SEMINAR TOXICOLOGIE DETERMINAREA EXPERIMENTALA A DOZEI LETALE DL50 Determinarea lui DL50 se face prin teste de toxicitate acuta

pe animale de laborator (cobai, sobolani, iepuri, caini, mai rar maimute). Pentru determinarie experimentale se folosesc loturi de animale din aceeasi rasa, adulte, sanatoase si daca nu se cere altefel- de ambele sexe. Experimentul consta in trei etape: Etapa 1. Determinarea intervalului dozelor letale DL0 si DL100 DL0 doza cea mia mare care nu produce moartea nici unui animal DL100 cea mia mica doza care produce moartea tuturor animalelor Etapa 2. Administrarea pe loturi de animale de cel putin 20 pentru fiecare doza, a unui numar de 4-6 doze in intervalul DL0 - DL100 , doze luate in progresie aritmetica. Etapa 3. Se determina mortalitatea in primele 24 h sau 48 h de la adminstrare. Rezultatele obtinute se exprima sub forma procentuala (% de animale decedate din numarul total de animale supuse unei anumite doze). Administrarea unei substante exogene poate sa produca doua tipuri de efecte din punct de vedere al mortalitatii de caracterizare a acestora: - Efecte gradate (efectul este direct proportional cu doza) - Efecte unice sau efecte cuantale, calitative sau de tipul totul sau nimic (rezultatul se exprima procentual si se determina pe loturi de indivizi) In domeniul dozelor letale s-a gasit ca raspunsul biologic se incadreaza intr-o distributie statistica gaussiana (normala). Daca se reprezinta grafic procentajele de deces functie de doza administrata, se obtine o curba in forma de S , care este de tip cumulativ (ogiva statistica). Determinarea lui DL50 se face folosind aceasta curba curba lui Frevan. Metoda este afectata de erori. Punctul de inflexiune al curbei reprezinta valoarea corespunzatoare lui DL50. 100

50

DL0

DL50

DL100

In prezent se foloseste exclusiv metoda de calcul a DL50 pe baza datelor experimentale, numita metoda probitului. Aceasta metoda are scopul de a obtine o dependenta liniara intre doza si efect (transformarea curbei S intr-o dreapta) si consta in parcurgerea urmatoarelor etape: 1) Se inlocuiesc dozele cu logaritmul lor zecimal 2) Se inlocuiesc procentajele de efecte cu probituri Probitul - y este definit prin urmatoarea formula:

Unde: x un procentaj corespunzator probitului respectiv xm media aritmetica a procentajelor de efecte dispersia rezultatelor experimentale obtinute prin metoda statistica matematica. y frecventa relativa x = xm 2 ; cand = 1 si xm = 0, probitul este:
-2 - xm 2

y=5+x

3) Construirea dreptei de regresie utilizand probiturile si logaritmul dozelor, folosind metoda celor mai mici patrate. y . . 5 . . . . Obtinerea probiturilor corespunzatoare procentajelor se face pe baza tabelelor

log DL50

log doza

Nu toate observatiile experimentale au acelasi grad de semnificatie pe intervalul dozelor letale, deoarece, intr-o distributie normala, tendinta este ca rezultatele se tinda catre medie, astfel incat in calculele statistice de determinarea dreptei de regresie, diferitele procentaje (probituri) vor avea o pondere diferita. Ponderea in functie de probituri se scoate din tabele. Ecuatia de regresie este urmatoarea: y = ym + b (x xm) unde: xm media aritmetica ponderata a logaritmului dozelor ym media aritmetica ponderata a probiturilor b factor de panta Calculul valorii DL50 prin metoda probitului Pe baza datelor primare ( doze, numar da nimale, procentaj de decese) se calculeaza logaritmul dozelor si se scot din tabele probiturile corespunzatoare procentajelor de decese si greutatea observatiilor. Se completeaza tabelul 1. cu datele obtinute in acest fel. Tabelul 1. Doza, d mg/kg 30 40 50 60 70 80 90 Tabelul 2. B*n 6,72 8,44 11,62 12,42 6,72 B*n = 45,92

x = log d 1,477 1,602 1,698 1,778 1,845 1,903 1,954

Nr.de animale, n 10 20 20 20 20 20 10

Nr.de decese 0 2 3 6 12 18 10

% decese 0 10 15 30 60 90 100

Probit, y 3,72 3,96 4,48 5,25 6,28 -

Greutatea obs., B 0,336 0,422 0,581 0,621 0,336 -

B*n*x 10,765 14,331 20,660 22,914 12,788 B*n*x = 81,45

B*n*y 24,998 33,422 52,057 65,205 42,201 B*n*y = 217,8

B*n*x2 17,253 24,332 36,730 42,277 24,333 B*n*x2 = 144,9

B*n*y2 92,991 132,347 233,213 342,320 265,023 B*n*y2 = 1065,8

B*n*x*y 40,047 56,751 92,558 120,303 80,309 B*n*x*y = 389,9

x2 2,181 2,566 2,883 3,161 3,404 3,621 3,818 -

y2 13,838 15,681 20,070 27,562 39,438 -

Utilizand datele din tabelul 1., se fac calculele si se completeaza tabelul 2. in vederea obtinerii mediilor ponderate ale lui x si y si a datelor necesare pentru calculul factorului de panta din ecuatia: y = ym + b(x-xm) In care: xm media aritmetica ponderata a valorilor lui x xm = B*n*x / B*n ym media aritmetica ponderata a valorilor lui y ym = B*n*y / B*n B ponderea sau greutatea observatiilor corespunzatoare probitului la doza x n numarul de animale supuse dozei x b factorul de panta, calculat cu expresia: in care: suma xy = B*n*x*y - [(B*n*x)( B*n*y)] / B*n suma xx = B*n*x2 - (B*n*x)2 / B*n Folosind datele din tabele rezulta: xm = 1,774 ; ym = 4,744 suma xx = 0,421 ; suma xy = 3,446 b = 3,446 / 0,421 = 8,18 Deci ecuatia dreptei de regresie este: y = 4,744 + 8,18 (x - 1,774) Calculul lui DL50 se poate face grafic sau analitic. 1. Pentru calculul analitic, in ecuatia dreptei de regresie se inlocuieste y cu valoarea 5 (care este probitul corespunzator unui procentaj de decese de 50%): 5 = 4,744 + 8,18 (x - 1,744) De aici rezulta x = 1,805 (aici x = logaritmul lui DL50 !) Se calculeaza antilogaritmul lui x si se obtine: DL50 = 63,82 mg/kg 2. Pentru calculul grafic se calculeaza coordonatele a 2 puncte d epe dreapta, folosind doua valori experimentale ale lui x si calculand valorile corespunzatoare ale lui y din ecuatia dreptei de regresie. b = suma xy / suma xx

Se reprezinta grafic (pe hartie milimetrica) dreapta de regresie folosind coordonatele acestor 2 puncte. Se obtine logaritmul lui DL50 din grafic, coborand perpendiculara de pe dreapta din punctul corespunzator probitului egal cu 5 si apoi se calculeaza DL50 . Tabelul 3. Probituri % 0 1 0 2,67 10 3,72 3,77 20 4,16 4,19 30 4,48 4,50 40 4,75 4,77 50 5,00 5,03 60 5,25 5,28 70 5,52 5,55 80 5,84 5,88 90 6,28 6,34 0,0 0,1 99 7,33 7,37 Tabelul 4. B Probituri 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0,000 0,001 0,001 0,002 0,002 0,003 0,005 0,006 0,008 0,011 0,015 8 2 3 0,015 0,131 0,019 0,154 0,025 0,180 0,031 0,208 0,040 0,238 0,050 0,269 0,062 0,302 0,076 0,336 0,092 0,370 0,110 0,405 0,131 0,439 7 6 Probituri 4 0,439 0,471 0,503 0,532 0,558 0.581 0,601 0,616 0,627 0,634 0,637 5 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

2 2,95 3,82 4,23 4,53 4,80 5,05 5,31 5,58 5,92 6,41 0.2 7,41

3 3,12 3,87 4,26 5,56 4,82 5,08 5,33 5,61 5,95 6,48 0,3 7,46

4 3,25 3,92 4,29 4,59 4,85 5,10 5,36 5,64 5,99 6,55 0,4 7,51

5 3,36 3,96 4,33 4,61 4,87 5,13 5,39 5,67 6,04 6,64 0,5 7,58

6 3,45 4,01 4,36 4,64 4,90 5,15 5,41 5,71 6,08 6,75 0,6 7,65

7 3,52 4,05 4,39 4,67 4,92 5,18 5,44 5,74 6,13 6,88 0,7 7,75

8 3,59 4,08 4,42 4,69 4,95 5,20 5,47 5,77 6,18 7.05 0,8 7,88

9 3,66 4,12 4,45 4,72 4,97 5,23 5,50 5,81 6,23 7,33 0,9 8,09

Fractiuni de la 1 la 4

Fractiuni de la 5 la 8