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Segundo Cuatrimestre de 2007
Profesores responsables: Dres. Esteban Hopp, Beatriz Saidman y Liliana Mola
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1. CONCEPTOS Y TÉCNICAS BÁSICOS DE GENÉTICA MOLECULAR
Bibliografía:
Repaso IBMyC, Alberts, GriffithsCap 1 y Recombinant DNA (Watson et al.).
Guía teórica:
1)
¿Qué son, de dónde se obtienen y para qué sirvenlas enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de res-tricción? ¿Cómo hacen las bacterias que producen ER para evitar que su genoma se vea afectado por lasmismas? ¿Qué tipos de especificidad presentan? ¿Quétipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato?
R:
Las endonucleasas de restricción son producidas por bacterias como mecanismo de defensa contra losfagos. El genoma se encuentra protegido por metila-ción específica del sitio de restricción mediante unametilasa con igual especificidad que la endonucleasa.Cortan el ADN en sitios específicos (secuencias defi-nidas de ADN de 4 ó 6 bases, generalmente). Algunosdejan extremos cohesivos, otros dejan extremos ro-mos. Siempre el sitio blanco (de reconocimiento) esun palíndrome, aunque el sitio de corte puede no coin-cidir con el sitio de reconocimiento. Los fragmentosgenerados se pueden separar fácilmente medianteelectroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. Lavelocidad de los fragmentos depende de su longitud:los más pequeños migran más rápido.
2)
¿En qué consiste la técnica de secuenciación deSanger? ¿Qué trascendencia tuvo y tiene en Genéticay Genómica? ¿Porqué desplazó a la técnica de Maxam& Gilbert? ¿Cuál es la ventaja de la secuenciaciónautomática y en qué se diferencia de la manual?
R:
En la secuenciación manual, se suele marcar conradioisótopos y se corren 4 calles por secuencia (una para cada nucleótido). Se revela por autoradiografía.Secuenciación de Sanger (ver esquema de libro): se-cuenciación por dideoxinucleótidos-
ADN simple cadena-
Oligonucleótido iniciador (
primer
)-
Incubación c/ 4 diferentes dideoxinucleótidos(uno para cada calle)-
(Mono)deoxinucleótidos (uno de ellos marcado,usualmente
α
[
32
P]dCTP)-
Electroforesis en gel de poliacrilamidaExisten métodos no radiactivos (como tinción connitrato de plata), pero son menos utilizados. En la se-cuenciación automática se marca con fluorocromos(aquí se marca el
primer
, con un color distinto paracada nucleótido a detectar) y se corren las cuatro reac-ciones en el mismo carril (que suele ser un capilar).Los fragmentos se detectan mediante un láser a la sa-lida del gel que distingue los 4 fluorocromos. No re-quiere detener la corrida electroforética, por lo querevela un mayor número de nucleótidos. Permitió lasecuenciación masiva de genes y genomas posibili-tando el advenimiento de la genómica y proyectoscomo el genoma humano.La técnica de M&G es un método degradativo y tiene2 reacciones “de terminaciones de nucleótidos” ines- pecíficas (revela 2 nucleótidos y el verdadero se saca por comparación con otra calle del gel). Esta razóndificulta, además, la automatización. Por otro ladoresultan más difíciles de controlar las condiciones.
3)
¿En qué consiste la PCR de punto final? ¿Es unatécnica cualitativa o cuantitativa? ¿Qué diferenciasexisten entre PCR de punto final y PCR de tiemporeal? ¿Es posible hacer una PCR a partir de RNA?¿Cómo? ¿Puede utilizarse para diagnóstico (la detec-ción de HIV, por ejemplo)? ¿Qué ventajas o desventa- jas tendría respecto a otras técnicas diagnósticas comoel ELISA?
R:
PCR: polymerase chain reaction (esquema del Re-combinant DNA de Watson et al.)-
Utiliza la Taq polimerasa:
Thermus aquaticus
-
Permite amplificar segmentos específicos de ADN.-
No requiere digestión del ADN.-
No requiere clonar el segmento-
Se requiere poca cantidad de ADN.Es una técnica fundamentalmente cualitativa, debido aque llega a una meseta de amplificación por limitantesque no suelen ser la concentración del templado. LaPCR en tiempo real va siguiendo la cinética de ampli-ficación permitiendo comparar las fases logarítmicasde amplificación entre sí y así cuantificar con preci-sión los templados frente a una referencia o estándar.Para realizar una PCR a partir de RNA se debe hacer RT-PCR (se llama igual que la otra –una por Retro-Transcriptasa y la otra por Real Time). Se realiza la primera reacción con retrotranscriptasa y después secontinua con Taq pol.Es posible utilizar PCR para diagnóstico y tiene comoventaja que se trata de un método directo (detecta alvirus y no los anticuerpos con los que reacciona el paciente). Por eso sirve para la detección en reciénnacidos o personal médico de alto riesgo que trabajacon pacientes, antes de los 6 meses que tarda en detec-tarse una respuesta inmunológica. No da falsos positi-vos (salvo por contaminación de amplicones: un pro- blema general de las PCRs).
Desventajas
: más com- plejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hayque purificar RNA e implica mayor exposición al vi-rus por parte del personal que hace el diagnóstico.
4)
¿En qué consiste un Southern blot? ¿y el northern?¿y el western? ¿Para qué se usan y qué tipo de molé-culas se detectan en cada caso? ¿Qué relación tiene elSouthern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones delos RFLPs. Compare la utilización de Southern vs.PCR, northern vs. RT-PCR y western vs. ELISA.
R
: Southern blotting:
3
-
Se parte de ADN (genómico de alto peso molecular en el caso de los RFLP) y se lo digiere con enzimasde restricción.-
Los fragmentos de ADN se separan por electrofore-sis en gel de agarosa.-
Se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa y sedesnaturaliza el ADN.-
Se incuba con una sonda marcada específica de lasecuencia en estudio.-
Lavado y exposición del filtro.-
Detección autoradiográfica o fluorográfica.Esta técnica permite determinar:a)
Presencia y número de sitios de corte con una de-terminada enzima de restricción en un fragmentode ADN dado y establecer la existencia de poli-morfismos para fines diagnósticos o de estudiogenético (RFLP). b)
Número de copias (aproximado) del gen en el ge-noma, por ejemplo cuando se hacen transgénicos.Los RFLP surgen de comparar los patrones de restric-ción de Southern blot entre distintos individuos, espe-cies, etc. observando diferencias (polimorfismos) ensitios de corte.Aplicaciones de los RFLP:-
mapeo genético-
diagnóstico prenatal-
diferenciación de individuos (
fingerprinting
)-
estudios evolutivos Northern blotting:-
El ARN celular total o mRNA se separa por tamañoutilizando electroforesis en gel de agarosa (en pre-sencia de un agente desnaturalizante como el for-maldeído para evitar la formación de estructuras se-cundarias en el ARN durante la corrida).-
Se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a un papeltratado químicamente.-
Hibridación con una sonda apropiada marcada se-guida por autoradiografía. Se revelan bandas que in-dican el número y tamaño de los tipos de ARN com- plementarios a la sonda.Permite cuantificar aproximadamente y evaluar nive-les de expresión de genes (para mejor precisión se usaRT-PCR en tiempo real). También es útil, entre otrascosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque eltamaño de un mRNA específico puede compararsecon el tamaño de los cDNA copiados de ese mRNA, yrevela si este cDNA está completo.En el Western blotting se transfieren proteínas corri-das en un gel de poliacrilamida a una membrana denitrocelulosa o PVDF y luego se las visualiza por sureacción con anticuerpos específicos.La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern para varias de sus aplicaciones (por ser menos com- plejo, tener menos requerimientos de cantidad de tem- plado, y porque puede automatizarse mejor) pero noen todos los casos (por ej., comparaciones evolutivas).Pero aún en este último caso, hoy en día empiezan aser reemplazados por los SNPs o por comparacióndirecta de la secuencia nucleotídica de genes dia-gnósticos. En algunos casos, se puede tener una sonda pero no conocer la secuencia nucleotídica para diseñar los iniciadores, por lo que se puede hacer un Southernsi no se tiene la información como para hacer PCR. Northern y RT-PCR, ídem que con Southern. La PCR “común” (denominada de punto final) no es cuantita-tiva, para ello se debe hacer PCR de tiempo real cuan-titativa (qRT-PCR).El western es más específico que el ELISA (se identi-fica la banda). No da falsos positivos. Es más comple- jo y caro. Se utiliza para confirmación del HIV, por ej.
5)
Indique si las siguientes afirmaciones son verdade-ras o falsas y justifique su respuesta:a)
Un experimento de northern requiere desnaturali-zación de la doble cadena de ADN. b)
En una reacción de PCR estándar se utilizan dos
primers
complementarios a la cadena codificante.c)
La secuenciación por el método de Sanger no re-quiere, en ningún paso la desnaturalización de la do- ble cadena del ADN.d)
Al leer una autoradiografía en una secuenciaciónde Sanger el extremo 5´ del fragmento secuenciado seencuentra más cerca del polo positivo y el extremo 3´más cerca del polo negativo.
R:
a) FALSO. Se trata de ARN de simple cadena elque se somete a electroforesis. b) FALSO. Se utilizan dos primers complementarios alas dos cadenas.c) FALSO. En esta secuenciación se requiere la des-naturalización del ADN.d) VERDADERO: Dado que es un método de secuen-ciación por síntesis, los fragmentos más pequeños co-rresponderán a la región 5´ del fragmento a secuen-ciar. Estos fragmentos pequeños migran más y lohacen hacia el polo positivo (ya que el ADN tienecarga negativa).
Problemas:
1)
Suponiendo un alineamiento al azar de nucleótidosen un fragmento de ADN, ¿cuál es la probabilidad deque una endonucleasa de restricción cuyo sitio de re-conocimiento consta de cuatro bases pueda cortar elADN? ¿y para una enzima de seis bases? ¿y para unade ocho?
R:
A T C G4 bases ¼ X ¼ X ¼ X ¼*( ¼ )
4
= 3.9 10
-3
*(probabilidad de que c/base se encuentre y que allado se encuentre una base cualquiera)6 bases ( ¼ )
6
= 2.4 10
-4
8 bases ( ¼ )
8
= 1.5 10
-5
Fórmula general: (1/4)
n
, donde n = longitud de la se-cuencia que se busca.A medida que aumenta el número de bases disminuyela probabilidad de encontrar un sitio blanco de restric-ción.
2)
Un fragmento de ADN clonado, con extremos co-hesivos generados por EcoRI, lleva el gen que codifi-ca para un polipéptido de la cápside de un virus queinfecta a humanos, pero que enferma sólo a personas
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