Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

Estructura del ADN

Breve resea histrica Hasta casi la mitad del siglo XX una de las preguntas que mantena ocupados a los investigadores en el campo de la Biologa Molecular y Celular era Qu molcula posee la informacin gentica? La mirada apuntaba principalmente a dos macromolculas: las Protenas y el ADN. La molcula de ADN, por ese entonces, pareca demasiado simple para encargarse de tamaa tarea, ya que estaba constituida por solo cuatro componentes. El mismo Levene en la dcada del 20 haba aseverado que, como las muestras de ADN estudiadas posean proporciones casi iguales de las cuatro Bases nitrogenadas, el ADN deba comportarse como un tetranucletido, en el cual los ramilletes de a cuatro nucletidos se repetan a lo largo de la molcula de manera ms que montona. Una molcula tan montona y repetitiva no se acercaba en lo ms mnimo a la idea de una verdadera portadora de la informacin gentica. Fue hasta la dcada del 50 que gracias a las experiencias y trabajos de Alfred D. Hershey y su colega Martha Chase se pudo comprobar, a travs de estudios realizados con virus Bacterianos, que la informacin gentica era portada por la molcula de ADN. El broche de oro lo constituye el trabajo realizado por James Watson y Francis Crick quienes realizan el modelo del ADN que concordaba perfectamente con los hechos conocidos y ayudara a explicar el papel biolgico de esta molcula. No nos olvidemos que los dos jvenes investigadores contaban ya con una suma de informacin ms que relevante e imprescindible para el armado del modelo. Entre los datos ms importantes con los que contaban podemos rescatar: Se saba que la molcula de ADN era muy grande, larga y delgada. Compuesta por nucletidos que contenan las bases nitrogenadas Adenina, Timina, Citosina y Guanina. Linus Pauling (1950) haba demostrado que las cadenas de aminocidos que componen las protenas estn dispuestas a menudo en forma de una hlice y se mantienen con esa conformacin gracias a las uniones puente de Hidrgeno que se forman entre los aminocidos de los distintos giros de la hlice. Pauling haba sugerido que la estructura del ADN poda ser semejante a la hlice que presentaban las protenas. Los patrones de las fotografas del ADN, obtenidas hasta este momento, reflejaban los giros de una hlice de grandes dimensiones. Erwin Chargaff analiz el ADN y confirm que las cantidades de las Bases Pricas eran iguales a las de las Bases Pirimdicas. En sntesis, las cantidades de Adenina eran iguales a las de Timina y, las de Citosina se correspondan a las de Guanina. Con todos estos datos, Watson y Crick intentaron construir el modelo de ADN. Para llevar la gran cantidad de informacin gentica el modelo deba considerar dos aspectos fundamentales: ser heterogneo y variado. Armaron as el modelo en hojalata y alambre y, como quien arma un rompecabezas, encajaron cada pieza en su lugar.

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

A medida que armaban el modelo, se dieron cuenta que los nucletidos que conformaban la molcula de ADN podan encajarse en cualquier orden. Dado que la molcula de ADN posee miles de nucletidos de largo, la variabilidad y la heterogeneidad estaban aseguradas, puesto que la combinacin de las bases se volva incalculable. Otra de las conclusiones a las que arribaron fue que la cadena posea una direccin, ya que cada grupo fosfato est unido a un azcar en la posicin 5 (el quinto carbono en el anillo de azcar) y al otro azcar en la posicin 3 (el tercer carbono en el anillo del azcar). As la cadena tiene un extremo 5 y otro 3. Lo interesante del trabajo fue el armado de la cadena complementaria. Las Adeninas nicamente podan aparearse con las Timinas y las Guaninas con las Citosinas. Pero, para que esto ocurra, la direccin de las cadenas deba ser inversa. Es as como el extremo 5 se aparea con el 3, vale decir que ambas cadenas son Antiparalelas. Los estudios de Watson y Crick determinaron que la conformacin tridimensional del ADN consiste en dos cadenas enrolladas de tal manera que se constituye una doble Hlice. Las Bases Nitrogenadas estn agrupadas unas sobre otras constituyendo lo que se conoce como Ordenamiento de Apilamiento. Si la cadena gira conformando una hlice, debe de existir un eje de rotacin. El mismo est conformado por las desoxirribosas que estn unidas entre s por una molcula de Fosfato constituyendo entonces un enlace 3- 5 fosfodiester. Este eje azcar - fosfato se encuentra en la parte externa de la molcula, mientras que las Bases Nitrogenadas quedan dispuestas hacia el lado interno de la misma. La doble hlice exige que cada una de las Bases Nitrogenadas de una cadena se aparee en forma complementaria con la base de la otra cadena. Este apareamiento tiene lugar mediante las uniones Puente de Hidrgeno que se forman entre las mismas. Entre las Bases Adenina y Timina se forman dos uniones Puente de Hidrgeno, mientras que entre la Guanina y la Citosina se establecen tres uniones de la misma naturaleza. No esta dems aclarar que la unin entre las Bases Citosina y Guanina ser, en consecuencia, ms fuerte que la que se establece entre la Adenina y la Timina.

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

Figura N 1: Estructura de una porcin de la molcula de ADN. Cada nucletido consiste en un Grupo Fosfato, un azcar (desoxirribosa) y una Base Nitrogenada Prica o Pirimdica. El eje de cada cadena esta constituido por la secuencia repetida de azcar fosfato. Cada grupo Fosfato est unido al carbono 5 de la desoxirribosa y al carbono 3 del siguiente nucletido. Las dos cadenas se mantienen unidas por medio uniones Puente de Hidrgeno, que se establecen entre las bases complementarias (A-T y C-G). Se forman tres uniones P. de H. entre las bases C y G, mientras que entre la A y T se establecen solo dos. Las cadenas son antiparalelas, la direccin desde el extremo 5a 3de una es opuesta al de la otra.

Biologa Molecular Topologa de ADN

Lic. Marcelo F. Goyanes

Las cadenas de ADN pueden enrollarse una sobre otra de dos formas: en sentido horario o en sentido antihorario. Es decir que si las cadenas giran a favor del movimiento de las agujas del reloj diremos que lo hacen en sentido horario, de lo contrario el sentido que adquiere el giro ser denominado antihorario. Esto determina que existan dos variantes de AND, el que se enrolla en sentido horario se denomina Right Handed ADN y el que lo hace en forma contraria se denomina Left Handed ADN o ADN Z. Right Handed ADN: Esta variante de ADN a su vez puede subdividiese en dos tipos de organizacin: el ADN A y el ADN B. 1. ADN A: Las bases Nitrogenadas forman, al unirse con el eje azcar fosfato, un ngulo de 20. Por cada vuelta de la hlice, encontraremos 11 pb (pares de bases). Es menos frecuente que el ADN B. 2. ADN B: Las bases nitrogenadas forman un ngulo de 90 con el eje azcar fosfato. Por cada vuelta de la Hlice encontraremos 10 pb. Es el tipo de ADN ms frecuentemente encontrado.

Left Handed ADN o ADN Z: Este tipo de ADN, como indicbamos arriba, gira en sentido antihorario. Esta disposicin en el giro hace que el ADN adquiera forma de ZIG ZAG, de ah su nombre. Por cada vuelta de hlice hay 12 pb. El ADN Z se encuentra acompaado de la unin de grupos metilo (-CH3) y juega un rol importante en la regulacin de la expresin gnica. Generalmente las zonas metiladas del ADN no se transcriben, es as como la distinta disposicin del ADN Z en el genoma de una clula intervendr en forma activa en la diferenciacin de la misma.

Superenrollamiento: La mayora de los esquemas que podemos llegar a visualizar del ADN lo muestran como una molcula lineal y con una estructura de doble hlice. En realidad la conformacin que adquiere en el espacio dista de ello, ya que el mismo posee una estructura cerrada, constituyendo bucles. Esta estructura la adopta ya que le son agregadas fuerzas adicionales que lo mantienen empaquetado. Si adems del giro que presenta (horario u antihorario) le agregamos otro giro alrededor de su eje, obtendremos una idea ms acertada de su verdadera conformacin. Este giro adicional, con el que se encuentra dispuesto en el espacio, se lo denomina Superenrollamiento. Ahora bien, si a algo que ya posee un giro le agregamos otro, este puede o no coincidir en su direccin con el anterior. Es as como nos veremos ante la presencia de dos tipos de Superenrollamiento: el Positivo y el Negativo.

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

Superenrollamiento Positivo: Se presenta cuando el ADN se enrolla en el espacio en sentido horario, al igual que la doble hlice, quedando apretado. Este tipo de Superenrollamiento se produce en vivo slo en condiciones especiales. Un caso tpico que genera Superenrollamiento Positivo esta dado por enzimas que rompen el ADN, lo giran y luego vuelven a unirlo. Si el giro que realizan va a favor del sentido horario el nmero de pb por vuelta aumentar, quedando la doble hlice apretada. Estas enzimas se denominan Topoisomerasas (sern descriptas en el captulo referido a la autoduplicacin del ADN). Un caso extremo de Superenrollamiento estara dado en el pasaje de ADN del tipo B al ADN del tipo Z. En este ltimo caso, el ADN gira en sentido horario sobrepasando el sentido horario de la hlice original. Otro de los casos en los cuales el Superenrollamiento Positivo se hace evidente, y que veremos ms adelante, lo confiere el aumento de tensin originada por delante de la horquilla de replicacin durante el proceso de autoduplicacin del ADN. Superenrollamiento Negativo: En este caso, el ADN gira en sentido antihorario. De esta forma, la tensin del ADN baja y la cantidad de pb por vuelta de la hlice se hace menor. Es sumamente importante ya que, disminuyendo la tensin de la doble hlice, se hace factible la separacin de las dos cadenas.

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

Replicacin del ADN

Una de las caractersticas ms notables del ADN es su capacidad de replicarse. Vale decir que el ADN es capaz de formar copias de s mismo. El proceso de autoduplicacin del ADN se lleva a cabo en el perodo S del ciclo celular. Esta etapa es un paso previo obligado para realizar la divisin celular en la etapa M de mencionado ciclo. Los genes deben poseer tres funciones principales, como portadores del material hereditario: Deben ser capaces, por medio de una replicacin fiel, de transmitir la informacin gentica de generacin en generacin.
Figura N 2: Ciclo Celular

Deben contener la informacin necesaria para sintetizar todas las protenas fundamentales para permitir el normal desarrollo de la clula. Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolucin, es decir, deber aceptar la capacidad de mutar. La replicacin permite que el ADN sea capaz de cumplir con las funciones anteriormente mencionadas. La rplica del material hereditario es un producto directo de este proceso; la informacin para la sntesis de las protenas est asegurada por medio de la replicacin y los errores en la replicacin posibilitan y generan cambios que pueden llevar a la evolucin. La replicacin del ADN es Semiconservativa, puesto que las dos cadenas del ADN sirven de patrn para la sntesis de las nuevas cadenas. Cada doble hlice hija, producto del proceso de autoduplicacin, tendr una cadena recin sintetizada (nueva) y otra cadena que, con anterioridad, formaba parte de la molcula parental.

Figura N 3: Replicacin Semiconservativa del ADN. Obsrvese en la figura que las cadenas del ADN parental se conservan y pasan a formar parte de las cadenas hijas. En el esquema, las cadenas nuevas se visualizan en negrita.

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

La replicacin se llevar a cabo en el ncleo de la clula eucariota, e intervendrn una dotacin de enzimas que se encargarn de abrir la doble hlice, incorporar los nucletidos y disminuir la tensin que se genere por delante de ella. Enzimologa de la Replicacin: Con el fin de esclarecer el proceso de replicacin, describiremos primero todas las enzimas que intervienen y luego desarrollaremos el proceso en su conjunto. ADN polimerasa: Es la principal enzima de este proceso. Ella es capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN , a partir de una hebra patrn y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucletidos). Los desoxirribonucletidos, para ser incorporados por esta, deben estar trifosfatados. Es decir que se necesitarn dATPs, dGTPs, dTTPs y dCTPs, para poder sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Otra de las caractersticas principales de esta enzima, es que polimerizar los nucletidos en la direccin 5a 3. Como consecuencia de esto, la direccin en la cual leera la cadena patrn de ADN ser de 3a 5 . Un rasgo a tener en cuenta es que la ADN polimerasa NO puede iniciar su sntesis sin la existrencia de un cebador de ARN. No solamente polimeriza los nucletidos, sino que se ha comprobado que es capaz de corregir los posibles errores que se cometan durante la autoduplicacin. Helicasas: Son las enzimas encargadas de separar las dos hebras del ADN. Estas enzimas son responsables de la ruptura de las uniones puente de Hidrgeno que se establecen entre las bases de las dos cadenas del ADN. Para poder separar las dos hebras del ADN se necesitar energa, que es obtenida de la hidrlisis del ATP. Por cada dos pares de bases que separan, se gastan dos molculas de ATP. Protenas estabilizadoras de la cadena: Una vez que las cadenas del ADN son separadas, la estabilidad de las mismas disminuye considerablemente. El ADN tiende a reasociarse y, son estas protenas quienes impiden que el ADN vuelva a su conformacin inicial. Su presencia es fundamental para mantener las cadenas estiradas. Topoisomerasas: Al producirse la duplicacin, el ADN adquiere cierto grado de superenrollamiento. Imaginemos que la molcula de ADN es como una bandita elstica, a la cual le conferimos vueltas alrededor de su eje longitudinal. Si ahora tomamos uno de sus extremos y separamos cada una de sus partes veremos que, por delante de donde se produce la separacin, la bandita adquirir una mayor tensin, plegndose sobre s misma. Lo mismo ocurre con la molcula de ADN, si la Helicasa separa las cadenas delante de donde se est produciendo la replicacin aumentar, en forma ms que considerable, la tensin de la molcula. Para evitar esto, las topoisomerasas cortan la doble hlice, rotan el ADN y vuelven a unirlo, evitando as que aumente la tensin por delante de la horquilla de replicacin. En consecuencia, encontraremos a las Topoisomerasas por delante del lugar donde se est produciendo la duplicacin. ARN polimerasa o Primasa: Esta enzima es la que sintetiza el cebador, un primordio de ARN necesario para que la ADN polimerasa pueda iniciar la sntesis de las

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

nuevas cadenas. El cebador es una pequea porcin de ARN de 10 a 12 ribonucletidos de largo que se mantendr unido a la cadena de ADN molde hasta que sea removido. Mecanismo de la Replicacin: Ya dijimos que la duplicacin se llevar a cabo durante el perodo S del ciclo celular y que es un proceso fundamental para que la clula pueda dividirse. El ADN actuar como patrn, ya que la ADN polimerasa agregar los nucletidos de las nuevas cadenas por complementariedad de bases. El lugar donde transcurre la replicacin se denomina Horquilla de Replicacin, esta estructura tiene forma de Y, y es la zona donde se sintetiza el ADN para formar las dos molculas hijas (Ver figuras N 4 y 5). Las horquillas de replicacin se originan en una estructura denominada Burbuja de Replicacin, una regin en la que las cadenas de la hlice de ADN se separan una de otra, actuando como patrn para la sntesis de las nuevas cadenas de ADN. Las zonas donde se producen las Burbujas de replicacin no son aleatorias, se ha demostrado que existen secuencias de bases que indican los lugares precisos donde la replicacin ha de comenzar. Cada Burbuja de Replicacin posee dos Horquillas de Replicacin, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda. Este proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para esto, las Helicasas se unirn a la cadena de ADN e hidrolizarn las uniones Puente de Hidrgeno que las mantienen unidas. La consecuente apertura de la doble hlice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, esta es compensada por la unin de las protenas estabilizadoras de la cadena simple. La ADN polimerasa no es capaz de iniciar la sntesis a partir de los desoxirribonucletidos libres, por lo tanto necesitar que la Primasa sintetice en forma previa el Primer o Cebador. Una vez incorporado el Cebador, la ADN polimerasa incorporar los nucletidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrn. Una vez que la Horquilla avance, la tensin por delante de la misma aumentar, para evitar esto las Topoisomerasas cortarn la doble hlice, la rotarn y volvern a unirla. Debido a la orientacin antiparalela del ADN, una de las cadenas de la horquilla de replicacin quedar en sentido 3a 5, por lo cual la ADN polimerasa podr trabajar en forma continua (recordemos que esta enzima Figura N 4: Horquilla de replicacin. Sntesis de la lea en direccin 3a 5y cadena continua y de la discontinua. polimerizaba en direccin 5a 3). En cambio, la otra cadena de la Horquilla, quedar orientada en la direccin inversa (5a 3), por lo cual en cada Horquilla de Replicacin debern actuar al menos dos ADN polimerasas. Una de ellas podr actuar en forma contnua, puesto que, a medida que se abra la doble hlice se encontrar con el extremo 3 de la cadena patrn,

Biologa Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

pudiendo as incorporar el nucletido correspondiente. En cambio, la otra ADN polimerasa se encontrar, cuando la apertura de la doble hlice avance, con el extremo 5 de la cadena patrn, por lo cual ser necesario incorporar otro cebador de ARN para poder continuar la sntesis. En resumen: cuando la cadena patrn presente la direccin 3a 5, la sntesis se realizar en forma Continua. Por el contrario, cuando la cadena patrn . presente la direccin 5a 3, la sntesis se realizar en forma Discontinua.

Una de las consecuencias de la sntesis Discontinua es que quedarn pequeos fragmentos de ADN, de unos 100 a 200 pb, intercalados con los cebadores. A estas porciones de ADN se los denomina Fragmentos de Okazaki, en honor al cientfico que los describi por primera vez. En el caso de la cadena conductora (la que se polimeriza en forma continua) es necesario la presencia de un solo Cebador, en cambio, en la cadena retardada (la que se polimeriza en forma discontinua) se necesita ms de un Primer. Luego de terminada la sntesis de ambas cadenas, los Cebadores son removidos por una enzima y la ADN polimerasa agrega los nucletidos faltantes. La enzima denominada Ligasa, se encarga de unir ambos extremos del ADN.

Figura N 5: Proceso de Replicacin del ADN. Obsrvese la Horquilla de Replicacin en la cual se encuentran actuando las dos ADN polimerasas. La cadena con direccin 3a 5 se replica en forma continua y la de direccin opuesta lo hace en forma discontinua. La Primasa sintetiza el Cebador. La Topoisomerasa acta en forma adelantada a la Horquilla de Replicacin, disminuyendo el superenrollamiento positivo.

Biologa Molecular Energtica de la Replicacin:

Lic. Marcelo F. Goyanes

Ya hemos mencionado que las unidades estructurales utilizadas en este proceso son los desoxirribonucletidos. Tambin se dijo que los mismos deban encontrarse trifosfatados para poder ser utilizados por la ADN polimerasa. Es as como se utilizarn Desoxiadenina trifosfato (dATP), Desoxiguanina trifosfato (dGTP), Desoxicitosina trifosfato (dCTP) y Desoxitimina trifosfato (dTTP). Antes de incorporar el nucletido a la cadena patrn, la ADN polimerasa escinde dos de los tres grupos fosfato de los mismos, quedando as monofosfatados y liberndose por cada uno un PPi. Esta ruptura de los enlaces de alta energa que mantena unidos a los P libera energa, que es utilizada para impulsar las reacciones catalizadas por la ADN polimerasa. Replicacin en Clulas Procariotas y Eucariotas: La gran mayora de la informacin con la que contamos, en materia de la replicacin del ADN, se obtuvo a partir de investigaciones realizadas en organismos Procariotas. Sin embargo, no hay diferencias sustanciales entre ambos procesos. La principal diferencia radica en que las clulas Procariotas replican el ADN en forma desnuda, puesto que en las clulas Eucariotas el ADN se encuentra es estado de Cromatina. Esta Cromatina esta bsicamente formada por ADN y protenas bsicas denominadas Histonas. Como veremos ms adelante, las Histonas se unen al ADN y ayudan al empaquetamiento del mismo. Las protenas nucleares frenan el accionar de la ADN polimerasa, por lo tanto, la velocidad de replicacin en las clulas Eucariotas es diez veces menor que en las clulas Procariotas. Basndose en esto, tambin es posible explicar la diferencia entre la longitud de los Fragmentos de Okazaki. En las clulas Procariotas, los segmentos de Okazaki poseen una longitud de 1000 a 2000 pb en cambio, en las clulas Eucariotas, los Fragmentos adquieren longitudes de apenas 100 a 200 pb. Una de las explicaciones posibles es la disposicin de las histonas a lo largo de la molcula de ADN, esta longitud de 200 pb coincide con los tramos de ADN que quedan desprovistos de mencionadas protenas.
Figura N 6: Replicacin del ADN. La figura muestra el proceso por el cual se inicia la burbuja de replicacin. A) La replicacin se inicia en una secuencia de 300 pb, que indican el origen de la misma. B) La doble hlice se abre, conformando la burbuja de Replicacin, la Primasa sintetiza el Cebador. C) Una vez sintetizado el cebador, la ADN polimerasa comienza a sintetizar la nueva cadena de ADN. D) Se originan dos Horquillas de replicacin completas, una de las cuales se desplaza hacia la izquierda con la cadena continua en la parte superior y la retrasada en la parte inferior, y la otra hacia la derecha, con la cadena continua en la parte inferior y la cadena retrasada en la parte superior.