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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
E. coli: 4.6 X 106 bp genome size, in terreni ricchi.
G= 22’, aerobiosi, per produzione di proteine
ricombinanti.
1 di partenza clonazione
Frammentazione
enzimatica
DNA Linearizzazione
bersaglio enzimatica
Tra gli strumenti più utili a nostra disposizione si annoverano gli enzimi di
restrizione, enzimi capaci di riconoscere sul DNA brevi sequenze bersaglio, di
solito palindromiche tagliandole in posizioni specifiche.
Una palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da
sinistra, per es. la parola radar oppure ala. Un sito di riconoscimento
palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in
direzione 5’3’, sono uguali. Per es. la sequenza:
5 −ΓΑΑΤΤΧ−3
3 −ΧΤΤΑΑΓ−5
Gli enzimi di restrizione furono scoperti intorno agli anni ‘50 e devono il loro nome al
fenomeno della restrizionemodificazione controllata dalla cellula ospite. Si notò che
talvolta l’introduzione in E.coli di DNA esogeno, proveniente da un diverso ceppo di
E.coli, risultava nella sua rapida frammentazione in piccoli frammenti (restrizione).
L’analisi di un DNA virale rivelatosi capace di resistere alla degradazione, rivelò, una
decina di anni più tardi, la presenza di alcune basi metilate. Si scoprì, quindi,
l’esistenza in E.coli di sistemi di restrizione/modificazione capaci di metilare
specifiche basi e, contemporaneamente, di tagliare le stesse basi quando non metilate.
Con questo sistema E.coli è capace di degradare DNA esogeno tagliandolo in specifici
siti di riconoscimento. Gli stessi siti presenti sul DNA endogeno, tuttavia, non sono
tagliati perché preventivamente metilati dal sistema di restrizionemetilazione
ENZIMI DI RESTRIZIONE
ISOLATI DAI BATTERI RICONOSCONO BREVI SEQUENZE DI DNA
E TAGLIANO MOLECOLE DI DNA IN SITI SPECIFICI
(SITI DI RICONOSCMENTO)
-N-N-GAATTC-N-N
EcoRI -N-N-CTTAAG-N-N
3’ 5’
3 CLASSI:
• TIPO I E III:
ATTIVITA’ DI RESTRIZIONE E DI METILAZIONE NELLA STESSA
MOLECOLA. ASPECIFICITA’ DI TAGLIO: NON USATI IN BIOLOGIA
MOLECOLARE.
• TIPO II:
2 ATTIVITA’ SU MOLECOLE DISTINTE. ELEVATA SPECIFICITA’ DI
TAGLIO.
NOMENCLATURA
GENERE E SPECIE DEL BATTERIO DA CUI E’ STATO ISOLATO.
ISOSCHIZOMERI
RICONOSCONO LA STESSA SEQUENZA DI TAGLIO.
Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la
frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati.
E’ ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più
frequentemente di uno che ne riconosce 6.
ENZIMI DI RESTRIZIONE
• UNITA’ DI ENZIMA
• “EFFETTO STAR”
ENZIMI DI RESTRIZIONE: MODALITA’ DI TAGLIO
Es. SmaI
5'-CCC GGG-3'
3'GGG CCC-5’
Es. EcoRI
5'-G AATTC-3'
3'-CTTAA G-5’
Es. PstI
5'-CTGCA G-3'
3'-G ACGTC-5'
ELETTROFORESI SU GEL
ESTRAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA DA GEL DI AGAROSIO
(POLISACCARIDE RICAVATO DA ALGHE MARINE)
ESEMPI DI SISTEMI DI PURIFICAZIONE:
• elettroeluizione
• colonne a scambio ionico
• gelfiltration
• ultrafiltrazioni
• agarosio a basso punto di fusione
• ecc. ecc.
VETTORI PLASMIDICI
MOLECOLE DI DNA CIRCOLARI, A DOPPIO FILAMENTO CAPACI
DI AUTOREPLICAZIONE CHE SI MANTENGONO NEI BATTERI
COME ENTITA’ EXTRACROMOSOMALI INDIPENDENTI
CARATTERISTICHE ESSENZIALI:
replicazione (uni o bidirezionale)
circolo rotante
Richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico
Funzioni dell’origine di replicazione
•I gruppi di incompatibilità
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
Modalità di replicazione:
• quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la
replicazione del cromosoma batterico e si di dicono sottoposti a controllo
stringente. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.
• Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla
replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato.
Sono presenti in molte copie fino a 1000 per batterio.
I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione
plasmidica
L’inizio della replicazione può essere controllata regolando:
• La disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidico
• La disponibilità di proteine essenziali alla replicazione
• La funzionalità di proteine essenziali alla replicazione
SPECIFICITA' D'OSPITE
• Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie
batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata ( narrow host range). Per
esempio PBR322 o PUC18 che si replicano solo in E.coli.
• Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si
dicono a largo spettro d'ospite (Broad host range). Per es. RK2 , è capace di
replicarsi in molti batteri gramnegativi.
I plasmidi a largo spettro d'ospite derivano questa loro proprietà dal possesso
di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell' origine di replicazione.
Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico.
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
Plasmidi con la stessa origine di replicazione (Inc) sono incompatibili tra loro.
I batteri dipendono per la loro replicazione da componenti genetiche
dell'ospite batterico in grado di riconoscere l'origine di replicazione e iniziare
la replicazione. Per esempio i geni che codificano la DNA polimerasi, RNA
polimerasi DNA dipendente, RNasi H ecc. Se in uno stesso batterio entrano
due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per
componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno
dei due plasmidi verrà perso. Possono invecere coesistere plasmidi con origine
di replicazione diverse che appartangono a diversi gruppi di incompatibilità
MARCATORI SELEZIONABILI
I plasmidi naturali a volte codificano per uno o pochi geni non essenziali
capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per
esempio possono codificare per la tossine batteriche o per geni di resistenza
agli antibiotici. In alcuni casi, tuttavia, nessun vantaggio competitivo sembra
essere associato alla presenza di geni di resistenza.
Tutti i vettori di clonaggio includono almeno un marcatore selezionabile.
Hanno lo scopo essenziale di distinguere e selezionare le molecole
ricombinanti. Inoltre, sotto un'appropriata pressione selettiva, stabilizzano il
plasmide
I marcatori selezionabili più utilizzati nei batteri sono i geni di resistenza agli
antibiotici. Per esempio il gene per la Betalattamasi codifica per un enzima
capace di idrolizzare l'anello lattamico degli antibiotici di tipo penicillinico (es.
l'ampicillina). I batteri che contengono un plasmide con questo gene quindi
( simboleggiato con Amp o Ap) possono crescere in terreni di coltura che
contengono l'ampicillina.
SITI DI RESTRIZIONE UNICI
Per effettuare un clonaggio molecolare é necessario avere sempre
almeno un sito di riconoscimento per una endonucleasi di
restrizione.
Il sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione deve
essere presente nel vettore una volta sola per non distruggere
l'integrità fisica del plasmide e non deve essere presente in
regioni cis essenziali (es. ori o promotori) o in geni che codificano
per funzioni essenziali (es. geni di resistenza).
TIPI DI PLASMIDI
• PLASMIDI F
• PLASMIDI R
• PLASMIDI DEGRADATIVI
• PLASMIDI CRIPTICI
• PLASMIDI DI GRUPPO DI INCOMPATIBILITA’
• PLASMIDI A CAMPO DI OSPITI RISTRETTO E
LARGO
• PLASMIDI INGEGNERIZZATI
GENETICAMENTE
COME SI PRESENTANO I PLASMIDI?
I plasmidi possono essere lineari o integrati nel
cromosoma batterico (episomi) ma, nella maggior parte
dei casi , sono molecole di DNA circolari
nick
Plasmide circolare Plasmide linearizzato
Plasmide superavvolto
(supercoiled)
rilassato
GEL DI AGAROSIO E BROMURO DI ETIDIO:
Le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte.
forma linerizzata ( tagliata con un
Plasmide: enzima di restrizione in un sito unico)
forma rilassata
forma lineare
forma superavvolata
PLASMIDE pBR322
CONTIENE SEGMENTI DI DNA CHE DERIVANO DA TRE PLASMIDI PRESENTI IN
NATURA IN CEPPI DI E. coli
DNA LIAGASI T4
• DNA-LIGASI DERIVATA DAL
BATTERIOFAGO T4. FORMA LEGAMI
FOSFODIESTERI CONGIUNGENDO I GRUPPI
FOSFATO 5’ E OSSIDRILE 3’ DI MOLECOLE
DI DNA ADIACENTI.
• RICHIEDE ATP
TRASFORMAZIONE
PROCESSO CON IL QUALE SI INTRODUCE DNA
PURIFICATO IN UNA CELLULA BATTERICA
I TAPPA
PIASTRATURA DELLE CELLULE CONTENENTI LA MISCELA DI
TRASFORMAZIONE SU MEZZO CON AMPICILLINA
CRESCITA
LB/AMP
• CELLULE + pBR322 INTATTO SI
II TAPPA
CELLULE CHE CRESCONO NEL MEZZO CON AMPICILLINA
VENGONO TRASFERITE IN UN MEZZO CON TETRACICLINA
CRESCITA
LB/TET
• CELLULE + pBR322 INTATTO SI
INCORPORATA NEL
GENE lacZ’
pUC Vector
Blue white
VANTAGGI
VANTAGGI
• COSMIDI
DNA clonato di 40 kb
• Ciclo litico:
litico il
batteriofago replica il
proprio corredo genetico,
si assembla in virione
maturo e lisa la cellula
uccidendola.
• Ciclo lisogeno: il fago é
capace di integrare il
proprio DNA nel
cromosoma batterico,
mantenendolo in uno stato
profagico inattivo e non
dannoso per l'ospite
batterico .
A livello molecolare il controllo della scelta del ciclo litico o di quello lisogeno dipende dall’espressione
di una serie di repressori proteici. Il repressore essenziale nel mantenimento del ciclo lisogeno è cI. La sua
presenza reprime efficacentemente l’espressione dei geni del ciclo litico. La proteina più importante per
lo stabilirsi del ciclo litico è il prodotto del gene S.
geni tardivi
cI cro cII O
N P
cIII
Q
γ
β S
α
xis R
int
att cos
i d ella
n
Gen
i de Ge esta
t
coda lla
Lisi o Lisogenia?
Lamda è un fago temperato, che può infettare una cellula di E.coli e lisarla, producendo molte particelle
fagiche, oppure integrarsi nel cromosoma batterico replicandosi come parte integrante di coli senza produrre
danno alcuno. La scelta tra ciclo litico e ciclo lisogeno è influenzato da diversi fattori. Una volta che la scelta
è stata effettuata è, essenzialmente irreversibile, anche se una piccola percentuale di fagi possono revertire da
un ciclo all’altro.
L’espressione dei geni di λ si divide in fasi che portano all’espressione dei geni molto precoci, precoci,
intermedi e tardivi.L’espressione dei geni precoci utilizza essenzialmente le proteine di coli e porta alla
trascrizione dei geni N e cIII, a partire da PL e d cro e cII, a partire da PR.
I prodotti di cIII e cII e sono necessari all’espressione di cI, che, a sua volta reprime l’espressione della
maggior parte dei geni, incluso se stesso.
N e cro, d’altra parte codificano, rispettivamente per un fattore di antiterminazione e per un repressore di cI
Il prevalere dell’azione di N e cro porta alla repressione di cI, alla trascrizione dei geni intermedi e allo
stabilirsi del ciclo litico, mentre il prevalere dell’azione di cIII, cII e, quindi, cI, porta al ciclo lisogeno.
PR TL
cIII N cI cro cII
TL PL
Aspetti applicativi
Dal punto di vista pratico inizialmente i batteriofagici hanno suscitato molto interesse per un loro possibile
utilizzo contro agenti patogeni batterici. Completamente superato dall'introduzione degli antibiotici, questo
possibile utilizzo dei batteriofagi come "antibiotici naturali" sta nuovamente risquotendo qualche interesse, a
causa della comparsa di ceppi batterici resistenti agli antibiotici. Il principale campo di applicazione dei
batteriofagi, tuttavia, consiste nello sviluppo di diversi tipi di vettori per biologia molecolare.
molecolare Fra i più
comuni citiamo, ovviamente, il fago λ , ma anche M13, T3, T7 e f1.
Packaging in vitro
Sebbene il DNA possa essere inserito in un batterio per trasformazione, la dimensione del genoma di λ rende
questa metodica poco efficiente. Si preferisce sfruttare, in alternativa, il sistema di packaging in vitro di λ .
In una normale infezione litica, λ comincia a replicarsi con la modalità del circolo rotante, producendo lunghi
concatenameri. Questi vengono successivamente ridotti in frammenti lineari, delimitati dalle estremità cos,cos e
impacchettati all’interno di un capside vuoto. In seguito all’assemblaggio con una coda, si ricostituisce un
virione maturo e infettivo. Il risultato di un’ infezione fagica consiste nella formazione di placche di lisi
traslucide su uno strato di batteri a confluenza.
Mescolando il DNA da inserire, con due colture di fagi difettivi, uno incapace di introdurre il DNA nei
capsidi vuoti e l’altro incapace di produrre capsidi vuoti, si riesce a produrre un packaging efficiente
A causa delle caratteristiche biologiche di λ, la produzione di lunghi stampi concatenati, risulta in packaging
più efficienti.
I vettori derivati dal fago l
I più importanti vettori fagici sono quelli derivati dal fago l. Il DNA di l è una molecola
lineare a doppio filamento di 48,5 Kb, caratterizzata dalla presenza alle estremità 5’ di due
terminali coesivi a singola elica di 12 bp. Queste code a singolo filamento sono chiamte siti
cos ( per cohesive ends ) e permettono la circolarizzazione del DNA di l dopo l’infezione della
cellula ospite.
La mappa genetica del fago l comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi in tre
gruppi funzionali:
La parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della testa
e della coda.
La parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che porta
all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione
non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori.
La parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico.
Struttura generale dei vettori λ
La regione tra i geni J e N del genoma di λ, come dicevamo, non è essenziale per la crescita litica. In linea di
principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14500 bp di DNA estraneo, che
ricostituirebbero la lunghezza originale del genoma di λ. Nella testa, del fago, però, può trovare posto fino al
105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di λ altre regioni non essenziali che
possono essere rimosse. Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA
estraneo inseribile. Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di λ, pari a circa 37 Kb, al di
sotto il DNA non viene impaccato e il λ non è vitale.
I vettori che contengono un sito di restrizione unico (x) per l'inserzione di DNA estraneo sono chiamati
vettori d'inserzione.
d'inserzione Questi vettori sono più facili da utilizzare e possono accettare inserti di dimensioni da 8
fino a 10-12 Kb. Sono generalmente utilizzati per costruire librerie di cDNA.
I vettori con due siti di taglio, in cui la parte centrale del DNA (frammento stuffer) può essere rimossa e
sostituita con un frammento di DNA estraneo, sono chiamati vettori di sostituzione. Possono accettare inserti
da 10 a 22 Kb e sono in genere utilizzati per costruire librerie genomiche.
In linea generale tutti i λ utilizzati come vettori sono stati estesamente modificati. In particolare sono stati
creati siti di restrizione unici nella regione centrale, eliminando eventuali siti di restizione multipli mediante
mutazioni sito-specifiche. I vettori derivati da λ inoltre sono stati ridotti in dimensione rispetto al wild type,
eliminando la maggior parte delle sequenze non necessarie al ciclo litico. λ gt10 è un esempio di vettore
d'insezione, mentre EMBL3 rappresenta un esempio di vettore di sostituzione.
Clonaggio in vettori di sostituzione
I vettori di sostituzione permettono di clonare frammenti di 1520 kb. Si effettua una digestione genomica
parziale con Sau3A e si purifica una popolazione intorno a i 15 kb. Si digerisce quindi un vettore di
sostituzione con BamHI, complementare a Sau3A, e si ligano insieme i bracci destro, sinistro e la
popolazione di digesti parziali di circa 15 Kb.
BamHI
digestione parziale
con Sau3A
ligazione
Isolamento frammenti sito cos sito cos
da 15 Kb
Packaging in vitro
infezione di E.coli
screening
Infezione di
E.coli
packaging in vitro
I frammenti privi di inserto
e di “stuffer” sono troppo
piccoli per essere impacchettati
e dare particelle virali
autoradiografia
gt10 + EcoRI Clonaggio in vettori di insezione
ligasi
Infezione di
E.coli
packaging in vitro
IL PACKAGING DEL DNA DEL BATTERIOFAGO l NELLE TESTE
DURANTE IL CICLO LITICO
50 kb
IL SISTEMA DI CLONAZIONE BASATO SUL BATTERIOFAGO l
La selezione nei vettori fagici
Il problema di selezionare i cloni ricombinanti è più complesso nei fagi a causa delle dimensioni e della
ridondanza delle genoteche da cui si parte
Dal punto di vista pratico la manipolazione e selezione dei batteriofagi ricombinanti è simile a quella
dei plasmidi. In entrambi i casi si utilizzeranno le stesse tecniche, già studiate, per manipolare il DNA.
Le principali differenze risiedono nell’introduzione del DNA nella cellula e nel tipo di colonie.
* Nel caso dei vettori di sostituzione, come ad esempio EMBL3, i fagi ricombinanti sono
automaticamente selezionati. La ligazione dei bracci destro e sinistro, infatti, ricostituisce un DNA
fagico le cui dimensioni sono inferiori al fatidico 75% del genoma virale necessario per
l'impacchettamento del DNA in un capside. Solamente i fagi ricombinanti contenenti un inserto di
dimensioni adeguate, potranno quindi ricostituire la dimensione sufficiente per poter essere
inpacchettati nel capside ed essere vitali.
In molti casi, ad esempio nei Lambda Zap, viene utilizzata la selezione bianco/blu già descritta per i
vettori plasmidici, in cui l'inserto da clonare è posizionato all'interno del gene per la β -galattosidasi
interrompendone l'integrità strutturale. In presenza di un β -galattoside cromogenico, come l'X-gal, le
placche ricombinanti appariranno bianche, quelle prodotte fagi conteneti da vettori senza inserto
appariranno blu.
Lambda gt10 è un altro esempio di inattivazione inserzionale. Il sito EcoRI è posizionato in mezzo al
gene cI. Un inserzione al suo interno, dunque distruggerà l’integrità strutturale del repressore e il fago
non sarà più in grado di entrare nel ciclo lisogeno. Quindi i faghi senza inserzioni avranno colonie
torbide ( miscela di fagi lisogeni e litici) mentre i fagi con l’inserzione daranno placche chiare (placche
litiche). La distinzione può essere resa ancora più evidente usando E.coli recanti la mutazione hfl
( high frequency of lisogeny), in cui tutti fagi conteneti il solo vettorie non produrranno affatto placche.
I COSMIDI
• 40 kb DI DNA CLONATO
Permettono di inserire DNA fino a 45 Kb. Un cosmide è semplicemente un plasmide, di solito
intorno alle 5 Kb, contenente, un sito cos. Come tutti i vettori plasmidici contiene una ori, un
marcatore di resistenza e siti unici di restrizione e si utilizza nello stesso modo. Invece di
trasformare la miscela di ligazione per trasformazione, processo che sarebbe piuttosto
inefficiente, vista la dimensione media di un cosmide, si può utilizzare un packaging in vitro. Il
cosmide infatti possiede un sito cos è può essere considerato un buon substrato per una reazione
di packaging, purchè abbia dimensione comprese tra 37 e 51 Kb. Considerando la dimensione
media di un vettore cosmidico, la dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide
varierà tra 32 e 45Kb.
UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO
pLFR-5
UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO
SELEZIONE IN
PRESENZA DI
TETRACICLINA
SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A
INSERTO MOLTO GRANDE (>100kb)
• FACILITANO L’ANALISI DEI GENOMI
EUCARIOTICI COMPLESSI
• INDISPENSABILI PER:
- MAPPATURA GENOMA UMANO
- SCOPERTA DI GENI UMANI
ESEMPIO:
CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI
(BAC): COSTRUTTI VETTORE-INSERTO
BASATI SUL PLASMIDE F
Trasformazione di cellule procariotiche ed eucariotiche
Un aspetto importante di tutte le tecniche di ingegneria genetica è rappresentato
Dalla introduzione del DNA ricombinante in una cellula ospite capace di
replicarlo.
La capacità di trasferire geni da un organismo ad un altro è alla base di tutte le tecni
che di ingegneria genetica. L’efficienza di questo passaggio è cruciale per garantire il
successo di qualunque clonaggio
Svariate strategie di trasferimento genico sono state evolute in diversi organismi e
sono rimaste le tracce di antichi trasferimenti genici. I batteri, per esempio, sono in
grado di trasferire materiale genetico da batterio a batterio, mediante coniugazione; i
virus infettando cellule suscettibili di vari organismi; i batteri del suolo del genere
Agrobacterium riescono a trasferire e integrare stabilmente in cellule vegetali porzioni
del loro genoma.
Recenti progressi nelle tecniche di trasferimento genico permettono oggi di trasferire
ad alta efficenza, e in modo controllato materiale genico in altri organismi.
L’introduzione di materiale genetico eterologo, cioè proveniente da un altro
organismo, in una cellula viene generalmente definita trasformazione. Bisogna
tener conto, tuttavia, che il termine “trasformazione” è piuttosto generico, indicando,
per esempio anche la trasformazione di cellule normali in cellule tumorali.
Generalmente per “trasformazione” s’intende il trasferimento di DNA in cellule
batteriche, mentre per “trasfezione” il trasferimento genico mediato da batteriofagi o
virus.
Per le cellule animali il termine “trasformazione” indica il passaggio da cellula
normale a cellula tumorale, mentre l’introduzione di DNA eterologo nella cellula si
definisce “ trasformazione mediata da DNA” o, più frequentemente “trasfezione”.
Tipi di trasferimento genico
DNA
DNA
plasmidico
virus
Elettroporazione Trasfezione PEG
CaCl2 Elettroporazione
Coniugazione DEAEdestrano
Trasformazione CaPO4
Cellula animale
Cellula batterica
Elettroporazione
cannoncino balistico
Agrobacterium
Elettroporazione
fusione di protoplasti Cellula vegetale
protoplasto
Principali metodi di trasferimento genico
Batteri Protoplasti
Elettroporazione Elettroporazione
trasformazione chimica con CaCl2 fusione di protoplasti
coniugazione batterica
Piante
elettroporazione
trasferimento mediato da Agrobacterium
cannoncino balistico
fusione di protoplasti
Cellule animali
PEG
Lieviti Elettroporazione
PEG DEAEdestrano
Elettroporazione CaPO4
DEAEdestrano
TRASFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI
• CONIUGAZIONE
Protocollo di trasformazione con cellule calciocompetenti
A. CaCl2 method (fresh cells)
1. Dilute overnight LB culture 1:1000 into 100 ml of fresh LB broth at 37° C
2.Collect cells at O.D.A600=0.40.5 (It may vary depending on the strains) and
sediment at 4.000 x g (=5000 rpm with A4 rotor * ) for 5’ at 4°C
3. Wash cells in about half the volume ( 50 ml ) of cold 0.1 M CaCl2
4. . Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently in about 1/4 the
volume
( 25 ml ) of cold 0.1 M CaCl2
5. Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently in
4 ml ) of cold 0.1 M CaCl2. Stand on ice for at least 30’.
6. Add DNA in a volume as little as possible (up to 0.1 ml) to a 200 µl aliquot of
competent
cells and incubate on ice from 1 hour to all day
7. Heat shock for 90’’ at 42°C. (important!)
8. Add 0,8 ml of LB without drugs and incubate without shaking for 1 hour
9. Plate on selective media by spreading.
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
I plasmidi possono essere classificati in due gruppi; plasmidi coniugativi e non coniuga
tivi in relazione alla loro capacità di trasferire materiale genetico tra batteri mediante la
coniugazione batterica. In generale, sono i plasmidi di grosse dimensione ad essere
coniugativi, mentre la maggior parte dei piccoli vettori usati in ingegneria genetica, non
lo sono.
Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:
• Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)
• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)
• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus mob (mobilizzazione)
Plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili; tuttavia se un plasmide
possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando appositi batteri
helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti.
CONIUGAZIONE BATTERICA
• B: vettore di clonazione
mobilizzabile non
A
coniugativo (di interesse)
B C
• C: cellula ricevente
bersaglio
ESEMPIO DI SELEZIONE
• Ceppo A: non può crescere su mezzo
minimo, AMP sensibile
condizioni
…. CELLULE BERSAGLIO CHE HANNO
ACQUISTATO IL VETTORE DI
CLONAZIONE PLASMIDICO!