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17 Video Microscopia

17 Video Microscopia

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5454
La Video-Microscopíaautomática comométodo de recuentode células somáticasde alta precisión
Miguel Ángel Pérez García
1
, Jesús Ángel Baro de laFuente
2
, Carlos Enrique Carleos Artime
3
, María BelénCoya Fernández
1
, Rocío Muñiz Vega
1
, Rafael OrtegaArias de Velasco
4
1
Dpto. de Ingeniería Eléctrica y Electrónica de laUniversidad de Oviedo (Gijón, Asturias)
2
Dpto. de Ciencias Agroforestales de la Universidad de Valladolid (Palencia)
3
Dpto. de Estadística e Investigación Operativa de laUniversidad de Oviedo (Gijón, Asturias)
4
Centro Técnico Veterinario La Espina S.L. (Salas, Asturias)
Introducción
En este trabajo se presenta un método alternativo de alta preci-sión para obtener el Recuento de Células Somáticas (conocido comoRCS o, de forma más habitual, SCC por sus siglas anglosajonas SomaticCell Count) en leche fresca. El SCC es un importante indicador delestado de salud del animal y resulta un parámetro básico dentro delcontexto de calidad de leche [3, 6, 7]. No en vano, tanto en el primercaso como en el segundo, el SCC constituye una herramienta empleadapor todos los agentes que intervienen en los sistemas de producciónde leche, bien sea para la estimación del estado de salud, bien sea paradiagnóstico de las instalaciones o para fijar los precios al productor dela leche fresca [4, 8, 9].Las células somáticas son células del sistema inmunitario presen-tes en la sangre o células epiteliales de descamación de las glándulasmamarias. La presencia de dichas células en la leche es una consecuen-cia de su origen y, en valores bajos, se considera como algo totalmentenormal; en tales casos hablamos de niveles celulares fisiológicos yno denotan más que la situación en la que el animal debería estarsiempre. Sin embargo, bajo determinadas circunstancias, estos nivelespueden incrementarse considerablemente, poniendo de manifiesto unasituación anómala.Un incremento en las células somáticas suele deberse a un incre-mento de las células inmunitarias en la sangre y esto, a su vez, sueleser una consecuencia de la respuesta del sistema inmunitario ante elataque de algún agente patógeno; estamos ante la presencia de mas-titis, es decir, inflamación de la glándula mamaria; incluso, valores algosuperiores a los fisiológicos suelen ser un indicador poco halagüeño yaque pueden denotar una situación peligrosa que, sin llegar a ser unainflamación evidente, causa pérdidas económicas importantes para elganadero [4, 9]: es lo que se suele denominar como mastitis subclínica,una situación poco definida en la que el animal produce recuentoscelulares medianamente altos sin otros síntomas. Se ha encontradouna cierta relación entre los recuentos celulares y la pérdida de pro-ducción según se indica en la Figura 1.Datos como los de la Figura 1 deben ser tomados como unamera indicación o una orientación para el ganadero y no como algocategórico, puesto que el número de circunstancias que afecta a laproducción es mayor y en cualquier sistema complejo es imposibleencontrar la explicación de un factor en una sola causa.
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Figura 1. El LS (Linear Scre) cm una herramienta de identificación de prblemas más cercana a la realidad que el recuent celular pr su identificación cn lapérdida de prducción y su precisión (una cifra significativa) es muy aprpiada para la escasa precisión de ls métds de recuent de células smáticas actuales.Sin embarg, una relación tan categórica entre LS y pérdida de prducción n deja de ser un espejism ya que ls factres que intervienen en la prducción de leche sn muchs más que el recuent celular y fácilmente pueden enmascarar el efect de aquel.
 
nº 13nº 17nº 13
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nº 17
Efectos del tipo de conservante añadido al ensilado de trigo sobre la producción y composición química de la leche
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Aunque menos frecuente, también es posible que se produzcaun incremento de las células somáticas por aumento de las célulasepiteliales ya sea por causas mecánicas –sobre-ordeño, mala parame-trización de la máquina de ordeño– o por degeneración de los tejidosglandulares producidos por algún proceso infeccioso.Sea cual sea la causa, en general, el incremento de células somá-ticas denota la presencia de algún tipo de problema. Por otro lado, lascélulas somáticas tienen efectos lipolíticos y proteolíticos que afectannegativamente a la calidad y reducen su vida útil al causar un enran-ciamiento prematuro de la leche; también reducen el rendimientoquesero y la calidad de muchos de los derivados lácteos [6, 7, 8, 9].Por tanto, el SCC se convierte en un parámetro clave en laestimación de la calidad del producto –la leche– y en la salud de losanimales que la producen y, por ello, se viene usando tanto comoherramienta de diagnóstico clínico, como parámetro de valoración dede la leche en un sistema de pago por calidad que ha sido adoptado,en mayor o menor medida y con diferentes niveles de corte para elSCC, en la mayoría de los países industrializados. Este tipo de sistemasemplea diversos niveles de SCC para determinar desde primas en elprecio al ganadero hasta penalizaciones o, incluso, prohibición decomercialización de leche con recuentos celulares excesivamente altos.Sin embargo, sí que se producen discrepancias importantes a la hora dedefinir los diversos “niveles de corte” para el SCC entre los diversos paí-ses lo que no deja de arrojar una cierta sombra sobre todo el proceso,ya que alguien podría preguntarse por qué en unos lugares los nivelesde tolerancia son más altos que en otros.Sea como fuere, en España, como en otros países de su entorno,
 
La Video-Microscopía automática como método de recuento de células somáticas de alta precisión
Figura 2. Evlución del recuent de células smáticas a l larg de ls últims añs, bservand una fuerte reducción cm efect del Cntrl Lecher oficial.Fuente: Labratri Interprfesinal de la Leche y de ls Aliments (LILA). Sinembarg, una prpuesta raznable a crt plaz cm es la de reducir el SCC (RCS) a 100.000 cél/ml en tanque exige un cambi en la tendencia actual que puede exigir la adpción de medidas  prcedimients adicinales.Figura 3. Ejecución del métd de referencia de la IDF-FIL para el recuent de células smáticas en leche (DMSCC  prtcl 148A). En el últim pas, el peradr debe cntar una a una las células (las individuales aparecen en la imagen rdeadas pr un círcul rj), incluyend las de ls agrupamients (aparecen rdeadas pr un círcul granate), l que resulta bastante tedis y dad a errres.
 
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érez M. A., Bar J.A., Carles C.E., Cya M. B., Muñiz R. y ortega R.
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el Control Lechero Oficial se encarga, entre otras tareas, de realizar unmuestreo periódico –mensual– de los niveles de SCC de los distintosanimales lo que permite informar a los ganaderos del estado de susestabulaciones en lo que a este factor se refiere, permitiéndoles tomarmedidas preventivas o correctivas. Esta labor de monitorización haresultado extraordinariamente positiva al permitir una fuerte dismi-nución de los recuentos de células somáticas en leche, redundandoen la correspondiente mejora de la calidad y en el incremento de losbeneficios para el ganadero. Como buena prueba de ello, en la Figura2 se muestra un ejemplo del efecto del sistema establecido sobre losrecuentos celulares a lo largo del tiempo en Asturias.Hasta aquí, parece evidente la necesidad de obtención delrecuento celular (SCC) en la leche, pero el problema acaece cuando nospreguntamos por el cómo. 
Los métodos de recuentode células somáticas
Existen varios métodos, sistemas y equipos para obtener elrecuento celular en la leche, basados en tecnologías diferentes. Estaabundancia parecería indicar una cierta facilidad en la obtención delSCC, pero nada más lejos de la realidad: la presencia simultánea demétodos basados en diversas tecnologías sólo indica la incapacidad decualquiera de ellos de proporcionar una solución definitiva.En la actualidad se dispone de técnicas directas e indirectas derecuento celular que van desde el tradicional, sencillo y eficaz Test deCalifornia (CMT, siglas anglosajonas de California Mastitis Test), que se puedellevar a cabo en la propia estabulación por personal no especializado, hastalos sofisticados sistemas de laboratorio basados en epifluorescencia y cito-metría de flujo como los comercializados por la firma Foss, con un elevadorendimiento a la hora de procesar grandes volúmenes de muestras.Con vistas a obtener un método de referencia que pueda serusado para evaluar el comportamiento de los demás, la InternationalDairy Federation (IDF-FIL) ha adoptado un método de alta precisiónque consiste en la realización de extensiones microscópicas de leche yen el recuento manual de células en un número suficiente de camposmicroscópicos y que se conoce como el protocolo 148 A [10]. Estemétodo, ejecutado por un operador bien entrenado resulta muy pre-ciso, aunque es laborioso, lento y está sometido a sesgos provocadospor las circunstancias específicas de cada operador y por otros factores,como el cansancio o el estado de ánimo.Además de este método, que no deja de ser un sistema dereferencia que se suele usar para calibrar los demás, hay otras posibi-lidades que sí pueden emplearse en tareas rutinarias de recuento. Unbreve recorrido por ellas nos ofrece dos grandes grupos de métodos derecuento: los directos y los indirectos, según se efectúe la estimacióndel SCC contando el número de células presentes en una determinadamuestra o por evaluación de los efectos que estas células producen.Entre los métodos directos tenemos los basados en la evaluación deextensiones microscópicas y los basados en epifluorescencia, ya seapor análisis de imagen, ya por citometría de flujo; entre los métodosindirectos se tienen los clásicos como el CMT, basado en el incrementode la viscosidad producida después de la ruptura de las membranaspor un agente detergente, y la liberación de moléculas de ADN. Unaevolución de este método es el WMT (Wisconsin Mastitis Test) queintroduce una mayor sofisticación al evaluar objetivamente la visco-sidad [5]. Dentro de los métodos indirectos cabe destacar la medidade conductividad que se relaciona con la presencia de mastitis por elincremento de iones que se produce en estos casos; este método, enalguna de sus múltiples versiones es incorporado en algunos equiposde ordeño como sistema de alerta de la presencia de mastitis debido asu bajo coste y a lo simple que resulta su implementación.Como antes se indicó, el método de referencia para todos losdemás por su elevada precisión es el de recuento de células somáticasbasado en el análisis por un operador de imágenes de extensionesmicroscópicas, método denominado “Microscopía Óptica Directa” o,por sus siglas en inglés, DM-SCC (Direct Microscopy SCC). Los pasosque comporta este método pueden observarse en la Figura 3 y consis-ten, básicamente, en la extensión de una cantidad de leche determi-nada (10 microlitros) sobre un portaobjetos para ocupar una extensiónde 100 mm
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, su tinción con azul de metileno y el recuento manual deun número suficiente de campos microscópicos.El CMT –el conocido Test de California– supone el empleo de unasustancia con acción detergente como el laurilsulfato capaz de destruirlas membranas celulares y liberar el ADN contenido en el núcleo de lascélulas, provocando un incremento de la viscosidad de la muestra quedebe ser evaluada de forma más o menos subjetiva: un elevado núme-ro de células somáticas implica la liberación de gran cantidad de ADN–moléculas de gran tamaño– y, en consecuencia, una mayor viscosidad(véase Figura 4); por el contrario, cuando el SCC es bajo la cantidad deADN liberada es baja y la viscosidad resulta menor.
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Figura 4. Descripción del CMT: sbre una muestra de leche se añade un agente detergente cm el laurilsulfat. La destrucción de las paredes celulares libe-ra el ADN cntenid en el núcle, mléculas muy largas que incrementan laviscsidad. El peradr interpreta el nivel de viscsidad btenid para decidir de frma cualitativa la situación del animal en cuant a recuent de células smáticas.Figura 5. Cnductividad vs. SCC btenid pr el métd de referencia de la IDF-FIL, indicand cn líneas verticales las pérdidas supuestas en la prducción pr ls niveles de SCC. El valr de la cnductividad se ha btenid cn un puente de medida de impedancias hp4284. Cm se puede bservar la relación es más que dudsa pr debaj de un millón de células pr mililitr l que invalida este métd para la mayría de las aplicacines. N bstante, realizand ajustes para cada animal de cada instalación se puede mejrar alg el resultad, cmen ls equips que incrpran firmas cm DeLaval  Afikin.

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