Peso molecular de natural tanasa

Cromatografa de filtracin en gel con Sephadex G-200

V0 = 25 ml
Determinado utilizando Azul Dextrano 2000

Eluyente 0.05 M citrato-fofato 1 ml/min

La muestra que contiene protenas se recogieron en su volumen de elucin (Ve) y el grfico de Ve/Vo contra el logaritmo del peso molecular (Mw) se representan para la estimacin del peso molecular natural de tanasa.

Inmovilizacin
Amberlite IR 1204 Amberlite XAD 7 Celulosa DEAE Celite 500 mg 10,0 ml de 0,1 M de buffer citrato-fosfato(pH 5,0) t=2h T= ambiente

Enzima pp. =10 ml 100 rpm T= 42 C t=12 h.

Filtrar

El filtrado se analizo para la actividad de los restos tanasa y el contenido de protena. La eficiencia de inmovilizacin se determin en trminos de protena total adsorbida por gramo de soporte. La reutilizacin de la enzima tambin fue examinada.

3 lavados con buffer

CARACTERIZACIN DE TANASA

Temperatura ptima
Mezcla de reaccin

Ensayo enzimtico

Crudo

Purificado

inmovilizado

T = 25-100 C t = 30 min

Diluciones

Incubacin

Crudo y Purificado
0.5 M de buffer citrato-fosfato

Inmovilizado
100mg en 0.5 ml buffer citrato fosfato (0.01 M, pH 5)

Estabilidad de temperatura
Mezcla de reaccin

Crudo

Purificado

inmovilizado

Incubacin 0.5 M buffer citratofosfato T= 25-100 C t = , 1, 6, 12 y 24 h.

Ensayo enzimtico

Energa de activacin

pH ptimo
Mezcla de reaccin

Crudo

Purificado

inmovilizado

Incubacin cido tntico T= ptima = 50 C Buffers 0.5 M pH (3.0 11.0) Citrato-fosfato pH (3.0-5.0) Fosfato pH (6.0-7.0) Tris pH (8.0-9.0) Glicina NaOH pH (10.0-11.0)

Ensayo enzimtico

Estabilidad del pH
Mezcla de reaccin

Crudo

Purificado

inmovilizado

Incubacin

Buffers pH (3.0 -10) T= 37C t = , 1, 6, 12 y 24 h.

Ensayo enzimtico

Especificidad de sustrato
[0.01-0.06]g/L
cido tnico Galato de metilo Galato de propilo

Line-Weaver Burk
Km Vmax

Efecto de los tensoactivos

Mezcla de reaccin
Choleate de sodio Sodio taurochol eate Treton X100

Tensoactivos 1.0 ml

Crudo

Purificado

inmovilizado

Tween-80

Sodio dodecil sufate

Tween-60

Incubacin 10mg tanasa liofilizada (4U) Tensoactivos 1.0 ml t = 5.30 y 60 min

Ensayo enzimtico

Efecto de los disolventes orgnicos

Mezcla de reaccin
tetrahidr ofurano

Acetona
Tetraclor uro de crbono

Crudo

Purificado

inmovilizado

Tolueno

Disolvenes organicos

Formald ehido

Eter de petroleo

Heptano Etanol

Incubacin
10mg tanasa liofilizada (4U) Disolventes orgnicos 20% y 60% (v/v) t = 5 y 60 min

Ensayo enzimtico

Efecto de los inhibidores

Inhibidores

Mezcla de reaccin

Purificado

Incubacin 10mg tanasa liofilizada (4U) Inhibidores 1mM t = 5 y 60 min

Choleate de sodio cido brico de fenilo Cloruro de propanol B-marcaptoetanol cido bromoactico Ditiotreitol Cianamida cido benzoico de mercurio cido Yodoactico 1,10-fenantrolina fenil metil sulfonilo de fluoruro N-etilmaleimida 8-hydroxyquinona

Ensayo enzimtico

Periodo de validez

Crudo y crudo liofilizado de P. variable tanasa

t= 1 ao

T = 4 y 30 C

0, 7, 15, 30, 60, 120, 180, 240 y 365 das