar a

la dilución de 10-8 los organismos disminuyeron excesivamente hasta literalmente

desaparecer de las muestras (Tabla 1).

Tabla 1. Valores obtenidos de la densidad de población estimada
*=placas contaminadas
Resultados de Enumeración de Procariotas

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

Filtració TNTC* TNTC TNTC* TNTC* TNTC* TNTC* TNTC* TNTC* TFTC TFTC

n (28) (4)

MPN 5 5 5 5 5 5 5 5 2 2

liquido

Spread TNTC TNTC* TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC* TFTC 0* 0

Plate (2)

Pour TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC* TFTC 0

Plate (2)

Rolling TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC Spread 0

Chips

Dilución TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC 11 0 0 0 0

Agar

MPN 5 5 5 5 5 5 3 2 0 0

Agar

En el caso del método de NMP, es imposible cuantificar la cantidad de

organismos presentes en las muestras. Por lo tanto se procedió a utilizar el

método de replicas para la determinación de densidad poblacional en las

muestras donde cada columna representa una dilución y cada fila representa una

replica (Tabla 2 y Tabla 3).

Tabla 2. Método de replicas MPN liquido. Los resultados son obtenidos a partir
de la cantidad de tubos positivos y negativos por dilución.

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

R
1 * * * * * * * * * *
E

P 2 * * * * * * * * * *
L

I
3 * * * * * * * *
C 4 * * * * * * * *
A

S 5
* * * * * * * *

5 5 5 5 5 5 5 5 2 2
Positivo Negativo
Tabla 3. Método de replicas MPN Agar. Los resultados son obtenidos a partir de
la cantidad de tubos positivos y negativos por dilución.

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

R
1 * * * * * * * *
E

P 2 * * * * * * * *
L

I
3 * * * * * * *
C 4 * * * * * *
A

S 5
* * * * * *

5 5 5 5 5 5 3 2 0 0
Positivo Negativo

Una vez realizados esto, se procedió a determinar el número más probable

según la tabla 1, pagina 230 del manual del laboratorio. Para el MPN Agar el

número mas probable fue 138,269. En el caso de MPN líquido el número más

probable se determinó promediando los dos valores más cercanos al obtenido, de

esto el número más probable resultó ser 73637.5. Con estos valores se procedió

a calcular la densidad poblacional. Para obtener la misma se multiplicó el valor

obtenido de la tabla por la división de 1 entre el factor de dilución por el factor de

corrección del volumen (volumen de tabla entre volumen de inoculo) (Tabla. 4)

Tabla.4 Densidad del Cultivo en MPN

MPN Agar MPN Liquido

2.76 x 107 células/ml 7.4 x107 células/ml

Al verificar los resultados se observo que había dos diferentes tipos de

colonias, una blanca cremosa, otra rosada en la gran mayoría de los agares. Esto

es evidencia de contaminación de las muestras.

Discusión

Al culminar este ejercicio, podemos decir que entre los métodos utilizados,

el que resulto ser mas eficiente en cuanto a la enumeración se refiere es en NPM

esto es dado a la distancia existente en las placas y la cantidad de muestra

utilizada lo cual permite un buen control de crecimiento, contrario a los demás

métodos utilizados, que no le proveen una control suficientemente eficiente para

su crecimiento. Esto depende también de varios factores como, tipo de agar o

fuente nutricional para el crecimiento de los organismos, tipo de microorganismos

que se este utilizando, temperatura y tiempo de espera para la lectura de los

resultados entre otros. Con respecto a la contaminación podemos argumentar

que muy posiblemente fue causada debido a un mal manejo de las placas

durante la preparación de estas o durante la inoculación

 La importancia de realizar este ejercicio, es familiarizarnos con los

diferentes métodos para la enumeración de organismos en muestras a gran

escala y entender sus virtudes y defectos para su utilización en diversos ejercicios

donde es importante conocer la cantidad de determinado organismo en una

muestra.
Referencias

Ayala-del-Rio H.L., Fuentes, F., Massol-Deya A., (2007) Manual de Laboratorio

Ecología de Microorganismos. (pp. 225-242); Universidad de Puerto Rico.

 Universidad de Puerto Rico en Humacao

Facultad de Ciencias Naturales

Departamento de Biología

Método de Enumeración para la Determinación de

Densidad de Comunidades Microbianas

Sharon M. Boschetti-Medina

801-01-0907

BIOL4029 Sec. 002

Prof. Hector L. Ayala Del Rio

2 de noviembre de 2007