U NA M F E S C UAU T I T L N

M I C R O B I O L O G A FA R M A C U T I C A

M A N UA L D E P R C T I C A S

ALUMNO:______________________

GRUPO________

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS CODIGO: DOC-CB-DEX01-00 No de REVISIN: 0

REGLAMENTO GENERAL PARA LOS LABORATORIOS

1) Este reglamento aplicar para personal acadmico, alumnos y laboratoristas. 2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deber utilizarse bata blanca con manga larga. 3) La tolerancia para el inicio de la sesin de laboratorio ser hasta de 10 minutos a partir de la hora sealada. 4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prcticas. 5) En todo momento deber mostrarse una conducta adecuada en el rea de trabajo. 6) Queda prohibido en los laboratorios: a) Tirar basura fuera del cesto. b) Ingerir alimentos y/o bebidas. c) Fumar. d) Recibir visitas. e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos. f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios. g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesin experimental. h) Sentarse sobre las mesas de trabajo. i) Mover el mobiliario de su lugar. j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.
7)

Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado fsico representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas, txicas, inflamables o biolgico-infecciosas (Art. 3 de la Ley General del Equilibrio y Proteccin del Ambiente).

8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de telfonos celulares, reproductores de sonido o cualquier medio electrnico de entretenimiento. El uso de las computadoras porttiles queda restringido a temticas relacionadas con la asignatura. 9) El acceso al laboratorio se permitir nicamente cuando est presente un profesor.

10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deber programarse con el profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prcticas. 11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depsito la credencial vigente de la UNAM. 12) El alumno deber revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomala (faltante o material daado) y ser devuelto en las condiciones en que se recibi, de no hacerlo, se har acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio. 13) Es obligacin de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el laboratorio.

Prctica No. 1 CONTROLDECALIDAD YNORMASDEBIOSEGURIDAD

INTRODUCCIN

El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la confiabilidad de la informacin que proporciona el laboratorio sobre los productos que examina o produce. El objetivo de cumplir con este parmetro es obtener la calidad ptima en todos los procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible. Es necesario iniciar el desarrollo de un diseo general del Laboratorio, en donde la planificacin, la remodelacin o la ampliacin deben estar a cargo de un Comit en el que participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros profesionales del mismo.

El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios especficos, programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal previsto. Como reas secundarias se consideran corredores, salas de mquinas, escaleras, etc.
La industria farmacutica establece un conjunto de actividades necesarias para asegurar que los productos terminados cumplan con la calidad requerida debido a que los medicamentos tienen la finalidad de dar un beneficio al individuo que lo consuma que es la salud. Para que un medicamento pueda llegar al consumidor tiene que pasar por varias actividades de calidad lo que garantiza que durante el proceso de fabricacin, acondicionamiento y distribucin mantiene la identidad, pureza, concentracin, potencia e inocuidad requeridos para su empleo, que no se encuentren contaminados o alterados y no representen un riesgo para la salud El aseguramiento de la calidad es la recopilacin de la experiencia en el manejo de la calidad, que se ha normalizado internacionalmente. Es necesario conocer dos documentos normativos que son bsicos para el correcto desempeo de este sistema: Good Manufacturing Practices (GMP) o Buenas Prcticas de Manufactura y la Norma ISO 9000

1.1

GMPS O BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA

En la produccin de frmacos es necesario tener extremo cuidado, siguiendo los principios normativos de las GMPs, independientemente si los productos van a ser estriles o no. Este sistema de GMPs fue elaborado en los Estados Unidos por la agencia de Salud: Federal Drugs Administration (FDA por sus siglas en ingls) por medio del Cdigo Federal de Regulaciones (CFR) y se encuentra en el Registro Federal por los departamentos ejecutivos y agencias del gobierno federal estadounidense. La cual est dividida en 50 ttulos y cada uno est dividido en partes y subpartes. La parte aplicada a la industria farmacutica es la 211, subpartes B a la K. Los laboratorios de la Industria Farmacutica controlan la calidad microbiolgica de las materias primas, la eficacia de los procesos de tratamiento, los puntos crticos de la produccin y la calidad del producto final, por ende las BMPs tienen como objetivo la implantacin de programas de calidad en las actividades que realizan ya que los resultados incorrectos pueden tener una gran repercusin econmica y sobre la salud pblica.

1.2

NORMAS ISO STANDARDIZATION)

(INTERNATIONAL

ORGANIZATION

FOR

Son una serie de estndares (conocidas en EE.UU. como series ANSI/ASQC Q90-Q94). Primariamente percibido para ayudar a armonizar un gran nmero de estndares nacionales e internacionales, integrado por una delegacin mundial conocida como ISO/Technical Comit 176, conformada por las siguientes agencias AFNOR (Association Francaise de Normalisation), ANSI (American National Standard Institute), BSI (British Standard Institute), NNI (Nederlans Normalisate Institut) y SSC (Standard Council of Canada), entre otras.

La serie ISO 9000 consiste de 5 documentos: tres son bsicos de los modelos de aseguramiento de la calidad: 9001, 9002 y 9003; y dos soportan documentos guas: 9000 y 9004. El ttulo claramente indica su propsito:

1.2.1

ISO 9000. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y ASEGURAMIENTO DE CALIDAD. Gua para seleccin y uso.

NORMAS

DE

1.2.2

ISO 9001. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en diseo, produccin, instalacin y servicio. ISO 9002. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para el aseguramiento de calidad aplicable a la fabricacin e instalacin. ISO 9003. SISTEMAS DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en inspeccin final y prueba. ISO 9004. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y ELEMENTOS DE LOS SITEMAS DE CALIDAD-GUIAS.

1.2.3

1.2.4

1.2.5

1.2.6 CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la confiabilidad de la informacin que proporciona el laboratorio sobre los productos que examina o produce.

El objetivo de cumplir con este parmetro es obtener la calidad ptima en todos los procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible.
Es necesario iniciar el desarrollo de un diseo general del Laboratorio, en donde la planificacin, la remodelacin o la ampliacin deben estar a cargo de un Comit en el que participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros profesionales del mismo. El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios especficos, programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal previsto. Como reas secundarias se consideran corredores, salas de mquinas, escaleras, etc. El Laboratorio debe disponer de: Instalaciones con capacidad de produccin de servicios conforme a las necesidades (volumen, calidad y oportunidad). Elementos para la proteccin del personal, de las instalaciones y del equipo Medios para el control de la emisin de contaminantes al medio ambiente. Costos de operacin razonables para su funcionamiento

1.2.7

Requerimientos bsicos de un laboratorio

1.2.8 Ubicacin y construccin. La ubicacin del Laboratorio de Microbiologa debe ubicarse lejos de reas o instalaciones que puedan interferir en el resultado de los anlisis o permitir por su proximidad contaminaciones qumicas o biolgicas. Las reas de apoyo (lavado de material y esterilizacin) deben estar cerca del rea analtica para facilitar el flujo de operacin. El rea de preparacin de muestras debe estar aislada para evitar contaminaciones cruzadas que pueden tener efecto sobre la integridad de la muestra y por consiguiente sobre el resultado del anlisis En cuanto a las caractersticas de construccin del Laboratorio, se deben emplear materiales de construccin no inflamables, resistentes a la corrosin y de fcil limpieza, de superficies lisas para disminuir la posibilidad de acumulacin de desechos o microorganismos. Los techos, paredes y suelos deben ser lisos y fciles de lavar, impermeables a los lquidos y resistentes a la accin de las sustancias qumicas, solventes y productos desinfectantes utilizados de ordinario en el laboratorio.

El color de los techos y paredes debe ser de tonos claros mate que permitan una difusin homognea de la luz, evitando reflejos perjudiciales. No debe emplearse pintura inica para evitar la disolucin de molculas gaseosas en el ambiente
Las puertas y ventanas pueden ser de madera o metlicas y deben abrir hacia afuera, las metlicas son las ms empleadas por su calidad y resistencia. Las ms utilizadas son las de aluminio por no requerir pintura y por mantener su apariencia permeable. Si el laboratorio tiene aire acondicionado; las ventanas debern ser fijas de cierre absoluto y tener como nica misin el permitir la entrada de la luz natural 1.2.9 Instalaciones Elctricas En cuanto a las instalaciones elctricas se debe contar con un suministro de energa elctrica suficiente, estable, libre de fluctuaciones y aislada convenientemente. La carga elctrica se debe determinar tomando en cuenta los aparatos elctricos y electrnicos de que dispone el laboratorio; las lneas de distribucin de corriente deben de estar diseadas para alimentar los equipos en cada rea sin sufrir sobrecarga. El voltaje se estabiliza, por medio de un regulador central con lneas de distribucin de corriente estabilizada para las reas que lo requieren, o por unidad, con un regulador de voltaje para cada aparato. 1.2.10 Tuberas Es conveniente sealar o pintar con colores reglamentarios las tuberas.

La instalacin de gas, se pueden utilizar gas natural o licuado. Se debe construir en tubera de cobre asegurando la total ausencia de fugas en las juntas y debe de llevar el color reglamentado que es amarillo. Las instalaciones de aire comprimido, sta es una disposicin como servicio comn en los laboratorios, se prefiere situarlo a travs de una red que puede ser construida en tubera de hierro o cobre, operada a presin del orden de 5 Kg/cm2 alimentado por un compresor localizado en la sala de mquinas, y la tubera debe de ser de color azul. Las condiciones ambientales en el laboratorio se deben prestar atencin a los niveles de iluminacin, de ventilacin, de temperatura y de humedad para el bienestar de los trabajadores, as como el control de vibraciones y ruidos que puedan afectar considerablemente las operaciones analticas.

1.2.11 Aire. El aire de los recintos recargados por gases de combustin, placas calientes, as como emanaciones de productos qumicos o cidos exigen una renovacin peridica del ambiente. La ventilacin puede llevarse a cabo en forma natural o por medio de sistemas mecnicos; se recomienda una renovacin del aire de 6 a 10 veces por hora para mantener el ambiente inocuo y cmodo. Es aconsejable prever una instalacin mecnica de ventilacin que introduzca aire del exterior y expulse el aire viciado sin recirculacin; el aire del recinto debe estar libre de polvo y microorganismos, la velocidad de entrada y salida se debe mantener baja y no debe provocar corrientes. La calidad del aire se debe controlar peridicamente a nivel microbiolgico (Ver Prctica 2)

1.2.12 Temperatura La temperatura ambiente deber mantenerse entre 20 y 23 C y la humedad relativa del aire debe ser aproximadamente de 50% con una tolerancia del 5% ya que valores fuera de estos lmites pueden deteriorar los medios de cultivo y producir errores en algunas pruebas de laboratorio. Deben contar con aire acondicionado y no se debe apagar al finalizar las horas de trabajo ni durante los fines de semana, ya que las operaciones se ven seriamente afectadas por las variaciones bruscas de temperatura ambiente. 1.2.13 Limpieza La limpieza se debe hacer diariamente en todas las reas, despus de la jornada de trabajo. Se ha demostrado que 90% de la posible contaminacin del aire y otras fuentes se depositan en las superficies horizontales. La contaminacin microbiana proviene directa o indirectamente de las personas, del aire de ventilacin o del ambiente exterior, de las superficies, de los equipos y materiales. El objetivo principal de la limpieza es eliminar la contaminacin microbiana y la suciedad de las superficies; para lo cual, se debe restregar o friccionar lo suficiente.

Al igual que los productos, los mtodos de limpieza pasan por una fase de desarrollo para asegurar que son eficaces para usarse en la produccin. Deben desarrollarse PNO (Procedimiento Normal de Operacin) de limpieza, y el personal debe seguirlos con diligencia. El uso de un protocolo de limpieza puede ayudar a rastrear cambios en el proceso de limpieza. Las operaciones de limpieza, las observaciones, los cambios en el procedimiento, los resultados de pruebas y las recomendaciones pueden documentarse en esos protocolos

1.2.14 Campanas de flujo laminar En las campanas de flujo laminar se debe verificar a intervalos mensuales la velocidad del flujo de aire requerido midiendo la presin a ambos lados de los filtros; estos se deben reemplazar cada 6 meses. 1.2.15 Autoclaves Es una cmara de presin que se usa para esterilizar utensilios, material de laboratorio, medios de cultivo, cepas microbianas, etc. Debe ser considerado potencialmente peligroso, cuando el aire ha sido expulsado y la cmara se ha llenado con vapor saturado, existe una relacin entre la temperatura y la presin. Se debe verificar el correcto estado de la vlvula de seguridad, cuando comienza a salir el vapor de la espita por lo cual el equipo debe:

Ser confiable Ser seguro (temperaturas de +/- 1.0 C) Dar un tiempo se respuesta Las pruebas de distribucin del calor deben ser conducidas con el nmero adecuado de termopares. Las pruebas se deben hacer con esporas biolgicas.

1.3

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA Los fundamentos de seguridad son constantes y una vez que han sido aprendidos gobiernan, en cierta forma, automticamente los actos del trabajador cuidadoso. Todos los establecimientos de enseanza deben incluir en sus programas de formacin un programa especfico de entrenamiento en mtodos de seguridad. Un defecto y que conduce con ms frecuencia a los accidentes de laboratorio es el intento de obtener resultados con demasiadas prisas. Ningn Laboratorio debera de carecer de un cdigo de reglas y medidas de seguridad.

1.3.1 Bioseguridad La seguridad en el manejo de los objetos del laboratorio as como de la proteccin del personal es un componente esencial en la prctica moderna del Laboratorio. La Bioseguridad del Laboratorio incumbe a todo el personal; por tanto, cada empleado debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condicin que atente contra ella. Se deben realizar algunas actividades como:

Redactar un manual de Bioseguridad y de operaciones en el que se identifiquen los riesgos reales o potenciales y se indiquen las prcticas o procedimientos adecuados para reducir al mnimo o eliminar tales riesgos especiales. Cerciorarse de que todos los miembros del personal han recibido la instruccin necesaria acerca de los riesgos de infeccin. Estar seguro de que se apliquen mtodos de descontaminacin en caso de derrame, o ruptura de recipientes de material contaminado.

1.3.2 Criterios del Nivel de Bioseguridad de los laboratorios Conjunto de normas que han de cumplir los laboratorios en los que se manipulan microorganismos infecciosos, muestras de tejidos humanos o animales de laboratorio. Definen las combinaciones de: equipos de proteccin (barreras primarias), instalaciones del laboratorio (barreras secundarias) y de contencin del edificio (barreras terciarias), ms adecuadas para la manipulacin de los agentes biolgicos de riesgo. Se definen 4 niveles de bioseguridad: Nivel 1- Manipulacin de agentes que no producen enfermedad en adultos sanos. Agentes biolgicos bien caracterizados no causantes de enfermedades en adultos y con un riesgo mnimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente Nivel 2- Agentes patgenos en el hombre (riesgo = dao percutneo, ingestin, mucosas). Agentes biolgicos del grupo 2 : aquel que puede causar una enfermedad en el ser humano y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. Nivel 3- Agentes patgenos con potencial de transmisin por aerosol. Agentes biolgicos del grupo 3. aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano y presenta un serio peligro para los trabajadores con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz

Nivel 4- Agentes peligrosos o patgenos con un alto riesgo de enfermedad, con transmisin por aerosol o por medios desconocidos. Agentes biolgicos del grupo 4. Aquel que causando una enfermedad grave en el ser humano supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista una profilaxis o tratamiento eficaz. Existe toda una gama de equipos de proteccin indicados segn sea el nivel de bioseguridad del laboratorio. 1.3.3 Saneamiento del medio Existen reglas importantes que debe seguirse:

Mantener ordenado y en buen estado de higiene el conjunto de los locales. Tener suficientes cubos para basura de un modelo aprobado (con tapa). Mantener todos los lugares cerrados, de manera que puedan entrar en ellos roedores, insectos y otras plagas. Disponer de agua potable. Disponer de lavados apropiados, mantenidos en buenas condiciones de higiene. Destinar el espacio suficiente para que el personal pueda comer. Deben existir vestidores separados para hombres y mujeres, con armarios separados para ropa de calle y para ropa de proteccin.
REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA Los miembros del personal se deben lavar las manos despus de haber manipulado No permitir pipetear con la boca. Prohibir al personal comer, beber o fumar en la zona de trabajo del Laboratorio. No aplicarse cosmticos. No guardar comida, ni bebidas en los refrigeradores del Laboratorio. Se debe mantener el Laboratorio limpio y aseado. Las superficies de trabajo de descontaminarn al menos una vez al da, e inmediatamente en caso de derrame de sustancias potencialmente peligrosas. Es necesario que todos los procedimientos tcnicos se practiquen de manera que se evite la posible formacin de aerosoles. En el Laboratorio es necesario utilizar batas, uniformes u otras prendas apropiadas; no se debe llevar ropa de laboratorio fuera de ste y se requiere desinfectar las prendas contaminadas, mediante procedimientos apropiados. Autorizar el paso a la persona de trabajo del Laboratorio, slo a las personas que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos y que satisfagan

1.3.4

cualquier requisito que se exija para entrar; durante el trabajo se deben mantener cerradas las puertas del Laboratorio. Slo tendrn acceso las personas autorizadas. No permitir la entrada a nios en las zonas de trabajo del Laboratorio, No permitir la entrada de animales que no tengan relacin con los trabajos que se estn realizando. Utilizar guantes en todos los trabajos que entraen un posible contacto accidental con material infeccioso. Los guantes se deben quitar aspticamente y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder a su eliminacin.

1.3.5 Colores de Seguridad En un laboratorio las indicaciones de seguridad deben ser tomadas de forma seria, y el personal debe estar capacitado para saber qu es lo que se est indicando en cada momento. Para hacer ms fcil el entendimiento y lograr que todas las medidas de seguridad sean llevadas a cabo se han establecido colores de tono llamativo para usarse en diferentes tipos de sealizacin. La tabla siguiente hacer referencia a cada uno de los casos.

Rojo
Amarillo Verde

Azul

1.3.6

Colores de seguridad para tuberas

Rojo Amarillo Verde

1.3.7 Modelo de Rombo para sustancias usadas en un laboratorio El esquema del sistema debe ser un rombo, cuya diagonal mayor debe ser perpendicular al plano horizontal. El rombo se debe dividir en cuatro secciones, como lo muestra la figura 1; con el siguiente orden y color de fondo: I. Riesgo a la salud, en color azul II. Riesgo de inflamabilidad, en color rojo III. Riesgo de reactividad, en color amarillo IV. Riesgos especiales, en color blanco

Figura 1 Modelo de rombo de seguridad

Para identificar los riesgos especiales se debe:

Usar las letras OXI para indicar la presencia de una sustancia oxidante; Usar el smbolo W para indicar que una sustancia puede tener una reaccin peligrosa al entrar en contacto con el agua; Opcionalmente usar las letras o smbolos del equipo de proteccin personal.

1.3.8

CRITERIOS DE CLASIFICACION DE GRADOS DE RIESGO A LA SALUD (MODELO ROMBO)

1.4

OBJETIVO GENERAL

Conocer las Normas Oficiales Mexicanas (NOMs) que se aplican en el Laboratorio de Microbiologa Farmacutica mediante el control de calidad para evitar riesgos y garantizar la integridad del personal y de las instalaciones.

1.5

OBJETIVOS PARTICULARES

Identificar los puntos crticos que puedan ser fuente de contaminacin en el Laboratorio de Microbiologa Farmacutica de la FESC, que puedan interferir en los resultados mediante la elaboracin de productos farmacuticos. Designar la clasificacin de los reactivos y materias primas de acuerdo a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana 018 del Cdigo SIMAR Proponer la construccin de un Laboratorio de Microbiologa Farmacutica, de acuerdo al diseo estipulado en las NOMs.

1.6
1.6.1

ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE
Realizar la clasificacin de los siguientes reactivos con el modelo del rombo.

a) Hidrxido de Potasio b) Perxido de Hidrgeno c) Cloruro de sodio d) Cristal Violeta e) Lugol f) Safranina g) Alcohol 90% h) Acetona

1.6.2

Ubicar la tubera del Laboratorio de Microbiologa y de acuerdo a los fluidos que conducen dichas tuberas realizar un reporte de acuerdo a lo establecido en la NOM-026-STPS1-1994 1 .

1.6.3

Realizar una inspeccin en el Laboratorio de Microbiologa y establecer si cumple con las normas de seguridad en cuanto a los sealamientos de prohibicin, obligacin, precaucin, de equipo contra incendio, salidas de emergencia y primeros auxilios de acuerdo a la NOM-026-STPS1-19941.

1.6.4

Determinar el equipo de proteccin personal que se necesita en el Laboratorio de Microbiologa de la FES Cuautitln.

1.6.5

Realizar una inspeccin y evaluar si el Laboratorio de Microbiologa cumple con los requerimientos de construccin establecido por las NOMs.

El alumno debe investigar NOM-026-STPS1-1994

1.7
1.7.1

RESULTADOS
Modelo de Rombo

1.7.2

Tuberias

1.7.3

Sealamientos

1.7.4

Equipo de proteccin personal

1.7.5

Actividad Extra:

Indica en la tabla el nivel de Bioseguridad del Microorganismo descrito. Microorganismo B.subtilis Clostridiumbotulinum Candidaalbicans E.Coli S.Typhi Virusdelbola VirusdelaFiebredeLassa B.antracis VirusHepatitisC VirusdeHIV Nivelde Bioseguridad

1.8

OBSERVACIONES ADICIONALES

_______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ___________________________________________________________.___________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ________________________________________.______________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________.

1.9

CONCLUSIONES

_______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ___________________________________________________________.___________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ____________________________________________________________.

1.10 BIBLIOGRAFA
LVAREZ, Ma. del Roco. Tesis Manual de Introduccin al Control de Calidad en el Laboratorio de Microbiologa. Universidad Femenina de Mxico. Escuela de Q.F.B. 2001 CFR, Parte 211. Current Good Manufacturing Practice For Finished Pharmaceuticals. FDA, EE.UU, 1992 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-017-STPS-2000. Equipo de Proteccin Personal. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificacin y Comunicacin de Peligros y Riesgos por Sustancias Qumicas Peligrosas en los Centros de Trabajo. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-026-STPS1-1998. Colores de Seguridad e Higiene. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin para establecimientos de la Industria Qumico-Farmacutica dedicados a la Fabricacin de Medicamentos

1.11 Referencias Electrnicas

www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/biosfty.htm

Prctica No. 2 MONITOREOAMBIENTAL

2.1 INTRODUCCION

Las condiciones del medio ambiente, en las diferentes reas de produccin y del Laboratorio de Microbiologa, tienen un impacto en la calidad de los productos y de las pruebas que se realizan. Debido a que el aire, la infraestructura, los equipos y el mismo personal pueden volverse fuentes de contaminacin, es necesario crear un Programa de Monitoreo Ambiental que permita mantener los diferentes contaminantes ambientales dentro de los lmites mximos permitidos, que marca la NOM-059, con el fin de que dichos laboratorios operen adecuadamente. Podemos definir el monitoreo ambiental como la medicin u observacin programada que debe realizarse en los diversos puntos de un rea ya que son elementos esenciales de un programa de control que proporciona datos para identificar los factores que contribuyen en los procesos de contaminacin y una vez identificado el problema instituir medidas apropiadas y evaluar su eficacia. En el laboratorio de Microbiologa, la vigilancia ambiental microbiolgica del rea tendr en cuenta la efectividad de la limpieza y sanitizacin de las superficies, as como la eficacia de la filtracin en los sistemas de aire, y la asepsia del personal. Se efecta la medicin de contaminantes biolgicos en tres fases: Captacin Cultivo Anlisis 2.1.1 MUESTREO AMBIENTAL La fsica de captacin de partculas suspendidas en el aire y los principios generales para una buena recogida de muestras son aplicables a todo tipo de materia con independencia de si es de origen bilgico o no. Los diferentes mtodos de recogida de muestras de contaminantes biolgicos, se basan en pasar un determinado volumen de aire sobre un soporte de retencin del contaminante por medio de un sistema de aspiracin.

El soporte debe impedir la destruccin de los microorganismos mantenindolos vivos dado que en el cultivo de la misma se propiciar su crecimiento para poder despus proceder al conteo. Los diferentes mtodos de captacin de contaminantes biolgicos son: Sedimentacin: Consiste en ubicar cajas petri, que contengan medios de cultivo adecuado, en aquellas zonas escogidas para el muestreo. Tras el periodo de muestreo se recogern las placas y se procesarn segn las tcnicas analticas microbiolgicas ms apropiadas Recogida en medio acuso: Consiste en hacer borbotear un volumen de aire a travs de una solucin isotnica contenida en un frasco lavador y la posterior determinacin cuantitativa por los mtodos microbiolgicos habituales. Filtracin: Consiste en filtrar un volumen de aire a travs de filtros de gelatina, incubndolos posteriormente sobre medios de cultivo apropiados. Impactacin: Se basa en la retencin de microorganismos libres o de microorganismos aerotransportados, adheridos a partculas de polvo, en placas que contengan medios de cultivo, ejemplos: recolector Andersen, Recolector RCS (Reuter Centrifugal System), SAS (Surface Air System).

2.1.2 MUESTREO DE SUPERFICIE Esta fase tienen un inters especial puesto que permite determinar la posible contaminacin por agentes bilgicos de las materias primas, de los instrumentos de trabajo, las ropas, el mobiliario o los elementos de construccin que por sus caractersticas pueden convertirse en reservorios de agentes biolgicos. El anlisis de superficies, de lquidos o del polvo es necesario, puesto que la simple medicin ambiental puede, en ocasiones, dar como resultado la inexistencia de contaminacin microbiolgica, es decir, proporcionar falsos negativos. Este tipo de mediciones son importantes ya que permiten identificar los focos de contaminacin que es uno de los objetivos fundamentales en la evaluacin de la exposicin a agentes biolgicos.

Placa de contacto: Esta placa que contiene un medio de cultivo adecuado, e ligero exceso, se coloca sobre la superficie a muestrear, presionando sobre la misma y mantenindola inmvil durante el contacto. Frotis(Swab-rinse): Este mtodo se basa en la utilizacin de hisopos estriles, que nos permiten muestrear zonas de difcil acceso para las placas de contacto. Dichos hisopos se colocan posteriormente sobre un medio de cultivo adecuado.

2.1.3. MUESTREO DEL PERSONAL Se busca disminuir otra de las formas de contaminacin como es el contagio a travs de manos y cabello. Tambin debe realizarse cada 2-4 meses estudios mdicos como son: coproparasitoscpico, reacciones febriles y exudado farngeo (ya que una forma importante de transmisin de patgenos son las gotitas de saliva al hablar, toser o estornudar); por lo cual es importante el uso de cofia y guantes. En la mayora de los mtodos de muestreo comentados el soporte en que se recogen los contaminantes es una placa que contiene un medio de cultivo que permitir el crecimiento de los contaminantes biolgicos captados. El medio de cultivo es el material donde se multiplicarn los microorganismos formando colonias, por lo tanto, deber reunir las condiciones que permitan y favorezcan su desarrollo. En una muestra, ya sea ambiental, de agua o de un material, van a coexistir muchos microorganismos diferentes con requisitos vitales distintos. El cultivo de esa muestra en una placa con un medio de caractersticas determinadas harn que otros muchos pasen inadvertidos. Existen diferentes variedades de medios de cultivo en funcin del objetivo del anlisis. Por ltimo es indispensable el analizar el tipo de microorganismos para su aislamiento, e identificacin para poder proponer la descontaminacin del rea y posteriormente volver a sondear para verificar que la zona este libre. Lo importante del monitoreo ambiental en cuanto a la industria, es que la vigilancia proporcione informacin a tiempo para que se adopten medidas correctivas con el objeto de recuperar el control del proceso antes de que sea rechazado el producto.

2.2. OBJETIVOS Identificar posibles fuentes de contaminacin en diversas zonas del laboratorio, por medio de un monitoreo ambiental para poder constatar la limpieza de ste para proponer medidas de correccin en las reas que lo ameriten. Monitorear al personal, tomando muestra de manos, cabello y boca, para determinar si estn libres de microorganismos (bacterias u hongos).

2.3 MATERIAL

EQUIPO Estufa de incubacin Microscopio ptico

VIDRERIA Y OTROS Portaobjetos Ansa bacteriolgica

MEDIOS DE CULTIVO Agar SDA Agar AST Agar sangre Caldo nutritivo

REACTIVOS Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Agua estril Aceite mineral Aceite de inmersin

2.4 DIAGRAMA DE TRABAJO Analizar posibles focos de infeccin en el laboratorio

Mesas

Estufa incubadora

Personal

Refrigerador

Aire

Delimitar 20 cm2 de la mesa

Frotar el rea delimitada con un hisopo estril humedecido en caldo nutritivo.

Colocar una caja de agar SDA y una caja de agar AST destapadas, en el nivel medio de cada uno de los equipos.

Frotar el rea de las paredes, rejillas zonas sospechosas utilizando un hisopo estril humedecido en caldo nutritivo.

Colocar una caja de agar SDA y una caja de agar AST, destapados en los pasillos durante 30 minutos.

Una vez tomada la muestra sembrar en una caja de agar SDA y en en una caja de agar AST, utilizando la tcnica de masivo.

Una vez tomada la muestra sembrar en una caja de agar SDA y en en una caja de agar AST, utilizando la tcnica de masivo.

Desinfectar el rea y repetir la operacin, utilizando hisopo y cajas nuevas.

Incubara 37 C Durante 24hr.

Proponer una solucin para desinfectar la zona

Realizar conteo de colonias y tincin de gram

Determinar si cumple con los lmites establecidos

2.4.1 DIAGRAMA DE TRABAJO

PERSONAL

Manos

Boca

Cabello

Colocar directamente las manos sobre una caja de agar AST y sobre una caja de agar SDA.

Hablar de frente a una caja de Agar sangre

. Hablar de frente a una caja de Agar sangre utilizando un cubrebocas

Obtener un cabello desde la raza y colocarlo sobre un medio de agar AST y en un medio de agar SDA

Incubar a 37C durante 24 hr.

Realizar gram

Determinar si el personal est libre de microorganismos

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.

NOMBRE DE LA PRCTICA Fecha de la Prctica NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS

MONITOREO AMBIENTAL No. de Prctica

MONITOREO Mesa sin desinfectar

UFC/cm2

MORFOLOGA MICROSCPICA

Mesa desinfectada Refrigerador (cajas abiertas) Refrigerador (hisopado) Estufa incubadora (cajas abiertas) Estufa incubadora (hisopado) Aire Cabello Boca sin cubrebocas Boca con cubrebocas FIRMA DE REVISIN

2.5.

DISCUCIN

___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 2.7 CONCLUSIONES

___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

REFERENCIAS

ITACA (Iteractive Training Advanced Computer Application, S.L.), Riesgos qumicos y biolgicos ambientales, Marcombo ediciones tcnicas, (2006), Barcelona Espaa, 165pp. Ramrez Trejo Violeta, Elaboracin de procedimientos normalizados de operacin requeridos para el control microbiolgico de medicamentos estriles, (2009), tesis de licenciatura Q.F.B., UNAM, Mxico. http:www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/105/8.html

Prctica No. 3 Evaluacin de Medios de Cultivo

3.1 INTRODUCCION
Un medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar a los microorganismos in vitro, as como efectuar pruebas de susceptibilidad. El desarrollo de las tcnicas de crecimiento de microorganismos en medios slidos y de obtencin eficaz de cultivos puros se debi a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo esencial en todas las reas de la microbiologa. Gran parte de la Microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio a travs de medios especiales de cultivo para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos, analizar agua y alimentos, en microbiologa industrial y otras actividades. Los microorganismos necesitan fuentes de energa y la composicin precisa de un medio adecuado depender de la especie que se quiere cultivar, debido a que las necesidades nutricionales varan considerablemente y pueden ser elementales (para su composicin celular) energticas (satisfacen las reacciones oxido-reduccin) o especficas (compuestos que deben ser proporcionados porque no se encuentran en sus vas sintticas). Adems de los nutrientes los medios de cultivo deben reunir condiciones fsico-qumicas especficas de actividad de agua, pH, potencial de oxido-reduccin (E0), condiciones de isotona. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en particular se cultivan sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus propiedades o la utilizacin de ellas en condiciones controladas. 3.1.1 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Principalmente se clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes microorganismos en: Bsicos o Generales: Contienen los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo o agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticasena soya. Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el desarrollo de microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre, agar chocolate, agar suero, entre otros. De enriquecimiento: Para aumentar la propagacin de ciertos microorganismos sin favorecer el desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias: Ejemplo son caldo selenito de sodio y cistena, caldo tetrationato, agar yema de huevo mas leche, etc. Selectivos: Se incorporan sustancias inhibidoras de la propagacin de un grupo de bacterias, pero permiten el crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo, eosina-azul de metileno y MacConkey.

Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico que toman sus colonias. Ejemplo de estos medios son el agar sangre, MacConkey. De transporte: se utilizan en el envo de muestras al laboratorio, ms comunes son: Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio Carry-Blair. Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular un crecimiento abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de Dorset. Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh Leiffson, medio para MR-VP y los que prueben algn azcar.

3.1.2 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El control de calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluacin sistmica del trabajo para asegurar que el producto final se ajuste a un grado aceptable a lmites de tolerancia previamente establecidos, donde finalmente se proporcionen resultados verdicos y permite que se acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores de productos comerciales. La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas. Para realizar el control de calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los siguientes puntos bsicos: a) Personal: debe ser capacitado en el rea especfica y con un entrenamiento prctico. b) Material de vidrio: debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes, ya que la presencia de stos puede afectar los resultados. c) Materia prima: debe presentar caractersticas homogneas en el tamao de partcula, color y no presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio, frasco de vidrio mbar, composicin completa en la etiqueta, debe precisar fecha de caducidad, indicacin clara de la preparacin, as como el nmero y lote. El control de calidad para los medios de cultivo debe, en el anlisis final, asegurar que un medio respalde el desarrollo de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos comensales, exhibir una respuesta bioqumica tpica, ser estable y tener un tiempo de conservacin razonable. 3.1.3 PRUEBAS QUE SE REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO Esterilidad. La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es determinada por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes para todos los productos comerciales usados y debe efectuarse con varios tubos o frascos de cada lote. Se realiza particularmente para aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego de la esterilizacin, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos que pueden suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias; sin embargo, pueden aparecer microorganismos viables al subcultivar. Los parmetros a evaluar son aspecto fsico como signos de deterioro, decoloracin, turbidez, cambios de color o estado de hidratacin.

Pruebas de promocin e inhibicin de crecimiento Para determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo inoculado con una concentracin baja que nos permita ver la funcionalidad del medio, considerando que un error frecuente del control de calidad es el uso de un inculo concentrado que puede producir un desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta prueba, mediante el empleo de una tcnica que nos ayude a dicho propsito como la tcnica de Miles & Misra. Esta tcnica es una de las ms empleados para medios slidos, la cual consiste en sembrar una suspensin de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una placa, divida en cuadrantes; la suspensin debe ser de 0.02 ml, y adicionada en cada cuadrante, de cada una de las diluciones del cultivo. Despus de la incubacin de la caja, se cuenta con el nmero de UFC que crecen en cada dilucin. 3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Medicina Humana y veterinaria, se efectan investigaciones microbiolgicas en el diagnstico de infecciones y para el control de las medidas teraputicas que le siguen. Industria Farmacutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben cumplir con una especificacin microbiolgica establecida de acuerdo a la Farmacopea respectiva. En consecuencia, el control de calidad microbiolgico es una fase importante en el proceso de produccin. Industria Cosmtica, debido que casi todos estos productos contienen sustancias biolgicas activas y por ello pueden contener microorganismos patgenos. Industria Lctea, la leche cruda es un medio de cultivo ideal para numerosos microorganismos. Industria Crnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones microbiolgicas y para la deteccin de residuos de antibiticos, si un animal ha estado tratado con antibiticos antes del sacrificio. Industria Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse debido a la presencia de microorganismos. Su tratamiento est sometido a reglamentaciones particularmente estrictas.

3.2 OBJETIVO GENERAL

Al finalizar la prctica el alumno deber: Evaluar medios de cultivo, por medio de la promocin e inhibicin de crecimiento microbiano para determinar si los medios de cultivo son viables.

3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES Aplicar la tcnica de Miles & Misra, por medio de la inoculacin de cepas ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar si los medios de cultivo son viables. Comprobar si la morfologa colonial obtenida en cada uno de los medios de cultivo es especfica de los microorganismos tipo empleados.

3.3 METODO EXPERIMENTAL 3.3.1 MATERIAL

4.3.1.1 EQUIPO Microscopio ptico Estufa de Incubacin Vortex Asa bacteriolgicas calibradas de 0.01 y 0.001 ml Mecheros Bunsen 3.3.1.2 MATERIAL DE VIDRIO Tubos de ensaye de fondo plano Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml Porta objetos planos Cubre objetos Tubo 0.5 del Nefelmetro de Mac Farland 3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo) Agar Sangre (AS) Agar Chocolate (ACh) Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB) Agar Cetrimida (AC) Agar sales Manitol (ASM) Agar McConkey (AMc) Agar Dextrosa Saboraund (ADS) Agar Salmonella-Shigella (SS) 3.3.1.4 CEPAS ATCC # COLECCION Salmonella enteritidis Enterobacter aerogenes Staphylococcus aureus Pseudomonas aureginosa Cndida albicans Streptococcus -hemoltico grupo A Escherichia coli Shigella 3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS OF Nitratos MR VP KIA SIM Urea Citratos MIO Arginina Malonatos LIA 3.3.1.6 REACTIVOS Glicerol Cristal Violeta Alcohol etlico al 70 y 90% Acetona Lugol

Safranina Aceite de inmersin Solucin Salina Fisiolgica (estril)

3.3.2 METODO EXPERIMENTAL

3.3.2.1 DETERMINACION DE LA DILUCION PARA LA TECNICA a) Sembrar las cepas de los diferentes microorganismos con un asa bacteriolgica 24 horas antes de la experimentacin. b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y posteriormente colocarlas durante menos de una hora en la estufa de incubacin a 37 C. c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y agregar 4.5 ml de SSF (estril). d) Preparar una suspensin de la cepa del microorganismo igualando la turbidez con el tubo nmero 0.5 del Nefelmetro de McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml e) Tomar de la solucin anterior un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlo a un tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilucin 10-1) f) Homogenizar la solucin en el vortex g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con SSF (Tubo 2 de dilucin 10-2) h) Homogenizar la solucin obtenida en el Vortex. i) Realizar los pasos hasta el tubo 5. 3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO a) Agregar 10 l de la dilucin para la tcnica de Control de Calidad en los diferentes medios de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente. Para realizar esta tcnica se debe emplear segn sea el medio de cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que debe diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por ltimo otro que no debe crecer (Cuadrante III) y el ltimo cuadrante se emplea como rea de esterilidad. b) Esperar a que la solucin anterior se difunda en el medio de cultivo, posteriormente realizar un barrido y/o estriado con una asa bacteriolgica y se incuba las cajas petri con los medios de cultivo en la estufa de incubacin a 37 C / 24 hrs. c) Realizar la lectura de las cajas petri (conteo manual), en donde el nmero de colonias debe oscilar entre 20-30 por cuadrante. d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un medio de referencia para asegurar el crecimiento del microorganismo, empleando la misma dilucin para cada una de las cepas de microorganismos empleados para comparacin de la recuperacin bacteriana en los medios de cultivo evaluados y de referencia. NOTA: A continuacin se presenta un diagrama de flujo con base al diseo experimental.

3.4 DIAGRAMA DE FLUJO

3.5 RESULTADOS
UNIVERSIDADNACIONALAUTNOMADEMXICO. FACULTADDEESTUDIOSSUPERIORESCUAUTITLAN. LABORATORIODEMICROBIOLOGAFARMACETICA.
NOMBRE DE LA PRCTICA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.

Fecha de la Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS No. de Prctica

Nombre de la bacteria/Levadura Gram Catalasa Oxidasa O/F Otra prueba especificar CUENTA VIABLE. Dilucin Morfologa Colonial Tipo de Agar: _________________________________ UFC/mL

10-1

10-2

10-3

10-4

NOMBRE DEL AGAR MODO DE ACCIN

CONTROL DE CALIDAD. Parmetros a evaluar Promocin (--) Bacteria/Levadura Morfologa Colonial UFC/mL

Promocin (+)

Inhibicin

Esterilidad

PRUEBAS BIOQUMICAS. PRUEBA Microorganismo usado Cumple

3.6CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _________________________________________.___________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________._ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ ________________________________________.____________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________. FIRMA DE REVISIN

4.7 BIBLIOGRAFIA
BOLAOS, Carlos Alberto y ANACORETA, Inocencia Vargas. Tesis. Evaluacin de la Estabilidad de diferentes Medios de Cultivo preparados en condiciones estndar. FESC, 1999. COLLARD, Patrick. El desarrollo de la Microbiologa. Editorial Reverte. Barcelona, Espaa. 1990. COLLINS, C.H. Mtodos Microbiolgicos. 5 ed. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990. HERNNDEZ, Guadalupe. Tesis. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bacteriologa. FESC, 2000. KONEMAN, MD. Diagnstico Microbiolgico. 5 ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1999 MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Secretara de Salud. Direccin General de Epidemiologa. Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos Dr. Manuel Martnez Bez. Mxico DF, 1989. NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993. Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo. PRESCOTT, Lasing. Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Espaa, 1999.

PRCTICA No. 4 CONSERVACIN DE CEPAS INTRODUCCIN

Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validacin. Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son: ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia. NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania. As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210. Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de almacenaje, fecha de ltimo pase. En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos:

Caractersticas tpicas. Caractersticas estables. Reproducibilidad.

MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS.

Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser reproducidas despus. El medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el menor nmero de subcultivos. Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

CULTIVOS STOCK:
Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos". Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para evitar su potencial mutacin. Los dos mtodos ms importantes para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el ultracongelamiento.

LIOFILIZACIN: Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en leche

estril o similar, y se coloca en tubos con tapn de rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formacin de aerosoles. Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIENTO: Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en caldo

Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5 ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C. Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido. Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

CULTIVOS SEMISTOCK:
Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios. Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelacin y

son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos de 6 a 12 meses.

CONGELAMIENTO EN CONGELADOR CONVENCIONAL:

Se preparan tubos con tapn de rosca conteniendo agar soya tripticasa-cistena. Inocular el cultivo puro y jven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses.

CULTIVO EN CTA:
Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte pequeos crculos de papel encerado y colquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin. Prepare una suspensin de caldo nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por Volumen ) y 0.25% de cido ascrbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice en autoclave. Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y jven y coloque una gota del mismo con una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en una caja Petri. Con una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Pentaxido de fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a 35C y luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente.

SECADO EN DISCOS CON GELATINA:

Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas bacterias. En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo jven y bien desarrollado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o una aguja. Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos.

Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazn o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con tapn de rosca. Se esterilizan y luego se les hace solidificar en forma inclinada. Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a temperatura ambiente.

CONSERVACIN EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL: MANTENIMIENTO EN TIERRA ESTRIL:
Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas. Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1 hora. Haga una suspensin fuerte del microorganismo jven y esporulado y colquelo en el tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO:

Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados diariamente.

BACTERIAS RESISTENTES:
Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

BACTERIAS DELICADAS :
Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin. Despus de una serie de 6 pases consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

BACTERIAS ANAERBICAS:
Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado despus de esterilizar por autoclave. Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

HONGOS:
Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

CULTIVOS DE TRABAJO COMERCIALES:

Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras. Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo soya tripticasa e incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o agar sangre. Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metdico de pase de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo pase.

OBJETIVO
Conocer y aplicar las tcnicas de mantenimiento de un cepario bacteriano y de hongos, por medio de metodologa establecida en la literatura, para ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin.

MATERIAL Medios de cultivo y reactivos Cajas de agar soya tripticasa Cajas de agar sal y manitol Cajas de agar MacConkey Cajas de agar cetrimida Cajas de agar dextrosa Sabourou Tubos de OF Tubos de citratos Tubos de MR-VP Tubos de KIA Tubos de LIA Tubos de MIO Tubos de arginina Tubos de malonato Tubos de nitratos Tubos de urea Tubos con caldo nutritivo Tubos de carbohidratos Tubos con agua estril Tubos de dilucin con 5 ml de SSF estril Tubos de dilucin con agar base sangre inclinados Tubos de dilucin con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche
descremada Plasma de conejo Suero humano Perxido de hidrgeno Reactivo para oxidasa Reactivo de Erlich -naftol -naftilamina KOH 40% cido sulfanlico Aceite de inmersin

Aceite mineral estril Cristal violeta Lugol Alcohol/acetona Safranina

Vidriera y diversos
Pipetas graduadas estriles de 1 ml Pipetas graduadas estriles de 10 ml Tubo 0.5 del Nefelometro de MacFarland Microscopio compuesto Mechero/tablita Palillos estriles Asas bacteriolgicas Portaobjetos Cubreobjetos Plastilina Estufa bacteriolgica Refrigerador Congelador

Material Biolgico
Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Streptococcus faecalis Salmonella Typhi Pseudomonas aeuroginosa Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Klebsiella pneumoneae Candida albicans

DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificacin y conservacin de cepas.

Cepadesconocida

Realizarpruebasbioqumicas primarias

Sembrarpordilucin

Gram Catalasa Motilidad Oxidasa

OF

AgarSoya Tripticasena

Mediosselectivos ydiferenciales

Incubar24hrs/37C

Incubar 24hrs/37C
Registrareinterpretar resultados

Registrareinterpretar resultados.

Prepararsuspensin bacterianaigualadaal tubo0.5delNMF.

Realizarpruebas bioqumicassecundarias
Registrareinterpretar resultados

Inocularconunaasada2tubos conagarbasesangreinclinados

Colocar1ml.encaldoBHI con1%desacarosay1% delechedescremada.

Incubar812hrs/37Cyconservar

Auntuboinclinado agregarhastacubrir aceitemineralestrily mantenera2025C

Auntuboinclinado agregarhastacubrir aceitemineralestril yrefrigerara8C

ElcaldoBHIsecongela a10C

DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperacin e identificacin de cepas.

Cepaconservada

Eliminarelaceitemineral estrilaltuboinclinado incubadoatemperatura ambiente

Ambientaryeliminarel aceitemineralestrilal tuboinclinadorefrigerado

Descongelarelcaldo BHIcolocndoloa temperaturaambiente

Dividirentresunacajadeagar soyatripticasenaeinocularen cadaterciolascepasrecuperadas

Dividirentreslosmediosselectivosy diferencialeseinocularencadatercio lascepasrecuperadas

Incubar24hrs/37C

Crecimientoenagar soya tripticasa

Crecimientoenmedios diferenciales y selectivos

Registrareinterpretar resultados

Realizarpruebas bioqumicasprimarias

Realizarpruebas bioqumicassecundarias
Registrareinterpretar resultados

Gram

Oxidasa Motilidad

OF

Catalasa

Registrareinterpretar resultados.

7 ANALISISMICROBIOLOGICODEAGUA
7.1 INTRODUCCION

El agua empleada en la Industria Farmacutica, ya sea como aditivo en las diferentes formas farmacuticas o en las operaciones de limpieza de los equipos y reas, que participan en los procesos de produccin farmacuticos, debe cumplir ciertas especificaciones dependiendo el tipo de agua que se emplea y en los procesos de produccin que se utiliza. Se debe contar con un sistema de control que asegure y mantenga la calidad del agua desde que se recibe para su proceso de purificacin hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos) describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla muestra el agua usada en la industria farmacutica: 1
tipo de agua Agua Purificada uso El agua purificada es usada como un excipiente en la produccin de preparaciones oficiales, para limpieza de equipo y preparaciones de algunas soluciones farmacuticas. El agua purificada tiene requerimiento fsico, qumico y microbiolgico. Para obtener agua purificada se utiliza agua comnmente de la red municipal que es sometida a varias operaciones unitarias, como desionizacin, destilacin, intercambio inico, osmosis inversa, filtracin u otro proceso de purificacin. especificaciones pH: entre 5 y 7 Determinar los siguientes compuestos: Cloruros: 0.5 mg/l Sulfatos* Amonio: <0.03 ppm Calcio* Dixido de Carbono* Metales pesados* Sustancias oxidables* Nitratos: <0.2 ppm Slidos totales: <0.001% Carbono orgnico total: 500 ppb Conductividad* Lmites Microbianos No ms de 100 UFC/ml de mesfilos aerobios y ausencia de patgenos. Cumplir con todos los requisitos de agua purificada y pruebas de esterilidad.

Se usa en las preparaciones farmacuticas no parenterales. Esta agua no debe contener Agua Purificada Estril agentes antimicrobianos y debe estar envasada apropiadamente. Agua para la Fabricacin de Se usa como aditivo para . la fabricacin de Inyectables inyectables y para la limpieza de los equipos. Es producida a partir de agua potable y se purifica por destilacin u osmosis

Cumple con los requisitos de todas las pruebas indicadas en Agua Purificada y: Endotoxinas. Libre de endotoxinas. Lmites microbianos. Ausencia de patgenos

inversa.

El agua es un excelente vehculo para la transportacin de los organismos patgenos, especialmente los que existen en las aguas negras cuando ests no han sido bien tratadas. Los estragos causados por la proliferacin de estos grmenes hicieron que se tomaran medidas como la cloracin de los suministros de agua. Es preciso analizar el agua para determinar si es potable; el anlisis microbiolgico del agua es un procedimiento diseado para comprobar si una muestra de agua ha sufrido contaminacin de aguas negras, materia fecal; y por lo tanto, si contiene microorganismos patgenos al humano y/o animales. Los organismos en el agua estn generalmente diluidos a tal grado que la pequea muestra de agua a analizar estar muchas veces libre de todo patgeno. En este tipo de anlisis se trata de detectar aquellos microorganismos que son provenientes de aguas negras, materia fecal; los llamados coliformes.3 Las bacterias patgenas que causan ciertas enfermedades pueden sobrevivir al caer en el agua y ser transportadas, usando el agua como vehculo, de una persona a otra. La presencia de estos microorganismos en el agua origina una contaminacin de la misma y la hace impropia e insegura para su consumo. El grupo de los microorganismos Coliformes es el ms ampliamente utilizado en la microbiologa de los alimentos y en la industria farmacutica como indicador de prcticas higinicas inadecuadas. El uso de los Coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para: La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los alimentos. La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del equipo. La demostracin y la cuenta de microorganismos Coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o diferenciales.5
7.1 7.1.1 METODOS DE ANALISIS METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) se emplea para la determinacin de nmero de microorganismos viables, un procedimiento estadstico en el cual se elaboran diluciones especficas para alcanzar un punto de extincin. Generalmente se emplean rplicas, usualmente 3 a 10 de cada dilucin y se registra el patrn positivo o negativo. Para determinar en NMP de microorganismos presentes en la muestra original se emplea una tabla estadstica basada en la distribucin de Poisson.

En los diferentes procedimientos del NMP se emplean criterios variados para establecer las marcas positivas o negativas. En muchos procedimientos, un tubo se marca positivo cuando hay crecimiento visible (como aumento en la turbidez). Otros procedimientos emplean criterios ms cuantitativos, tales como un incremento en la concentracin de protenas o criterios diferenciales, como la produccin de cidos a partir carbohidratos o produccin de dixido de carbono, y de clorofila son tambin utilizadas para establecer una marca positiva en procedimientos para bacterias y algas respectivamente utilizando este mtodo. 7
7.1.2 CUENTA EN PLACA

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el recuento de termoflicos, psicroflicos y psicotrficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos y productos farmacuticos.8

7.2

MUESTREO DEL AGUA

En el anlisis microbiolgico, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta, los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamao o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o partida de donde provienen. La recoleccin de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma. Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideracin. Las condiciones de conservacin y transporte, tiempo comprendido entre la recoleccin de la muestra, su entrega al laboratorio, as como la realizacin del anlisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la poblacin microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos.
7.3 TECNICA ENZIMATICA

7.3.1 Ready cult: La identificacin bacteriana se realiza determinando la actividad enzimtica especfica, se evidencia por un cambio de color o emisin de fluorescencia en un medio de cultivo especifico.

SUSTRATOS CROMOGENICOS X - GAL MUG

ENZIMAS - D - Galactosidasa - D - Glucoronidasa

Para la determinacin de los Coliformes totales la enzima - D Galactosidasa degrada al sustrato X-GAL produciendo una coloracin azul-verde, para determinacin de Coliformes fecales la enzima - D Glucoronidasa degrada al sustrato MUG produciendo fluorescencia.

7.4

OBJETIVOS EL ALUMNO IDENTIFICARA LOS PRINCIPALES MICROORGANISMOS OBJETABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO, POR LA TECNICA DEL NMP Y LA TECNICA ENZIMATICA DE READY CULT. EFECTUAR LA TOMA DE MUESTRA, SU PREPARACION Y ANALISIS MICROBIOLOGICO PARA LA IDENTIFICACION Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA DE AGUA. MATERIAL

7.5

7.5.1 EQUIPO Bao Mara Autoclave Estufa de Incubacin Refrigerador Microscopio ptico 7.5.2 MATERIAL DE VIDRIO Pipetas graduadas de 1 ml (estriles) Pipetas graduadas de 10 ml (estriles) Cajas de petri (estriles) 7.5.3 MEDIOS DE CULTIVO 1 Agar Mc Conkey (AMc) Agar Cuenta Estndar 1 Agar Cetrimida (AC) 6 tubos con Caldo rojo de fenol Lactosado concentracin simple (CRFL) 3 tubos con Caldo rojo de fenol Lactosado concentracin doble 7.5.4 REACTIVOS Kit paraTincin de Gram Rojo de metilo Reactivo de Kovac -Naftol 5% Perxido de Hidrgeno Agua destilada KOH

4 tubos con Caldo Lactosado bilis verde brillante (CBVB) 1 tubo con Caldo Soya Tripticasena 1 Citratos 1 SIM 1 Rojo de metilo 1 Vogues Proskauer 2 Medio O/F

7.6

METODOLOGA

MUESTRA DE AGUA

MESOFILOS AEROBICOS

DETERMINACION DE Pseudomonas

Se colocan 4 cajas petri estriles

En un tubo con 5 mL de Caldo Nutritivo se agregan 5 mL de la muestra de agua

Agregar 1 mL de la muestra en cada caja.

Incubar de 24-48 hrs a 37C

Agregar 25 mL de Agar Cuenta Estndar

Si el tubo esta turbio se siembra en Agar Cetrimida

Homogeneizar. 6 vueltas a la derecha y 6 a la izquierda

Se realizan pruebas bioqumicas para Identificar Pseudomonas

2 cajas se incuban 37C /24-48 hrs

2 cajas se incuban 25C /24-48 hrs

Determinar el NMP

7.7

RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.
NOMBRE DE LA PRCTICA Fecha de la Prctica NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS ANALISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA No. de Prctica

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA MUESTRA TOMADA EN: Fecha/Lugar de la toma. APARIENCIA MESFILOS AEROBIOS Caja 01 Caja 02 NUMERO MS PROBABLE NMP No. de Serie 24 hrs Cambios despus de la Incubacin 48 hrs 72 hrs UFC/mL UFC/mL Promedio.

01

02

03

Pseudomonas spp. Medio de Cultivo Morfologa colonial

Ready Cult Turbidez y cambio de color Fluourescencia Prueba del Indol

CONCLUSIONES. _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ FIRMA DE REVISIN

ESPECIFICACIONES

Prueba Mesfilos aerbicos Coliformes Totales Coliformes Fecales Determinacin de Pseudomonas

LIMITES PERMISIBLES Menor a 100 UFC/Ml Menor a 2 UFC/mL de agua Ausentes Ausentes

BIBILOGRAFIA: 1 FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS. 7 ed. Secretara de Salud. Mxico, 2000 3 BRADSHAW, Jack. Microbiologa de Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, DF. 1990 4 MANUAL DE TRATAMIENTO DE AGUAS. Departamento de Sanidad del Estado de Nueva York, Albany. 8 ed. Editorial Limusa. Mxico, DF. 1990 5 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de microorganismos Coliformes totales en placa. 6 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-112-SSA1-1994. Determinacin de bacterias Coliformes. Tcnica del nmero ms probable. 7 RHEINHEIMER, Gerhard. Microbiologa de las Aguas. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990. 8 NORMA 7OFICIAL MEXICANA. NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

Productos Farmacuticos No Estriles. Objetivo. Conocer y manejar los procedimientos establecidos en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos a travs de su ensayo en productos farmacuticos no estriles para asegurar la calidad de estos. Introduccin. Los productos farmacuticos considerados como no estriles que se fabrican son: tabletas, grageas, cpsulas, comprimidos, supositorios, vulos, jarabes, elixires, emulsiones, suspensiones, cremas, geles, pomadas, ungentos, soluciones, y deben de cumplir con las buenas prcticas de fabricacin. La presencia de una gran variedad de levaduras, hongos y bacterias en productos farmacuticos pueden ocasionar una serie de problemas como: la descomposicin del principio activo, ruptura de la emulsin, cambios en el color, olor y consistencia, y daos al paciente. Cada materia prima presenta caractersticas independientes y dependiendo de su origen (animal, vegetal y/o sinttico) son aprovechadas por los microorganismos como sustratos. En estas materias primas las bacterias, hongos y levaduras pueden: Mantenerse viables. Desarrollarse. Ha de saberse que cada una de las materias primas presenta diferentes lmites microbianos, tal y como se demuestra en la farmacopea indicada. Por otra parte los anlisis microbiolgicos debern de ser minuciosos y brindar una cuantificacin del estatus microbiano de la muestra obtenida. La importancia de la presencia de microorganismos en los productos no estriles debe ser evaluada en trminos de uso y de la naturaleza del medicamento. La USP sugiere que cierta categora de productos sean analizados de rutina para determinar cuenta total microbiana y contaminantes microbiolgicos especficos. Las formas farmacuticas no estriles deben de cumplir con normas oficiales NOM-059 -SSA1-1994, NOM-073-SSA1-1993; respecto a la cantidad y tipo de microorganismos que puedan contener. Los requisitos generales de calidad microbiolgica son los siguientes:

Cuenta Total de Bacterias mesfilas aerobias Cuenta Total de Bacterias anaerobias Cuenta Total de Hongos y Levaduras Identificacin de Microorganismos Patgenos Objetables Materiales. Equipo: Bao Maria Estufa bacteriolgica Refrigerador Autoclave Microscopio ptico Instrumentos de vidrio Pipeta graduadas de 1 y 10 ml estriles. Probeta graduada de 100 ml estril Porta objetos y cubre objetos Medios de cultivo Botella de dilucin con 90 ml de caldo soya tripticasena Botella de dilucin con 90 ml de caldo tioglicolato Agar soya tripticasena Agar dextrosa Saboraud Agar Sales Manitol Agar MacConkey Agar Cetrimida Agar Letheen Reactivos Safranina Lugol Cristal violeta Aceite de inmersin Azul de algodn Agua destilada Buffer de fosfatos pH= 7.2 Solucin salina fisiolgica

Diagrama de trabajo Dilucin de la -muestra. Muestra Revisar estado Fsico

Muestras viscosas calentar en bao mara a 45 C

Pesar o medir el equivalente a 10 g o 10 m.

Colocar una muestra en cada uno de los caldos: soya tripticasena y Tioglicolato.

Identificar cada uno de los caldos

Reservar el caldo soya tripticasena

Incubar 37 C por un periodo de 24-72 h

Revisar cada 24 h y registrar cambios

Mesfilos aerobios, Hongos y Levaduras; Microorganismos Objetables.

Botella de Dilucin Caldo Soya Tripticasena Hongos y Levaduras Mesfilos aerobios Microorganismos objetables

Tomar 4 ml del caldo soya tripticasena

Tomar 4 ml del caldo soya tripticasena

Tomar 0.1 de la muestra y estriar en cada uno de los medios

Adicionar de 20 a 25 ml de medio dextrosaSaboraud fluido (45 C)

Colocar cada 1 en cada una de las 4 cajas petri estriles

Agar Sales-Manitol Agar MacConkey Agar Cetrimida Agar Salmonella-Shigella

Colocar cada 1 en cada una de las 4 cajas petri estriles

Adicionar de 20 a 25 ml de medio Cuenta Estndar fluido (45 C)

Rotular cajas petri e incubar: 37 C/24-48 h

Homogeneizar la muestra, Dejar gelificar

Homogeneizar la muestra, Dejar gelificar Si existe crecimiento: Identificar colonias y realizar pruebas bioqumicas primarias y secundarias.

Rotular cajas petri e incubar: 2 cajas a 37 C/24 h 2 cajas a 25C/1 semana

Rotular cajas petri e incubar: 2 cajas a 37 C/24 h 2 cajas a 25C/24 h

Realizar conteo, obtener promedios

Realizar conteo, obtener promedios

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA. NOMBRE DE LA PRCTICA Fecha de la Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES No. de Prctica

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA NOMBRE LOTE CODIGO FECHA DE RECEPCIN AISLAMIENTO TIPO DE MEDIO CALDO SOYATRIPTICASENA CALDO TIOGLICOLATO 24 48 72 96

MESFILOS AEROBIOS Caja 01 Caja 02 HONGOS Y LEVADURAS Caja 01 Caja 02

UFC/mL

UFC/mL

Promedio.

UFC/mL

UFC/mL

Promedio.

PRUEBAS BIOQUMICAS PRIMARIAS GRAM INDOL ( NITRITOS ( ) LISINA (

) O/F ( ) RM ) ( VP ) CITRATOS ( ( MALONATOS ) UREA ) NOMBRE DE LA PRCTICA COAGULASA ) BILIS ESCULINA ) CAMP ( ) ( NOV 5g ( ) ( HIPURATO ) ( ( ( ( ( ) NITRATOS ( H2S ) GAS ) ( ( )

) ORNITINA ) ARGININA ( ( )

CATALASA ) OXIDASA ( ) MOTILIDAD )

FENILALANINA ( )

PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES. BACITRACINA 0.04 UI ) NaCl 6.5% ( ) (

OTRAS PRUEBAS

Carbohidratos GLU ( ARA ( ) SAC ( ) ADO ( ) ) FRUC ( MEL ( ) LAC ) ) SOR ) ( ( MAN ( DUL ) ( ) RAM ( MNL ( ) TRE ) ) RAF ) ( ( XIL ) ( )

SAL (

Otros carbohidratos:

MICROORGANISMO IDENTIFICADO.

CONCLUSIONES. ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________. ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________. ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________ FIRMA DE REVISIN

PRODUCTOS FARMACUTICOS ESTRILES

9.1 INTRODUCCIN Un producto farmacutico estril es el que se encuentra libre de microorganismos y pirgenos, y cuando es administrado no ocasiona una respuesta adversa por contaminacin microbiolgica. En este tipo de productos se eliminan todas las formas viables de microorganismos, por la realizacin de un proceso de esterilizacin en el cual las clulas microbianas o sus componentes se remueven o destruyen, de tal modo que ya no son detectables en medios de cultivo adecuados para su proliferacin. Un requisito fundamental para todo producto estril es que tenga la mxima calidad y ofrezca la mejor seguridad al paciente. Los productos farmacuticos estriles son diversos como: inyectables (sueros, soluciones, nutritivas, ampolletas, intramusculares, subcutnea, intravenosa), slidos estriles (polvos liofilizados para inyectables), ungentos (ticos y oftlmicos), lquidos (oftlmicos), etc. 1 La Norma Oficial Mexicana 056-SSA1-1993, establece una serie de caractersticas sanitarias que un rea de proceso para productos farmacuticos debe cumplir, tales caractersticas son: superficie adecuada (espacio suficiente para trabajar y limpiar cmodamente), acabados sanitarios (superficies lisas, eliminando ngulos de 45 y que resistan la accin de los sanitizantes), ventilacin apropiada (aire filtrado por filtros absolutos de ser requerido), extraccin eficiente (donde se genere calor, gases y/o vapores) e iluminacin suficiente (natural o artificial). 2,3 Las guas de la FDA (Federal Drug Administration) describen el procesamiento asptico como un proceso en que el producto, contenedor y tapones son sujetos a procesos de esterilizacin, sin embargo, al ser estas operaciones separadas, tienen sus correspondientes consecuencias (como riesgo de contaminacin) debido a que no hay cercana entre un proceso y otro para mantener la esterilidad del producto y en contenedor final. El trmino de rea asptica se define de manera sencilla como: Zona comprendida dentro de un rea limpia, diseada y construida para minimizar la contaminacin por partculas viables y no viables, mantenindola dentro de lmites preestablecidos 4 . Esta rea cuenta con un ambiente microbiolgico controlado, y est diseada de tal forma que permita una limpieza fcil y eficiente.

TESIS. Auditorias Tcnicas en la Industria Farmacutica. Alejandra Manzano Montiel. FESC, 2004

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin para Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica dedicados a la Fabricacin de Medicamentos. 3 GUIA DE PRCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM. Monografa Tcnica No. 1. Mxico DF, 1989.
4

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica dedicados a la Fabricacin de Medicamentos.

para

9.1.1 CLASIFICACIN DE LAS REAS ASPTICAS Las reas aspticas se clasifican en grado A, B, C y D de acuerdo con las caractersticas requeridas del aire. sta clasificacin se representa en la Tabla 9-1 Tabla 9-1 Clasificacin de los tipos de rea asptica usadas en la fabricacin de productos farmacuticos
estriles.

Para controlar el nivel de contaminacin microbiana de las distintas zonas de funcionamiento, deben monitorizarse las reas (Ver prctica Monitoreo Ambiental). Cuando se realicen operaciones aspticas, la monitorizacin debe ser frecuente utilizando mtodos como placas de sedimentacin, muestreo volumtrico del aire y de superficies (por ejemplo, hisopos y placas de contactos). Los resultados del monitoreo deben estudiarse al revisar la documentacin del lote para la liberacin del producto terminado. Las superficies y el personal deben supervisarse tras las operaciones crticas. Tambin es necesario realizar un monitoreo microbiolgico despus de la validacin de sistemas, limpieza y desinfeccin, etc. Este monitoreo es adicional y distinto al que se lleva de rutina en la produccin 9.1.2 AREAS DE FABRICACIN DE MEDICAMENTOS La fabricacin de medicamentos est sujeta a requisitos especiales para minimizar los riesgos de contaminacin microbiana, de partculas y de pirgenos. La garanta de calidad reviste una importancia especial y esta fabricacin debe seguir estrictamente mtodos de preparacin y procedimientos establecidos y validados cuidadosamente. La confianza en la esterilidad u otros aspectos de la calidad no debe basarse exclusivamente en un proceso final o en los ensayos sobre un producto terminado. Las diversas operaciones de preparacin de los componentes, preparacin del producto y llenado debern realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia. Las operaciones de fabricacin se clasifican en dos categoras: aquellas en que el producto se esteriliza al final y aquellas que se realizan aspticamente en todas o alguna de sus partes.

9.2 9.2.1

PRUEBAS MICROBIOLGICAS PRUEBAS DE IRRITABILIDAD

9.2.1.1 Pruebas de Irritabilidad para Medicamentos de Uso Oftlmico. Los productos oftlmicos son preparados estriles de acuerdo a las buenas prcticas de manufactura para garantizar su seguridad y efectividad por lo que deben cumplir con la prueba de irritabilidad. Esta prueba se debe realizar no solo a colirios y pomadas oftlmicas sino tambin, a aquellos medicamentos de uso tpico que accidentalmente puedan introducirse al ojo (ungentos, cremas o soluciones que se apliquen en la cara). Se basa en la evaluacin de las reacciones oculares observadas despus de la administracin del producto oftlmico. Para la realizacin de la prueba se utilizan conejos albinos, adultos, sanos, de cepa adecuada y cuyo peso debe estar entre 1 a 3 Kg. Se deben mantener en jaulas individuales y aisladas, en condiciones de ventilacin, temperatura, iluminacin controlada. Los animales se deben emplear con una frecuencia no mayor de dos veces por semana, separando los ensayos consecutivos por un mnimo de tres das. Se aplican en el ojo derecho de cada uno de los conejos, 3 o 4 gotas del producto oftlmico en estudio y en el ojo izquierdo, el cual se toma como control, se aplica solucin isotnica de cloruro de sodio estril. Se observa la reaccin del ojo a los 5 minutos y a las 24 horas, despus de la aplicacin de unas gotas de fluorescena en los 5 dos ojos, detectando la respuesta con la ayuda de una lmpara de luz ultravioleta . Adems de estas pruebas realizadas in-vivo se pueden realizar tcnicas in vitro en huevos fertilizados (se mide la irritacin de la membrana corinica despus de administrar el medicamento), y existe la medicin de la irritacin de la cornea en ojos de ternera recin sacrificada. Todas estas tcnicas se encuentran en la NOM-039-SSA1-1993 Aunado a la tcnica realizada en conejos, se puede realizar pruebas de irritabilidad en piel de cobayos, e incluso se encuentran pruebas realizadas en piel de humano (prueba del parche)6. 9.2.1.2 Prueba de esterilidad. Las pruebas de esterilidad tal como estn descritas en la farmacopea, son adecuadas para revelar la presencia de formas viables de bacterias, hongos y levaduras. No contempla la realizacin de pruebas especficas para detectar virus, ya que estas tcnicas, para su cultivo son muy complicadas y estn limitadas a la deteccin de algunas especies. Todos los lotes de productos inyectables en sus envases finales deben probarse en cuanto a su esterilidad. La USP XXV describe los requerimientos oficiales que se deben cumplir. La FDA usa esos requerimientos como gua para probar productos estriles no oficiales. La prueba oficial principal se realiza por el mtodo de la filtracin, pero se utiliza transferencia directa si la filtracin por membrana es inadecuada. Esta prueba no pretende ser una evaluacin definitiva para un producto sometido a un proceso de esterilidad de eficacia desconocida, sino que est concebida en mayor medida como
5

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. Determinacin de los ndices de Irritacin Ocular, Primaria Drmica y Sensibilizacin

una prueba para verificar la probabilidad de que un procedimiento de esterilizacin convalidado con anterioridad se haya repetido, o para asegurar la continuidad de su eficiencia. Al realizar la prueba de esterilidad a un determinado nmero de unidades de un lote, si los resultados obtenidos son negativos, indican que la probabilidad de encontrar unidades contaminadas en la parte no analizada, es menor al nivel detectable sealado en los planes de muestreo utilizados. Ningn plan de muestreo puede asegurar que todas las unidades del lote se encuentren libres de microorganismos, por lo que la garanta de que el producto sea estril, se logra mediante la validacin del proceso de esterilizacin. La sensibilidad de esta prueba se ve afectada por la naturaleza del medio de crecimiento, por lo tanto debe realizarse utilizando medios de cultivo altamente nutritivos para que favorezcan el desarrollo de todos los microorganismos y esporas presentes en la muestra. Estos medio deben ser segn la USP de caldo tioglicolato, apropiado para bacterias y el digerido de soya Tripticasena para hongos y levaduras. Durante el desarrollo de la prueba esterilidad se deben tener las precauciones necesarias que eviten la contaminacin de la muestra para que esta mantenga sus caractersticas microbiolgicas originales. Una vez preparados y esterilizados los medios de cultivo y antes de ser utilizados, tienen que ser sometidos a un proceso de control de calidad para confirmar que realmente hayan quedado estriles y que no pierdan su capacidad de promover el crecimiento bacteriano. Si despus de incubar los tubos de tioglicolato a 30-35 C y los de digerido de soya Tripticasena a 20-25 C durante un perodo de 7 das, no presenta turbidez, se comprueba la esterilidad de los medios. La prueba de esterilidad es aplicable a medicamentos, materias primas, materiales de curacin y productos de uso clnico. Los medicamentos que deben ser estriles cuando el paciente adquiere son los parenterales, los oftlmicos y los ticos. La calidad microbiolgica de esos productos farmacuticos por dos tcnicas: 9.2.1.3 Mtodo de siembra directa Se aplica a productos que no contengan inhibidores del desarrollo bacteriano y todos aquellos que permitan apreciar fcilmente el crecimiento microbiano en los tubos, despus del perodo de incubacin. Los ungentos o lquidos oleosos, debern esparcirse y los slidos debern disolverse en diluyentes estriles que no inhiban el desarrollo bacteriano y con esta solucin se realizan los inculos correspondientes. La prueba de esterilidad para gasa, algodn, y otros implementos quirrgicos, debe realizarse lavando el material con solucin isotnica estril la cual despus de arrastrar los microorganismos, se siembra en los medios especificados. La cantidad del inculo y de medio depender del contenido del envase, pero nunca ser inferior a 1 ml y 15 ml respectivamente. Los tubos de tioglicolato inoculados se incuban durante 14 das a 30-35 C y los de digerido de soya Tripticasena a 20-25 C 6 .

PRADEU. Anlisis Qumicos Farmacuticos de Medicamentos. Editorial Limusa. Mxico DF.1998

9.2.1.4 MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA La prueba de esterilidad realizada por la tcnica de filtracin por membrana, es aplicable a aquellos productos estriles que pueden inhibir el desarrollo bacteriano, a los polvos insolubles, a las presentaciones parenterales de grandes volmenes y prcticamente a cualquier tipo de muestra. El equipo de filtracin soporta una membrana, la cual debe tener una porosidad de 0.45 micras, en la cual quedarn retenidas todas las formas viables y esporuladas de microorganismos, una vez que la muestra pase a travs de ella. La unidad completa deber esterilizarse en autoclave antes de ser utilizada; se conecta a un sistema de vaco para facilitar el paso de la muestra. Para el desarrollo de la tcnica se requiere agua destilada estril para disolver la muestra y solucin de enjuague del artculo o muestra problema; generalmente se utiliza solucin peptonada al 1% o solucin salina isotnica de NaCl. Para muestras de lquidos miscibles en agua, la prueba se llevar a cabo vaciando dentro del recipiente de filtracin de una manera asptica, el contenido de los envases, aplicando vaco para favorecer el paso del lquido a travs de la membrana. Si la solucin contiene inhibidores del desarrollo bacteriano, se enjuaga el filtro con varias porciones de peptona al 1 % para eliminar cualquier residuo que pudiera permanecer en la membrana y afectar el resultado de la prueba. Ya drenado el lquido, se separa la membrana y sostenindola con pinzas estriles especiales se corta en dos, introduciendo cada una de las mitades en los tubos del medio Caldo de tioglicolato y en digerido de soya Tripticasena, respectivamente. Los tubos se incuban a 30-35 C y a 20-25 C durante un perodo de tiempo no inferior a 7 das. 9.2.1.5 Prueba de Pirgenos Los pirgenos son productos del metabolismo celular presentes en artculos farmacuticos que han estado en contacto con algn tipo de contaminacin microbiana, los cuales al entrar al torrente sanguneo pueden provocar reacciones febriles. De acuerdo a la capacidad inherente de producir pirgenos, las bacterias se han clasificado en cuatro grupos: I Aquellas cuyos productos metablicos no tienen efecto en la temperatura II. Las que causan fiebre ligera durante un tiempo corto III. Las que causan un incremento marcado en la temperatura durante varias horas IV. Las que matan a los conejos o les producen colapso Los pirgenos ms potentes son los producidos por las bacterias coliformes de los gneros Salmonella y Pseudomonas. El proceso de esterilizacin por calor usado (cuando sea el caso) en la fabricacin de medicamentos estriles no elimina la presencia de pirgenos en las soluciones parenterales, deben seguirse las buenas prcticas de manufactura durante la fabricacin de los productos, para asegurar que cumplan con los requisitos de calidad establecidos para este ensayo. La prueba de pirgenos oficial est diseada para mantener un nivel aceptable de riesgo de reaccin febril en los productos farmacuticos; se efecta en conejos, en la cual se evala la elevacin de la temperatura

corporal, despus que se les ha administrado por va intravenosa, la dosis especificada de acuerdo en la norma de cada producto. La temperatura corporal del conejo ser determinada por va rectal introduciendo un termmetro o termopar; no se debern usar conejos que tengan una temperatura basal superior a 39.8 C y que presenten una variacin entre ellos de ms de 1 C. La temperatura basal control de cada uno de los tres conejos utilizados, debe registrarse 30 minutos antes de la administracin de la dosis problema en la vena marginal de la oreja del conejo, y debe ser verificada a la primera, segunda y tercera hora despus de la inyeccin. El producto cumple con la prueba de ausencia de pirgenos si ninguno de los conejos muestra un incremento individual igual o superior a 0.6 C respecto a su temperatura control y si la suma de los tres incrementos individuales ms altos, no excede de 1.4 C. 9.2.1.6 PRUEBA DE Amebocitus de Limulus Para asegurar que las soluciones parenterales sean apirognicas, las compaas farmacuticas han utilizado por ms de 40 aos, la prueba oficial de pirgenos que marca la FEUM. En los ltimos aos se han desarrollado una prueba de pirgenos in Vitro por medio del reactivo de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL), la cual permite estimar con gran sensibilidad y rapidez, la concentracin de endotoxinas procedentes de la pared celular de bacterias G (-) en un producto farmacutico. Esta determinacin ha demostrado ser 10 veces ms sensible que la obtenida por reaccin febril del conejo. La prueba de LAL est basada en la aglutinacin producida cuando las endotoxinas bacterianas se combinan con un preparado que contiene el lisado. Para la realizacin de la prueba de LAL se deben de combinar cantidades especficas de la solucin del ensayo y del Lisado diluido de Amebocitos (1:1 con buffer de fosfatos pH=7.2), incubando la mezcla a 37 C durante una hora. Si la solucin contiene endotoxinas, se produce un gel o aumento de viscosidad en la mezcla. La velocidad de reaccin entre el Lisado y la endotoxina depende de la concentracin, de la temperatura y del pH6.

9.3

OBJETIVOS

9.3.1

GENERAL

Evaluar a los productos farmacuticos considerados como estriles, mediante mtodos oficiales, para determinar si cumplen con la normatividad vigente.

9.3.2

PARTICULARES

Realizar las pruebas oficiales para productos farmacuticos estriles para consumo humano y/o animal.

Determinar si los productos evaluados estn libres de agentes patgenos.

Identificar los puntos crticos de riesgo que puedan ser fuente de contaminacin en la fabricacin de los productos considerados como estriles.

9.4 9.4.1

DESARROLLO EXPERIMENTAL MATERIAL DE VIDRIO Portaobjetos planos Cubreobjetos Tubos de ensaye grandes Pipetas graduadas de 1, 5, 10 ml Botellas de dilucin (leche)

9.4.2

MATERIAL DIVERSO

Gradilla para tubos de ensaye Pinzas de diseccin (estril) 9.4.3 EQUIPO

Autoclave Estufa de incubacin Refrigerador Filtracin con membrana 9.4.4 MEDIOS DE CULTIVO EN TUBO O BOTELLA (por equipo)

Caldo Tioglicolato (CT) Caldo Soya Tripticasena (CST)

9.4.5 REACTIVOS

( 10 tubos o 4 botellas por equipo) (10 tubos o 4 botellas por equipo)

Solucin Salina Fisiolgica (estril) Todos los necesarios para pruebas bioqumicas secundarias. 9.4.6 MUESTRAS Formas Farmacuticas estriles (indicadas por los profesores)

DIAGRAMA DE TRABAJO EXPERIMENTAL 9.4.6.1 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

9.4.6.2 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR MEMBRANA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

9.5

RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.
NOMBRE DE LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS ESTRILES.

Fecha de la Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS

No. de Prctica

CRECIMIENTO CST (hrs) PRUEBA ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA ESTERILIAD POR MEMBRANA 24 48 72 96 120 144 168 192 384

CRECIMIENTO CT (hrs) PRUEBA ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA ESTERILIAD POR MEMBRANA 24 48 72 96 120 144 168 192 384

MEDIO DE CULTIVO

COLONIAS

OBSERVACIONES (CAMBIO DE COLOR, COAGULACIN, ETC)

INTERPRETACIN

BIOQUIMICAS (SI ES EL CASO)

MICROORGANISMO(S) IDENTIFICADO(S).

CONCLUSIONES. _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ FIRMA DE REVISIN

9.6

BIBLIOGRAFA CEJUDO, Blanca y GARZON, Ma. de Lourdes. Control Biolgico para Productos Farmacuticos. Departamento de Sistemas Biolgicos. Divisin de C.B.S. UAM Xochimilco, 1993. GUIA DE PRCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM. Monografa Tcnica No. 1. Mxico DF, 1989. MANZANO, Alejandra. Tesis. Auditorias Tcnicas en la Industria Farmacutica. FESC, 2004. NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. Determinacin de los ndices de Irritacin Ocular, Primaria Drmica y Sensibilizacin NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-056-SSA1-1993. Requisitos Sanitarios del Equipo de Proteccin Personal.