Laporan Praktikum

Mikrobiologi Dasar

Disusun Oleh: KELOMPOK IX SHOFIYANI MUKARROMAH LESTARI IMANIYAH ALI TOPAN (073244022) (073244027) (053244049)

UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI 2009 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan tugas laporan praktikum mikrobiologi tepat waktu. Penyusunan laporan praktikum mikrobiologi ini selain

dimaksudkan untuk memenuhi tugas mata kuliah Mikrobiologi juga untuk memberikan sedikit pengetahuan tentang dunia mikroba. Penulis menyadari bahwa laporan praktikum mikrobiologi ini masih banyak kekurangan, sehingga saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan untuk lebih sempurnanya penyusunan laporan praktikum ini. Harapan penulis, semoga laporan praktikum mikrobiologi ini dapat memberikan manfaat dan nilai guna bagi penulis juga bagi pembaca.

Surabaya, 17 April 2009

Daftar Isi

Daftar isi BAB I PENDAHULUAN A Latar Berlakang B Tujuan Praktikum 1 2 3 4 Pembuatan Media Menangkap Mikroorganisme Isolasi Identifikasi a) Pewarnaan Sederhana b) Pewarnaan Gram c) Uji Katalase 5 6 7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A Pembuatan Media B Menangkap Mikroorganisme C Isolasi D Identifikasi 1 2 3 Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Uji Katalase Enumerasi Uji Resistensi Virus

E Enumerasi F Uji Resistensi G Virus BAB III METODE PRAKTIKUM

A Pembuatan Media B Menangkap Mikroorganisme C Isolasi D Identifikasi 1 2 3 Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Uji Katalase

E Enumerasi F Uji Resistensi G Virus BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A Pembuatan Media B Menangkap Mikroorganisme C Isolasi D Identifikasi 1 2 3 Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Uji Katalase

E Enumerasi F Uji Resistensi G Virus BAB VII SIMPULAN DAFTAR PUSTAKA

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Mikro biologi adalah ilmu yang mempelajari jasad hidup yang berukuran mikroskopis. Jasad hidup yang mikroskopis itu disebut dengan mikrobia, mikroorganisme, protista, atau jasad renik. Mikrobiologi sendiri memiliki beberapa cabang ilmu lain seperti bakteriologi yang khusus mempelajari bakteri, virologi yang khusus mempelajari virus, patologi dan lain-lain. Dalam kurikulum mata kuliah di Jurusan Biologi Unesa, mata kuliah mikrobiologi mempelajari bakteriologi, virologi dan mikologi. Mikroba terdapat dalam jumlah yang besar dan beranekaragamserta kosmopolit di alam ini. Mikroba redapat paling banyak di tempat tempat yang mengandung nutrisi, kelembaban dan suhu ayng sesuai dengan pertumbuhan dan reproduksinya. Mikroba ada yang menguntugnkan dan ada yang mreugikan bagi manusia. Banyak mikroba seperti virus dan baketri yang dapat mengakibatkan penyakit apabila masuk kedalam tubuh mahluk hidup lain seperti virus influenza, ada juga bakteri yang dapat menguntungkan manusia, seperti bakteri laktobasilus yang membantu dalam proses pencernaan. Oleh karena itu, pada praktikum mikrobiologi ini kita akan mempelajari berbagai aktivitas dari mikrobia yang meliputi: bakteri dan virus. Dengan menggunakan media dan teknik khusus, sehingga kita dapat mengidentifikasi mikrobia tersebut, serta mencoba menguji antibiotik yang bisa menghambat perkembangbiakan (resistensi) dari bakteri yang merugikan manusia. Serta dapat menginveksikan virus ke sel yang sesuai sehingga virus dapat bereproduksi dan dapat dimurnikan sehingga diketahui bentuk virusnya. B. Tujuan Tujuan dari pembuatan laporan ini adalah untuk melaporkan hasil dari kegiatan selama praktikum pada mata kuliah mikrobiologi, antara lain:

a) Mengetahui cara pembuatan media TA (Taoge Agar) sebagai media pertumbuhan mikroorganisme. b) Mengetahui cara menangkap mikrobia yang kemudian dibiakkan pada media TA dalam cawan petri. c) Mengetahui cara mengisolasi bakteri yang muncul pada media TA di cawan petri sehingga didapat 1 jenis mikrobia dalam satu media TA miring pada tabung reaksi tanpa adanya kontaminasi. d) Mengetahui cara mengidentifikasi bakteri yang sudah dibiakkan secara murni dengan menggunakan berbagai macam pewarnaan (pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, dan uji katalase). e) Mengetahui cara melakukan penghitungan (enumerasi) bakteri yang hidup. f) Mengetahui cara melakukan uji resistensi bakteri terhadap antibiotik dan mengetahuhui efektifitas antibiotik tersebut. g) Mengetahui cara memperbanyak dan memurnikan virus dengan menggunakan media hidup berupa ulat grayak (Spodoptera litura).

BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1.Media Penumbuhan Di lingkungan, terdapat berbagai macam jenis mikroba. Mikroba sangat sulit untuk diisolasi secara langsung dari habitatnya sehingga untuk melakukan isolasi tersebut harus menggunakan cara penangkapan mikroba terlebih dahulu, yaitu dengan cara menumbuhkan koloni mikroba pada cawan petri yang berisi medium agar (TA). Metode ini dilakukan dengan cara memadatkan medium agar pada cawan petri steril dan kemudian diinokulasikan menggunakan ose dengan cara menggoreskan mikroba pada medium sehingga nantinya akan terbentuk koloni bakteri yang terpisah (metode streak plate). Metode streak memiliki beberapa kelemahan yaitu proses penggoresan yang cukup lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi Langkah ini menggunakan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. dilanjutkan sehingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode streak, goresan di sisi pertama diharapkan koloni mikroba tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni yang lain. II.2.Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri merupakan usaha untuk mendapatkan biakan murni bakteri yang diharapkan berasal dari satu jenis koloni. Hal yang perlu diperhatikan dalam pemeliharaan bakteri adalah medium, yang merupakan sarana dalam menjaga kelangsungan hidup bakteri seperti karbon, nitrogen, mineral, hara dan air. Serta kondisi temperatur, pH, tekanan osmotik dan kondisi atmosfer. Untuk mengsiolasikan bakteri adalah dengan menginokulasikan koloni bakteri yang terpisah pada biakan campuran secara aseptik pada medium dalam cawan petri. Kemudian mengambil satu jenis bakteri dengan menggunakan ose dan diletakkan medium agar dalam tabung reaksi untuk dijadikan biakan murni (kultur murni) yang hanya terdiri dari satu jenis mikrobia. II.3.Identifikasi Bakteri Penampakan mikroba di dalamkehidupan sangatlah sulit, tidak hanya karena mereka sangat kecil tetapi juga karena mereka transparan dan praktis tidak berwarna ketika berada di dalam media cair. Untuk mempelajari kekayaan mikroorganisme dan untuk membedakan mikroorganisme ke dalam kelompok khusus untuk tujuan diagnosa, pewarnaan biologi dan prosedur pewarnaan dengan menggunakan mikroskop cahaya adalah peralatan utama dalam mokrobiologi. Mikrobia adalah organisme uniseluler yang tidak dapat dilihat strukturnya oleh mata telanjang. Namun dengan bantuan mikroskop kita dapat melihatnya. Tentu saja dengan cara dan teknik tertentu untuk mengamatinya. Identifikasi mikroba dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu: pewarnaan bakteri, pewarnaan gram, dan uji katalase dari bakteri tersebut. Yang dimaksud pewarnaan bakteri adalah bakteri diberi zat warna kimia agar mudah dilihat dan diperlajari. 1. Pewarnaan sederhana Mengamati mikroba dalam keadaan hidup adalah sangat sulit walaupun telah menggunakan mikroskop. Terutama pengamatan pada

sel bakteri. Sel bakteri ukurannya sangat kecil dan transparan. Oleh sebab itu dikembangkan metode pewarnaan. Bahkan hasil pewarnaan ini dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam, di antaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi. Dalam pewarnaan sderhana, teknik pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Kebanyakan sel bakteri dapat diwarnai dengan mdah menggunakan teknik pewarnaan ini karena sel bakteri bersifat basofilik (suka akan basa). Zat warna yang digunakan adalah zat warna yang bersifat basa sperti metylen blue, kristal violet, dan karbol fuchsin. Catatan waktu pembukaan pada masing-masing pewarna berbeda yaitu carbol fuchsin membutuhkan waktu 15 sampai 30 detik, kristal violet membutuhkan waktu 20 sampai 60 detik, dan metylen blue membutuhkan waktu selama 1 sampai 2 menit. Pada pewarnaan sederhana perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu sebelum zat warna dignakan dengan tujuan yaitu melekatkan sel pada gelas objek, membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai dari pada sel dalam keadaan hidup, mencegah terjadinya pecahnya sel kareana enzin yang ada di dalamnya, dan merubah daya ikat zat warna. Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan atau pengeringan secara dingin, sedang kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol atau bouin. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial yang sedikitnyamenggunakan tiga reagen kimia yang diaplikasikan pada preparat mikroskopis. Reagen pertama disebut pewarna dasar/primer yang fungsinya untuk mewarnai semuasel. Untukmendapatkan warna kontras, reagen kedua yang digunakan adalah agen dekolorisasi. Berdasarkan komposisi kimia dari komponen sel, agen dekolorisasi akan melarutkan zat warna primer dari sel secara keseluruhan atau hanya pada struktur sel tertentu. Reagen terkhir yaitu pewarna penutup yang merupakan pewarna kontras dari pewarna primer. Pada waktu dekolorisasi, apabila pewarna

primer tidak tercuci, warna penutup tidak dapat diserap dan sel beserta komponennya akan terwarnai oleh pewarna primer. Jika pewarna primer tercuci, maka komponene sel menjadi transparan dan akan terwarnai oleh pewarna penutup. (diserap). Gambar struktur sel gram positif dan gram negatif Dengan cara ini jenis sel atau struktur sel dapat dibedakan satu dengan lainnya berdasarkan warna yang tertinggal

Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri gram positif dan gram negtif. Teknik pewarnaan ini menggunakan empat macam reagen yang berbeda yaitu: a. Kristal violet (pewarna primer) yang digunakan pertama kali dan sel yang terwarnai akan berwarna biru keunguan (violet). b. Grams Iodine (mordant), yaitu merupakan substansi yang dibuat dari campuran larutan yang kompleks, untuk memperkuat ikatan pewarna primer. Hasil dari ikatan antara kompleks kristal violet dan iodine akan mewarnaia

sel secara intensiv. Semua sel nampak biru keunguan. Pada sel gram positif kompleks kristal violet dan iodine berikatan dengan Mg-RNA yang merupakan komponen dinding sel. Gabungan antara Mg-RNA-CV-I lebih susah dicuci dibandngkan dengan kompleks CV-I. c. Ethyl Alkohol 95% (agen pendekolorisasi), yaitu merupakan reagen yang mempunyai dua fungsi yaitu sebagai pelarut lemak dan sebagai agen pendehidrasi protein. Aksi ini dapat dideterminasi melalui jumlah lemak yang ada pada dinding sel bakteri. Pada sel gram positif, konsentrasi lemaknya rendah, hal ini menyebabkan kompleks Mg-RNA-CV-I tertahan karena dengan jumlah lemak yang sedikit akan mudah dilarutkan oleh alkohol. Pori yang terbentuk pada dinding sel oleh larutnya lemak kecil, sehingga akan tertutup oleh protein yang terdehidrasi alkohol. Akibatnya, pewarna primer susah dicuci dan sel menjadi berwarna biru keunguan. Pada sel garam negatif, kandungan lemaknya tinggi yaitu pada membran luar dinding sel, lemak ini akan dilarutkan oleh alkohol dan menyebabkan terbentuknya pori yang lebar. Pori ini susah ditutup oleh protein membran yang terdehidrasi. Hal ini menyebabkan ikatan kompleks CV-I lepas dan sel menjadi transparan. d. Sfranin (warna penutup), yaitu warna terakhir yang menyebabkan warna merah pada sel, terutama sel yang telah mengalami dekolorisasi. Pada sel gram negatif, setelah didekolorisasi, pewarna terakhir ini akan diserap. Pada sel gram positif, akan berwarna biru keunguan yaitu pewarna primer. Tahap yang paling kritis yang perlu diperhatikan dalam pewarnan gram adalah tahap dekolorisasi yang berdasarkan pada kemampuan CV-I lepas dari sel.

3. Uji Katalase Mikroorganisme serta reproduksinya. mampu merombak lingkungannya dan menggunakan bahan kimia sebagai sumber energi dan faktor pertumbuhan Semua aktivitas sel dibantu oleh enzim, bahkan dalam pemecahan bahan kimia kompleks menjadi bahan yang lebih sederhana melibatkan banyak enzim yang bekerja saling bertautan. Hal itu juga karena kerja enzim adalah sangat spesifik, satu jenis enzim umumnya hanya mampu bereaksi dengan satu jenis bahan. dideteksi. Katalase adalah enzim yang terdapat pada hampir semua bakteri. Enzim itu bertindak sebagai katalisator dalam pemecahan hidrogen peroksida dan menghasilkan oksigen. Enzim katalase paling banyak dihasilkan oleh bakteri obligat aerob, tetapi tidak dihasilkan oleh bakteri obligat anaerob. Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat digunakan untuk memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim Hasil dari reaksi enzimatis dapat diukur atau hilangnya suatu bahan pada media dapat

katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai enzim pernapasan bersifat racun terhadap sel mikroba. Bakteri katalase positif bisa menghasilkan gelembung-gelembung oksigen karena adanya pemecahan H2O2 oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteriitu sendiri. Komponen H2O2 ini merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, yang mana hasil respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksok bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini harus dipecah lagi agar tidak bersifat toksik lagi. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif sehingga tidak menghasilkan oksigen.

Bakteri katalase negatif tidak mempunyai enzim katalase yang menguraikan H2O2. Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya adalah H2O2. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzimkatalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya sendiri. Bakterikatalase positif akan

memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 yang mana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembunggelembung oksigen. Dengan enzim katalase, H2O2 duraikan dengan reaksi sebagai berikut: H2O2 II.4.Enumerasi Enumerasi diartikan sebagai penghitungan kepadatan mikroba. Enumerasi dapat dilakukan dengan berbagai cara. bantuan homositometer. Umumnya, cara yang dilakukan adalah hitungan langsung dengan menggunakan mikroskop dan Cara lain yang biasa digunakan yaitu hitungan Penelitian kuantitatif perlu lempeng tuangmenggunakan koloni counter. H2O + O2

dilakukan terhadap pertumbuhan sel, oleh karena itu perlu dicatat perbedaan antara konsentrasi sel atau jumlah sel per unit volume biakan dengan kepadatan bakteri yang diinfeksikan sebagai protoplasma total per unit volume. Pengitungan dengan menggunakan lempeng tuang (Pour Plate Method) digunakan untuk mengetahui perkiraan jumlah sel yang hidup yaitu melalui penanaman suspensi pada lempeng agar kemudian koloni yang tumbuh dihitung. Jumlah ini menunjukkan jumlah sel dengan anggapan satu koloni berasal dari satu sel. Metode lempeng tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan ketrampilan khusus dengan hasil biakan cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui ke

dalam 9 ml aquades. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapat tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (media agar) steril hangat (40-50 C) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37C) selama 24 jam. Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan. Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan menjadi panas), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. Pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator. II.5.Uji Resistensi Banyak bahan kimia baik organik maupun anorganik bersifat racun terhadap mikroorganisme. Usaha manusia dalam mengatasi berbagai penyakit telah menemukan ribuan senyawa kimia yang menghambat aktivitas mikroba dalam menimbulkan penyakit disebut antiseptik. Sedangkan bahan kimia yang berefek mematikan mikroba penyakit disebut desinfektan. Cara pengujian kekuatan desinfektan adalah bermacam-macam antara lain cara pengenceran, penggunaan tabung silinder, cara potongan kertas dan pengenceran agar tuang. Sedang kekuatan desinfektan itu sendiri dapat dinyatakan dengan koefisien enol dan standart internasional 9International Unit) khususnya untuk antibiotik. Suatu zat anti mikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti bahwa suatu antibiotik berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Seringkali toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bahkan absolut, ini berarti bahwa suatu antibiotik yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi oleh inang, dapat merusak parasit. Toksisitas selektif dapat berupa fungsi dari suatu reseptor khusus yang

dibutuhkan

untuk pelekatan

antibiotik

atau dapat bergantung pada

penghambatan proses biokomia yang penting untuk parasit tetapi tidak untuk inang. Mekanisme kerja sebagian besar obat antimikroba belum dimengerti secara jelas. Namun, untuk mudahnya dapat dibagi menjadi empat cara yaitu: a. Penghambatan Vankomisin. b. Penghambatan Polimiksin. c. Penghambatan sintesis protein, contohnya Kloramfenikol, Eritromisin, Linkomisin, Tetrasiklin, Aminoglikosida, dan Klindamisin. d. Penghambatan sintesis asam nukleat, contohnya Kuinolon, Pirimetamin, Rifampin, Sulfonamida, dan Trimetoprin. Mikroorganisme dapat memperlihatkan resistensi terhadap obat-obatan melalui beberapa mekanisme yaitu: a. Mikroorganisme menghasilkan enzim yang merusak obat aktif. Contoh: bakteri gram negatif resisten terhadap kloramfenikol bila menghasilkan kloramfenikol asetiltransferase. b. Mikroorganisme mengubah permeabilitasnya terhadap obat tersebut. Contoh: resisten terhadap amikasin dan terhadap beberapa aminoglikosida lain dapat disebabkan oleh gangguan permeabilitas terhadap obat, yang rupanya disebabkan oleh perubahan selaput luar yang mengganggu pengangkutan ke dalam sel. c. Mokroorganisme mengembangkan sasaran struktur yang diubah terhadap obat. Contoh: bakteri-bakteri yang resisten terhadap Klindamisin dan eritromisin memiliki reseptor yang telah diubah pada subunit 50S dari ribosom akibat metilasi 23S RNA ribosom. fungsi selaput sel, contohnya Amfoterisin B, Kolistin, Imidazol, Polien, dan sintesis dinding sel, contohnya Basitrasin, Sefalosporin, Sikloserin, Penisilin, dan

d. Mokroorganisme mengembangkan jalur metabolisme lain yang memintas reaksi yang dihambat oleh obat. e. Mokroorganisme menjalankan membentuk suatu enzim serta yang tidak telah begitu mengalami perubahan tetapi enzim tersebut masih dapat fungsi metabolismenya dipengaruhi oleh obat seperti enzim pada bakteri yang peka. Aktivitas antibiotik in vitro dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: a. PH lingkungan, beberapa obat lebih aktif pada pH asam dan yang lain pada pH basa. b. Komponen-komponen pendeteksian resistensi. c. Stabilitas obat: pada suhu inkubasi, beberapa obat antimikroba kehilangan daya kerjanya. d. Besarnya inokulum: timbulnya mutan yang resisten lebih sering pada populasi yang besar. e. Masa inkubasi: makin lama masa inkubasi berlangsung, maka makin besar kemungkinan timbulnya mutan resisten dan makin besar juga kemungkinan mikroorganisme yang paling kurang peka untuk mulai berkembang biak sementara kekuatan obat berkurang. f. Aktivitas peka terhadap metabolik daya yang kerja berada mokroorganisme: obat dalam daripada keadaan mikroorganisme yang aktif dan tumbuh cepat lebih mikroorganisme istirahat. II.6.Virus Virus merupakan mikro organisme yang sangat kecil yang menmiliki elemen genetik yang mengandung satu tipe asam nukleat yaitu DNA atau RNA. Virus memiliki selubung yang menyelubungi asam perbenihan: penambahan suatu zat tertentu pada perbenihan meningkatkan

nukleat virus yang terdiri dari lemak, protein, dan karbohidrat. Untuk memperbanyak virus diperlukan mahluk hidup sebagai inangnya (parasit obligat interseluler), perbanyakan terjadi dengan menggunakan perlengkapan sintesis virus dari inangnya. Kebanyakan virus hanya meninfeksi stu tipe kusus dari satu tipe sil inang, sehingga menyebabkan dibentuknya struktur kusus yang dapat mentransfer asam nukleat virus yang telah menginfeksi sel ke sel lain yang sejenis. Asam nikleat virus yang berupa DNA atau RNA yang menyandikan informasi genetik yang diperlukan untuk replikasi. Genom virus dapat beruntai tunggal atau beruntai ganda, berbentuk linkaran atau linier, danbersegmen atau tidak bersegmen. Bobot geniom virus DNA berlisar antara 1,5 x 106 (parvovirus) sampai 200 x 106. NPV adalah virus yang berbentuk segi banyak dan terdapat di dalam inclusion bodies yang disebut polihedra dan bereplikasi di dalam inti sel (nukleus). NPV memiliki badan inklusi berbentuk polihedral yang merupakan kristal protein pembungkus virion dengan diameter 0.- 20 mm. Kristal protein ini disebut dengan protein polihedrin yang berukuran kurang lebih 29.000 sampai 31.000 Dalton. Kristal protein ini berfungsi sebagai pelindung infektifitas partikel virus dan menjaga viabilitasnya di alam serta melindungi DNA virus dari degradasi akibat sinar ultra violet matahari. NPV telah ditemukan pada 523 spesies serangga, sebagian besar NPV bersifat spesifik inang, yaitu hanya dapat menginfeksi dan mematikan spesies inang alaminya. Sehingga pada mulanya penamaan NPV disesuaikan dengan nama inang asli dimana dia pertama kali diisolasi sebagai contoh NPV yang menginfeksi ulat Spodoptera litura dinamai Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus (SlNPV) dan yang menginfeksi ulat Spodoptera litura merupakan jenis inang yang dapat digunakan sebagai inang dari nucleo polihedro virus (NPV) karena diketahui bahwa virus ini memiliki sifat antara lain :

Memiliki inang spesifik dalam genus/ famili yang sama, sehingga tidak akan menginfeksi hewan lain non-sasaran.

Tidak mempengaruhi parasitoid, predator dan serangga berguna lainnya.

Virus ini memiliki struktur yang hampir sama dengan Helcoverpa armigara Nukleat Polyhedral Virus yang membedakan diantaranya hanya inang dari virus tersebut. Materi genetik yang dikandung dalam virus ini adalah ADN double helix yang diselubingi oleh nukleokapsid yang tersusun atas protein. Virus ini masih punya selubung terluar tersusun atas lipoprotein. Proses infeksi pada jenis virus SlNPV yang menginfeksi ulat Spodoptera litura adalah sebagai berikut : 1. Pelekatan sel inang yang cocok dan absorbsi, yaitu inetraksi yang terjadi antara virion dan atapak reseptor kusus pada permukaan sel. Hal ini terjadi ketika di tertelannya polihedral (berisi virus)bersama 2. penetrasi selubung, disertai dan yaitu dengan pakan, dalam saluran pencernaan. pelepasan proses pelepasan

masuknya virus ke dalam sel selubung yang terjadi setelah penetrasi usai, sehingga virus masuk dalam itoplasma. 3. replikasi komponen kanena dan vius SlNPV biosintesis dimana memiliki

asam nukleat berupa DNA maka replikasi terjadi dalam nukleus. 4. perakitan dan pematangan dimana dibentuk viroplasma, nukleo kapsid dan polihedral dan pembentuka PIB yang lengkap. 5. pembebasan virus dari sel inang dengan cara perusakan membran sel inang oleh virus NPV

BAB III METODE PERCOBAAN

A. Pembuatan Medium 1. Pembuatan medium universal dengan bahan dasar Tauge (TA) untuk bakteri Alat-alat : Gelas beker, kaca pengaduk, gelas ukur, cawan petri, corong, Bunsen, cawan Petri, autoklaf Bahan-bahan : Prosedur : a. Dibuat ekstrak tauge 150 200 g dengan cara dididihkan selama 15 menit dalam 1000 ml air lalu disaring dengan kertas saring untuk diambil filtratnya. b. Ditambahkan gula pasir 60 g, agar-agar batangan yang sudah dipotong kecil-kecil 8 10 g atau agar-agar powder 15 gram dan dipanaskan hingga agar-agar larut dan air sampai volume akhir setelah penambahan gula dan agar-agar adalah 1 liter. c. Agar dimaskkan dalam cawan petri sebanyak 9 ml. disterilisasi dengan autoklaf. Medium universal ini dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri dan jamur. Medium dapat disimpan dalam lemari es sampai saat dipakai. B. Menangkap dan mengisolasi mikroorganisme 1. Penangkapan dan pemeliharaan mikroorganisme Tauge, gula pasir, agar-agar dan aquades

Alat-alat : Bahan-bahan : Prosedur Penangkapan Bakteri a. Pembersih muka dioleskan ke wajah praktikan dengan kapas. b. Kapas sisa pembersih dioleskan pada ose yang telah disterilkan dengan cara dipanaskan dengan api hingga membara dan sebelum digunakan untuk mengambil air teh ose sudah didinginkan terlebih dahulu. Pengambilan bakteri ini menggunakan teknik aseptik. c. Ose yang telah disentuhkan pada kapas sisa pembersih mukanya dioleskan pada medium TA dengan metode streak secara aseptik. d. Diinkubasi pada inkubator pada suhu 360C 380C selama 24 48 jam.

Ose, lampu spirtus, alcohol, cawan petri, , kapas. Pembersih muka, medium TA dalam cawan Petri.

2. Isolasi mikroorganisme Alat-alat : Bahan-bahan : Lampu spiritus, jarum inokulasi (needle), incubator. Biakan campuran pada medium agar, medium miring pada tabung reaksi, alkohol 70% Prosedur : a. Diambil biakan campuran pada medium agar di cawan petri. b. Dipiilih satu koloni yang terpisah yang telah diberi label. c. Koloni terpilih diambil dengan ose secara aseptik.

d. Diinokulasikan pada medium dengan metode zig zag pada tabung reaksi miring yang berisi medium dengan menggunakan teknik aseptik. e. Diinkubasi biakan pada inkubator dengan suhu yang sesuai, biakan bakteri diinkubasi pada inkubator dengan suhu 360C 380 selama 24 48 jam Diamati karakteristik koloni yang muncul. C. Identifikasi bakteri 1. Pewarnaan Sederhana karbol fuscin. Prosedur : a. Kaca benda disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. b. Diteteskan 1 tetes aquades steril diatas kaca benda. c. Diambil biakan murni bakteri dengan ose dan mengoleskannya pada kaca benda dengan teknik aseptik. d. Dikering anginkan olesan kemudian difiksasi olesan tersebut dengan cara dilewatkan bagian bawah kaca benda diatas api. Melakukan pewarnaan a. Metilen biru diteteskan diatas sediaan mikroskopis kemudian membiarkannya selama 1-3 menit. b. Digunakan tetesan air dari kran untuk membilas sediaan. Membuat sediaan mikroskopis Alat-alat : Bahan-bahan : Bunsen, ose, mikroskop, cover glass, obyek glass, Kultur agar miring, alkohol 70%, reagen : methylen blue, cristal violet,

c. Dikering anginkan sediaan mikrokopis. d. Diamati sedian mikrokopis dibawah mikroskop kemudian digambar masing-masing organisme yang ditemukan. 2. Pewarnaan Gram Alat-alat : Bahan-bahan : Ose, Lampu bunsen, Pipet, Mikroskop, Kaca benda Biakan murni bakteri, Kristal violet, Gram iodne, Safranin, Ethyl alkohol 95%, Aquades steril Prosedur : Membuat sediaan mikroskopis a. Kaca benda disterilkan dengan alkohol 70 %. b. Diteteskan satu tetes aquades steril pada kaca benda. c. Diambil satu ose bakteri dan diinokulasikan pada kaca benda steril yang telah berisi aquades dan diratakan (teknik aseptik). d. Dilewatkan olesan bakteri diatas api lampu bunsen dengan cepat 2 atau 3 kali. e. Jadilah olesan bakteri yang siap diberi pewarnaan. Melakukan pewarnaan a. Olesan bakteri ditetesi dengan larutan kristal violet dan membiarkannya selama 1 menit. b. Dicuci dengan air yang mengalir kecil. c. Olesan ditetesi dengan grams iodin dan membiarkannya selama 1 menit. d. Dicuci dengan air yang mengalir kecil. e. Dekalorisasi dengan ethyl alkohol 95 %. f. Dicuci dengan air yang mengalir kecil. g. Ditetesi dengan pewarnaan safranin. h. Dicuci dengan air yang mengalir kecil. i. Dikeringkan dengan kertas hisap.

j. Diamati dibawah mikroskop. 3. Uji Katalase Alat-alat : Bahan-bahan : Prosedur : a. Kaca benda disterilkan dengan alkohol 70 %. b. Diambil 1 ose bakteri dari biakan media TA miring (teknik aseptik). c. Ditambahkan H2O2 pada olesan bakteri. d. Diamati ada tidaknya gelembung udara D. Enumerasi berurutan b. Tiap tabung diisi dengan 9 ml aquades steril c. Dibuat pengenceran sampel minuman mulai dari pengenceran terkecil sampai pengenceran terbesar (10 berikut : 1 ml sample bakteri dimasukkan kedalam tabung reaksi pertama, menghomogenkan sampai konsentrasi menjadi 10 1 5

Ose, Lampu bunsen, Pipet, Mikroskop, Kaca benda Biakan murni bakteri, alkohol 70 %, aquades steril

Alat-alat : Bahan-bahan : Prosedur :

Tabung reaksi steril, cawan petri steril, Pipet steril, Kertas label, bunsen Medium lempeng, Sample minuman, alkohol 70 %, aquades steril a. Disediakan 6 tabung reaksi steril yang telah diberi label 1 - 6 secara

- 10

) dengan cara sebagai

1 ml larutan dari tabung 1 diambil dengan spet, kemudian dimasukkan ketabung 2 dan dihomogenkan sampai konsentrasi

menjadi 10 -

Langkah yang sama dilakukan pada tabung 3 - 6 sehingga konsentrasi menjadi 10

5 6 6

d. Medium agar lempeng dipanaskan sampai cair e. Diberi label 10 dan 10 pada medium lempeng f. Larutan dengan konsentrasi 10
5

dimasukkan ke cawan petri yang

5

telah berisi media TA dengan suhu 40 - 45C dengan label 10 dan larutan dengan konsentrasi 10 ke medium lempeng dengan label 10
6 6

g. Media yang telah berisi sampel tersebut diinkubasi kedalam inkubator dengan suhu 220 270C selama 24 48 jam h. Dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap pengenceran E. Uji resistensi Alkohol 70 % Prosedur : a. Diencerkan antibiotik dengan pengenceran 300mg dalam 4 ml dan 300 mg dalam 6 ml dalam cawan petri steril (teknik aseptik). b. Paper disk digunting berbentuk lingkaran dengan cara diplong, kemudian direndam dalam antibiotik yang telah diencerkan (masingmasing pengenceran 3 buah paper disk). c. Mengoleskan biakan bakteri yang akan diamati pada lempeng agar secara merata dengan ose yang steril (teknik aseptik). d. Meletakkan guntingan paper disk yang telah direndam antibiotik diatas olesan bakteri pada lempeng agar yang akan diuji (masing-masing konsentrasi diberi tanda pada bagian luar cawan petri). e. Menginkubasi selama 24 - 48 jam. Alat-alat : Bahan-bahan : Cawan petri steril, pipet steril, paper disk, gelas ukur steril, ose, inkubator Biakan bakteri murni, medium lempeng TA, Antibiotik (Cliyndamisin),

f. Mengamati pertumbuhan koloni bakteri disekitar paper disk pada lempeng agar. Mengukur diameter bagian yang tidak ditumbuhi koloni bakteri. F. Virus Infeksi virus Alat-alat : Bahan-bahan : Botol kapsul, Pipete tetes, Petri disk, Pinset, Lampu spirtus Ulat grayak (spodoptera Litura), pakan buatan (komposisi dari Balitas Malang), Bayclin Prosedur : a. disterilkan semua alat yang digunakan dengan bayclin dan dengan cara diradiasi dengan sinar UV b. pakan buatan ulat dipotong kecil kecil (1 x 1) cm, dicelupkan pada suspensi virus, dimasukkan kedalam botol kapsul dengan pinset c. ulat dimasukkan kedalam botol kapsul dan ditutup dengan totup botol pasangannya d. ulat yang telah diinfeksi dipelihara sampai mati e. ulat yang telah mati dipanen secara hati hati agar tubuhnya tidak hancur, sebelumnya dibersihkan f. ulat yang sudah mati dimasukkan kedalan tabung reaksi steril yang telah berisi 1 ml aquades, disimpan dalam freezer kotoran ulat sudah

Pemurnian virus Mortal steril Bahan-bahan : Prosedur a. Ulat yang telah mati terinfeksi virus dihaluskan dengan mortar. b. ditambahkan aquades bila terlalu pekat kemudian menyaringnya dengan kertas saring. c. Volume diukur dengan gelas ukur. d. Hasil saringan yang telah diukur dimasukkan kedalam tabung sentrifuse. e. Dimurnikan dengan memutar pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. f. Super nata (air diatas endapan) dibuang. g. Ditambahkan aquades. h. Diaduk hingga rata atau homogen. i. Diputar kembali dengan sentrifuse pada kecepatan dan waktu yang sama sampai warna super natanya jernih (3 4 kali sentrifuse). j. Morfologi virus diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. Ulat mati yang telah terinfeksi virus, Aquades steril Alat-alat : Sentrifuse, Kertas penyaring, Gelas ukur steril, Tabung reaksi steril,

BAB IV HASIL ANALISIS DAN PEMBAHASAN

1. HASIL 1. Medium Penumbuhan Hasil dari praktikum pembuatan media penumbuhan mikroorganisme ini adalah diperoleh suatu medium penumbuhan bakteri yaitu medium TA (tauge agar) dengan bahan dasar tauge yang berwarna kuning kecoklatan dan sedikit transparan. 2. Penangkapan Mikroorganisme Tabel 4. 1. Morfologi Hasil Penangkapan Mokroba No 1 2 Warna Putih keruh Jernih transpa ran 3 Putih susu 4 5 6 Jernih Putih keruh Putih keruh Halus mengki lap Kasar Kasar Kasar Cembung Cembung Cembung Tidak rata Tidak rata Rata Bulat Bulat Bulat Ada Ada Ada Kering Seperti mentega Berlendir Kecil Kecil Besar Cembung Rata Tekstur Halus Halus Permukaan Cembung Cembung Tepi Rata Tidak rata Bentuk Bulat Bulat kecil seperti titik Bulat Ada Berlendir Besar Kenaikan Ada Ada Kepekatan Seperti mentega Kering Ukuran Kecil Kecil

3. Isolasi Bakteri Tabel 4. 2. Morfologi Bakteri Hasil Isolasi No 1 Warna Putih keruh Tekstur Halus Permukaan Cembung Tepi Rata Bentuk Bulat Kenaikan Ada Kepekatan Seperti mentega Ukuran Kecil

Putih susu

Halus mengki lap Kasar

Cembung

Rata

Bulat

Ada

Berlendir

Besar

Putih keruh

Cembung

Tidak rata

Bulat

Ada

Seperti mentega

Kecil

4. Identifikasi Mikroorganisme Tabel 4. 3. Hasil Identifikasi Bakteri No Mikroorganisme Morfologi Sel 1 2 3 Bakteri Bakteri Bakteri Bulat Batang Basil 5. Enumerasi Tabel 4. 4. Hasil Enumerasi Bakteri Pengenceran Jumlah koloni Jumlah bakteri -4 10 564 564 x 104 -5 10 380 380 x 105 10-6 226 226 x 106 Keterangan : Sampel diambil dari pembersih wajah, pada tanggal 25 Maret 2009 6. Uji Resistensi Dalam uji resistensi digunakan paper disk dengan diameter 0,5 cm yang direndam dalam antibiotik Clindamysin 300 mg selama 10 menit dan diperoleh hasil sebagai berikut : a. Pada cawan petri 1 dengan komposisi 4 ml aquades + Clindamysin 300 mg tidak ditemukan zona hambatan. b. Pada cawan petri 2 dengan komposisi 6 ml aquades + Clindamysin 300 mg tidak ditemukan zona hambatan. 7. Pemurnian Virus Bentuk Sel Susunan Sel Pewarnaa n Sederhana Biru Biru Biru Pewarnaa n Gram Negatif Negatif Negatif Uji Katalase Positif Positif Positif

Coccus Soliter Basil Tripobasil Monobasil Soliter

Dari hasil perbanyakan virus SlNPV pada ulat Spodoptera litura diperoleh virus berbentuk polihedral dengan warna hijau muda dan hasil dari pemurnian virus dengan centrifuse pada ulat Spodoptera litura terdapat sedikit virus tanpa kontaminasi bakteri. Ulat Spodoptera litura yang digunakan adalah ulat yang mati karena virus SlNPV dengan ciri-ciri diam terlentang dengan tubuh yang lunak berwarna hitam kecoklatan.

B. ANLISIS 1. Medium Penumbuhan 2. Menangkap Mikroorganisme Mikroorganisme yang ditangkap adalah suatu jenis bakteri. Bakteri yang digunakan untuk praktikum ditangkap dari kapas yang digunakan luntuk membersihkan wajah. Kapas tersebut dibasahi dengan pembersih wajahdari dokter. Koloni bakteri yang tertangkap dan ditanam dimedia taoge agar (TA). Ada 6 macam. Hasilnya seperti tertera pada table di atas, yaitu bakteri A, B, C, D, E dan F. keenam bakteri tersebut memiliki cirriciri morfologi yang berbeda seperti yang tertera pada tabel pengamatan di atas. 3. Isolasi Bakteri Bakteri yang di isolasi di tabung reaksi (media miring) diambil dari satu media koloni yang ada di cawan petri (hasil penangkapan mikroba) isolasi ini menggunakan metode streak. Bakteri yang di isolasi adalah bakteri A, C dan E. setelah diinkubasi selama 24 jam. Hasil isolasi menunjukkan bahwa ketiga jenis bakteri merupakan bakteri yang murni yang mana masing-masing berasal dari 1 macam koloni bakteri. Koloni bakteri A memilki ciri-ciri morfologi, yaitu berwarna krem, tekstur halus, permukaan cembung dan ada kenaikan, bentuk bulat dan kepekatan seperti mentega. Koloni bakteri C hasil isolasi memilki warna

putih, tekstur halus, mengkiap dan berlendir. Permukaan cembung dan tepi rata. Sedangkan koloni bakteri E hasil isolasi berwarna putih keruh, tekstur kasar, permukaan cembung dengan adanya kenaikan, kepekatan seperti mentega dan tepi rata. Hasil isolasi tersebut merupakan biakan murni bakteri.bakteri yang sudah murni tersebut selanjutnya akan dilakukan identifikasi menggunakan pewarnaan sederhana, pewarnaan gram dan uji katalase. 4. Identifikasi Mikroorganisme Pada pewaranaan sederhana dengan menggunakan metylen blue, ketiga jenis bakteri biakan murni (bakteri A, C dan E) memberikan warna biru saat diamati di bawah mikroskop akan tetapi terdapat beberapa perbedaan. Bakteri A yang di warnai dengan metylen blue memilki morfologi bakteri bulat, berbentuk kokus dengan susunan sel soliter. Bakteri C memiliki morfologi sel batang, berbentuk basil dengan susunan sel tripobasil, sedangkan bakteri E morfologi selnya basil, berbentuk monobasildengan susunan sel soliter. Pada pewarnaan gram, ketiga jenis bakteri tersebutmemberikan warna yang sama, yaitu warna merah. Hal ini berarti bakteri A, C dan E merupakan bakteri gram negatif. Pada uji katalase hasil dari ketiga jenis bakteri juga sama. Setelah ditetesi dengan larutan H2O2, terdapat gelembung-gelembung O2. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri a, c dan E merupakan bakteri aerob (bakteri katalase positif).

5. Enumerasi Sampel bakteri yang digunakan pada uji enumerasi berasal dari pembersih wajah, yaitu bakteri A mempunyai ciri-ciri berwarna krem, tekstur halus, permukaan cembung dan ada kenaikan, bentuk bulat dan kepekatan seperti mentega. Enumerasi dilakukan pada tanggal 26 januari 2009, dengan menggunakan metode hitungan lempeng tuang (Pour Plate

Method) dan di inkubasi selama 24 jam. Hasil enumerasi menunjukkan bahwa jumlah koloni bakteri yang paling sedikit, yaitu pada pengenceran 10-4 dengan jumlah koloni bakteri sebesar 564. Hal ini berarti pada kultur murni di media cair terdapat 564.10-4 bakteri. Jmlah koloni bakteri yang banyak dihasilkan pada pengenceran 10-6 dengan jumlah koloni bakteri sebesar 226 koloni. Hal ini menunjukkan bahwa pada kultur murni di media cair terdapat 226.10-6 bakteri. Hasil tersebut menunjukkan bahwa makin banyak jumlah pengenceran, maka jumlah koloni bakteri makin sedikit. 6. Uji Resistensi Pada uji resistensi yang menggunakan paper disk berdiameter 0,5 cm dan antibiotic Clindamysin 300 gram tidak menghambat bakteri yang terdapat pada ketiga cawan petri. Cawan petri 1dengan komposisi 4 ml ditambah dengan Clindamysin 300 gram tidak ditemukan zona hambatan begitu juga dengan cawan petri 2 dengan komposisi 6 ml ditambah dengan Clindamysin 300 gram. Uji resistensi hanya menggunakan 2 cawan petri yang berisi media taoge agar (TA) karena satu media di cawan petri sudah hancur (tidak padat). Perendaman paper disk pada antibiotik Clindamysin 300 gram selama 10 menit. 7. Virus Spodoptera litura Nukleo Polihedro Virus (SlNPV) merupakan virus yang hidup pada inang ulat spodoptera litura (ulat grayak). SlNPV masuk kedalam tubuh ulat melalui pakan yang telah dicelupkan kedalam suspensi virus kemudian dimakan oleh ulat Spodoptera litura. Pruses infeksi virus ditandai dengan warna kulit ulat yang berubah menjadi mrngkilap dan pucat pada hari pertama setelah infeksi. Setalah 3 hari infeksi dilakukan terdapat 2 ulat yang mati, pada hari ke 4 terdapat 1 ulat lagi yang mati. Ulat yang mati memiliki posisi terlentang dengan tubuh lunak berwarna hitam kecoklatan. Ada juga ulat yang hancur, hal ini terjadi karena waktu pengontrolan praktikan yang

cuma 1 x 1 hari, sedangkan kematian ulat sulit diprediksi, kemungkinan ulat matisudah lama, sehingga virus sudah keluar dari inang. Tubuh ulat mengeluarkan cairan kental berbau seperti nanah yang berisi partikel virus. Terdapat 6 ulat yang tidak mati hingga pada fase kepompong, hal ini dikarenakan kemungkinan umur ulat yang lebih dari instar 3. Pada umur ini zat kitin sudah terbentuk senpurna melapisi usus sehinga virus tidak dapat memasuku sel karena SlNPV tidak dapat menembus zat kitin. Setelah 7 hari dan semua ulat yang hidup menjadi kepompong. Ulat yang mati yang telah disimpan dimurnikan dengan sentrifuse secara bertingkat. Dari hasil pemurnian dilakukan pengamatan dibawah mikroskop diketahui bahwa SlNPV nampak mengkilap seperti kristal, memiliki bentuk yang polihedral, berwarna jernih, dan mengeluarkan sinar berwarna hijau. Dari pemurnian yang telah dilakukan terdapat sedikit viruskarena inang yang di infeksi juga sedikit. Pada lapang pandang mikroskop juga diketahui hasil pemurnian virus adalah murni tanpa adanya kontaminasi, meskipun terlihat adanya beberapa kotoran pada lapang pandang. C. PEMBAHASAN a. Medium Penumbuhan

b. Menangkap dan Mengisolasi Mikroorganisme Mikroornaisme yang dilihat pada mikroskop terlihat tumbuah dalam lingkungan alamiah sangat sulit untuk dibiakkan secara murni pada media buatan. Suatu cara agar dapat menangkap mikroba dari tempat yang diinginkan, yaitu dengan menumbuhkan sutu jenis koloni mikroba pada cawan petri yang berisi media taoge agar (TA). Untuk penangkapan mokroorganisme ini digunakan media taoge agar (TA) karena media taoge agar (TA) merupakan media universal dan kompleks sehingga segala macam mikroba sesuai dengan nutrient yang ada. Dalam media taoge agar (TA) dapat tumbuh dan berkembang biak. Sampel mikroorganisme yang

digunakan adalah bakteri dari pembersih wajah. Pembersih wajah dari dokter tersebut dituang ke kapas kemudian diusapkan ke muka. Hasil usapan yang ada di kapas itulah yang ditumbuhkan pada media taoge agar (TA) di cawan petri. Bakteri yang inokulasikan pada media taoge agar (TA) di cawan petri akan terjebak oleh agar sehingga sel bakteri tidak dapt bergerak. Dengan demikian tiap sel akan tumbuh membentuk koloni yang terpisah. Inokulasi bakteri ini dilakukan menggunakan metode streak yang bertujuan untuk mendapatkan koloni bakteri yang benar-benar terpisah dari koloni bakteri yna lain, sehingga memudahkan proses isolasi. Pada metode streak ini terdapat beberapa kesulitan, yaitu proses penggoresan cukup lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasidan kegagalan. Cara ini dilakukan engan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media taoge agar (TA) steril. Goresan dilkukan 3-4 kali membentukgaris horizontal di satu sisi cawan petri. Ose disterilkan lagi denagn api, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan petri kedua. Langkah dilanjutkan hingga keempat sisi cawan petri tergores. Seluruh tahapan tersebut harus dilakukan secara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi. Pada metode streak, goresan disisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua koloni bakteri mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni bakteri yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni bakteri yang lain. Bakteri yang sudah di inokulasikan harus diinkubasi. Lama dari inkubasi mempengaruhi jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Makin lama waktu inkubasi maka jumlah koloni bakteri yang tumbuh juga banyak sehingga inkubasi dilakukan selama 24-48 jam agar koloni bakteri tidak terlalu banyak. Setelah banyak kolni bakteri yang tumbuh pada media taoge agar (TA) di cawan petri, salah satu mcam koloni bakteri yang terpisah di

isolasi pada media taoge agar (TA) miring dalam tabung reaksi. Isolasi bakteri ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan satu jenis bakteri murni. Proses isolasi ini juga dilakukan menggunakan ose secara aseptic dengan metode zigzag hanya ada 1 koloni bakteri. Tiga jenis koloni bakteri yang diisolasi pertumbuhannya sangat cepat pada saat inkubasi selama 24-48 jam. Sehingga media miring penuh dengan koloni bakteri sehingga diakhir garis zig-zag tidak ditemukan 1 koloni bakteri tetapi penuh dengan koloni bakteri. Hasil dari isolasi tiga macam koloni bakteri, yaitu koloni bakteri murni. c. Identifikasi Mikroorganisme i.pewarnaan sederhana pewarnaan sederhana ini bertujuan untuk mengetahui bentuk morfologi dan susunan sel-sel bakteri. Pada pewarnaan ini digunakan 1 macam zat kimia yaitu metylen blue. Jika sel-sel bakteri ditetesi dengan larutan metylen blue kemudian dibilas dan dikeringanginkan selama 1 menit. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop maka warna sel akan terlihat biru. Hal ini terjadi karena metylen blue merupakan zat warna basa (bermuatan positif) sehingga mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri. Larutan metylen blue ini merupakan zat warna sederhana sehingga kebanyakan sel-sel bakteri mudah bereaksi karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka basa). Pewarnaan sederhana ini dapat digunakan untuk pewarnaan selanjutnya yaitu pewarnaan gram. Dengan demikian sel-sel bakteri ada yang terikat kokus dan basil. Pada pewarnaan sederhana ini perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu sebelum zat warna digunakan agar sel-sel bakteri melekat pada gelas obyek, membunuh bakteri karena sel dalam keadaan hidup, mencegah terjadinya pecahnya sel karena enzim yang ada didalamnya serta merubah daya ikatzat warna. b. pewarnaan gram

Pada pewarnaan gram ini, sebelumnya harus melakukan fiksasi terlebih dahulu. Pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial sehingga dapat membedakan bakteri dalam 2 kelompok utama yaitu gram positif dan gram negative sehingga sangat penting untuk mengklasifikasikan dan membedakan mikroorganisme. Selama pewarnaan gram, reagen yang digunakan terdiri dari 4 reagen. Reagen awal (reagen primer) yang digunakan adalah Kristal violet yang berfungfi untuk mewarnai semua sel sehingga sel-sel bakteri berwarna violet. Reagen kedua (mordant) yaitu grams iodine sebagai penguat ikatan pewarna primer (Kristal violet). Reagen ketiga (agen dikolorisasi) yaitu alkohol 95% sebagai pelarut lemak dan agen pendehidrasi protein. Proses ini dapat dideterminasi melalui jumlah lemak yang ada pada dinding sel bakteri atau mikroba. Reagen keempat (reagen penutup) yaitu safranin yang memberikan warna merah pada sel bakteri jika sel bakteri mengalami dikolorisasi. Warna primer dan warna penutup bersifat berlawanan (kontras). Maksudnya adalah pada waktu dekolorisasi, apabila pewarna primer tidak tercuci, warna penutup tidak dapat diserap dan sel beserta komponennya akan terwarnai oleh warna primer. Jika pewarna primer tercuci, maka komponen sel menjadi tidak berwarna dan akan terwarnai oleh warna penutup. Hasil dari pewranaan gram ini adalah sel-sel bakteri berwarna merah. Hal tersebut berarti bahwa bakteri yang digunakan merupakan bakteri negatif. Warna merah tersebut diperoleh karena safranin diserap oleh sel bakteri yang mengalami dekolorisasi. Dekolorisasi itu sendiri terjadi karena bendungan lemak pada membran luar dinding sel sangat tinggi sehingga lemak tersebut dilarutkan oleh alkohol dan menyebabkan terbentuknya pori yang lebar. Pori tersebut sudah ditutupi oleh protein membrane yang terdehidrasi sehingga sel menjadi transparan dan dapat menyerap warna merah (safranin). Tahap yang paling kritis dari prosedur pewarnaan ini yang harus diperhatikan adalah tahap dekolorisasi karena dekolorisasi yang

berlebihan dapat menyebabkan kehilangan warna primer sehingga bakteri gram positif nampak seperti gram negatif. Pada saat dekolorisasi c. uji katalase pada uji katalase diproleh hasil yang positif (katalase positif) yang menunjukkan bakteri tersebut merupakan bakteri aerob dan menghasilkan enzim katalase. Hal tersebut diketahui dari timbulnya gelembung gas O2 setelah ditetesi H2O2. bakteri katalase positif (bakteri aerob) dapat menghasilkan gelembung-gelembung gas O2 karena adanya pemecahana H2O2 oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Komponen H2O2 tersebut merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri katalase positig yang mana hasilnya respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen H2O2 harus dipecah agar tidak bersifat toksik lagi. Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2. bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 pewarna primer tidak tercuci sempurna, karena menyebabkan bakteri gram negatif nampak seperti gram positif.

dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya. Bakteri katalase positif akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 seperti pada hasil
percobaan yang telah dilakukan. Dengan enzim katalase, H2O2 diurai dengan reaksi sebagai berikut : 2H2O enzim katalase 2H2O + O2 d. Enumerasi Enumerasi yang telah dilakukan menggunakan metode hitungan lempeng tuang (Pour Plate Method) dengan tujuan untuk mengetahui jumlah sel bakteri yang hidup. Metode hitungan lempeng tuang ini sangat

mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Proses penuangan media dari tabumng reaksi kedalam cawan petri juga harus dilakukan secara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi. Media yang dituang tidak boleh terlalu panas, harus dalam keadaan suhu hangat karena selain menganggu proses penuangan (media panas menyebabkan tangan menjadi panas), media yang masih terlalu panas akan mengeluarkan uap yang akan menempel pada tutup cawan petri, sehingga mengganggu proses pengamatan. Bakteri yang tumbuh sesudah diinkubasi selama 24 jam dihitung dengan menggunakan koloni counter. Sebelum dilakukan penuangan media dari tabung reaksi ke dalam cawan petri harus dilakukan pengenceran kultur murni bakteri dalam media cair yang sudah dibuat sebelumnya. Pengenceran dilakukan dari 10-1 sampai 10-6. pengenceran ini bertujuan agar biakan yang digunakan tidak terlalu padat. Karena jika media terlalu padat akan mengganggu pengamatan. Sampel pengenceran bakteri yang diteliti adalah 10-4, 10-5 dan 10-6. julah bakteri yang paling banyak diperoleh dari sampel (10-6) karena satu koloni dianggap berasal dari 1 sel. Dari pengamatan tersebut dapat diketahui bahwa makin rendah tingkat pengenceran maka jumlah koloni bakteri makin sedikin tetapi jumlah bakteri makin banyak. Metode perhitungan lempeng tuang ini memiliki kerugian yaitu hanya dapat menghitung jumlah bakteri yang hidup saja dan keterbatasan jumlah koloni yang dapat dihitung yaitu sekitar 30-300 koloni. Hal yang harus diperhatikan inkubasi kultur di media cair yaitu hanya 6 jam agar bakteri yang tumbuh tidak terlalu banyak, karena jika bakteri yang tumbuh terlalu banyak maka pengenceran yang dilakukan juga makin banyak. e. Uji Resistensi Uji resistensi bertujuan untuk mengetahui resistensi bakteri terhadap suatu antibiotik. Antibiotik yang digunakan yaitu Clindamysin 300 mg. Uji resistensi yang dilakukan tidak ditemukan zona penghambat di sekitar paper disk, karena bakteri yang digunakan sudah resisten terhadap antibiotik Clindamysin 300 mg. Daya kerja antibiotik

Clindamysin 300 mg melalui penghambatan sintesis protein pada bakteri. Antibiotik Clindamysin 300 mg dapat melekat pada reseptor (rRNA 23 S) pada sub unit 50 S dari ribosom bakteri. Antibiotik ini menghambat pembentukan protein dengan mengganggu reaksi translokasi dan pembentukan kompleks inisiasi. Resistensi bakteri terhadap Clindamysin 300 mg terjadi karena reseptor yang telah diubah. Pada sub unit 50 S dari ribosom., akibat metilasi 23 S RNA ribosom. Selain itu, resistensi bakteri terhadap Clindamysin 300 mg juga dapat disebabkan karena metabolisme yang tidak aktif sehingga menjadi resisten atau berasal dari stabilitas antibiotik itu sendiri. Pada suhu inkubator, antibiotik Clindamysin 300 mg bisa kehilangan daya kerjanya sehingga membuat bakteri resisten. Waktu inkubasi juga mempengaruhi resistensi bakteri terhadap antibiotic Clindamysin 300 mg. makin lama masa inkubasi, maka makin besar kemungkinan timbulnya mutan resisten dan makin besar juga kemungkinan bakteri yang paling kurang peka untuk berkembangbiak sementara kekuatan antibiotik berkurang. Pada dasarnya ada hubungan antara konsentrasi antibiotik dengan tingkat resistensi bakteri. Makin tinggi konsentrasi antibiotik, maka kemampuan antibiotik untuk membunuh bakteri makin besar dan sebaliknya. f. Virus Spodoptera litura Nukleo Polihedro Virus (SlNPV) merupakan mikroorganisme yang memiliki 1 jenis materi genetik yang berupa DNA. SlNPV dapat bereplikasi jika masuk ke dalam inang yang tepat yaitu Spodoptera litura (ulat grayak). SlNPV masuk kedalam tubuh ulat Spodoptera litura melalui pakan buatan yang telah dicelupkan dalam suspensi virus yang kemudian dimakan oleh ulat, dari situ polihedral yang berisi virus tertelan bersama pakan membebaskan virus (virion) pada sel sel yang rentan. Proses pertama yangterjadi adalah pelekatan dan penetrasi virus masuk kedalam sel ulat dengan cara melepaskan kapsid ledalam

sitoplasma disertai peninggalan selubung (envelop) di luar sel host. Nukleo kapsid yang masuk kedalam sitoplasma mengalami penetrasi dan pelepasan DNA dari nukleo kapsid di sitoplasma. Pada tahap replikasi dan biosintesis komponen virus, DNA bebas masuk dalam nukleus sel host untuk melakukan replikasi, selain itu virus juga menyusun kompnen virus lain yang berupa kapsid dari komponen inang. Setelah replikasi DNA, kapsid dan envelop terbantuk, maka virusdirakit dengan komponen komponennya didalam sitoplasma. Pelepasan SlNPV menyebabkan sel inang akan hancur karena terjadi efek sitoplasmik yang akan mematikan sel inang karena virus keluar dengancara merusak membran sel inang. Hal inilah yang menyebabkan ulat menjadi hancur, yaitu karena adanya aktifitas virus yang merusak sel ulat. Infeksi virus terjadi pada sel ulat yang masih muda dinana zat kitin belum atau masih sedikit terbentuk karena virus tidak dapat menenbus zat kitin yang dimiliki oleh inang.pemurnian virus dilakukan dengan sentrifuse 3500 rpm. Hal ini dikarenakan dengan kecepatan tersebut virus akan terpisah dengan partikel lain karena virus memiliki berat dan ukuran tertentu sehingga digunakan metode sentrifuse bertingkat. Dari hasih pemurnian didapatkan sedikit virus tanpa adanya kontaminasi bakteri. Hal ini karena ulat yang terinfeksi hanya sedikit, dan adanya ulat yang hancur dalam wadah sehingga mungkin ada beberapa virus yang tertinggal di wadah. Dengan pengamatan dibawah mikroskop diketahui virus berbentuk polihedral yang merupakan kristal protein pembungkus virion, berwarna jernih mengkilap dan cahaya warna hijau muda.

BAB V SIMPULAN
a. Hasil dari praktikum pembuatan medium penumbuhan

mikroorganisme ini adalah diperoleh suatu medium penumbuhan bakteri dan jamur yaitu medium TA (tauge agar) dengan bahan

dasar tauge berwarna kuning kecoklatan dan sedikit transparan. b. Mikroorganisme yang diperoleh dari air teh basi adalah koloni bakteri yang berwarna putih dan orange pada medium agar tetapi setelah disolasi semua bakteri berwarna putih dengan tekstur rata. Sedangkan pada jagung yang berjamur didapatkan jamur dengan warna kuning dan orange pada medium agar. Bakteri dan jamur telah diisolasi sehingga didapat satu jenis mikrobia dalam satu media miring pada tabung reaksi tanpa adanya kontaminasi. c. Dari hasil identifikasi bakteri diperoleh hasil yaitu bakteri memiliki morfologi sel bulat, bentuk sel coccus dengan susunan sel monococcus dan diplococcus, memiliki endospora, tahan asam, gram negative, memiliki enzim katalase dan motilitas negative. Bakteri tersebut memiliki nama genus Brucella. Pada jamur yang diidentifikasi memiliki spora berbetuk oval, sporangium berbentuk bulat, sporangiofor, sel kaki dan hifa yang bersekat. Jamur tersebut memiliki nama genus Monilia sp. d. Enumerasi dilakukan dengan metode lempeng tuang dan jumlah koloni yang tumbuh dikalikan dengan faktor pengenceran untuk mengetahui jumlah bakteri yang sebenarnya. e. Uji resistensi dilakukan dengan metode paper disk. Dari uji resistensi ini dapat diketahui bahwa antibiotik cefadroxil mampu menghambat pertumbuhan bakteri pada cawan petri. Pada komposisi dengan antibiotik lebih pekat, zona hambat yang dihasilkan lebih luas. f. Virus SlNPV diperbanyak dengan menggunakan media hidup berupa ulat grayak (Spodoptera litura) dan telah berhasil dimurnikan. Virus SlNPV berbentuk polihedral dan berwarna hijau.

DAFTAR PUSTAKA

Dwijo Seputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan Jawet, Melnik dan Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: EGC John G, Holt, Noel, dkk. 1994. Determination bacteriology. USA: lippincott Williams dan Wilkinji Isnawati, Hidayat M., Thamrin, Mahanani Tri Asri. 2003. Simptapologi dan Hispatologi Ulat Helicoverpa armigera yang terserang virus Helicoverpa armigera Nuclear Polyhydrosis Virus (HaNPV). Jurusan Biologi FMIPA UNESA: Surabaya Kusnadi, Peristiwati, Ammi Syulasmi, Widi Purwianingsih, Diana

Rochintaniawati. 2003. Mikrobiologi. JICA: Universitas Pendidikan Indonesia Jawetz, Melnick, dan Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: EGC. Mahanani, Tri Asri dan Mulyono, Guntur Tri. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Surabaya: Unesa Press. Ristiati, Ni Putu. 2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Proyek Pengembangan Guru Sekolah Menengah. Anonym, (oneline) Phiyciology Superkingdom, altervista.org/gram%2BSamsuddin, 28 februari 2008 (oneline) Lembaga Pertanian Sehat | Develop Useful Innovation for Farmers : http://www.pertaniansehat.or.id, diakses 19 April 2009 of Bacteria (ex eubacteria) Domain /

http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://focosi.