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Manual NMP

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ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MASPROBABLE
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente deestimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacióncuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en ladeterminación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de dilucionesconsecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestrasde suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método esla necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en elmedio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtienedel patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tablaprobabililística.Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamañospoblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que puedennodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección deplantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas desuelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activosmetabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodostradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar ladensidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular autilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidosde crecimiento.
 
 
MANUAL ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS
 
226
Materiales & Equipos:
 Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.)Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaClMicropipetas de 20
µ
lPuntas para micropipetaIncubadora a 25°C• Vortex
Metodología
1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varioslugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las célulaspodrán ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo deensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5minutos en un vortex.3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamentetransfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferenciacorresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento dedilución hasta alcanzar la dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien lamuestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritasanteriormente.4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas deigual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inculado:
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
 
 
EL NUMERO MAS PROBABLE 227
5. Inoculación: Transfiera 5
µ
l de la dilución apropiada al área correspondiente.Repita esta operación cinco veces por cada dilución:6. Permita que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa conuna tirilla de parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en ascendencia evalúe elcrecimiento o no crecimiento sobre cada réplica inoculada. Reporte losresultados como se indican en el ejemplo a continuación:
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
 Diluciones 10-3- 10-4- 10-5- 10-6- 10-7:: 5 - 5 - 3 - 2 - 0
Datos & Análisis:
 Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada parasu muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla,promedie el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej.,5-4-1-1-0 no está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216)como el resultado más apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional de la muestra,entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección devolumen (ver nota Tabla 1) por el recíproco del factor de dilución menor inoculadoen la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108células/g de suelo). Acontinuación un ejemplo

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