LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

BIOQUIMICA MICROBIANA

MANUAL DE PRACTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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INTRODUCCION

Principios fundamentales de bioqumica microbiana El termino metabolismo se utiliza para aludir a todos los procesos qumicos que tienen lugar dentro de una clula .

El metabolismo de los compuestos orgnicos que contienen formas reducidas de carbono es la fuente de energa de la mayora de los microorganismos la serie de reacciones que comprenden la oxidacin de un compuesto se denomina va bioqumica . A continuacin se describe un panorama general simplificado del metabolismo celular.
Catabolismo y anabolismo Que es el metabolismo? Metabolismo intermediario Ruta metablica Lineal Ramificada Cclica Espiral

Catabolismo Degradacin de molculas complejas a molculas simples como lactato, piruvato, etanol, CO2, H2O, NH3 Reacciones de oxidacin Ganancia de energa 12 metabolitos precursores

Etapas del catabolismo Etapa 1. degradacin de macromolculas en sus respectivos componentes Etapa 2. las molculas simples se oxidan a un metabolito comn La acetil-CoA entra al ciclo CAC donde se oxida a CO2

Anabolismo FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Construccin de biomolculas Se necesita energa Etapas principales Biosntesis Polimerizacin Ensamblaje

Macro y micronutrientes Macronutrientes C, O, H, N, P, S, K, Fe, Ca, Mg. 95% de DW Micronutrientes Elementos traza Zn, Cu, Mn, Ni,

Composicin celular Elemento % DW C 50 O 20 N 14 H 8 P 3 S 1 K 1 Na 1 Ca 0.5 Mg 0.5 Fe 0.2 Cl 0.5

Requerimientos nutricios Requerimientos de C Fuente de energa Elemento para sntesis de compuestos celulares Clasificacin en base a necesidades nutricionales de fuentes de C Auttrofos Fotoauttrofos Quimioauttrofos Hetertrofos Fotohetertrofos Quimiohetertrofos

Requerimientos de N FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Necesarios para sintetizar enzimas, protenas y aa Requerimientos de S y P S necesario para fabricar protenas, coenzimas y aa P fabricacin de cidos nuclicos, fosofolpidos, ATP

Factores de crecimiento Aminocidos Purinas y pirimidinas Vitaminas

Captacin de nutrientes Transporte pasivo Difusin Gradiente de concentracin Transporte activo Requiere energa Tras locacin de grupo Medios de cultivo Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos especficos o facilitar la identificacin de una especie en particular Medios de cultivos Por su composicin los medios se clasifican en: Complejos No se conoce la composicin exacta del medio Puede contener Extractos e Infusiones vegetales o animales. Hidrolizados pancreticos o cidos. Sintticos Se conoce la composicin qumica del medio Crecimiento microbiano y rendimiento El crecimiento neto esta dado por: Y = - dX dS Eficiencia Aerobios 50% Anaerobios 10%

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Objetivo Conocer a grandes rasgos los diferentes medios de cultivo para el optimo crecimiento de los diferentes microorganismos , as como los cambios en dichos medios de acuerdo a las reacciones bioqumicas que llevan a cabo los microorganismos para obtener los nutrientes necesarios a para su crecimiento.

Pruebas de Identificacin

Prueba

Descripcin
Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen. La hidrlisis de la lactosa produce cidos orgnicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo. Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que origina la utilizacin de las protenas (peptona) del medio Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC

Resultado

Agar MacConkey

Positivo Negativo Sin crecimiento

Agar sangre

Medio de cultivo enriquecido con la adiccin de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los

Hemolisis alfa Hemolisis

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA hematies. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematies. Se siembre por agotamiento en estra en placas de agar sangre y se incuba Esta enzima hidoliza la lactosa originando glucosa y galactosa

beta Hemolisis gamma Sin crecimiento Sin resultados

Beta galactosidasa

Se aade un sustrato artificial ortocitrofenial galactsido (ONPG) que hidrolizado por la galatosidasa originandose en color amarillo La catalasa es una enzima que proteje a las clulas frente al perxido de hidrgeno producido en el metabolismo del oxgeno. Cataliza la formacin de agua y oxgeno a partir del perxido de hidrgeno. Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva) La actividad catalasa se detecta aadiendo unas gotas de perxido de hidrgeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (dara falsos positivos). La produccin de burbujas indica la presencia del enzima.

Positivo Negativo

Catalasa

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el cido y como consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul. El citrato es la nica fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de Simmon's inclinando el tubo La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patgenos dan una reaccin postiva y los no patgenos negativa Se aade una suspensin densa de bacterias a un tubo pequea con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulacin a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa. El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acenta la diferencia del ndice de refraccin entre las clulas y el medio incrementando as el contraste en clulas translcidas sin uso de colorantes. Los aminacidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el

Citrato

Positivo Negativo

Coagulasa

Positivo Negativo

Contraste de fases

Bacilos Cocos

Descarboxilas a

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA indicador (prpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son tiles en la diferenciacin de enterobacterias. Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (prpura de bromocresol) Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA

de aminocidos

DNasa

Se hace una estra gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela despus de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

Positivo Negativo

Las Endosporas son formadas por Bacillus y (calentamiento) Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamnete inactivas que resisten la alta temperatura, la desecacin y la radiacin.

Esporas

Positivo Negativo

Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de cultivo. Se inocula un tubo de caldo con una suspensin sospechosa de contener endosporas. Se calienta a 80 oC durante 10 min. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Se enfra y se incuba a temperatura adecuada. Las desaminasas catalizan la prdida de NH3 en un aminocido originando un cido carboxlico

Fenilalanina desaminasa

Se incolulan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Despus de la incubacin se aade una solucin de cloruro frrico. Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a cidos orgnicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entricas. Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequea cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.

Positivo Negativo

Fermentacin de azucares

Acido Acido + gas Negativo Sin cido

Gram

La tincin de Gram es la ms importante de las tinciones diferenciales. Las clulas Gram positivas retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol

Bacilos Gramnegativos Bacilos Grampositivos

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA mientras que las gram negativas no lo tienen y se tien entonces del color rojo de la safranina. Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento. Se tie con cristal violeta Se trata con lugol como mordiente Se decolora con etanol 96o Se aade safranina como colorante de contraste La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromtico. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato frrico.

Cocos Grampositivos Cocos Gramnegativos

Hidrlisis de Esculina

Positivo Negativo

Hidrlisis de gelatina

La mayora de los polmeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las clulas. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros que les sirven para crecer. La produccin de proteasas es evaluada por incorporacin de una

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA protena (gelatina o casena) en un medio slido en placa. La placa se inunda con cido que precipita la proteina no hidrolizada. Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lpidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la clula para ser utilizados en el crecimiento. Una emulsin de lpidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio slido complejo. Los polisacaridos, como el almidn son demasiados largos para ser transportados al interior de la clula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polmeros hasta oligo o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrlisis de almidn es analizada en medios conteniendo almidn en placa. Despus de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidn intacto forma un complejo prpura.

Hidrlisis de lpidos

Positivo Negativo

Hidrlisis del almidon

Positivo Negativo

Hidrlisis del hipurato

El hipurato es un compuesto orgnico aromtico que puede ser hidrolizado enzimticamente originando benzoato y glicina. Este test

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus. Una suspensin de bacterias se aade a una solucin de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se aade la nihidrina. Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptfano en indol La bacteria se crece en medios que contienen triptfano (caldo de triptoma). La presencia de indol se ensaya aadiendo dimetilaminobenzaldehdo. El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones unindose a los citocromos impidiendo el crecimiento microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer. Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potsico.

Indol

Positivo Negativo

Inhibicin por KCN

Sensible Resistente

Motilidad

La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparacin en fresco con el microscopio de contraste de fase

Movil Inmovil

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Para ver la movilidad se realiza una preparacin en fresco que se observa en contraste de fases. La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparacin. En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxgeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias slo pueden utilizar la glucosa por va fermentativa. En este test se evala la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar (oxidacin produciendo cido que se -fermentacin) detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) Es til en la distincin de pseudomonas y enterobacterias.

O-F

Fermentativo Oxidativo Negativo

Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxgeno (tubo de fermentacin) y otro no (tubo de oxidacin)

Oxidasa

La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial pfenilendiamina. Este test se

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo) Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo. Muchas bacterias producen sulfuro de hidrgeno a partir de aminocidos azufrados (cistena o metionina) o tiosulfato. La fermentacin de sulfhdrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.

Produccin de sulfhdrico

Positivo Negativo

Reduccin de nitrato

Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiracin. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso ms a gases (xidos de nitrgeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potsico. El nitrito procedente de la reduccin de clulas puede detectarse aadiendo alfanalfilamina y

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA cido sulfanlico produciendose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a ms que a nitritos produciendose gas. Si al aadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificacin) Es uno de los test del IMVIC para bacterias entricas. Algunas vias fermentativas originan cidos orgnicos mientras otras originan productos que son neutros.

Rojo de metilo

Las bacterias se crecen en caldo de glucosapeptona. Si se fermenta el azcar el pH baja por debajo de 4.3. Se aade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.

Positivo Negativo

Tioglicolato

Este medio se usa para Aerobio determinar el efecto del Anaerobio oxgeno sobre el Facultativo crecimiento microbiano. Un Microaerobi tubo con medio semislido o contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. As slo hay oxgeno en la superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxgeno (rojo) o no (incoloro). El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA crecimiento. Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producir un incremento del pH que puede detectarse con un indicador. Las bacterias se inoculan en un medio con glucosapeptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol La mayora, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una nica fuente de carbono. Este mtodo permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos especficos. Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgnicos como fuentes de carbono y energa. Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso fermentacin a butanodiol de la glucosa acumulan acetona en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentacin butanodilica de la glucosa aumentean acetona en el medio.

Ureasa

Positivo Negativo

Utilizacin Fuentes de Carbono

Positivo Negativo

VogesProskauer

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Se aade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoina se convierte en diacetilo que

Cuestionario. 1. Qu es el metabolismo microbiano.? 2. Cmo se divide? 3. Mencione los macronutrientes 4. cuales son los nutrientes trazas y porque se conocen con ese nombre? 5. Cual es el elemento mas importante y de mayor concentracin en los metabolismos microbianos

Practica 2
FERMENTACIN DE LA GLUCOSA Introduccin
Las vas para la oxidacin de los compuestos organicosy la conservacin de la energa en el ATP se pueden dividir en 2 grupos principales la Fermentacin y la respiracin : FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA En ausencia de un aceptor de electrones ,muchos organismos efectuar reacciones redox balanceadas de algunos compuestos organicos, con liberacin de energa a este proceso se le llama fermentacin. Fermentacon de la glucosa. Oxidacin y produccin de ATP . Aunque vista superficialmente parece compleja, la va bioquimica para la degradacin de la glucosa es en realidad muy simple , y se puede dividir en tres partes principalmente. La etapa I es una serie de reacciones de reacomodacin preparatoria que no implica oxido reduccin y no liberan energa pero conducen a la produccin de dos molculas de un compuesto intermedio clave , el gliceraldehido-3-fosfato En la etapa II hay oxido-reduccin , se produce energa de en lace fosfato alto en energa , en forma de ATP y se forman dos molculas de piruvato. En la etapa III ocurre una segunda reaccin de oxido-reduccin y se forman los productos de fermentacin ( etanol , CO y acido lctico. Rojo de Metilo (M) El rojo de metilo es un indicador de pH. (Frmula: C15H15N3O2). Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin de cidos organicos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algn carbohidrato fermentable, el ms comn es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reaccin positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentacin de la glucosa por la va cido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de cidos orgnico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo) Objetivo. Empleando los medios de cultivo adecuados ver prcticamente la facultad de algunos microorganismos para fermentar la glucosa. Material Mechero bunsen Asa bacteriolgica en punta Medio TSI Caldo lactosado

Material biolgico Cepas bacterianas Procedimiento

1. Cerca de la llama del mechero inocular con el asa en punta el medio de TSI y los
tubos con caldo lactosado conteniendo campana de Durhan

2. Incubar de 18 a 24 horas a una temperatura de 35-37 C

3. Anote sus resultados. 4. Realizar la prueba de catalasa

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Prueba de la Catalasa Fundamento La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba es positiva. Material y Portaobjetos. H2O2 de 10 volmenes Cultivos en fase exponencial reactivos de bacterias.Asas e hilos de siembra. Pipetas Pasteur Mtodo 1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur. 2. Suspender la bacteria 3.Detectar la formacin de burbujas

Cuestionario 1. Explique brevemente como se lleva a cabo la fermentacin de la glucosa 2. Por qu cambia de color el medio? 3. Mencione algunas de las rutas empleadas por los procariotas fermentativos.

4. Por qu realizamos la prueba de catalasa.? Explique

.

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Practica 3 PRUEBA DE INDOL

La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se requiere al fosfato de piridoxal.

Material Asa bacteriolgica Mechero bunsen Medio MIO Reactivo de Kovacs o Erlich

Material biolgico Cepas microbianas

Procedimiento
Tal como ocurre con muchas pruebas bioqumicas, los resultados de una prueba de indol se indican con el cambio de color que sigue a la reaccin. El cultivo bacteriano puro debe ser sembrado en un caldo con triptofano o peptona estriles o ambos por 24 a 48 horas antes de
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realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de reactivo Kovac (alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehdo y cido clorhdrico concentrado al caldo del cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich's (usando alcohol etlico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Ehrlich), en especial si se tiene un organismo que no sea fermentador y en organismo anaerbico. Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la presencia de escatol, tambin conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible producto de la degradacin del triptfano.

Bacteria indol positiva

Resultado Positivo para prueba de Indol

Las bacterias que resultan indol positivas al romper el indol del triptfano, incluyen:
Aeromonas hydrophilia, Aeromonas punctata, Bacillus alvei, La mayora de los Citrobacter spp., Edwardsiella spp., Escherichia coli, Flavobacterium spp., Haemophilus influenzae, La mayora de los Proteus spp. (excepto P. mirabilis), Plesiomonas shigelloides, Pasturella multocida, Pasturella pneumotropica, y FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Vibrio spp.

Bacteria indol negativa

Las bacterias que generan un indol negativo en esta prueba, incluyen:
Actinobacillus spp., Aeromonas salmonicida, Alcaligenes spp., La mayora de los Bacillus spp., Bordtella spp., Enterobacter spp., La mayora de los Haemophilus spp., La mayora de los Klebsiella spp., Neisseria spp., Pasturella haemolytica, Pasturella ureae, Proteus mirabilis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Serratia spp., Yersinia spp.

Cuestionario 1. Para diferenciar que tipo de microorganismos se realiza una prueba de indol? 2. Cul es la reaccin que se lleva a cabo en dicha prueba? 3. A que se debe el color del anillo formado? 4. Que es el triptfano? 5. Que tipo de reaccin se lleva a cabo?

Referencias
MacFaddin, Jean F. "Biochemical Tests for Indentification of Medical Bacteria." Williams & Wilkins, 1980, pp 173 - 183

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Practica 4

Coagulasa

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA G X50 000 (MET technique par cryofracture) S. aureus forma una cpsula de fibrina que le protege del sistema inmunolgico de una vaca

La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que permite la conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distingir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus.Esta protena tambin es producida por Yersinia pestis.[1] La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibringeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa esta estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor . La coagulasa Bound es parte de una familia ms grande de MSCRAMM Se piensa que la toxicidad de Staphylococcua aureus es debida a la presencia de coagulasa, adems de las enterotoxinas que posee. Material Laminillas Tubo de ensaye Agitador de madera (palillos)

Material biolgico Plasma de conejo con EDTA Cepas bacterianas (S.aureus)

Prueba de la coagulasa
Prueba de la Coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus del coagulasenegative staphylococci. S.aureus produce 2 formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada tambin conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la realizacin de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo.
Prueba de portaobjetos

Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto aglutinacin. Se ponen 2 gotas de solucin salina en el portaobjetos microescpico rotulado con un nmero de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la prueba de organismo mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un palo de madera. Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)[1] ) en la gota de
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solucin salina inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.
Si es positivo: Se podr observar aglutinacion macroescopica en el plasma en los 10 segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota de solucion salina. Si es negativo: No se observara aglutinamiento.

NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberia hacerse una prueba de tubo como confirmacin. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto aglutinacin y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.
Prueba del tubo de ensayo

cogulos formados por la reaccin de la coagulasa en un tubo de ensayo

La prueba se utiliza plasma que ha sido incoculado con una colonia de staphylococcal (por ejemplo, con un coco gram positivo catalasa positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1 horas. Si es negativo entonces continuamos la incubacion por unas 18 horas.
Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagular,[2] dando como resultado un cogulo (a veces el cogulo esta tan desarrollado que el liquido se solidifica completamente). Si sale negativo, el plasma permanece liquido. Un resultado negativo podria indicar que se podra tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas mas precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o mtodos de BBL CRYSTAL. Lista de staphylococci coagulasa positivo : Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Staphylococcus delphini, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans.

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Lista de' 'staphylococci coagulasa negativo de relevancia clinica: S.saprophyticus, S.cohnii subsp. cohnii, S.cohnii subsp. urealyticum, S.captitus subsp. captitus, S.warneri, S.hominis, S.epidermidis, S.caprae.

Cuestionario.
1. 2. 3. 4. 5. Que es la coagulasa .? Cmo actua? Podria emplear plasma humano en lugar de conejo en la prueba? Menciona algunas bacterias coagulasa positiva Mencione algunas bacterias coagulasa negativo

Referencias
1. A.Forbes, Betty; Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. BAILEY& SCOTT'S Diagnostic Microbiology (Tenth Edition edicin). Don Ladig. pp. 430 431. ISBN 8-8151-2535-6. 2. coagulase test en el Diccionario Mdico de Dorland

Practica 5
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Prueba de la Oxidasa
Principio del formulario Final del formulario

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asmismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpuranegruzco intenso. Realizacin de la prueba:
1. Mtodo en placa directa

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

1. Mtodo indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
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Prueba de la Fundamento

oxidasa Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C oxida al NNN'N',tetrametil,1-4,fenilendiamina (solucin acuosa al 1% (p/v). La oxidacin se detecta como color azul.

Material reactivos

y Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm) ;Placas de Petri ;Reactivo de oxidasa: Solucin al 1% de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada. El reactivo de oxidasa es bastante txico, manejar con precaucin. Se altera por la luz y el oxgeno, por lo que debe ser de preparacin extempornea y protegerse envolvindolo con papel negro 1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de Petri. 2-Aadir una gota del reactivo de oxidasa. 3-. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de forma rpida y con un asa de platino nueva o con un palillo de dientes)

Mtodo

Resultado

La reaccin positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos La imagen muestra varias bacterias que carecen de citocromo c oxidasa terminal y dos que las poseen (posiciones sobre las 11 y sobre las 13)

Cuestionario. 1. La prueba de oxidasa, Para que nos sirve? 2. Que es el citocromo C .? 3. Cuando se da como positiva .?
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Helicobacter Pylori Urease drawn from PDB 1E9Z.

Practica 6
Prueba de la Ureasa
La ureasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de urea a dixido de carbono y amonaco. La reaccin ocurre de la siguiente manera:
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(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3 En 1926, James Batcheller Sumner demostr que la ureasa es una protena. Es producida por bacteria, hongos y varias plantas superiores.

Caractersticas
Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol. Metal en el sitio activo: Niquel(II). pH ptimo : 7.2 Temperatura ptima: 50 C Especificidad enzimtica: urea e hidroxiurea. Inhibidor enzimtico: metales pesados.

Diagnstico

prueba de ureasa

Los organismos que producen ureasa tienden a ser patgenos del tracto gastrointestinal o urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el cido presente en estos medios acdicos. Los patgenos ureasa positivos, incluyen:
Helicobacter pylori Bacterias entricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia. Nocardia, una bacteria filamentosa. Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma. Cryptococcus, un hongo oportunista.

Prueba de la Ureasa
Se cultiva el microorganismo en investigacin en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del esterilizado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.[1][2]

Referencias
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 1. Prueba de la Ureasa. 2. http://www.joseacortes.com/galeriaimag/microorganismos/ureasa.jpg Obtenido de title=Ureasa&oldid=52803945 http://es.wikipedia.org/w/index.php?

Practica 7
OF Oxidacin Fermentacin
En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO gas . el oxigeno es el aceptor final de electrones, en el metabolismo respiratorio,en condiciones anaerobias en ausencia de un aceptor de electrones como nitrato, las bacterias solo pueden utilizar la glucosa por va fermentativa. En el laboratorio empleamos el medio de OF, para el ensayo de oxidacin fermentacin o medio de Hugh y Leifson para evaluar la capacidad de oxidar y fermentar produciendo acido que se detecta gracias al azul de bromotimol, como indicador, que vira a amarillo al acidificarse el medio . La degradacin se estudia con aporte de aire (con lo que es posible la degradacin oxidativa y fermentativa) y sin aire (solo la degradacin fermentativa). Metabolismo de carbohidratos de algunas especies importantes. Microorganismo Alcalig.fecalis Ps.aeruginosa Bact.anitratum S.dysenteriae S.sonnei Vibrio comma S.enteritidis E.coli S S S S S SG SG glucosa Aero anae S S S SG SG lactosa aero S S SG anae S SG sacarosa aero S ana S -

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Significados de los signos: = reaccin neutral o alcalina S = formacin de acido SG =formacin de acido y gas Material. Material biolgico Cepas a investigar Asa bacteriolgica Mechero bunsen Parafina Aceite mineral Medio OF con glucosa Estufa bacteriologica

Procedimiento 1. A partir de un cultivo de la cepa a investigacin , que se encuentre lo mas posible en fase logartmica, se siembra por picadura,hasta el fondo , dos tubos conteniendo el medio OF 2. Uno de los tubos se sella colocando una capa de aceite mineral y despus una de parafina. 3. Se incuban por 48 horas 4. Anote sus resultados Cuestionario 1. Mencione brevemente como se lleva a cabo el metabolismo oxidativo 2. Mencione brevemente en que consiste un metabolismo fermentativo 3. explique como funciona el medio OF .? 4. En base a que escogera el azcar que se pondra al medio OF? 5. Cual es el objeto de sellar un tubo?

Practica 8 MOTILIDAD
Introduccin.
La quimiotaxis es el movimiento que lleva a cabo un organismo para acercarse a una sustancia qumica o alejarse de ella. La quimiotaxis positiva se refiere a los movimientos para acercarse a dichja sustancia y se presenta cuando sta es benfica para ellas (ejemplo
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un nutriente) . la quimotaxis negativa es el movimiento para elejarse de una sustancia que le es perjudicial. Las sustancias qumicas que inducen le quiniotaxis positiva se llaman atrayentes y las negativas repelentes. . La quimiotaxis es un fenmeno de comportamiento y sugiere cierto tuipo de respuesta nerviosa. La mayora de los trabajos se ha llevado a cabo en dos especies, E.coli y S,typhimurium. Al analizar un gran numero de clulas podemos ver que el comportamiento bacteriano se divide en dos tipos de accin , que reciben el nombre de corridas y vueltas. ,el resultado final es que el microorganismo se mueve hacia el atrayente o se aleja del repelente. Y es el mecanismo sensorial qumico el que controla este movimiento. Por medio de una gran cantidad de estudios bioqumicos se ha demostrado que las bacterias poseen quimioreceptores especficos, que perciben la presencia de un compouesto. estos quimioreceptores son protenas situadas en la periferia de la clula y se unen a la substancia qumica. Las protenas de enlace que participan en la quimiotaxis son, en algunos casos las mismas que participan en el transporte de los nutrientes al interior de las clulas. Se han identificado por lo menos 4 proteinas citoplasmticas que participan en el proceso de emisin de seales . dos controlan la direccin de la rotacin flagelar y otras dos la exitacin flagelar. Obviamente la quimiotaxis es el resultado de una serie de reacciones reguladoras en cascada. El movimiento bacteriano pude ser por medio de flagelos, cilios y amiboideo. Objetivo Empleando medios de cultivo diseados para este fin, observar la movilidad de algunas cepas bacterianas.

El medio de cultivo es un medio semislido con tripteina , que es un digestivo pancretico de la casena, constituye una fuente de nitrgeno, aminoacidos y carbono necesarios para favorecer el crecimiento bacteriano. Adems contiene triptfano que permite la deteccin de triptofanasa, por liberacin de indol y cloruro de sodio que permite mantener el balance osmtico del medio y agar como agente solidificante.

Material Asa bacteriolgica Mechero bunsen Estufa bacteriologa Microscopio SSI Portaobjetos Cubreobjetos
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Medio MIO o SIM Cepas a investigar.

Material biolgico

Procedimiento 1. Sembrar el medio a partir de un cultivo de 18-24 horas por puncin profunda en linea recta 2. Incubar de 24-48 horas 3. Montar una preparacin en fresco de las diferentes cepas y observar al microscopio para determinar por examen en fresco si son miviles o no. 4. Revisar el cultivo y anotar los resultados Cepas mviles : producen turbidez que se extiende mas alla de la lnea de siembra Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lines de siembra.

Cepa Escherichia coli Klebsiella Shigella Salmonella typhimurum Proteus Cuestionario

Movilidad + + +

1. Explique a que se refiere el movimiento corridas y vueltas 2. Qu es una sustancia atrayente y una repelente? 3. Cules son los medios de que se basa una bacteria para llevar a cabo su quimotaxis?

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Practica 9 Reduccin de sulfatos y produccin de HS

Introduccin
Varios compuestos inorgnicos de azufre son importantes aceptores de electrones en la respiracin anaerobia.el sulfato, la forma mas oxidada de azufre, es uno de los principales aniones en el agua de mar y se utiliza por las bacterias reductoras de sulfato, grupo que esta muy ampliamente distribuido en la naturaleza. El producto final en la reduccin del sulfato es HS, un importante producto natural que participa en muchos procesos biogeoquimicos.comprende metabolismo de asimilacin cuando se reduce para usarlo como fuente de nutriente y de desasimilacin cuando se usa como aceptor de electrones para el metabolismo de energa .las bacterias utilizan el sulfato como fuente de azufre para la biosntesis., pero la capacidad de utilizar el sulfato como aceptor de electrones para los procesos de generacin de energa esta restringuido a un grupo muy especial de bacterias anaerobias obligadas. En la reduccin asimilativa de sulfato, el HS que se forma se convierte en azufre organico en forma de aminocidos, etc., pero en la reduccin desasimilativa del sulfato se excreta como HS. las bacterias reductoras de sulfato,son suceptibles a la toxicidad del HS, pero en general hay suficiente hierro en el ambiente en que viven , que todo el HS formado se elimina como FeS . el color negro donde se efectuar reduccin de sulfatos se debe a la acumulacin de FeS.+ Un medio de cultivo que nos permite observar esta reduccin de sulfatos es agar XLD (xilosa-lisina-desoxicolato). Forma de actuacin. La degradacin a acido de la lactosa,xilosa y sacarosa produce un viraje a amarillo del rojo de fenol que tiene como indicador. El tiosulfato y la sal de hierro III (citrato de amonio y hierro III) que contiene revelan la formacin de acido sulfihidrico por la precipitacin de FeS negro en las colonias.las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la presencia de un alo rojo-purpureo, debido al aumento de pH , alrededor de sus colonias. Colonias HS + + + microorganismo E.coli, Enterobacter, Aeromonas Klebsiella Citrobacter(cepas lactosa-positivas) Serratia Proteus vulgaris , P.mirabilis Salmonella
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Material Asa bacteriolgica Mechero bunsen Placas de agar XLD Estufa

Material Biologico Cepas

Procedimiento
1. Con una cepa de 18-24 horas inocular por estria cruzada placas de medio XLD 2. Incubar de 18-24 horas 3. Revisar y anotar resultados

Cuestinario
1. Describa brevemente el mecanismo para la reduccin de sulfatos tanto la va asimilativa como la desasimilativa. 2. Por qu es toxico el HS para los organismos en general? 3. Qu sucede en el interior de las minas con la presencia de HS y como se neutraliza este efecto?

Practica 9 Respiracin anaerbica

El proceso anaerbico es un proceso biolgico de oxidorreduccin de monosacridos y otros compuestos en el que el aceptor terminal de electrones es una molcula inorgnica
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distinta del oxgeno, y ms raramente una molcula inorganica cadena transportadora de electrones anloga a la de la mitocondria en la respiracin aerbica.[1] No debe confundirse con la fermentacin, que es un proceso tambin anaerbico, pero en el que no participa nada parecido a una cadena transportadora de electrones y el aceptor final de electrones es siempre una molcula orgnica como el NAD. En el proceso anaerbico no se usa oxgeno, sino que para la misma funcin se emplea otra sustancia oxidante distinta, como el sulfato o el nitrato. En las bacterias con respiracin anaerobia interviene tambin una cadena transportadora de electrones en la que se reoxidan los coenzimas reducidos durante la oxidacin de los substratos nutrientes; es anloga a la de la respiracin aerobia, ya que se compone de los mismos elementos (citocromos, quinonas, protenas ferrosulfricas, etc.). La nica diferencia, por tanto radica, en que el aceptor ltimo de electrones no es el oxgeno. Todos los posibles aceptores en la respiracin anaerbica tienen un potencial de reduccin menor que el O2, por lo que, partiendo de los mismos sustratos (glucosa, aminocidos, triglicridos), se genera menos energa en este metabolismo que en la respiracin aerobia convencional. No hay que confundir la respiracin anaerbica con la fermentacin, en la que no existe en absoluto cadena de transporte de electrones, y el aceptor final de electrones es una molcula orgnica; estos dos tipos de metabolismo tienen solo en comn el no ser dependientes del oxgeno. En la siguiente tabla se muestran distintos aceptores de electrones, sus productos y algunos ejemplos de microorganismos que realizan tales procesos:

Aceptor Nitrato Sulfato Azufre CO2 Fe3+ Mn4+ Selenato Arsenato Fumarato

Producto final Nitritos, xidos nitrgeno y N2 Sulfuros Sulfuros Metano Fe2+ Mn2+ Selenito Arsenito Succinato

Microorganismo de Pseudomonas, Bacillus Desulfovibrio, Clostridium Thermoplasma Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus Shewanella, Geobacter, Geospirillum, Geovibrio Shewanella putrefaciens Desulfotomaculum Wolinella succinogenes, Desulfovibrio, E. coli Campylobacter, Escherichia Desulfomonile FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

DMSO DMS TMAO TMA Clorobenzo Benzoato ato

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Muchas bacterias aerbicas contienen las enzimas nitrato-reductasas que catalizan la reduccin de nitrato a nitrito:[2]

NO3 + 2e + 2H+ NO2 + H2O

No obstante, el producto resultante (nitrito) es muy txico por lo que algunas especies de Pseudomonas y Bacillus pueden reducir el nitrato ms all del nivel de nitrito hasta nitrgeno molecular:
2NO3 + 10e + 12H+ N2 + 6H2O

El resultado final, nitrgeno, es un gas inerte y no txico. Este proceso se conoce como desnitrificacin que, si se produce en el suelo se considera perjudicial para la agricultura ya que ocasiona la prdida de los nitratos, necesarios para el crecimiento de las plantas.[1] Las bacterias reductoras de nitratos son anaerobias facultativas ya que el uso de nitratos y nitritos como aceptores de electrones son procesos alternativos que pueden utilizar estas bacterias para crecer en ausencia de oxgeno. En presencia de l, aunque el nitrato est presente, la respiracin procede enteramente a travs de la cadena aerbica de transporte de electrones.

Objetivo: empleando el medio de cultivo diseado para este fin poner de manifiesto la
reduccin de nittratos a nitritos.

Glucosa Nitrato Agar

Medio desarrollado por Casellas, para estudiar simultneamente la reaccin de oxidacin o fermentacin de glucosa y la reduccin de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fcil desarrollo. Esta prueba es til para diferenciar especies bacterianas. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, la glucosa es la fuente de energa y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. El contenido de agar, otorga la propiedad de ser un medio semislido, que permite determinar la movilidad y la distribucin de los productos cidos sobre la superficie o en el medio de cultivo. Algunas bacterias pueden fermentar anaerbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos mtodos, mientras que otras son incapaces de usarla. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para esos procesos finales. Estas diferencias ayudan a la identificacin bacteriana.
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La hidrlisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el azul de bromotimol de verde a amarillo Si este viraje ocurre solo en la parte superior del tubo, indica oxidacin de la glucosa; si todo el medio vira al amarillo, hay reaccin fermentativa, y si no vira o adquiere un color azulado,se presume que el microorganismo no utiliza glucosa. En este medio, adems, puede detectarse la movilidad observando si el crecimiento se aleja de la lnea de puncin, enturbiando el medio. La reduccin del nitrato a nitrito o gas nitrgeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess A (B15-501-61) y Griess B (B15-502-61) Britania, dando un compuesto diazoico coloreado. Si se observan burbujas en el medio, stas son de gas nitrgeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones. Frmula (en gramos por litro) Peptona Cloruro de sodio Extracto de carne Glucosa Agar Azul de bromotimol Nitrato de potasio pH final: 7.4 0.2 Siembra Por puncin en profundidad con ansa recta, a partir de un cultivo puro de 24 horas. Incubacin Durante 48 horas, a 35-37 C, en aerobiosis. Algunos microorganismos requieren hasta 4 das, y otros hasta 14 das de incubacin. Resultados 1-Metabolismo de la glucosa: -Microorganismos oxidativos: color amarillo en la parte superior del tubo. -Microorganismos fermentadores: color amarillo en todo el medio de cultivo. -Microorganismos que no fermentan y no oxidan la glucosa: el medio permanece verde o adquiere un color azulado. 2-Movilidad: -Positiva: presencia de turbidez que se extiende mas all de la lnea de siembra. -Negativa: solo se observa turbidez en la lnea de siembra.
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Instrucciones 10.0 5.0 3.0 10.0 4.0 0.01 1.0 Suspender 33 g de polvo por litro de agua destilada. Dejar embeber 2 minutos. Calentar a ebullicin hasta disolver. Distribuir en tubos de 10 mm de dimetro, 10 ml por tubo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Si no se usa de inmediato, hervir el medio antes de usarlo, a fin de eliminar el oxgeno. Solidificar en posicin vertical.

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3-Reduccin de nitratos: -Positiva: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. - Negativa: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. Notas: Los microorganismos que al reducir los nitratos a travs de la enzima nitrato reductasa, liberan gas nitrgeno, producen un resultado falso negativo con la metodologa detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo, agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitir dar el resultado definitivo de la prueba de reduccin de los nitratos. -Prueba Positiva: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de Zinc. -Prueba Negativa: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de Zinc.

Microorganismo Escherichia 25922 coli

Reduccin nitratos ATCC ATCC + + + + -

de

K. pneumoniae 700603

P. aeruginosa ATCC 27853 S. flexneri ATCC 12022 Acinetobacter spp. O: Oxidacin. F: Fermentacin.

Notas: frecuentemente, en la reduccin de nitratos a nitritos, los productos finales pueden ser nitritos (NO2), amonaco (NH3), nitrgeno molecular (N2), xido ntrico (NO), oxido nitroso (N22) o hidroxilamina (R-NH-OH).

Cuestionario.
1. Cul es la diferencia entre fermentacin y respiracin anaerobia? 2. escriba la reaccin que sse lleva a cabo en el medio de cultivo que nos permite identificar la reduccin de nnitratos.
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3. como se elimina el amoniaco,que se produce?

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Practica 10
Proyecto final
Desarrollo de bateras para identificacin de microorganismos Con los conocimientos adquiridos en este laboratorio y a lo largo de la carrera el alumno podr desarrollar bateras que comprendan las pruebas necesarias para la identificacin de diversos microorganismos.

Procedimiento.
Identificar Escherichia coli de Shigella sonnei y Klebsiella pneumoniae. Identificar Proteus vulgaris de Salmonella typhimurum Identificar Staphyloccoccus aureus de Streptococcus agalactie
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Identificar Vibrio comma de Escherichia coli Identificar Haemophilus influenzae de Yersinia

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