Bio242 Travaux dirigs de Physiologie Vgtale

Ce document renferme une srie dexercices destins illustrer les cours et, pour certains, prparer les TP de Physiologie Vgtale. Des exercices similaires sont susceptibles de faire partie de lexamen final de Bio242.

1re partie Fonctionnement du chloroplaste

I Purification dorganites cellulaires et rendement dextraction NB : cet exercice ne sera pas corrig pendant les sances de TD puisquil fait appel des notions tudies dans lUE Bio231. La comprhension de lexercice est toutefois utile pour linterprtation des rsultats obtenus au cours des sances de TP 1 et 2 de Bio242. 1 - Quels sont les critres recherchs lors de la purification dun organite cellulaire ? Quelles sont les conditions exprimentales requises pour atteindre ces objectifs ? 2 - On ralise l'extraction des chloroplastes partir de 670 g de feuilles d'pinard. Aprs broyage et centrifugation, on rcupre 12 ml de suspension. Le dosage des chlorophylles (Chl) totales, effectu avec 25 l de cette suspension projets dans 10 ml d'actone 80%, donne une absorbance de 0,54 652 nm dans l'extrait actonique. Calculer le rendement d'extraction des chloroplastes partir de feuilles d'pinard. Equation de Bruinsma : [Chl] mg/ml = A652 / 36 Teneur en Chl des feuilles dpinard : 0,981mg/g de feuille II Mise en vidence dun dgagement dO2 au cours de la photosynthse 1 On souhaite mettre en vidence de faon exprimentale le dgagement dO2 dorigine photosynthtique sur diffrents chantillons : une feuille, une suspension de chloroplastes purifis, une suspension de thylacodes purifis. Retrouver lquation globale de la photosynthse ; en vous aidant dun schma simplifi, situer les principales tapes de la photosynthse dans un chloroplaste. Que faut-il fournir aux diffrents chantillons pour observer un dgagement dO2 ? 2 On mesure le dgagement dO2 par une suspension de thylacodes laide dun ractif de Hill, le DCIP (dichlorophnolindophnol), qui absorbe 600 nm ltat oxyd. Lquation globale de la raction est : H2O + DCIPoxyd O2 + DCIPrduit On prpare le milieu ractionnel en ajoutant 10 ml de milieu tamponn isotonique (saccharose 0,3 M; tampon 10 mM, pH 7,8), 1 ml d'une suspension de thylacodes purifis (100 g/ml de Chl) et 1 ml d'une solution de DCIP 0,72 mM. Le zro d'absorbance du spectrophotomtre 600 nm est rgl avec un milieu ractionnel complet additionn de cristaux de dithionite de sodium (rducteur puissant). Pour effectuer la raction de Hill, un mlange ractionnel est plac devant une lampe de forte puissance et des mesures dabsorbance 600 nm sont effectues intervalles de temps rguliers. Les rsultats sont prsents sur le graphique suivant. Calculer la vitesse de dgagement dO2 par les thylacodes clairs ; le rsultat sera exprim en mol dO2 dgag par heure et par mg de Chl.

1.4 1.2 1 Abs 600 nm 0.8

0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 Temps, min 8 10

Cintique de rduction du DCIP par une suspension de thylacodes clairs. Labsorbance du DCIP oxyd 600 nm est mesure au cours du temps ractionnel, en minutes.

On ralise la raction de Hill dans les mmes conditions que celles dcrites prcdemment mais on utilise des chloroplastes purifis la place des thylacodes. Sachant que la quantit de chloroplastes utilise dans le milieu ractionnel contient 100 g de Chl, quelle sera lallure de la cintique de rduction du DCIP ? III Mise en vidence de la formation dun gradient de protons au cours de la photosynthse On dispose de 10 ml de suspension de thylacodes dans un milieu isotonique (teneur en Chl de 0,5 mg/ml). On mesure la variation de pH du milieu extrieur au cours de l'clairement de cette suspension de thylacodes en prsence d'un accepteur artificiel d'lectrons. A l'obscurit, on note que la valeur du pH du milieu extrieur est gale 7,10. Lorsqu'on claire les 10 ml de suspension, on observe une lvation du pH extrieur dont la valeur se stabilise 7,23. A laide dun schma simplifi des thylacodes tablir un bilan des lectrons et protons mis en jeu au cours des ractions photochimiques. Rappel : les plastoquinones sont des transporteurs mobiles qui fonctionnent selon lquation PQ + 2 H+ + 2 ePQH2 Expliquer l'alcalinisation du milieu extrieur observe au cours de lclairement. Calculer la valeur du pH du lumen des thylacodes atteinte au cours de l'clairement. On sait que le volume moyen du lumen est de 3 l/mg de Chl. Par ailleurs, on considre qu' l'obscurit, le pH initial du lumen est gal celui du milieu extrieur.

2me partie Nutrition hydrique et minrale

Pr requis - Avant de raliser les exercices qui traitent des notions de potentiel hydrique dans les cellules vgtales vous devez pouvoir rpondre aux questions suivantes : Quest ce que le potentiel hydrique dun systme ? Quelles sont ces composantes ? Dans le cas dune cellule vgtale quelle est la signification biologique de ces composantes ? Quel est lintrt de connatre le potentiel hydrique dun systme ?

Exercice 1 Une cellule dont le potentiel osmotique ( s) est gal -1,6 MPa et le potentiel de pression ( p) vaut +0,8 MPa est place dans 100 ml d'une solution de saccharose dont le potentiel osmotique sol est gal -0,7 MPa. Existe-t-il des mouvements deau entre la cellule et la solution ? Si oui, dans quelle direction s'effectuent-ils ? Quelles seront les valeurs du potentiel hydrique ( c), de s et de p de la cellule et de sol lorsque l'tat d'quilibre sera atteint ? Quelle(s) hypothse(s) faut-il mettre pour effectuer ce calcul ? Exercice 2 Trois cellules issues du mme tissu vgtal dont les caractristiques sont s = -1,5 MPa et p = +0,75 MPa sont places dans trois bchers distincts contenant 100 ml d'une solution 100 mM de saccharose (A), chlorure de sodium (NaCl, B), chlorure de calcium (CaCl2, C). Lexprience est effectue 27C. Existe-t-il des mouvements deau entre la cellule et les diffrentes solutions ? Si oui, dans quelles directions s'effectuent-ils ? Dans quelle condition lquilibre sera atteint le plus rapidement ? Quelles seront les valeurs de c, s et p de la cellule et de sol de la solution lorsque l'tat d'quilibre sera atteint dans les 3 bchers ? Quelle(s) hypothse(s) faut-il mettre pour effectuer ce calcul ? Remarque : Le potentiel osmotique de solutions dilues est calcul grce la loi de vant Hoff : s = -RTC o R est la constante des gaz parfaits (8.314 Pa m3 K-1 mol-1), T la temprature en K et C la concentration en soluts. Exercice 3 Une cellule A ( sA = -2.0 MPa et pA = + 0.6 MPa) est place au contact dune cellule B ( sB = -1.6 MPa et pB = + 1.2 MPa). Existe-t-il des mouvements deau entre les cellules A et B ? Si oui, dans quelle direction s'effectuent-ils ? Quelles sont les valeurs de c, s et p des cellules A et B lorsque l'tat d'quilibre est atteint ? Quelle(s) hypothse(s) faut-il mettre pour effectuer ce calcul ? Exercice 4 : Dtermination exprimentale du potentiel hydrique dun tissu vgtal On souhaite dterminer exprimentalement le potentiel hydrique des cellules du parenchyme de tubercules de pomme de terre. Pour cela on dcoupe lemporte-pice des chantillons dont on dtermine le poids et que lon place dans diffrentes solutions dilues de sorbitol (glucide difficilement absorb par les cellules). Le volume des solutions est en trs large excs (>100 fois) par rapport au volume des chantillons de tissu vgtal. Les chantillons sont maintenus dans les diffrentes solutions pendant plusieurs heures 20C puis nouveau pess aprs avoir limin lexcs de solution. Dans le tableau suivant les variations de poids, exprimes en % du poids initial, sont reportes en fonction de la concentration des solutions de sorbitol. Sorbitol, M poids (%) 0 14 0.1 12.5 0.2 8 0.3 -2 0.4 -12 0.5 -13 0.6 -13.5

Justifier les prcautions exprimentales qui consistent maintenir un rapport de volume solution/chantillon important et raliser lincubation sur une longue priode. Pour quelles raisons les variations de poids sont-elles exprimes en % du poids initial ? Dterminer le potentiel hydrique des cellules de parenchyme de pomme de terre.

Exercice 5 : La survie de plants de tomate un stress osmotique Des plants de tomate sont cultivs 27C sur une solution nutritive standard de concentration osmolaire totale 0.1 osM. Afin de tester la rsistance de ces plants au stress hydrique on ajoute des concentrations croissantes de polythylne glycol (PEG) la solution nutritive. Le PEG est une substance hydrosoluble non ionisable qui ne pntre pas dans les tissus vgtaux. On considre que le potentiel hydrique des racines, mesur au niveau du xylme, ne varie pas dans les diffrentes conditions testes, racines = -0,75 MPa. Expliquer en quoi le protocole exprimental utilis mime des conditions de stress hydrique. Dterminer la concentration en PEG quil faut ajouter la solution nutritive standard pour atteindre le point de fltrissement permanent. Ce point caractrise la teneur en eau du sol en de de laquelle le dficit dapprovisionnement en eau affecte le fonctionnement de processus vitaux essentiels (fltrissement). Exercice 6 : La nutrition minrale en phosphore Le phosphore est un des 6 macrolments nutritifs essentiels la croissance des plantes. Dans de nombreux cosystmes naturels cet lment est un facteur limitant pour plusieurs raisons : des complexes insolubles et non assimilables se forment entre le phosphore et diffrents cations prsents dans le sol, les formes assimiles par la plante (phosphate PO43-) sont trs peu concentres dans la solution du sol (de lordre du M), des zones dpuisement se forment proximit des racines. Les symptmes dune carence en phosphore sont une coloration verte accrue des feuilles, parfois accompagne dune coloration rouge due la production danthocyanes, un ralentissement de la croissance et une production rduite de graines. Pour ces raisons les engrais couramment employs en agriculture renferment des quantits importantes de phosphore. Dresser un inventaire des diffrentes formes organiques contenant du phosphore dans une cellule vgtale en prcisant leurs rles biologiques. Exprience 1 : La morphologie du systme racinaire est un des premiers facteurs qui conditionne labsorption minrale et donc la croissance de la plante. Afin dtudier larchitecture du systme racinaire en fonction de la disponibilit en phosphate inorganique

(Pi) dans le sol des plantules dArabidopsis thaliana ont t semes sur des milieux de culture contenant 1 mM Pi (milieu standard) ou 5 M Pi (milieu carenc). Aprs 14 jours de culture diffrentes mesures sont effectues (tableau 1) : longueur de la racine primaire et du systme racinaire complet, vitesse dincorporation du Pi aprs incubation du systme racinaire dune plantule dans une solution de Pi radioactif (32PO43-).
Milieu standard Milieu carenc (+P) (-P) Longueur racine primaire (cm) 9,5 1 5,7 0,7 Longueur systme racinaire complet (cm) 21 3 19 2 Vitesse dincorporation du Pi (mol Pi / h / g) 1,1 0,2 5,6 0,7 Les valeurs indiques correspondent la moyenne cart type de 5 mesures indpendantes. La vitesse dincorporation du Pi est calcule en moles de Pi incorpor par heure et par gramme de matire frache. Tableau 1

Quelles sont les consquences de la carence en Pi sur larchitecture racinaire ? Quelles sont les consquences de la carence en Pi sur la capacit intrinsque des racines absorber le Pi disponible dans le sol ? Comment peut-on expliquer ce phnomne au niveau molculaire ? Exprience 2 : Un laboratoire a slectionn un mutant dArabidopsis qui prsente les symptmes dune carence en Pi (feuilles vert fonc contenant dimportantes quantits danthocyanes) lorsquil pousse sur un sol contenant une quantit approprie de phosphore. Diffrentes expriences sont ralises afin de comprendre lorigine du phnotype anormal de cette ligne nomme pho1. Des plantules sauvages (wild type, WT) et mutantes (pho1) sont cultives sur un milieu contenant 1 mM de Pi. Aprs 7 jours de culture les racines et les feuilles sont spares pour mesurer la masse frache, la teneur en Pi et la teneur en phosphate total (tableau 2).
Tableau 2 pho1 WT feuilles racines feuilles racines Poids frais (g) 6,4 0,8 3,2 0,4 22 4 71 Pi (mol / g MF) 5,1 1,5 15,3 0,6 10,3 0,7 11,1 0,4 Phosphate total (mol / g MF) 15 3 39 2 29 3 30 2

A quoi correspondent les valeurs "phosphate total" ? Quel est lintrt de mesurer ce paramtre ? Quelles sont les caractristiques du mutant pho1 ? Quelles hypothses peut-on formuler sur la nature de la mutation pho1 ? Des plantules WT et pho1 sont cultives pendant 14 jours sur un milieu contenant du Pi en quantit non limitante avant dtre transfres pendant 1 heure dans une solution nutritive contenant du Pi radioactif. A la fin de la priode dincubation on dtermine la vitesse dincorporation de la radioactivit dans les racines et le % de radioactivit incorpore qui est retrouve dans les feuilles. Une exprience similaire est ralise en parallle en ajoutant la solution nutritive du sulfate radioactif (35SO42-) la place du Pi radioactif. Les rsultats des expriences dincorporation sont rassembls dans le tableau 3.
Absorption racinaire Transfert vers les feuilles (nmol / h / g) (%) Pi 1559 144 0,9 0,1 pho1 Sulfate 367 34 35 3 WT Pi 1593 130 22 3 Sulfate 391 45 25 4 Les vitesses dincorporations de Pi et sulfate sont exprimes en nmoles incorpores par heure et par gramme de matire frache. Tableau 3

Ces expriences permettent-elles de confirmer/infirmer les hypothses mises prcdemment ? En quoi lexprience dincorporation de sulfate est-elle importante ? Le gne affect dans le mutant pho1 a t identifi et caractris. PHO1 code une protine de 782 acides amins qui possde 6 hlices transmembranaires prdites. Lexpression du gne PHO1 dans diffrents organes dArabidopsis est analyse par Northern blot (Figure 1).
Figure 1 : Expression tissulaire du gne PHO1 dArabidopsis. Des ARN sont extraits partir de diffrents organes dArabidopsis, spars en gel dagarose puis hybrids avec une sonde PHO1. Une coloration du gel au bromure dthidium permet de visualiser les ARN ribosomiques (rRNA). 1, graines ; 2, feuilles de la rosette ; 3, tiges ; 4, feuilles de la tige ; 5, fleurs ; 6, racines.

Le promoteur du gne PHO1 a t clon en amont du gne rapport GUS codant la glucuronidase (fusion transcriptionnelle). Lorsque lenzyme GUS est exprime elle est capable de cliver son substrat X-Gluc pour produire un compos bleu insoluble qui permet de localiser lenzyme au niveau tissulaire et cellulaire. Des plantules WT dArabidopsis ont t transformes avec la construction proPHO1:GUS et lexpression du transgne a t visualise par microscopie optique aprs rvlation de lactivit GUS in vivo (Figure 2).

Figure 2 : Profil dexpression de la fusion transcriptionnelle proPHO1:GUS. Lactivit GUS est observe aprs 15 30 min de raction (incubation des plantules avec le substrat de la glucuronidase). A, zone mature de la racine ; B, apex et zone dlongation de la racine ; C, zone mature de la racine. A et B, vues longitudinales ; C, coupe transversale. La flche indique la zone de formation dune racine secondaire. Aprs 24h de coloration aucun marquage GUS nest observ dans les feuilles, les fleurs ou les graines.

En quoi les expriences des figures 1 et 2 sont-elles complmentaires ? Que pouvezvous conclure sur la localisation et la fonction de la protine PHO1 ?

3me partie Hormones vgtales

Contrle de lorganogense in vitro par les auxines et les cytokinines Exprience 1 : Des fragments de moelle de tige de tabac sont cultivs in vitro sur des milieux contenant ou non une auxine (acide -indolactique, AIA ou IAA) et une cytokinine (kintine). Aprs plusieurs semaines, on observe lallure des cultures. Quels organes sont reconnaissables ? Classez en 3 ou 4 catgories (dont vous donnerez les caractristiques macroscopiques) les types de structures obtenues. Quels sont les effets des deux types dhormones sur la prolifration cellulaire ? Sur la diffrenciation des organes ?

Expriences 2 : Des fragments de tige de tabac sont cultivs in vitro sur des milieux contenant ou non une auxine (AIA) et une cytokinine (sulfate dadnine), dans des conditions de concentrations qui favorisent la formation de bourgeons et donc de feuilles. Aprs 35 jours de culture on compte le nombre de bourgeons noforms. Les rsultats sont reports dans le graphe ci-dessous.

Dans les conditions de culture de cette exprience, comment se comporte le fragment de tige en labsence dhormones ? Quel est leffet de la cytokinine seule ? de lauxine seule ? Quels effets peut-on a priori attendre de laction combine des deux hormones ? Quen est-il ?

Contrle hormonal de la maturation des fruits La maturation des fruits et un phnomne physiologique complexe. Chez les fruits charnus, on observe une phase au cours de laquelle il y a une augmentation importante de la respiration et modification des activits biochimiques. On observe notamment une augmentation de la production de sucres, de la consommation dacides organiques, des modifications des pigments et des parois cellulaires. La maturation est contrle de faon hormonale. On distingue deux types despces, dites "climactriques" ou "non climactriques", selon le rle jou par lthylne dans la maturation. CAS DUN FRUIT CLIMACTERIQUE : LA TOMATE Le dveloppement du fruit de tomate est caractris par 3 phases successives : une phase de croissance lente (nombreuses divisions cellulaires) pendant la 1re semaine, une phase de croissance rapide (croissance cellulaire intense) et enfin une phase de maturation aprs 4 5 semaines de dveloppement. Exprience 1 : Des plants de tomates sont traits 2 jours aprs anthse (soit au tout dbut du dveloppement du fruit) par de leau, de lthrel, un prcurseur dthylne couramment utilis en agronomie, ou de lacide aminooxyactique (AOA), un inhibiteur de synthse dthylne. On suit au cours du dveloppement des fruits la production dthylne et la quantit dACC (acide aminocyclopropane carboxylique), prcurseur naturel de lthylne (Fig. 1). Mtabolisme de lthylne :

mthionine

ACC synthase

ACC

ACC oxydase

thylne

threl

AOA, AVG

Fig 1 : Effets de traitements lthrel ou lAOA effectus 2 jours aprs anthse sur la production dthylne ( gauche) ou dACC ( droite) au cours du dveloppement du fruit de tomate.

1 - A quel(s) stade(s) du dveloppement normal du fruit de tomate observe-t-on une production dthylne ? Quel est leffet des traitements lthrel et lAOA sur la production dthylne. Sachant que le traitement est effectu 2 jours aprs anthse quelle(s) hypothse(s) pouvez-vous faire pour expliquer un effet long terme ? 2 - Comparez les courbes daccumulation dACC et de production dthylne lors de chacune des 3 phases de dveloppement du fruit. Sachant que lACC est le prcurseur de lthylne in planta (cf schma), quelles hypothses pouvez-vous faire sur lactivit ACC oxydase qui convertit lACC en thylne au cours du dveloppement du fruit ? 3 - Quel est leffet de lapplication dAOA ou dthrel sur laccumulation dACC ? Comment expliquer leffet long terme dun traitement prcoce lthrel ?

Exprience 2 : Des tomates transgniques chez lesquelles le gne de lACC oxydase est inactiv ont t produites. Ces tomates restent vertes une date o les fruits de plantes contrles sont rouges mais peuvent ventuellement rougir aprs traitement lthylne (C2H4) ou au propylne (C3H6) (Fig. 2). On observe la production dthylne et lactivit respiratoire (caractristique de la phase de maturation) chez ces plantes, lair ou en prsence dthylne (Fig. 3).

Fig. 2 : Fruits rcolts 49 jours, avant maturation, traits lair ou lthylne pendant 1, 2 ou 15 jours puis lair et observs 16 jours aprs rcolte.

Fig. 3 : Production dthylne (A) et activit respiratoire (B) chez des fruits contrles (cercles) ou transforms (triangles) laisss lair (en blanc) ou traits (en noir) au propylne (C3H6, traitement en continu) ou lthylne (C2H4 ; traitement partir du 76me jour, indiqu par une flche).

1 - Quel est leffet de linactivation du gne de lACC oxydase sur la production dthylne et sur la maturation du fruit lair ? 2 - Sur les plantes contrles quel est leffet dun traitement lthylne ou au propylne (considrs comme quivalents) ? Quen est-il sur les plantes transgniques tudies ?

CAS DUN FRUIT NON CLIMACTERIQUE : LA FRAISE Chez la fraise, ce nest pas lovaire mais le rceptacle floral qui grossit aprs fcondation et constitue la partie charnue du fruit (voir figure). Chaque akne constitue en fait un petit fruit sec. La rgulation hormonale de la croissance des fraises a t tudie depuis les annes 1950. Interprtez lexprience de Nitsch prsente ci-dessous.

La maturation de la fraise peut tre suivie par laccumulation danthocyanes (pigments de la famille des flavonodes et responsables de la coloration rouge) et lactivit phnylalanine ammonia lyase (PAL), enzyme de la voie de biosynthse des flavonodes. - Lors dune 1re exprience, on traite des fruits immatures avec de lAVG (inhibiteur de la synthse de lACC) ou des ions argent, inhibiteurs de laction de lthylne. On mesure la quantit danthocyanes et lactivit PAL 10 jours aprs le dbut du traitement. - Dans une 2nde exprience, les aknes sont ts sur des moitis de fruits immatures. On mesure ensuite la quantit danthocyanes et lactivit PAL dans les 2 moitis de fruits 10 jours aprs llimination des aknes. - Dans une 3me exprience, on limine la totalit des aknes sur des fruits immatures et on ralise une application dauxine (NAA). Dix jours aprs llimination des aknes on mesure la quantit danthocyanes, la quantit de chlorophylle et la fermet des fruits.
Traitement Contrle + AVG + ions argent Demi-fruit contrle Demi-fruit sans aknes Contrle + NAA Anthocyanes (nmol / g) 280 46 345 109 246 148 112 25 325 76 237 86 17 9 Activit PAL (pkat / mg de protines) 47 9 41 10 48 16 55 12 127 22 Chlorophylle (g / g) 2,1 0,7 5,9 1,4 Fermet (unit arbitraire) 110 30 630 90

Que dduisez-vous de ces rsultats en ce qui concerne le contrle hormonal de la maturation des fraises ?

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