INSTITUI-O

DE

PESQUISAS

ENERGTICAS

NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

COMPARAO DO TESTE DA CLONIDINA COM 0 TESTE DE TOLERNCIA k INSULINA NA AVALIAO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA

MARCELO CIDADE BATISTA

Tese apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Doutor em Tecnologia Nuclear.

Orientador: Prof. Dr. tflilan Nicolau

SAO PAULO 1986

AOS HEUS

PAIS

JOO E DILZA

A LENA

cujo carinho e apoio se encontram escritos trabalho. em cada pgina deste

tOM!5SO MAClONAL DE tr.e I. P. . ,.

r:.3AR/SP

AGRADECIMENTOS

Esta tese resultou da colaborao t influncia de vrias pessoas, is quais expresso minha gratido: Ao Prof. Dr. Wilian Nicolau, orientador e sobretudo amigo, cujo estimulo e participao pessoal foram de fun damentai importncia para o meu desenvolvimento na rea de Endocrinologia e Radioimunoensaio, culminando, agora, com a realizao deste trabalho. Ao Dr. Jlio Kieffer (in memorian), ex-orientador e responsvel por minha formao em Medicina Nuclear, por me Incentivar a ingressar no curso de ps-graduao. Dra. Constncia Pagano Gonalves da Silva, ex-orientadora, pelo apoio dado durante a realizao dos cursos e seminrios de area. Ao Dr. Walter Bloise, Dra. Berenice Bilharinho de Mendona e Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold, responsveis por minha formao clinica na rea de Endocrinologia. Suas valiosas sugestes contriburam multo para a elaborao deste tra balho. Ao Dr. Francisco Homero D'Abronzo, que me auxiliou e orientou no desenvolvimento da parte metodolgica d e s t e trabalho.

''-Wll-l DE Vr~

- "A" SP

A Maria Angel Henrfques Zanella Fortes, mino, pela colaborao tc!c indispensvel no mento do radioimunoensaio s SH.

Isabel

Cristina de Hello Guazzelii e Antonio CSneido Pinheiro Palodesenvolvi-

Dra. Sandra Ma>*a Villares. pela participao na dosagem do: hormnios pepndicos e soBatonedina C. A todos os moic:.s estagirios e residentes trabalharam na Unidade d* o>adas e Intersexo 1985-86, em especial i Dra. 5niornar Madurcira estimulo. A Valeria S*"iuel Undo, Maria Beatriz da Fonte Kohec, e Norma no e ano Dra. que de Edna

Regina Nakandakare, pelo afilio na realizao dos testes de

T3nid Cecilio Silva, Dbora Gonalves de Carvalho e esterides. Ao Dr. Paulo Lu<z k^iirrt Costa, pela na anlise estatstica dos

Cherem, pela participao rt dpsagem dos hormnios peptfdicos

colaborao

Ao Dr. Rui Montei 10 de Barros Maciel, pelo forneci^ mento de preparaes hormonais de referenda. FAPESP - Fuhdeao de Amparo i Pesquisa do Estado de SSo Paulo, pelo apoio financeiro concedido durante a realizao deste trabalho.

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Este trabalho foi realizado na Diviso de CHnica Mdica I do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sio Paulo.

r-L DE ENERGIA U\CLEAR, SP

; r\ E. ij. .

NDICE

I II III IV V V
VII VIII IX

-RESUMO -ABSTRACT -INTRODUO -OBJETIVOS -CASUSTICA - MATERIAL E MTODOS

-RESULTADOS -DISCUSSO -CONCLUSES

1 5 9 19 21 23
87 125 138

- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

140

'" -'' ~~ C F : E R G : A . .. " . Z. li.

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I -

RESUMO

J !

COMPARAO DO TESTE DA CLONIDINA COM O TESTE DE TOLERNCIA A INSULINA NA AVALIAO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA
MARCELO CIDADE BATISTA

RESUMO
Foram estudados 31 pacientes, com idade entre 2,9 abaixo

e 17,5 anos e altura entre 1,3 e 8,5 desvios-padres

da mdia para sexo e idade. Todos foram submetidos a 2 testes de liberao de GH: (1) teste de tolerncia insulina

(ITT): insulina simples 0,1 U/kg de peso por via endovenosa, com coletas de sangue nos tempos de -30, O, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos; (2) teste da cionidina (TCLO): cionidina

0,0375 mg/m* de superfcie corprea por via oral, com coletas de sangue nos tempos de -30, 0, 30, 60, 90 e 120 minutos. 0

6H foi dosado em soro por mtodo de radioimunoensaio desenvo^ vido em nosso laboratrio e padronizado por comparao com

preparaio de referncia fornecida pelo "National Institutes of Health". A sensibilidade do mtodo foi de 1,1 0,08 ng / ml (mdia + erro padro da mdia), a variao 1ntraensa1o 5,6, 4,7 e 4,2Y e a interensaio de

de 19,4, 8,7 e 12,6% para

amostras-controie de 6H contendo 1,9, 8,3 e 25,2 ng/ml, respectivamente. A especificidade foi considerada adequada com ;?:C'.

. _*.P/3P1 :. ..

base ea estudos de Imunorreatividade cruzada e dos efeitos no especficos do meio de Incubao. Fora considerados normais quanto secreo de 6H 9 crianas (Grupo IA) e 12 adolescentes (Grupo IB) que preen^ chiam 3 ou mais dos seguintes critrios: ausncia de sinais

tpicos de nanismo hipofisrio; ritmo de crescimento normal; dosagem srica normal de somatomedina C (SmC) e pico de libe raSo de GH maior do que 7,0 ng/ml em pelo menos um teste de estimulo (ITT ou TCLO). Foi estabelecida deficincia de GH

em 8 crianas (Grupo ZA) e 2 adolescentes (Grupo 2B), que apresentavam sinais tpicos de nanismo hipofisrio e/ou ritmo de crescimento diminudo, SmC baixa e pico de GH menor do que 5,0 ng/ml nos 2 testes provocativos (ITT e TCLO). No TCLO, os nicos efeitos colaterais observados foram Mpotenso e sonolncia discretas, ao passo que todos

os pacientes apresentaram hpogicemia (< 45 mg/dl) no ITT, , acompanhada por sudorese, n&useas, mal-estar geral e sonoiri cia. Nos Grupos IA e 16, os picos de liberao de GH foram de 10,3 + 1,7 (mdia ; erro padrSo da mdia) e 15,3 + 2,8 ng/ml _ * _ no ITT e de 14,8 2,4 e 12,2 + 3,5 ng/ml no TCLO, respecti_ _ vamente. Estes valores no foram considerados estatisticamente diferentes (p > 0,05) quando comparados pelo teste "IP de Mann-Whitney. A Incidncia de resultados faiso-negativos 28,6 e 9,19 p*

(pico < 7,0 ng/ml) nos Grupos IA e IB foi de

rs o ITT * de 11,1 e 58,3X par* o TCLO, respectivamente. No

Grupo 2A, os picos de GH observados no ITT e TCL

foram de

0,89 + 0,08 e 1,1 0,08 ng/ml, respectivamente, sendo signj^ _ ficantemente menores (p < 0,05) do que os do Grupo IA e no ultrapassando 2,3 ng/ml em nenhum teste. No foi calculada a mdia dos picos no Grupo 2B, j que este era constitudo por apenas ? pacientes, cujos valores mximos foram de 0,9 e

3,5 ng/ml no ITT e 1,7 e 4,8 ng/ml no TCLO, respectivamente. Conclui-se que o TCLO apresenta maior eficincia de causar

de liberao de GH do que o ITT em crianas, alm

efeitos colaterais menos graves. Deve, portanto, ser considerado o teste de eleio para excluir o diagnstico de nanismo hipofisrio na idade pr-puberal, que engloba a maioria dos pacientes com dficit de crescimento. Et adolescentes,

no entanto, o TCLO foi menos eficiente do que o ITT para excluir deficincia de GH, devendo ser utilizado apenas teste complementar. Quando ambos cs testes so como

realizados hipofisSrio

em um mesmo paciente, o diagnstico de nanismo

pode ser estabelecido com segurana prxima a 100%, sugerindo que esta deva ser a conduta preferida naqueles com clinica desta patologia. suspeita

.-: r '} -. '

II -

ABSTRACT

COMPARISON OF THt CLONIDINE TEST WITH THE INSULIN TOLERANCE TEST IN THE EVALUATION OF PATIENTS WITH SHORT STATURE
MARCELO CIDADE BATISTA

ABSTRACT
He studied 31 patients aged 2.9 to 17.5 years, with heights from 1.3 to 8.5 standard deviations below the mean (1)

for age and sex. All underwent 2 6H provocative tests: Insulin tolerance test (ITT):

Intravenous regular Insulin

0.1 U/kg body weight with samples drawn at -30, 0, 15, 30, 45, 60 and 90 minutes; (2) clonidine test (CLOT): oral at

clonidine 0.0375 mg/m* surface area, with samples drawn

-30, 0, 30, 60, 90 and 120 minutes. Serum GH was measured by a rad1o1mmunoassay method developed in our own laboratory and calibrated against a reference preparation provided by the National Institutes of Health. The sensitivity of the method was 1.1 + 0.08 ng/mi (mean + standard error of the mean), _ and 4.2* and an 12.61 for quality

with an Intraassay precision of 5.6, 4.7 Interassay precision of 19.4, 8.7 and

control samples of 1.9, 8.3 and 25.2 ng/ml, respectively. An adequate specificity was demonstrated by cros$-react1v1ty studies and by assays designed to test non-specific effects

of the medium used for Incubation. A normal GH secretory reserve was established In 9 children (Group 1A) and 12 adolescents (Group IB), who had 3 or more of the following features: absence of typical signs of pituitary dwarf 1 sin; normal growth rate; normal serum

somatomedin C (SmC) measurement and peak GH responses greater than 7.0 ng/mi In at least one provocative test (ITT or CLOT). Eight children (Group 2A) and 2 adolescents (Group 2B) were diagnosed as GH deficient by the presence of typical signs of pituitary dwarfism and/or reduced growth rate, low serum SmC and a less than 5.0 ng/mi GH response to 2 provocative tests (ITT and CLOT). Slight hypotension and drowsiness were the side-effects observed during CLOT, whereas all patients hypoglycemia (< 45 mg/dl) in ITT, associated with nausea, malaise and drowsiness. only had

sweating,

In Groups 1A and IB, peak GH

responses were 10.3 + 1.7 (mean + standard tr.or of the mean) and 15.3 2.8 ng/rol for ITT and 14.8 2.4 and 12.2 + 3.5 ng/ml for CLOT, respectively. These values were not statistically test of Mannfor

different (p > 0.05) when compared by the "U" -Whitney.

False-negative results (peak i 7.0 ng/ml)

Groups 1A and IB were 28.6 and 9.U for ITT and 11.1 and 58.3X for CLOT, respectively. In Group 2A, peak 6H responses for

ITT and CLOT were 0.89 * 0.08 and 1.1 0.08 ng/ml, respectively, with no response greater than 2.3 ng/ml. These values were

significantly lower (p < 0.05) than the ones Group 1A.

observed

in

It was not possible to calculate mean peak levels this for

for Group 2B, since only 2 patients were included in group. Their peak GH responses were 0.9 and 3.5 ng/ml

ITT and 1.7 and 4.8 ng/ml for CLOT, respectively. We conclude that the clonidine test with a low-oral dose of 0.0375 mg/m* is more effective than ITT in promoting GH release in children, besides being associated dangerous side effects. provocative test It should be considered the diagnosis of with less

the best pituitary most

to exclude

dwarfism in the prepubertal age, which encompasses patients with growth retardation.

Nevertheless, the clonidine

test is less effective than ITT to exclude GH deficiency in adolescents and should be used only as a complementary In pubertai patients. When both tests are performed in test a

single patient, pituitary dwarfisn is very rarely nisdiagnosed, suggesting that this should be the preferred this disorder Is clinically suspected. approach when

COMISSO KMiQML OE EKERGiA NUCLEAR/SP

!. '<'. E . W

Ill -

INTRODUO

10

A somatotrofina (GH) o hormnio ais abundante da hipfise humana, estando presente em quantidades de 5 a 10 mg em cada glndula. Ele sintetizado e armazenado nas clulas somatotrficas, correspondentes a 35 a 45* da pituitria e localizadas predominantemente nas suas asas laterais. Seu

ritmo de secreo dirio de 1 a 2 mg, desaparecendo do pias ma com uma meia vida de 20 a 25 minutos (12). 0 GH presente em extratos hipofisrios e no plasma corresponde a uma mistura heterognea de pelo menos 6 pe 0 com

tideos, identificados por seu tamanho ou carga (42).

ponente fisiolgico predominante consiste em uma cadeia polj^ peptfdica nica, contendo 191 aminocidos e com peso molecular de 22.000 daitons. 0 papel primordial do 6H consiste no controle do crescimento somtico ps-natal. Quando administrado a criaji as com hipopituitarismo, ele estimula o crescimento proporcionado do esqueleto e tecidos moles, associado a balanos positivos de nitrognio, potssio, clcio, fsforo e nagnsio. Acredita-se que esta aio seja mediada principalmente

pela geralo das somatomedinas (57), embora alguns estudos

11

"1n vitro" tenhas demonstrado UM possvel efeito estimuiatrio direto do 6H sobre r crescimento longitudinal dos ossos (34). As somatomedinas corresponde* a una famlia de pe tideos cujos 2 principais componentes, dencainados "insulin-like growth factors" I (somatomedina C) e II, tm peso mole cuiar de 7.500 daitons (57). So sintetizadas principalmente no ffgado e sua ao sobre o crescimento somtico consiste em promove** a mitogenese e estimular a sntese de colgeno e proteoglican. Circulam no sangue ligadas a protenas carregadoras de alto peso molecular (145.000 daltons), formando

complexos proteicos que as protegem contra a protelise e as conferem mela vida maior e flutuao sangnea menor do que

s dos demais hormnios peptidicos. Esta caracterstica per_ mite que os nveis sricos de somatomedina C (SmC), cuja secr o diretamente controlada pelo GK, possam ser utilizados como ndice de secreio da somatotrofina (75)'. A secreio de GH regulada pelo hi potalamo atravs de 2 peptideos sintetizados ao nvel dos ncleos ventromediai e arqueado: a somatocrinina (6RH) e a somatostatina (SS), gentes estimilador e inibidor da secreio h1pof1sir1a de GH, respectivamente. Atravs de mecanismo de "feedback" negativo, concentraes sricas de 6H e somatomedinas atuam diretjs mente sobre o hipotfilamo, aumentando ou reduzindo a liberao de 6RH e SS. As somatomedinas tambm agem ao nvel da h1p6-

\2

fise, ciminuindo a resposta das clulas somatotrficas ao 6RH (44). Mecanismos de controle neural exerce importante

ao sobre o hipotlamo, participando tambm d? regulao da secreo de GH. A ativao dos receptores -adrenrgicos e

serotoninrgicos centrais promove a liberao de 6RH e, conseqentemente, de 6H (44) ao passo que o bloquei o dos receptores colinrgicos inibe esta resposta (13). Por outro lado, a es timulao dos receptores e-adrenrgicos centrais provoca 1n^ biSo da secreo de 6H (44). A secreo de 6H episdica, caracterizada pulsos de durao limitada. Na maior part* do dia, por as con

centraes sricas deste hormnio situam-se em nvel Inferior 3,0 ng/ml, C O M 1 a 2 picos moderados ocorrendo 2 a 4 horas aps as refeies. Os valores mximos so detectados aproxi nadamente 1 hora aps incio do sono profundo (estdio III

ou IV), com picos Menores ocorrendo posteriormente durante as fases mais tardias do sono (9,12). Distrbios da secreo de 6H podem resultar em patologias tais como o nanismo hipofisrio, decorrente da defj_ cincia deste hormnio, ou a acromegalia, provocada por tumor produtor de 6H. 0 nanismo hipofisrio corresponde a uma causa rara de retardo de crescimento em crianas, sendo respons-

vel por menos de IX destes casos. Entretanto, o seu d1agn tico multo Importante, j que se dispSe, atualmente, de

13

teraputica adequada para esta doena, como o GK extrado de hipfises humanas ou produzido por engenharia gentica (12). A possibilidade de dficit de GH deve ser considerada em todas as crianas que se apresentarem con baixa esta tura proporcionada, inferior a 3 desvios-padres em relao de

i mdia para sexo e idade (11). Em crianas acima de 5 anos

idade a dosagem srica de SmC corresponde a um bom teste de triagem, praticamente excluindo a presena de nanismo hipofi sirio quando normal (75). Entretanto, quando os nveis encontram-se diminudos, o que pode ser ocasionado por outras doenas como desnutrio e hipotireoidismo, o diagnstico de dficit de GH precisa ser confirmado por estudos da secreo deste hormnio. Estes tambm so necessrios em crianas

abaixo de 5 anos de Idade, nas quais no possvel uma boa discriminao entre valores normais e baixos de SmC (75). A dosagem srica basal de GH no permite,na maioria das vezes, diferenciar entre crianas com e sem deficincia

deste hormnio, j que sua secreo episdica e mantm co centraes sricas baixas durante a maior parte do dia (28). Por este motivo, testes provocativos de liberao de GH foram desenvolvidos, com o Intuito de se poder avaliar a reserva nenhum

hipofisiria deste hormnio. Nio existe, no entanto,

teste que consistentemente promova uma resposta hormonal ade quada em todo paciente sem dficit de GH. Isto ocorre por-

que os diversos estmulos agem ao nvel do hipotllamo atravs

14

de Mecanismos neurals monoaainrgicos, Modificando a secreo de SRH e/ou somatostatina; o efeito no , portanto, direto Por estas ra

sobre as clulas somatotrficas hipofisrias.

zes, o diagnstico de nanismo hipofisrio deve se basear na demonstrao de resposta subnormal do 6H a pelo menos 2 testes provocativos (32). Os testes de estimulo pode* ser divididos em 2 gran des grupos (17):
1t) TESTES DE TRIAGEM

Estes testes consiste na dosage do GH em una nica amostra de sangue coletada 20 a 40 minutos aps o inicio do exercido fisico ou 1 hora aps o inicio do sono. Ape sar de seren fisiolgicos, convenientes, de baixo custo e se efeitos colaterais, apresentam u*a incidncia relativamente alta (ao redor de 30X) de resultados falso-negativos (Indivduos sem deficincia derte hormnio mas com resposta subnormal ao teste) e, porisso, s so

utilizados a nvel ambuiatoriai para excluir o diagnstico de nanismo hipofisSrio em pacientes com baixa suspeita clinica desta patologia.

21) TE8TES DEFINITIVOS Estes testes Implicam na dosagem de 6H em amostras seriadas de sangue coletadas antes e aps administrao de

-,

f -

15

mi estimulo farmacolgico como a insulina, 1-dnpa, argi nina ou glucagon. Apesar de apresentarem uma menor incidncia de resultados falso-negativos (varivel de 10

a 30%), todos esto associados a efeitos colaterais desagradveis, por vezes severos e perigosos. So indica dos em pacientes com caractersticas clinicas de nanismo hipofisrio e/ou resposta subnormal triagem. Entre os testes definitivos, o teste de tolerncia insulina (ITT), embora associado s conseqncias perigose a um teste de

sas da hipoglicemia, parece ser o mais eficiente no que

refere i liberao de 6H, sendo considerado por muitos autores o teste padro C O R O qual os demais devem ser comparados (48). Acredita-se que a hipoglicemia promova a secreo de 6H por estimulao de receptores o-adrenrgicos centrais, j que o bloqueio destes receptores por drogas como a fentolamina inj^ be esta liberao (44). Nos vrios estudos prvios sobre o

ITT (18,20,35,36,56,59,64,72,77), a incidncia de resultados falso-negativos variou de 8 a 265, dependendo do nvel de GH cima do qual a resposta foi considerada normal (5,0, 7,0 ou 10 ng/ml). Em todos, nSo foi observada liberao de 6H nenhum paciente com deficincia deste hormnio. Recentemente, a clonidina, um agonista o-adrenrem

gico central utilizado como snt1-h1pertens1vo (37,55,69), foi Introduxida como novo agente capaz de estimular a secreio

16

de 6H. Esta ao da clonidina, inicialmente demonstrada adultos normais por Lal e col. (38) em 1975,

eu

provavelmente

se deve estimulao de receptores a,-adrenrgicos centrais. Em estudos realizados em macacos Rhesus (5 ), Chambers e

Brown comprovaram que a clonidina atua ao nvel de receptores o-adrenrgicos centrais, n3o tendo qualquer efeito sobre receptores dopaminrgicos ou serotoninrgicos. Em 1978, Gold e col. (26) demonstraram, nestes Mesmos animais, que a administrao de piperoxane, um a-antagonista, bloqueia o aumento da secreo de GH induzido pela clonidina. Outra evidncia por da

da ao a-adrenrgica central da clonidina foi relatada Ganong e col. (22), que observaram que, ps transseco edula espinhal, a resposta do GH a esta droga

permanecia que

Inalterada. Estudos mais recentes em animais indicaram

a clonidina promove a liberao de GH por estimular neurnios hipotalmicos secretores de GRH (44). G1l-Ad e col. (23) foram os primeiros a descrever, em 1979, o uso da clonidina como agente liberador de GH para excluir o diagnstico de nanismo hipofisrio em crianas adolescentes com baixa estatura. Utilizando uma dose de 0,15 mg/m* de superfcie corprea, os autores e oral

demonstra-

ram uma elevao significante da concentrao de GH em todos os pacientes sem dficit deste hormnio. Nos 7 pacientes com hipopUuitarismo, no houve aumento estatisticamente signify
i

cante dos nveis de 6H (mximo de 2,5 ng/mi), com exceSo de

17

1 (pico de 5,5 ng/ml), C O M provivel deficincia GH.

parcial

de

EM estudos Mais recentes, o teste da clonidina rea Uzado com a dose de 0,15 mg/m* foi comparado com o ITT (16, 39,66), 1-dopa (62,71) e arginina (71), sendo em todos obser vado um maior pico de liberao de 6H e uma menor incidncia de resultados falso-negativos no primeiro teste. Em apenas

um trabalho (30), os resultados obtidos no ITT foram equivalentes aos do teste da clonidina no que diz respeito i efi cincia de liberao de GH. Embora a clonidina na dose de 0,15 mg/* seja um

excelente estimulador da secreo de GH, ela provoca sonolrt cia e hipotenso moderadas. Em todos os estudos realizados com esta dose (16,23,30,39,62,63,66,71), houve reduo dos

nveis pressricos que variou de 15 a 25 mmHg para a sistl^ ca e de 10 a 15 mmHg para a diastlica. foii observada hipotenso severa Em u.n relato (47),

associada a choque, que res a

pondeu expanso de volume, levando os autores a chamar ateno para esta possvel complicao do teste.

Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais, alguns autores tentaram realizar o teste da clonidina com d ses menores e fixas tais como 0,025 mg (41), 0,05 ou 0,1 mg (40) ou com a dose de 0,035 mg/m* (11). Em todos estes estti dos, fora observadas sonolncia e hipotensio Multo mais d1s_ cretas do que com 0,15 g/m*, havendo decrscimo de 5 a 15 wwHg

18

na presso sistlica e de 2 a 7 mmHg na diastlica.

Entre-

tanto, os resultados no que diz respeito eficincia de liberao de GH foram muito discrepantes e no relacionados magnitude da dose. Utilizando 0,050 ng de clonidina.

Lanes

e coi. (40) obtiveram picos de GH de 11,6 + 1,6 ng/ml {mdia _ + erro padro da mdia) e resultados falso-negativos de 361, _ enquanto que, no estudo de Laron e col. (41) com a dose 0,025 mg, estes valores foram de 30,6 + 8,8 ng/ml _ e de 8.3X,

respectivamente.

Estas diferenas talvez possam ser explica

das pelo fato de que, no primeiro trabalho (40), apenas pacientes pr-pberes foram avaliados, ao passo que, no segundo (41), estudou-se um grupo misto constitudo por crianas

e adolescentes. Sabe-se que, na poca da puberdade, a r e s posta do GH aos estmulos provocativos clssicos maior que a observada na infncia, devido ao aumento da do

secreo

de testosterona e estradiol (19). Isto no foi ainda, no e tanto, demonstrado para o teste da clonidina, j que ele nujn ca foi avaliado em grupo constitudo apenas por pacientes p beres. NSo se chegou, ainda, a um consenso geral sobre qual a dose de clonidina a ser utilizada nos testes provocativos, ou seja, a dose mnima que promova uma estimuiaao eficiente da secreSo de 6H associada a uma baixa Incidncia de efeitos colaterais, t mister, portanto, que outros estudos sejam realizados para esclarecer esta dvida.

IV -

OBJETIVOS

20

Comparar o teste da clonidina realizado com a admi nistrao oral de uma dose de 0,0375 mg/m* de superfcie cor prea com o teste de tolerncia insulina em grupos de entes pr-pberes e pberes no que diz respeito 2: Is) 28) Eficincia de liberao de GH. Incidncia de efeitos colaterais indesejveis.

CASUSTICA

: MAC-:: .;. n? EKERCA :I;CLEA?./S? : : ;\ E. N.

Foram estudados 31 pacientes, sendo 22 do sexo majs culino e 9 do sexo feminino, com Idade entre 2,9 e 17,5 anos,

que procuraram o Servio de ndocrinologia do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So

Paulo (HC-FMUSP) com queixa de dficit de crescimento. Em todos, foi ccr.statada uma estatura abaixo da mdia para sexo e idade, variando entre 1,3 e 8,5 desvios-padres (DP). Dezenove pacientes que se apresentaram com forte suspeita clinica de dficit de GH foram Internados por aproximadamente 5 dias na enfermaria da Diviso de Clinica

Mdica I do HC-FMU3P, sendo toda a avaliao clinica, laboni torial e radiolgica realizada neste perodo. Os outros 12 pacientes foram estudados a nvel ambulatorial, compietando-se a investigao diagnostica em um perodo mximo de 4 meses.

VI -

MATERIAL E MTODOS

25 sena de cefalia, convulses, desmaios, alteraes visuais, tosse, dispnia, cianose, edema, diarria, verminose, polidipsia, poliria, nictria, disria, hematria, dores steo-articulares, fraqueza Muscular, caimbras, as te.iia, sonolncia e intolerncia ao frio; f) exame ffsico: altura (mdia de 3 medidas feitas por UM

nico mdico era estadiraetro construdo de acordo con as recomendaes de Underwood e Van Hyk (74)), peso,relao pbis-vrtex/pbis-cho, presena de pelos axilares e pu bianos, desenvolvimento mamrio, tamanho de pnis e testculos, distrbios neurolgicos, anormalidades cardio-

-respiratrias e gastrointestinais, presena de estigmas somticos, sinais de raquitismo, de hipotireoidismo, de Cushing ou de dficit de 6H. A estatura e o peso dos pacientes foram segundo as tabelas de Marques e coi. (45), as quais avaliados foram e

utilizadas para o calculo dos respectivos desvios-padres idade estatura!. Os graus de pubarca e teiarca

foram clas-

sificados de acordo com os parmetros de Tanner (46).

1.2. AVALIAO LABORATORIAL E RADIOLGICA GERAL Os exames laboratoriais gerais Incluram hemograma completo, giicemia de jejum, dosagens sricas de sdio, potssio, uria, creatinina, protenas totais, albumina, cllcio,

26

fsforo, fosfatase alcalina, urin tipo 1 , parasitolgico de fezes e eventualmente caritipo. For tambm realizados Rx e

de trax, Rx de crnio para visualizao da sela trcica

Rx de *5os e punhos para avaliao da idade ssea conforme o Atlas de Greulich & Pyie (29). U a paciente foi submetida a m

tomografia computadorizada de crinio.

1.3. AVALIAO HORMONAL BASAL Dosagens sricas basais de somatomedina C (SmC), triiodotironina (T ) , tiroxina (T.), tireotrofina (TSH), te tosterona (T) em meninos e estradiol (E.) em meninas foram

realizadas em todos os pacientes. Niveis sricos basais de hormnio luteinizante (LH) e hormnio foiiculo-estimulante (FSH) foram determinados apenas nas meninas pberes.

1.4. TESTES FARMACOLGICOS DE ESTMULO Todos os testes Mveram incio is 8:00 horas da nhi, com o paciente repousando em decbito dorsal por pelo

menos 1 hora e em jejum por um perodo mnimo de 8 horas. Amostras seriadas de sangue foram coletadas atravs de veia

canuiada com "butterfly" mantida com soluo fisiolgica 0,91, sendo a punlo realizada pelo menos 60 minutos antes da primeira coleta. 0 sangue para dosagen5 hormonais foi colocado m tubo de vidro simples, deixado em repouso por 3 horas a

temperatura ambiente para que houvesse retrao do cogulo e, a seguir, centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos. 0 soro foi ento separado, aliquotado em volumes de 1 a 2 ml e congelado a -20C at a hora do ensaio. A coleta de glicemia durante o teste de tolerncia i insulina foi realizada em tubos contendo fluoreto de sdio, os quais foram encaminhados ao laboratrio Imediatamente aps o trmino do teste.

a)

TESTE DE .OLERNCIA INSULINA (ITT)

Amostras de sangue para dosagem de GH, glicernia e cortisol (este ltimo determinado apenas em pacientes com sus peita clinica de panhipopituitarismo) foram coletadas nos tem pos de - 30, 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos, sendo realizada, no tempo zero, a administrao endovenosa em bolo de insulina simples (U-40 Biobrs - Bioqumica do Brasil S.A., Montes Claros, MG) na dose de 0,1 U/kg de peso. Foram ntonitorizados sintomas e sinais de hipoglicemia durante todo o teste, tendo-se sempre 3 disposio soluo de glicose h1 per tnica a 50X (20 m U a qual era sistematicamente Injetada por via endovenosa no

final do teste ou durante este se ocorresse perda de conscin cia.

28

b)

TESTE DA CLONIDINA

Amostras de sangue para dosages de 6H foram coleta das nos tempos de -30, 0, 30, 60, 90 e 120 minutos, sendo a clonidina administrada por via oral, no tempo zero, na dose de 0,0375 mg/m* de superfcie corprea. O comprimido de

0,1 mg (Atensina 0,1 mg, De Angeli, Itapecerica da Serra, SP) foi esmagado e dissolvido em 10 ml de gua resultando eu soluo de 0,01 mg/rol. 0 volume correspondente dose calcula da para cada paciente foi ento aspirado em seringa de plstico e injetado diretamente na boca, solicitando-se ao paciente que succionasse e engolisse todo o liquido durante o pro cedimento. Seguiu-se lavagem da seringa com gua por 2 vezes para remoio de possveis resduos da droga retidos nas paredes de plstico, sendo a igua aspirada e administrada ao paciente da mesma maneira que a soluo de clonidina. Medidas do pulso e presso arterial foram realizadas em cada tempo do teste, sendo tambm observados quaisquer outros efeitos colaterais.

c) TE8TE DO HORMNIO LZBERADOR DO TSH (TRH) ASSOCIADO AO TESTE DO HORMNIO LIBERADOR DAS GONADOTROFINAS (LHRH) Amostras de sangue para dosagem de LH, FSH, TSH e proiactina (PRL) foram coletadas nos tempos de -30, 0, 15, 30, 45 e 60 minutos, sendo realizada, no tempo zero, a adminis

trao endovenosa em bolo de ZOO ug de TRH

(Escola Paulista

de Medicina, So Paulo, SP) associado na mesma seringa a 100 | g i de LHRH (Ayerst, So Paulo, SP). Todos os pacientes fora submetidos aos testes tolerncia i insulina e clonidina, ao passo que o teste de do

TRH associado ao LHRH s foi realizado naqueles com suspeita clinica de panhipopituitarisao.

1.5.

SEGUINENTO AHBULATORIAL Todos os pacientes foram avaliados em ambulatrio a

cada 3 meses por um perodo mnimo de 6 meses. Nestas consul^ tas, prestou-se particular ateno ao ritmo de crescimento e

incio ou evoluo do desenvolvimento puberal.

2.

METODOLOGIA LABORATORIAL

2.1.

DETERMINAO DOS NVEIS SRICOS DE 6H Todas as dosagens de 6H foram realizadas em triply

cata por mtodo de radioimunoensaio (RIE) desenvolvido a pajr tir de reagentes Inteiramente preparados no Laboratrio Pesquisas da Diviso de Clinica Mdica I do HC-FMUSP. de Todos

os aspectos da tcnica foram cuidadosamente analisados e coji troiados de modo a se obter, no final, um ensaio adequado is

CC.V.;-:'.- . ; .. E Ef.ERC A r ^ f ^ / s :

30

finalidades deste projeto.

2.1.1. Extrao e purificao do GH-HC 0 6K utilizado na preparao de padres p ra radiolodao e curva de deslocamento (a seguir designado

GH-HC) foi extrafdo a partir de um lote de 100 hipfises con geladas, previamente obtidas de cadveres humanos, baseado

no mtodo de Chapman e col. (6) com pequenas modificaes (53). As hipfises, coletadas durante autpsias de rotina pelo Servio de Anatomia Patolgica da FHUSP, foram conservadas a -20C, envoltas individualmente em papel

alumnio at o seu processamento. A disseco das glndulas, realizada a 4*C assim como todas as demais etapas, foi segui da de homogenizao em liqidificador durante 3 minutos com 200 ml de tampo Tr1s-fosfato (50 mM Tris, 10 mM Na 2 HPO 4> 5 mM EDTA, 1 mH feniimetanossulfonilfluoreto), cujo pH foi

ajustado a 8,7 com HC1 concentrado (Fig. ]). 0 homogeneizado foi colocado em agitador magntico (Fanem Ltda., So Paulo, SP) por 2 horas e depois centrifugado a 10.000 g por 1 hora. 0 precipitado foi retomado, rehomogeneizado com 60 1 de tam po Tris-fosfato pH 9,5 (ajustado com NaOH) e submetido aos

mesmos processos das etapas anteriores. Os sobrenadantes das fraes foram combinados, filtrados em li de vidro e o pH re duzido a 6,3 pela adilo de 4cIdo actico 50X, gota a gota, com agitao constante. A suspenso foi ento centrifugada

31

HIPFISES

DISSECADAS

I
HOMOGENEIZADOS EM TAMPO TRIS-HCL 5 0 mM pH 8,7 (CONTENDO 1,0 mM FENILME TILSULFONILFLUORETO, lOmM No 2 HPO4 ,5mM EDTA) SOBRENADANTE A

RESDUO A REEXTRAIDO SOBRENAOANTE B RESDUO B

i

n
I

COMBINAO SOBRENADANTE A + B PRECIPITAO EM pH 6 , 0 COM AC. ACTICO A 5 0 % , PRECIPITAO ISOELETRICA EM pH 4 , 9 REALIZADA EM ETANOL ( 1 = 7 )
u

PRECIPITADO C COLETA - S E PRL

PRECIPITADO p RETIRADO RESDUO DE ETANOL COM TAMPO TRIS-ACETATO 50mM pH 4 , 9 PRECIPITADO E DISSOLVIDO EM TAMPO TRIS-ACETATO 50mM pH 8.5, FILTRADO E CONCENTRADO EM MILLIPORE

SOBRENADANTE D COLETAM-SE AS 6 30PR0TENAS

- , . . ,*.. SOBRENADANTE E

l
SOBRENADANTE RESDUO INSOLUVEL FILTRAO EM SEPHADEX G-IOO PROTENAS DE ALTO PESO MOLECULAR
P|CO ' h e H PIC0 DEh 6 H

CROMATOGRAFIA EM DEAE CELULOSE GH ELUDO EM TAMPO ACETATO DE AMNJA 2 0 0 mM pH 8 . 3

I
CONGELAO DO GH A - 1 9 8 C FIG. 1 - ESQUEMA RESUMIDO DO PROCESSO DE EXTRAO DO GH-HC

32

por 18 horas a 8.000 g, seguida de decantaio do sobrenadante e ressuspenso do precipitado com 50 ai de tampo Tris-fos fato cujo pH foi ajustado a 6,3 con HC1 concentrado. Esta

frao homogeneizada foi adicionada ao sobrenadante anterior e centrifugada a 8.000 g por 1 hora, sendo o precipitado separado para eventual extrao da prolactina. 0 pH do sobrenadante foi reduzido a 4,9 pela adio seqencial, gota a go ta, de icido actico a 50X e etanol absoluto (volume 1:7), coa agitao constante. A soluo resultante repousou ento por 12 horas antes de ser centrifugada a 15.000 g por 1 hora. A frao sobrenadante foi decantada e separada para eventual extrao de LH, FSH, TSH e lipotrofinas. 0 precipitado, que continha o 6H, foi lava do C O M 50 ml de tampo Tris-fosfato, cujo pH foi ajustado a 4,9 com HC1 concentrado contendo etanol 12,5%. A suspenso

foi ento centrifugada a 15.000 g por 1 hora e o precipitado dissolvido em 500 ml de tampo Tris-acetato 50 mN pH 8,5. A soluo resultante foi filtrada e concentrada utilizando-se

Membrana de Millipore 10 K a um volume de 90 ml, o qual foi centrifugado a 15.000 g por 1 hor?.. A frao sobrenadante foi aplicada a uma coluna (5 x 100 cm) de Sephadex 6.100

(PharMacia Fine Chemicals, psalla, Sucia), previamente equi, librada com tampo Tris-acetato 50 mM pH 8,5 contendo ciortw tanol 0,021. A eluio foi realizada com este Mesmo tampo (fluxo 75 ml/min) e o efluente da coluna monitorizado com

33

absorb&ncia a 280 nm (Fig. 2A). Quando o GH nonnero comeou a ser eluido, o efluente da coluna de Sephadex foi conectado diretamente a outra coluna (2 x 60 cm) de dietilaminoetil ce lulose DEAE - c 52 (Whatman, Clifton, NJ, EUA), preequilibra da com tampo acetato de amorno 0,05 M pH 8,3. Aps receber o 6H, a coluna foi lavada com 350 ml de tampo acetato de

amnio 50 mM pH 8,5 (fluxo 80 ml/hora) em um gradiente crescente de concentrao at 200 mM, mantendo-se o mesmo volume e monitorizando-se o efluente com absorbncia a 280 nm (Fig. 2B). Quando o pico principal do GH comeou a ser eluido, a em

sua frao central (8 ml) foi coletada em frasco imerso

gelo seco, aliquotada em volumes de 0,1 ml e congelada em ni trognio lquido (-198C). 0 contedo de uma destas alquotas foi sub metido a testes de controle de qualidade que consistiram em: a) determinao da concentrao de protenas pelo mtodo de Schacterie & Pollack (68), obtendo-se em mdia um de 1,46 mg/ml; b) quantificao do GH-HC por "kit" comercial de RIE (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, EUA), utilizando-se 6 diluies progressivas (1/200.000 at valor

1/3.200,000 em tampo de ensaio) como amostras desconhecidas e obtendo-se em mdia um valor de 1,15 mg/ml; c) estimativa da atividade biolgica do GH-HC por mtodo de

34

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

Inn)
100 90 60 70 60 50 : 40 30 20 10

(nm)
t

\ \ / \ MONO MERO

100 0 80

FRAO CENTRAL COLETADA

r~i
\ 1\
/
\A

70
60 50 40 30 20 10

IDMERoA

U 7\

1000
(A)

^ V

^V
100 (B)

x.
200

2000 VOLUME (ml)

VOLUME (ml)

FIG. 2 - CR0MAT06RAFIA DO GH-HCEM SEPHADEX G.IOO(A) E EM D E A E - c 52 ( B).

35

radiorreceptor em fgado de mulher grvida (10), cujo re sultado foi de 2,1 U/ml; d) comparao do GH-HC com padro fornecido pelo National

Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA (GH-NIH) por ele troforese em gel de poliacrilamida (8), a qual demonstrou ter o GH-HC padro de isohormnios com predominncia forma fl semelhante ao do GH-NIH; e) determinao da contaminao por outros hormnios hipofi srios atravs de "kits" comerciais de RIE (Clinical Assays, Cambridge, MA, EUA): TSH < 3 uUI/ral, PRL = 3 ng/mg, FSH * 82 mUI/mg e LH = 641 mUI/mg. 0 GH-HC foi conservado em nitrognio liqui do por um perodo de 9 meses. A cada 45 dias aproximadamente, uma alquota foi descongelada e utilizada para: a) preparao de padres para radioiodao contendo 5 ug de GH em 50 ul de tampo fosfato (TF) 0,2 M pH 7,4 preparado com fosfato de potssio monobsico. Estes foram no mes. mo dia utilizados para marcao e a seguir desprezados; b) preparao de padres para curva de deslocamento contendo 1 ug de
GH em

da

ml

de

tampo borato (TB) 0,1 M pH 8,5

com albumina sHca bovina (BSA, Sygma Chemical Company, St Louis, MD, EUA) e azida sdica 0,1% (a seguir designa do tamplo de ensaio). Estes foram aliquotados em volumes

de 0,5 ml e congelados a -20*C por 30 dias. Neste perfodo,

36

uma alquota foi descongelada na hora de cada ensaio utilizada para a preparao de solues contendo

1,25,

2,5, 5,0, 10, 20 e 40 ng/ml de GH "frio" em tampo de en saio, sendo todas desprezadas aps o trmino do RIE.

2.1.2. Radioiodao do GH-HC A radioiodao do GH-HC foi realizada de

acordo com o mtodo clssico de Greenwood e Hunter (27) com apenas algumas modificaes (51). Em cada processo de marca o, adidonaram-se seqencialmente, em tubo de vidro 12 x 60 mm, 50 ul do padro para radioiodao (preparado no mesmo dia) 125 contendo 5 ug de GH-HC,e 1 mC1 de I sob a forma de lodeto de sdio livre de carreador (Amersham International plc,

Buckinghamshire, Inglaterra), com no mnimo 100 mC1/ml. Aps homogenizao, foram pipetados 20 ul de soluo de cloramina T (Merck S.A., Rio de Janeiro, RJ) contendo 1,4 mg/ml em TF

0,2 M pH 7,4, seguidos de agitao suave por 10 segundos e adi^ o de 20 pi de soluo de metabissulfito de sdio (Merck)

contendo 2,0 mg/ml em TF 0,2 M pH 7,4. Procedeu-se ento a nova agitao suave por 10 segundos antes da adio de 0,2 ml de soluo de lodeto de sdio (10 mg/ml em TF 0,2 M pH 7,4) homogenizao final da mistura. A eficincia de radioiodao foi determine da de maneira grosseira pelo denominado teste do carvo, no qual 1 ul do material radioiodado,diludo em 2,4 ml de tampo e

37 de ensaio,foi adicionado em duplicata a 0,5 ml de suspenso de carvo (carvo Merck a 100 mg/ml em TB 0,1 N pH 8,5). Aps horaogenizao em "Vrtex" e centrifugao por 15 minutos a

1000 rpm, o sobrenadante foi separado do precipitado por decantao e a radioatividade de ambos determinada em contador de cintilao de poo (Gamma 4000, Beckman Instruments Inc., Irvine, CA, EUA). Considerou-se uma boa eficincia de marca o quando 60X ou mais da radioatividade total encontrava-se no precipitado (correspondente ao GH-HC 1 25

I).

Como, em

cada processo, 2 alquotas do mesmo padro de GH-HC foram si multaneamente submetidas a radioiodao, o teste do carvo de

permitiu tambm escolher o material com maior eficincia marcao, o qual foi em seguida submetido a purificao. A cromatografia do GH-HC -

I foi realiG.75

zada em coluna de vidro (1 x 55 cm) contendo Sephadex

(Pharmacia) deareada e previamente equilibrada com TB 0,05 M pH8,6 com BSA 0,1* e azida sdica 0,1%. Todo o contedo do tubo de radioiodao foi colocado no topo da coluna e, logo aps sua penetrao no Sephadex, foram adicionados 0,3 ml de soluo

de lodeto de sdio (10 mg/ml). A seguir, a eluio foi iniciada com TB 0,05 H pH 6,6 com BSA 0,1% e azida sdica 0,1%, com fluxo de 0,5 ml/minuto, sendo os primeiros 6 ml do eluTdo desprezados. 0 restante foi coletado em alquotas de 1 ml a cada 2 minutos (2070 Ultrorac II, LKB, Bromma, Sucia) em 80 tubos de vidro (15 x 100 mm) contendo 0,1 ml de soluo de

38

BSA 21 em TB 0,05 M) pH 8,6 con azida sdica 0.1X. A radioatividade dos 80 tubos foi determinada por contagem de 10 | l do contedo de cada tubo em dete i tor de cintilao gama. Aps construo do grfico expressando a distribuio da radioatividade ao longo do volume eludo (Fig. 3 ) , 2 picos foram constatados: pondendo ao 6H-HC o primeiro corres I livre.

I integro e o segundo ao

Praticamente no foi observado pico de agregados do hormnio Marcado. Os contedos dos tubos que acusaram as 3 maiores ati vidcdes no primeiro pico foram misturados de modo a se obter, no final, 3 ml de GH-HC - 1 2 5 I integro. Este foi, a seguir, aliquotado em volumes de 0,1 ml e congelado a -20C por um perodo de 30 dias. 0 controle de qualidade do GH-HC - 125 I p u j rificado consistiu em:

*)

DETERMINAO DO GRAU DE CONTAMINAO POR TESTE DO CARVO

1 25 I LIVRE

PELO

Este teste foi realizado da mesma maneira que antes da cromatografia, s que agora adicionando-se 10 ul de GH-HC - 2 5 I diludos em 2,4 ml de tampo de ensaio suspenso de carvo. Para que o hormnio marcado fosse conside_ rado de boa qualidade, a porcentagem de radioatividade total 125 presente no sobrenadante (correspondente ao I livre) deve ria s1tuar-se abaixo de 20X (51).

39

CP , (XIO3)

G H - H C - I 2 5 I NTEGRO

60

60 VOLUME (ml )

FIG. 3-CROMATOGRAFIA

DO G H - H C - I 2 5 I EM SEPHADEX G.75.

40

b)

AVALIAO DA IMUNORREATIVIOADE MAXIMA DO GH-HC PELA ADIO DE EXCESSO DE ANTICORPO

125

Os seguintes reagentes foram incubados, em triplicata, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampo de ensaio (100 pi); (1)

(2) anti-soro 72 (100 ul de solu (3) GH-KC 1Z5

o 1/1000 em tampo de ensaio);

(100 pi

de soluo 1/200 em tampo de ensaio). 0 mtodo de separao do complexo antfgeno -anticorpo do antfgeno livre,utilizado neste coo em todos

os demais ensaios deste projeto,consistiu na adio de 1,0 ml de soluo de polietilenoglicol a 17X (PEG S000, Sygma), pre parada em tampo de ensaio sem BSA e conservada a 4C. Se-

guiu-se a centrifugao a 3000 rpm por 30 minutos a 4*C e de cantao do sobrenadante. Aps contagem do precipitado, o foi

grau de ligao mxima do hormnio mar ado ao anticorpo

determinado pela razo (radioatividade do precipitado/radio^ tividade total x 100), devendo situar-se acima de 80% que o GH-HC 125 I fosse considerado de boa qualidade. para

C)

ESTIMATIVA DA ATIVIDADE ESPECFICA DO GH-HC MTODO DO AUTODESLOCAMENTO (25,49,05)

125

PELO

Os seguintes reagentes foram Incubados, em triplicata, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1)

concentraes crescentes de hormnio marcado (100 ul de solu_ es 1/100, 1/75, 1/50 e 1/25 em tampo de ensaio, cujas &ti_

41

vidades foram previamente determinadas, a seguir denominadas amostras desconhecidas) e de hormnio "frio" (100 pi de solu

es contendo 0, 1,25, 2,5, 5,0, 10, 20 e 40 ng/ml em tampo de ensaio); (2) anti-soro 72 (100 pi de soluo 1/90.000 em (3) GH-HC 125

tampo de ensaio);

I (100 | l de soluo 1/200 i apenas para

em tampo de ensaio).

Em 3 tubos (N5B), incubou-se

tampo de ensaio (200 pi) e hormnio marcado (100 pi) determinao da ligao inespecffica.

Todos os tubos foram contados antes e aps precipitao com PEG para determinao da radioatividade total e do precipitado, respectivamente. A seguir, a razo ra

dioatividade ligada/radioatividade total (B/T), utilizada p^ ra construo da curva dose-resposta da Fig. 4, foi calculada para cada padro de GH "frio" e amostra desconhecida pela equao: B T onde: Bi (ou Bn) * radioatividade do precipitado correspondente ao padro 1 ng/ml de GH "frio" (Bi) ou & desconhecida n (Bn). NSB * radioatividade do precipitado correspondente ao NSB. T * radioatividade total. tubo amostra Bi (ou Bn) - NSB T x 100

CONCENTRAO DEGH-HC- I 2 5 I PRESENTE NA AMOSTRA DESCONHECIDA 1,25 2,5 5,0 10 20 40 LOG [ 6 H ] (ng/ml)

FIG. 4 - CAlCULO DA MASSA DE GH-HC J 2 5 I PRESENTE EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA PELA TCNICA DO AUTO-DESLOCAMENTO.

43 A concentrao do hormnio Marcado e, conseqentemente, sua assa, presente nas diferentes amostras

desconhecidas,foi entio determinada por interpolao de suas respectivas razes B/T a partir da curva dose-resposta. Foi possvel, dessa Maneira, correlacionar a massa e atividade do traador presente em cada amostra e construir o grafico da

Fig. 5, a partir do qual a atividade especifica foi calculada pela reciproca da inclinao da reta obtida por regresso linear simples.

d)

DETERMINAO DA ESTABILIDADE DO GH-HC- 1 2 5 ! 4C E A -20C

CONSERVADO A

Os seguintes reagentes foram incubados, em triplicate, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1)

tampo de ensaio (100 ul); (2) anti-soro 72 (100 ul de s o U o 1/90.000, correspondente ao tubo Bo) ou tampo de ensaio (100 pi, correspondente ao tubo NSB); (3) GH-HC-125I (100 ul de soluo 1/200). Aps separao com PEG e contagem do precj^ pitado, as porcentagens de ligao total (XBo total), inespe cffica (XHSB) e especifica (XBo especifica) foram calculadas pelas equaes:

MASSA DO TRAADOR

8.0

r 0.985

/ 6.0

4.0

2.0

y^
r

ATIVIDADE ESPECFICA
i i

2,0

4#0 6,0 8,0 10 ATIVIDADE DO TRAADOR (jiCi.10'2)

FIG. 5 -RELAO ENTRE A ATIVIDADE DE UMA AMOSTRA DE G H - H C - I 2 5 I E SUA RESPECTIVA MASSA DETERMINADA PELA TCNICA DO AUTODESLOCAMENTO.

4$

radioatividade do precipitado do tubo Bo XBo total

radioatividade total

x 100

radioatividade do precipitado do tubo RSB MSB = x 100

radioatividade total

o especfica

- IB o total

- XNSB

Medidas seriadas ao longo de 30 dias

aps

radiolodao (Fig. 6) revelara uma reduo lenta e discreta dos 3 parmetros ao longo de todo o perodo, sendo esta redu o U M pouco ais acentuada a 4*C do que a -20"C. Estes dados demonstrara* uaa aaior perda de Imunorreatividade do h o m nio arcado a 4*C e, por esta razo, as alquotas de 6H-HCI

conservadas a -20*C passara* a ser descongeladas e diludas apenas na hora do ensaio, sendo desprezadas aps o trmino deste.

COMPARAO DO GH-HC -

12

*I

COM

GH-NIH -

125

(PREPARAO PARA RADIOIODAAO FORNECIDA PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH E MARCADA NO HC-FMUSP)

0s seguintes reagentes foram Incubados em triplicate, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) padres

de GH "frio" (100 pi de solues contendo desde 0 at 40 ng/l>, (2) anti-soro 72 (100 ui de soluo 1/90.000); (3) GH-HC- 125 I

LI6. 80

46

60 4O 20

10

15 20 25 30 DIAS PO'S RADIOIODAAO DO GH-H(

(A)

%DE LI6.

o
60
40

20

10

15
(B)

20

25

30

DIAS POS RADIOIODAAO DO GH-HC FIG. 6 - VARIAO DA PORCENTAGEM DE LIGAO TOTAL ( ) , INESPECFICA ( ) E ESPECFICA ( ) AO LONGO DE 3 0 DIAS APS RADIOIODAAO DO GH-HC COM ESTE CONSERVADO A 4 * C ( A ) OU A - 2 0 * C ( B ).

47

OU GH-NIH -

I (100 pi de soluo 1/200).

Em 3 tubos (NSBX

incubou-se apenas tampo de ensaio (200 pi) e hormnio sarca do (100 |il). Aps separao com PEG e contagem do preci pitado, as curvas dose-resposta para cada hormnio marcado fo ram elaboradas e comparadas entre si (Fig. 7 ) . 0 paralelismo observado entre elas confirmou o comportamento do GH-HC 1Z5

idntico

I em relao ao GH-HIH - 1 2 5 I . Oito processos de radioiodao foram reali

zados em um perodo de 9 meses, um a cada 45 dias aproximada mente. Em dois, a eficincia de marcao determinada pelo

teste do carvo foi inferior a 501 e, porisso, o material rja dioiodado no foi submetido a purificao. Nos outros 6 pro

cessos, a eficincia de marcao situou-se entre 64 e 71%, o grau de contaminao com 125 I entre 4 e 15%, a imunorreativj^

dade mxima entre 82 e 94% e a atividade especfica entre 124 e 157 uCi/ug, demonstrando a boa qualidade do para fins de RIE. GH-HC 125 I

No houve deteriorao significante de n<e

nhum destes parmetros ao longo dos 9 meses, Indicando ser o nitrognio liquido eficiente meio de conservao para o GH-HC.

2.1.3.

Produo de anti-soro anti-GH A tcnica de Imunizao empregada para a

produo de anti-soro anti-GH baseou-se primariamente no mtodo de Va1tukat1s e coi. (76).

48

L06IT0 B/Bo (%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20 40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 7 - COMPARAO ENTRE CURVAS DOSE - RESPOSTA PREPARADAS COM GH -HC -'25l ( - * J E GH-NIN-125! (A-*).

49

Preparou-se,inicialmente,emulso contendo 3 mg de GH (Kabi Diagnostica, Estocolmo, Sucia), 9 ml de so luo salina e 6 ml de adjuvante completo de Freund, seguida de homogenizaao em Vrtex e repouso por 24 horas a 4C para confirmar a no separao das partes. Aps raspagem dos pelos do dorso, 3 coelhos da Nova Zelndia (idade mdia de 3

meses) foram imunizados, cada animal recebendo 30 aplicaes intradrmicas de 0,1 ml da emu1 so em diferentes pontos do

dorso, correspondendo a 0,6 mg de 6H. A cada 3 semanas, foi realizada nova imunizao nas mesmas condies que a primeira, s que com emu Iso preparada com adjuvante incompleto Freund. Amostras de sangue foram colhidas atravs de

da punSo da veia central da orelha 10 dias aps cada Imunizao. 0 sangue coletado foi deixado em repouso a 4C por 48 a 72 horas para que houvesse retrao do cogulo, seguido de separao do soro e diluio do mesmo com tampo de ensaio na proporo de 1:1. Procedeu-se entco 3 titulao do anti-

-soro para se determinar a necessidade ou nu de novas 1munj[ zaes. Aps a quarta imunizao de um dos animais, foi finalmente obtido um anti-soro (anti-soro 72), cujas excelen-

tes caractersticas foram demonstradas pelos testes de c o n trole de qualidade. Estes consistiram em:

a)

DETERMINAO DO TTULO, O QUAL FOI DEFINIDO COMO A DILUI

50

O FINAL

DO ANTI-SORO

CAPAZ DE LIGAR

BOX DO (54)

HORMNIO

MARCADO EM CONDIES PR-ESTABELECIDAS

Os seguintes reagentes foram incubados, em triplicata, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampo de ensaio (100 ul); (1)

(2) diluies progressivas do

anti-soro 72 (100 pi de soluo 1/30.000 at 1/1.920.000 em 125 tampo de ensaio); (3) GH-HC I (100 ul de soluo 1/200). Em 3 tubos, incubou-se apenas tampo de ensaio (200 ul) hormnio marcado (100 pi). Aps separao com PEG e contagem do precj^ pitado, os valores da %Bo especifica para cada diluio do e

anti-soro foram calculados e expressos no grfico da Fig. 8. 0 titulo do anti-soro 72 foi ento determinado pela diluio final correspondente a 501 de ligao especifica, ou 1/640.000. seja,

b)

CLCULO DA CONSTANTE DE AFINIDADE (K) PELO MTODO DE SCATCHARD (67)

Os seguintes reagentes foram Incubados, em triplicate, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1)

concentraes crescentes de GH "frio" (100 pi de solues cojt tendo desde 0 at 40 ng/mi); luo 1/90.000) (2) anti-soro 72 (100 ul de so 125 e (3) GH-HC I (100 ul de solulo 1/200).

Em 3 tubos (NSB), Incubou-se apenas tampo de ensaio (200 pi) e hormnio marcado (100 ul).

51

% DE LIGAO ESPECFICA

70

30 20 10 TITULO DO ANTI-SORO
O

o o 6 C D

o o _O d
fO

o o o o o o d ~d C M

O O O

-d CD

o o o -d

C O

oi DILUIO FINAL DO ANTI-SORO (LOG) FIG. 8-CURVA DE TITULAO DO ANTI-SORO 72.

52

Todos os tubos fora contados antes e aps precipitao com PEG para determinao da radioatividade total e do precipitado, respectivamente. Os parmetros radioatividade ligada/radioatividade livre (B/F) e concentrao

de hormnio ligado ao anticorpo (b) forem calculados para ca da padro de 6H "frio" pelas equaes:

B F

(Bi - NSB) IT - (Bi-NSB)] (Bi-NSB)

b concentrao de GH "frio" x

onde: Bi * radioatividade do precipitado correspondente concentrao 1 ng/ml de GH "frio"; NSB = radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB; T ' radioatividade total.

A partir do grafico relacionando estes parmetros (grafico de Scatchard, Fig. 9 ) , o valor (2,1 . IO 1 0 l/mole) foi determinado pela inclinao da obtida por regresso linear simples. de

2 K reta

S3

B/F 2.0

1.5

r= 0,985

1.0

0,5

25

50

75

100 b(Mol/I.IO* 12 )

FIG. 9 - DETERMINAO DA CONSTANTE DE AFINIDADE ( K ) PELO GRA'FICO DE SCATCHARD.

54

c)

DETERMINAO DA IMUNORREATIVIOADE CRUZADA COM PADRES PUROS DE LH, FSH, TSH, PRL E HORMNIO LACTOGNICO PLACEN TRIO (HPL) FORNECIDOS PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (PREPARAES PARA RADIOIODAO)

Os seguintes reagentes foram incubados, e triplicate, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1)

concentraes crescentes de hormnio "frio" em tampo de ensaio (100 ui) tais como 6H (0 at 40 ng/mi), TSH (at 2500 ng/ml), HPL (at 10.000 ng/ml) e LH, FSH e PRL (at 2.000 ng/ml cada um); (2) anti-soro 72 (100 ul de soluo 1/90.000) e '.i) arcado

6H-HC - 1 2 5 I (100 ul de soluo 1/200) e hormnio (100 ul).

Aps separao com PEG e contagem do preci^ pitado, o grau de inibio da ligao maxima (B/Bo) foi d e terminado para cada hormnio pela equao:

(Bi-NSB)
r x 100

Be

(Bo-NSB)

onde: BI radioatividade do precipitado correspondente i concentrao 1 ng/ml de hormnio "frio"; Bo * radioatividade do precipitado correspondente i concentrao zero; NSB radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.

55

A porcentagem de imunorreatividade cruzada do anti-soro 72 para cada hormnio foi ento determinada pela razo entre a concentrao de 6H "frio" e a do hormnio estu dado necessrias para provocar 50% de inibico ( 2 ) , ou seja, B/Bo * 50X (Fig. 10). Os seguintes valores foram encontrados: LH < 0.3X, FSH < 0,3t, TSH < 0.3X, PRL - 0,6*. HPL < 0,U. As caractersticas do anti-soro 72, comparveis s descritas na literatura para anticorpos anti-GH de comprovada eficcia (50), confirmaram a sua excelente qualidade, permitindo que ele fosse utilizado em todos os ensaios deste projeto. Alquotas de 0,1 ml foram liofilizadas e pos teriormente conservadas a -20C. A cada 6 meses, uma foi re constituda e diluda 1/10 em tampo de ensaio, realiquotada eu volumes de 0,1 ml e recongelada a -20C. A partir destas ltimas alquotas, solues 1/90.000 em tampo de ensaio foram preparadas a cada 30 dias, conservadas a 4C e utilizadas nos ensaios durante este perodo.

2.1.4. Mtodo de separao do complexo antgeno-anticorpo do antigeno livre A separao do complexo antgeno-anticorpo do antigeno livre foi realizada pela tcnica do polietilenoglicol, descrita em 1971 por Desbuquois e Aurbach (14). Este agente provoca a reduo da quantidade de Sgua livre do sistema, resultando em diminuio da solubilidade e precipitao

imunuirnc Ml

IVIUAUt

CRUZADA

Ill4ng/ml

X 100 - 0,6 %

LOG 1 TO B/Bo(%)

PRL

20

1.25

2.5

5.0

10

20

40

250

500

1000 2000 LOG [ H ] (ng/m;)

FIG. 1 0 - DETERMINAO DO 6RAU OE IMUNORREATIVIDADI CRUZADA DO ANTI-S0R0 72 COM A PRL.

57

do complexo antfgeno-anticorpo ( 7 ). Suas principais vantagens consistem em ser um mtodo simples e de baixo custo no caso do GH, promover a separao instantnea e e,

eficiente

do complexo antigeno-anticorpo do antgeno livre. 0 grau re lativamente alto de ligao inespecfica, citado como a prin^ cipai desvantagem deste mtodo, no parece comprometer signi ficantemente a preciso de ensaios em que a capacidade de li gao total maior do que 50X ( 7 ), como o caso do RIE de senvolvido neste projeto. Por estas razes, o PEG foi escolhido como mtodo de separao, ao invs de tcnicas mais so fisticadas tais como precipitao com segundo anticorpo, quais exigem maior custo e complexicidade. A concentrao de PEG a ser adicionada ao as

ensaio foi determinada por experimento que consistiu na incu bao em triplicata, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente, dos seguintes reagentes: (1) tampo de ensaio (100 ul);

(2) anti-soro 72 (100 ul de soluo 1/90.000, correspondente ao tubo Bo) ou tampo de ensaio (100 ul, correspondente tubo NS6); (3) GH-HC - 1 2 5 I (100 ul de soluo 1/200). precipitao foi realizada com diferentes concentraes nais de PEG (2 a 20%) diludo em tampo de ensaio sem ao A fiBSA, de

p1petando-se 1,0 ml do mesmo imediatamente aps adio

soro humano (100 ul). Uma vez contados os precipitados, as porcentagens de ligao total, Inespecfica e especifica foram determinadas para cada concentrao de PEG e expressas

% DE LIGAO

60
50

40

30

20

10

8 12 16 20 CONCENTRAO FINAL DE PEG (%)

FIG. II-VARIAO DA PORCENTAGEM DE LIGAO TOTAL ( ) , INESPECFICA(o) E ESPECFICA ( ) EM FUNO DA CONCENTRAO FINAL DE PEG.

59

no grfico da Fig. 11. o incremento da concentrao de PEG acima de 10X resultou em aumentos muito pequenos da XBo espe cfica associados a elevaes mais significativas da XNSB, de monstrando no haver vantagem alguma em se utilizar concen-

traes muito maiores do que 10X. Por esta razo, a concentrao final de PEG foi fixada em 12,IX, sendo este utilizado em todos os ensaios deste projeto. A Influncia da concentrao proteica do valor

elo sobre o grau de precipitao do complexo antigeno-anticorpo provocado pelo PEG foi estudada em ensaio no qual realizou-se incubao idntica do experimento anterior. Soro humano ("pool" com concentrao proteica total = 7,0 g/dl, imunologicamente negativo para hepatite B, sifilis e Chagas) foi acrescentado mistura de incubao em volumes crescen tes variando de 0 at 200 pi, seguido da adio de 1,0 ml de PEG (concentrao final 12,It). Aps contagem do precipitado, as porcentagens de ligao total, inespecffica e especifica foram calculadas para cada volume de soro adicionado an tes do PEG e expressas no grafico da Fig. 12. Na ausncia de soro, a precipitao do complexo antigeno-anticorpo com PEG foi multo pequena, aumentando substancialmente aps adio

de 25 pi de soro. Incrementos a partir deste volume resulta ram em aumentos progressivos da XBo total e XNSB, ao
i i

passo

que a XBo especifica permaneceu praticamente constante. Estes dados demonstraram claramente a necessidade de uma concentra

_.

. _. r

.L-

, _J,j..,^

"I-

-*^

" * "'

'

30

20

10

50

100

150

200

VOLUME DE SORO ( j i l ) FIG. 12 - VARIAO DA PORCENTAGEM DE LIGAO TOTAL ( ) , INESPECFICA ( ) , E ESPECFICA ( ) EM FUNO DO VOLUME DE SORO ADICIONADO IMEDIATAMENTE ANTES DO PEG (CONCENTRAO FINAL 12,1%).

61

So minia de protenas sricas (1,2 g/ml) para que a preci pitao do complexo antigeno-anticorpo pelo PEG fosse comple ta. Com a finalidade de se igualar a concentra o de protenas sricas em todos os tubos de um determinado ensaio, foi estc*>e1ecido que, antes da precipitao com PEG, seriam acrescentados 100 ul de soro humano ("pool" com c o n centrao proteica total variando entre 6,0 e 8,0 g/dl) nos tubos correspondentes curva-padro (diluda em tampo de

ensaio), sendo pipetados 100 ul de tampo de ensaio nos tubos correspondentes aos controles e amostras desconhecidas. Nos casos em que houvesse necessidade de diluir estas amostras

com tampo de ensaio antes de sua dosagem, seria adicionado, antes do PEG, soro diludo em tampo de modo a completar volume de soro presente em cada tubo a 100 ul. o

2.1.5. Protocolo do RIE de GH A elaborao do protocolo do RIE de GH, des crito na Tabela I, envolveu o estudo de diversos fatores:

PREPARAO DOS PADRES DE 6H " F R I O " , CONTROLES E AMOSTRAS

Um padro de GH contendo 1 ug/ml (preparado no dia da radioiodao) foi descongelado na hora do RIE e diludo progressivamente em tampo de ensaio at obteno de

62

Tabela I - Protocolo do RIE de GH

Tubo Taapio/Padrio/Aaostra Anti-soro 72 (1/90.000)

u.c-mi
(1/200) (pi)

Taspio/Sora (Ml)

PEG (in)

(HD
Total

W)

(D
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

SB Bo A B C D E

F
Controla Aaostra

200 100 100 100 100 100 100 100 100 100

(taaplo) (taapio) (padrio 1,25 ng/al) (padro 2,5 ng/al) (padrio 5,0 ng/l) (padrio 10 ng/al) (padrio 20 ng/al) (padrio 40 ng/al) (aostra) (aaostra)

100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 1OO 100 100 100

(soro) (soro) (saro) (soro) Uor) (soro) (soro) (soro) (taapio) (tapl>;

a) adiio seqencial, ia triplicata, de taapio d* ensaio/padrio/aaostra, anti-soro 72 e GH-HC- I , seguida de hoaojenizao ea Vrtex; iocubaio por 20 a 24 horas a teaperatura aabitnte; adiio seqencial de taapio/soro e PEG, seguida de hoaogenino ea Yrtei; centrifugasio a 3000 rpa por 30 ainutos a 4C; aspiraio do sobrenadante; eentagea do precipitado por 1 ainute ea detector de cintilalo gata; anlise dos dados obtidos atravfs do prograaa de coaputador RIA CALC.

b) c) \ a) f) g)

63

todos os pontos da curva (padres "frios" contendo 1,25, 2,5, 5,0, 10, 20 e 40 ng/ml). Aps o trmino do ensaio, estas so

lues foram todas desprezadas. Os controles (alto, mdio e baixo), inclu^ dos no incio e no final de cada ensaio, foram preparados a partir de 3 "pools" obtidos pela mistura de soros previamente dosados.com concentraes de GH variando entre 20 a 25, 7 a 10 e 1 a 3 ng/ml, respectivamente. Alquotas de 0,5 ml de

cada controle foram conservadas a -20C at sua utilizao no ensaio, sendo desprezadas a seguir. As amostras de soro a serem dosadas, mantidas a -20C desde a sua coleta, foram descongeladas no incio do ensaio e recongeladas aps o trmino deste, permitindo assim a repetio da dosagem caso esta fosse necessria.

b)

CONCENTRAO DO QH-HC -

125 I

Uma soluo 1/200 em tampo de ensaio foi preparada na hora do RIE a partir de uma alquota de 100 ul de GH-HC I conservada a -20C desde o dia da radioloda-

o, sendo ambas desprezadas aps o trmino do ensaio. Desta soluo, um volure de 100 ul, correspondendo * uma massa de 0,07 ng e a uma atividade aproximada de 15.000 cpm, foi pipetjj do em cada tubo do ensaio, resultando em uma concentrao f^ nal de 0,23 ng de traado* por ml da mistura de Incubao.

64

C)

DILUIO DO ANTI-SORO ANTI-GH

De acordo com Hunter (33), a diluio

do

anticorpo a ser utilizada em um determinado ensaio deve resultar em ligao especfica ao redor de 651. Baseado nesta premissa, as solues 1/60.000 e 1/90.000 do anti-soro 72, cujas respectivas <Bo especifica correspondiam a 65 e 62X, fo ram incubadas com antgeno "frio" e marcado de acordo com o

protocolo da Tabela I, resultando em diluies finais do anticorpo de 1/180.000 e 1/27O.OOO, respectivamente. As carac

terfsticas das curvas dose-resposta assim obtidas (Fig. 13A) foram comparadas pelos seus respectivos perfis de preciso (Fig. 13B), elaborados segundo os critrios de Rodbard (60). A preciso intraensaio obtida com a diluio 1/90.000 foi

nitidamente superior obtida com a soluo 1/60.000, situan do-se em nvel igual ou inferior a 10% para concentraes de GK "frio" acima de 1,7 ng/ml. A sensibilidade, definida como a dose mnima detectvel, tambm foi melhor com a 1/90.000 (0,8 ng/ml) do que com 1/60.000 (1,3 ng/ml). dados permitiram concluir que a soluo 1/90.000 soluo Estes

resuitava foi

em melhores caractersticas do ensaie e, porisso, ela

escolhida e utilizada em todos os RIEs de GH realizados neste projeto.

65

L06IT0 B/Bo(%)

80

50

20

5,4 (A)

10,8

21,6 43,2 LOG [GH] (ng/ml)

1,35

2,7

5,4 (B)

10,8

21,6 43,2 LOG [ G H ] ( n 9 / m l )

FIG. 13 - CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A) E PERFIS DE PRECISO (B) PARA RIEs DE GH REALIZADOS COM DILUIES 1/60.000 ( * - * ) E 1/90.000 ( ) DO ANTI-SORO 72.

66

d)

TEMPO DE INCU3AO

As caractersticas das curvas dose-resposta elaboradas com e sem perodo de pr-incubao (Fig. 14A1, definido como a incubao do antigeno "frio" com anticorpo

sem a adio do traador, foram comparadas pelos seus respec tivos perfis de preciso (Fig. 14B). A introduo de pr-i cubao por 1 hora, realizada a temperatura ambiente ou a

37"C, levou a uma reduo muito discreta da dose mnima detectvel (0,7 e 0,6 ng/mi, respectivamente, comparadas com

0,9 ng/ml, obtida sem perodo de pr-incubao), associada a urna piora Importante da preciso intraensaio para concentraes de GH "frio" acima de 10 ng/nl. Por esta razo, os

RIEs de GH deste projeto passaram a ser realizados sem per do de pr-incubao. Aps adio do hormnio marcado, o tempo

de incubao necessrio para que a reao atingisse o equl^ brio foi determinado em diferentes condies de temperatura. Neste experimento, os seguintes reagentes foram incubados,em tr1p!1cata,a 4C, temperatura ambiente e a 37C: de ensaio (100 ul); (2) anti-soro 72 (100 ul (1) tampo de soluo

1/90.000, correspondente ao tubo Bo) ou tampo de

ensaio 125 (100 ul, correspondente ao tubo NSB); (3) GH-HC - I (100 pi

de soluo 1/200). Aps diferentes perodos de Incubao (0 a 48 horas), foi efetuada a separao com PEG, seguida de

contagem do precipitado. 0 clculo da porcentagem de ligao

b/ao(%j

67

80

50

20

CV

1,25

2,5

5,0 (A)

10

20 40 LOG [GH] (ng/ml)

50 40 30 20 10
1,25 2,5

5,0 (B)

10

20 40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 14 - CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A ) E PERFIS DE PRECISO ( B) PARA RIEt DE GH REALIZADOS SEM PERODO DE PR- INCUBAO ( - ) E COM PERODO DE PR-INCUBAO POR 1 HORA A TEMPERATURA AMBIENTE (-k) OU A 37 C ( - - ) .

68

total, inespecifica e especifica para cada tempo e temperatu ra de Incubao (Fig. 15) permitiu concluir que (1) a reao atingiu o equilbrio mais rapidamente a 37*C (12 horas) do

que a 4C ou a temperatura ambiente (16 horas para ambos); (2) a XBo especifica observada no equilbrio durante incubaSo a temperatura ambiente (47X) foi maior do que a 4* e 37C (43 e 41X, respectivamente); (3) a XNSB durante incubao a 4C e a temperatura ambiente foi semelhante (ao redor de 16X), mas inferior observada a 37C (ao redor de 17,51). A partir

destes dados, ficou estabelecido que a incubao dos RIEs de 6H seria realizada a temperatura ambiente por 20 a 24 horas, j que, nestas condies, a XBo especifica era maior XNSB permanecia em nveis aceitveis. e a

e)

PROCESSAMENTO E ANLISE DOS DADOS OBTIDOS

Os clculos da curva dose-resposta e da con centrao das amostras desconhecidas foram efetuados por um programa de computao denominado RIA CALC, formulado por

D. Gianeila (comunicao pessoal) em 1982. Este programa ba seia-se na transformao Iog1to-log, segundo os critrios pr postos por Rodbard e col. (61). Em todos os ensaios (exceto os correspon-

dentes ao clculo da atividade especifica e da constante de afinidade), a curva dose-resposta foi ajustada a uma reta por regresso linear no ponderada a partir das equaes:

69

4#C

TEMPERATURA AMBIENTE

37 # C

10 20 30 40 50

10 20 30 40 50

10 20 3 0 40 51 HORA!

FI6. 1 5 - INFLUNCIA DO TEMPO t TEMPERATURA DE INCUBAO SOBRE AS PORCENTAGENS DE LIGAO T O T A L O , INESPECFICA ( o ) , E ESPECFICA ( A ) .

70

Logito (B/Bo X) a b.logi

B % Bo

Bi-NSB = Bo-NSB x 100

onde: BI = radioatividade do precipitado correspondente concen trao 1 ng/ml do padro de GH "frio"; Bo ou NSB = radioatividade do precipitado correspondente aos tubos Bo e NSB, respectivamente.

As concentraes das amostras

desconhecivalores

das foram determinadas pelo clculo dos respectivos

logito (B/Bo %) e interpolao a partir da curva dose-respos ta.

2.1.6. Caracterizao do RIE de GH

a) COMPARAO COM PADRO INTERNACIONAL PARA DETERMINAO DE PARALELISMO E POTNCIA

Em 3 ensaios diferentes, concentraes crescentes de GH-NIH (preparao de referncia fornecida pelo

National Institutes of Health) e GH-HC "frios" foram Incuba125 das com anti-soro 72 e GH-HC I, obedecendo ao protocolo da Tabela I. Aps separao com PEG e contagem do precipita do, as curvas dose-resposta para cada hormnio foram compara ' !

71

das entre si para determinao de paralelismo (confirmada por inclinaes idnticas das curvas) e potncia. Esta ltima

foi calculada pela razo entre as concentraes de GH-HC e 6H-NIH necessrias para provocar 50% de inibio da ligao mxima, ou seja, B/Bo = 50% (21). A Fig. 16 mostra claramente o paralelismo entre as 2 curvas, confirmando o comportamento idntico dos 2 hormnios. O clculo da potncia revelou ser o GH-HC, em mdia, 7% mais potente do que o GH-NIH, permitindo dessa maneira a calibrao correta dos padres "frios" de GH-HC.

b)

SENSIBILIDADE

A sensibilidade, definida como a dose mfnj^ ma detectvei (DHD), f o i determinada pela concentrao de G H que resultou em valor B/Bo estatisticamente Assim, diferente do

obtido para a dose zero ( 1 5 ) .

'(Bo-NSB) - 2 DP
D D * concentrao de G correspondente ao logito N H

(Bo-NSB) onde: Bo - mdia das contagens do precipitado em 9 replicatas tubo Bo; DP desvio-padro de B~; NSB contagens do precipitado do tubo NSB. do

LOGITO B/Bo(%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 16-COMPARAO DAS CURVAS DOSE-RESPOSTA PREPARADAS COM PADRES DE GH - HC () E GH- NIH ( * ~ ) "FRIOS*.

73

A sensibilidade, calculada e 12 ensaios, foi de 1,1 + 0,08 ng/ml (mdia erro padro da mdia), do considerada adequada para o estudo dos testes de o de 6H. sen

libera-

c)

PRECISO

A variao intraensaio intraamostra foi de terminada pelo perfil de preciso (Figs. 13B e 14B), elabora do de acordo com os critrios propostos por Rodbard (60). e col.

0 coeficiente de variao (CV) para uma determinada de hormnio "frio" foi calculado pela equao:

concentrao

y CVx = dy/dx onde: y = desvio-padro da resposta B/Bo correspondente concentrao x (determinada em triplicata); dy/dx inclinao da curva dose-resposta no ponto correspo^ dente i concentrao x> x 100

Em todos os RIEs de 6H, a variao ensaio situou-se em nvel igual ao Inferior a 10X para centraes de GH acima de 1,5 - 2,0 ng/ml e permaneceu redor de 5% para valores entre 10 a 30 ng/ml,

intraconao

Intervalo que

74

compreende a maioria dos picos de 6H obtidos nos testes liberao.

de

Quando 9 replicatas do controle baixo (2,3 no/ml), seqenfoi de

dio (8,0 ng/ml) e alto (22,3 ng/ml) fora dosadas cialmente em um nico RIE, o coeficiente de variao 5,6, 4,7 e 4,2%,respectivamente.

No houve alterao signi-

ficativa destes valores quando 4 replicatas foram determinadas no inicio e 4 no final do ensaio, demonstrando a estabilidade do RIE. A variao interensaio intraamostra calculada por dosagens repetidas dos controles baixo, foi mdio

e alto em 12 ensaios sucessivos, resultando em valores de 19,4, 8,7 e 12,6* para concentraes de 1,9, 8,3 e 25,2 ng/ml, respectivamente.

d)

ESPECIFICIDADE

A especificidade, definida como o grau interferncia provocado por substncias estranhas sobre

de a

reao antigeno-anticorpo, foi estabelecida de acordo com os critrios propostos por Yalow & Berson (78):

d )

Estudo dos efeitos no especficos do meio de incubao Uma possvel dvida surgida na elaborao

do RIE de 6H consistiu na diferena existente entre a composio do melo de Incubao dos pontos da curva-padrSo (apenas tampo de ensaio) e das amostras desconhecidas (tampo de ensaio mais soro), o que poderia Invalidar a comparao da

75

razo B/Bo das amostras desconhecidas como as da curva-padro. Para se avaliar esta possibilidade, foram comparadas curvas dose-resposta preparadas com padres GH-HC "frio" diludos em tampo de ensaio e em
r

de

stripper"

(soro com concentrao de GH < 1,2 ng/ml), obedecendo ao pro tocolo da Tabela I. A Fig. 17 revela a identidade entre estas 2 curvas, excluindo dessa maneira a presena de efeitos no especficos do soro sobre a reao antgeno-anticorpo e validando o protocolo do RIE de GH. Neste mesmo experimento, a porcentagem de ligao Inespecfica, determinada pela Incubao de tampo

de ensaio (200 pi) e GH-HC - 1 2 5 I (100 pi) por 20 a 24 horas a temperatura ambiente, no foi significantemente diferente da calculada pela incubao de soro, tampo de ensaio e hormnio marcado (100 ul de cada), exibindo valores de 14,9 e

14,3%, respectivamente. Estes dados demonstraram a validade de se utilizar o mesmo NSB para o calculo da curva-padro e das amostras desconhecidas.
d ) Recuperao quantitativa

Neste experimento, padres de GH "frio" (100 ul de solues contendo desde 1,25 at 40 ng/ml em tampo de ensaio) foram Incubados em trip!icata, por 20 a 24 horas a temperatura ambiente, com anti-soro 72 (50 pi de soluo 1/45.000 em tampo de ensaio) e GH-HC 25

(50 ul

76

LOGITO B/Bo (%)

60

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20 40 LOG [GH ] ( n g / m l )

FIG. 17- COMPARAO ENTRE CURVAS DOSE RESPOSTA PREPARADAS COM PADRES DE GH "FRIO" DILUDOS EM TAMPO DE ENSAIO ( - ) OU EM "STRIPPER" ( * - * ) .

77

de soluo 1/100 em tampo de ensaio), completando-se o volu me final a 300 ul com tampo de ensaio. Simultaneamente, os mesmos padres de 6H "frio" foram incubados com quantidade

fixa e conhecida de GH (100 ul de soro contendo 5,3 ng/ntl) e volumes idnticos de anticorpo e hormnio marcado, sendo tra tados como se fossem amostras desconhecidas. Aps separao com PEG e contigem do precj^ pitado, as concentraes de GH presentes nestas amostras foram determinadas por interpolao a partir da curva dose-res posta e comparadas cem os valores esperados. A existncia

de uma relao linear tipo Y - X entre as concentraes espt radas e observadas (Fig. 18) confirmou a identidade entre e s _ tes 2 parmetros e excluiu novamente a presena de efeitos

no especficos do soro sobre a reao antigeno-anticorpo.

do) Construo de curva dose-resposta com diluies progres sivas de soro de paciente acrompglico

Neste experimento, padres de GH "frio" e diluies progressivas (1/2 at 1/32 em tampo de ensaio) de soro de paciente acromegiico contendo 43,1 ng/mi de GH fo125 ran Incubados com anti-soro 72 e GH-HC I, obedecendo ao protocolo da Tabela I, e utilizados para construo de curvas dose-resposta. A identidade entre estas 2 curvas, demonstra da na F1g. 19, excluiu a presena de substncias estranhas

que pudessem Interferir com a reao antigeno-anticorpo nestas condies.

78

CONCENTRAO OBSERVADA ( ng/ml)

50

40

r * 0,994

30

20
.2.

10

10 20 30 40 50 CONCENTRAO ESPERADA ( n g / m l ) FIG. 18-RELAO ENTRE AS CONCENTRAES ESPERADAS E OBSERVADAS DE GH EM ENSAIO DENOMINADO RECUPERAO QUANTITATIVA.

LOGITO B/Bo (%)

60

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40

LOG [ G H ] ( n g / m l ) FIG. 19- COMPARAO ENTRE CURVAS DOSE - RESPOSTA PREPARADAS COM PADRES DE GH "FRIO" () OU COM DILUIES PROGRESSIVAS DE SORO DE PACIENTE ACROMEGAllCO A*).

80

2.2.

DETERMINAO DOS NVEIS SRICOS DOS DEMAIS HORH NIOS Todos os outros hormnios, com exceo da testoste

rona, foram dosados em duplicata no soro por "kits" ciais de RIE.

a) SmC - "kit": "Sm-C Radioimmunoassay Kit" (Nichols

comer-

Institute

Diagnostics, San Juan Capistrano, CA, EUA). - caractersticas: dosagem sem extrao prvia; o por segundo anticorpo. - sensibilidade: 0,1 U/ml. - variao intra e interensaio: 5,0 e 5,2S para concentraes de 0,70 e 1,50 U/ml, respectivamente. - variao interensaio: 11,2, 9,4 e 9,0% para concentraes de 0,33, 1,3 e 3,2 U/ml, respectivamente. separa-

TU

- "kit"

"GAMMACOAT

(" ^

X1 T

Radioimmunoassay Kit"

(Clinical Assays, Tr Cambridge, MA, EUA).

no! - Genentech Diagnostics,

- caractersticas: fase slida (anticorpo ligado 3 parede do tubo). - sensibilidade: 9 ng/dl: - variao Intrasnsaio: 7,9, 3,6 e 3,1 para concentraes de 89, 169 e 449 ng/dl, respectivamente.

81

"kit":

"GAMMACOAT

l""'1J '

Free/Total

T 4

Radioimmuno

assay Kit" (Clinical Assays). - caractersticas: fase slida (anticorpo ligado parede do tubo). - sensibilidade: 0,5 ug/dl. - variao intraensaio: 7,8, traes de 2,3, 7,8 e 3,2 e 4,05 para concen-

13,2 ug/dl, respectivamente. 3.6 e 5,2X para concen-

- variao interensaio: 7,1, traes de 2,8, 7,7 e

13,0 ug/dl, respectivamente.

d)

TSH - "kit": "GAMMADAB HS V

Ij hTSH Radioimmunoassay Kit'

(Clinical Assays). - caractersticas: separao por segundo anticorpo. - sensibilidade: 0,34 iiUI/ml. - variao Intraensaio: 4,6, 4,1 e 5,2% para concen-

traes de 2,6, 5,6 e 14,8 pUI/ml, respectivamente. - variao Interensaio: 7,3, 5,3 e 5,3* para concentraes de 3,0, 5,1 e 12,2 pUI/ml, respectivamente.
e) PRL - "kit": "GAMMADAB
R

ij

Prolactin Radioimmunoassay

Kit" (Clinical Assays). - caractersticas: separao por segundo anticorpo.

- sensibilidade: 1,6 ng/ml. - variao intraensaio: 5,0, 2,9 e 5.3X para concen traes de 16,0, 41,4 e 116 ng/ml, respectivamente. - variao interensaio: 5,1, 5,4 e 9,2% para concen-

traes de 11,7, 41,0 e 118 ng/ml, respectivamente. - valores normais: calibrados pelo padro da WHO 1st IRP 75/504. f)
LH - "kit": "GAMMADAB
R

['"ij

LH Radioimmunoassay Kit"

(Clinical Assays). - caractersticas: separao por segundo anticorpo.

- sensibilidade: 1,6 mUI/ml. - variao intraensaio: 6,7, 8,4 e 8,8% para concen-

traes de 16,9, 38,7 e 172 mUI/ml, respectivamente. - variao interens2io: 7,8, 4,2 e 7,35 para concen-

traes de 16,6, 40,6 e 150 mUI/ml, respectivamente. - valores normais: calibrados pelo padro da WHO 2 n d IRP-HMG.
g) FSH _ "kit": "GAMMADAB

N
I'

ij

FSH Radioimmunoassay Kit'

(Clinical Assays). - caractersticas: separao por segundo anticorpo. - sensibilidade: 0,5 mUI/ml.

83

- variao Intraensao: 6,4, traes de 8,4, te. - variao interensaio: 8,6, es de 8,1,

6,6 e 5.6X para concen-

24,4 e 49,6 UI/ml, respectivamen-

5,5 e 9,4% para

concentra

23,4 e 51,9 mUI/ml, respectivamente.

- valores normais: calibrados pelo padro da WHO 2nd IRP-HHG.

h) Cortisol TM |125 I l l\

- "kit": "GAMMACOAT

Cortisol Radioimmunoassay

Kit" (Clinical Assays). - caractersticas: fase slida (anticorpo ligado parede do tubo). - sensibilidade: 0,24 pg/dl. - variao intraensaio: 7,9, traes de 3,8, 11,6 e 3,2 e 4,45 para concen-

39,1 f/g/dl, respectivamente. 5,0 38,1 e 5,2* para concen-

- variao interensaio: 9,7, traes de 3,8, 11,4 e

ug/dl, respectivamente.

1)

Estradioi - "kit": "Coat - A - Count Estradiol" (Diagnostic

Products Corporation, Los Angeles, CA, EUA). - caractersticas: dosagem sem extrao prvia; fase slida (anticorpo ligado parede do tubo). - sensibilidade: 10 pg/mi, - variao Intraensaio: 11,4, 4,7 e 2,8% para concen-

84 traes de 37, 111 e 295 pg/ml, respectivamente. - variao interensaio: 13,7, 7,0 e 5,51 para concentraes de 81, 125 e 300 pg/ml, respectivamente.
j) Testosterona

Os nveis sricos de testosterona foram

determina

dos por RIE segundo o mtodo de Abraham ( 1 ), aps extrao do soro com acetato de etila: hexana (3:2) e sem cromatogra fia prvia. Antes de ser utilizado, o anti-soro (Radioassay Systems Laboratories, Inc., Carson, CA, EUA) foi testado, sen do a sua especificidade considerada adequada. Os padres

"frios" foram obtidos da Sygma e o hormnio trici ado da A.nersham. A sensibilidade variou de 5,5 a 6,5 ng/dl, a variao intraensaio de 5,6 a 6,7% e a interensaio de 12 a 15%.

2.3. OUTRAS DETERMINAES LABORATORIAIS Todos os outros exames laboratoriais foram includos na rotina do Laboratrio Central do HC-FMUSP e determina dos por tcnicas consagradas na literatura (3,4,31): a) hemograma completo: a contagem global foi realizada em

contador automatizado e a especfica em lmina aps colo rao com mistura de Romanowsky (Leishman); b) c) gileemia piasmtica: mtodo enzimtico automatizado; sdio e potssio sricos: espectrofotometria de chamai

85

d)

uria srica: mtodo enzimtico da urease;

e) creatinina srica: mtodo colorimtrico; f) g) protenas sricas totais: mtodo do biureto; albumina srica: mtodo do verde bromocresol;

h) clcio srico: espectrofotometria de absoro atmica; i) fsforo srico: mtodo de Fiske-Subbarow; j) fosfatase alcalina: mtodo enzimtico e cintico;

1) urina tipo I: microscopia ptica; m) exame parasitoiogico de fezes: mtodo de Faust e Hoffmann[

f
n) caritipo: analise em cultura de linfcitos. l

3. MTODOS ESTATSTICOS

Os nveis de GH observados nos testes de

tolern-

cia insulina e clonidina foram comparados e estatisticameni te analisados pelo teste H " de Mann-Whitney, o equivalente nSo pararntrico do "t" de Student, com poder de de 95% (43,70). eficincia de

Este teste foi escolhido por se tratar

comparao entre variveis Independentes, com nmero relativamente pequeno de amostras, cuja distribuio no era p r e viamente conhecida. As diferenas foram consideradas significativas ao nvel de 5% (p < 0,05).

86

Todos os valores foram expressos como mdia

+ _

erro padro da mdia (EPM), inclusive os dados referentes literatura.

VII -

RESULTADOS

88

Os pacientes foram divididos em 2 grupos, de acordo C O M os dados obtidos na avaliao clnica, laboratorial, radiolgica e hormonal. GRUPO 1: PACIENTES SEM DFICIT DE 6H Foram includos neste grupo 21 pacientes que pree cheram 3 ou mais dos seguintes critrios: a) b) ausncia de sinais tpicos de nanismo hipofisrio; ritmo de crescimento normal;

c) dosagem srica normal de SmC; d) pico de liberao de GH maior do que 7,0 ng/ml menos uit teste de estmulo (ITT ou clonidina). Os principais fatores que contriburam para a baixa estatura destes pacientes foram: a) dficit de crescimento Intrauterino, caracterizado como em pelo

altura Inferior a 46 cm e peso abaixo de 2.500 g ao nascimento para gestaes a termo: 4 pacientes (FCS, MAN, FFH e JCES);

89

b)

retardo puberal, caracterizado por inicio da puberdade aps os 13 anos em meninuj e aps os 14 em meninos: 5 pa cientes (SRC, SCN, AVC, JCES e A S ) ;

c)

desnutrio discreta, caracterizada por baixa proteica e protenas sricas totais entre 5 - 6 pacientes (FCS, FFK, RTS, A/M, SRC, AVC e JCES);

ingesto g/dl: 7

d)

doena crnica prvia (tuberculose pulmonar e lcera duo denal estenosante): 2 pacientes (JCES e AS);

e)

nanismo primordial, caracterizado por retardo mental estigmas somticos: 1 paciente (FCS);

f)

baixa estatura familiar, caracterizada pela mdia da altura dos pais inferior a 158 cm (correspondente ao centil 10 da populao brasileira): RTS, SCN, PMR, CAC, EZ e MBH). Em 7 pacientes (JAM, ADO, AHM, MTT, JHS, MSP e JAB), 7 pacientes per(FFH,

no foi encontrada explicao para o dficit de crescimento.

1.

AVALIAO CLNICA

(TABELAS II E I I I )

1.1. IDADE E SEXO Foram estudados 15 meninos e 6 meninas, com Idade entre 2,9 e 17,5 anos.

90

1.2.

HISTRIA

DO DFICIT

ESTATURAL

O incio do retardo de crescimento foi observado des de o nascimento at 3 anos antes da avaliao inicial no HCFMUSP. Vrios pacientes tinham sido previamente tratados com

v i t a m i n a s ou anabolizantes no hormonais, sem resultados satisfatrios .

1.3.

ANTECEDENTES

INDIVIDUAIS

Todos os pacientes nasceram aps gestaes normais a t e r m o , exceto o paciente SCN, que nasceu prematuro ses) com peso de 1.800 g e altera de 37 cm. Quinze (7 mepartos

foram por via vaginal, apresentao ceflica, apenas um domi ciliar, enquanto que 6 mes foram submetidas a cesrea. Duas crianas (FCS e JCES) apresentaram cianose na hora do parto do

e 5 (FCS, MAN, FFH, SCN e JCES) nasceram com peso menor que 2.500 g e altura abaixo de 45 cm.

Foram observados retardo do desenvolvimento neuropsico-motor em 4 pacientes (FCS, RTS, SCN e JCES) e baixo de (FCS, em

a p r o v e i t a m e n t o ^scolar em 2 (FFH e R T S ) . As c o n d i z e s n u t r i o foram consideradas inadequadas em 7 c r i a n a s

FFH, R T S , AAM, SRC, AVC e JCES) e as de afeto domiciliar apenas 1 ( J C E S ) .

Os pacientes JCES e AS tinham sido previamente sub metidos a cirurgias de lcera duodenal estenosapte e pneu-

91

m e c t o m i a direita por tuberculose pulmonar,

respectivamente.

A m a i o r i a referia verminose anterior t r a t a d a . Doze pacientes relataram incio do d e s e n v o l v i m e n t o puberal entre 9 e 17 anos, sendo este c o n s i d e r a d o em 4 (SCN, A V C , JCES e A S ) . em M B M aos 12 a n o s . retardado

A menarca tinha o c o r r i d o apenas

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITRIOS

A mdia da altura dos pais foi m e n o r do q u e 1 5 8 cm em 7 pacientes (FFH, RTS, S C N , PMR, CAC, EZ e M B M ) , no sendo possvel d e t e r m i n a r a idade em oue teve incio a paterna ou m a t e r n a . p'jberdade

Apenas os pais de F C S eram consangneos

(primos em lfi g r a u ) , enquanto que s JHS tinha um irmo com n a n i s m o (hipofisrio). N o foram detectadas outras patologias

f a m i l i a r e s que pudessem ajxiliar no d i a g n s t i c o da causa da baixa estatura.

1.5.

INTERROGATRIO

COMPLEMENTAR

No foram observados sintomas importantes referentes aos sistemas neurolgico, crdio-respiratrio, gastro-i testinal, steo-articular ou endcrino em nenhum dos pacientes estudados.

f.V '.

' r " f '',

92

1.6.

EXAME

FSICO entre

A altura variou entre 1,3 e 4,2 DP e o peso 0,7 e 3,4 DP abaixo da mdia para sexo e idade.

0 exame clnico de FCS revelou retardo do desenvol vimento neuro-psico-motor associado a hipotonia global e estigmas somticos comoplato ogival, retrognatia, filtro sal curto e esboo de sinofris. na-

No paciente MAN, foram dee EZ, no

tectados pectus escavatum e prega simiesca e, em JAB nevos em tronco e plato ogival. Os demais pacientes

apresentavam estigmas ou anormalidades importantes. Oito meninos e 1 menina no mostravam nenhum sinal de puberdade ao exame fsico, sendo classificados como Grupo IA (Tabela I ) . Nos outros 12 pacientes, includos no Grupo ras

IB (Tabela I I ) , foi detectada pubarca em todos, telarca

5 meninas e testculos com dimenses maiores do que 2,5 cin nos 7 meninos.

2.

AVALIAO LABORATORIAL E RADIOL6ICA GERAL III)

(TABELAS II E

As protenas sricas totais estavam

discretamente

diminudas em 4 pacientes (FCS, FFH, SRC e AVC), sendo deteve tada hipoalbuminemia em apenas um {FCS). Foi constatada an^ e

mia hipocrmica microcitica em 4 pacientes (FCS, A^M, AVC

93

TABELA II - Dados clnicos e laboratoriais em pacientes pr-pberes sem dficit de GH (Grupo IA)
Noie Sexo Idade cr on. (anos) (kg) (-DP) Peso Altura Idade Idade ssea (anos) Ritio cresc. (c/ano) (g/dl) Heiog. Prot. tot. (g/dl) (g/dl) Alb.

(1)

(c.)

( DP) -

1)

estat. (anos)

FCS KAN FFH RTS JM A

H M M
H

2,9 9,0 91 ,
11,0 11,0 12,1 13,0 14,5

10,2 22,0 19,0 18,7 31,1 26,8 25,2 24.3 IS.5

2, 6 1.1 1,7
1. 8

85, 0
122, 0 114, 3 120, 0 131. 138,

3,1 1,9 3,3 3,0 1,8 1.3 3,1 5.5 2, e

1,7 7,0 5,7

6,5

1,5

10,2 13,9 13,5 12.4 12,6 12,3 12,6 13,3 11,2 12-16

5,3

3,2

7 6
10

5,6 6,3 5,3 3,3 2,1 4.2 5.1 5,1

7,4 5,8
6.1

4,3
3,9 i.,0

H K K
H

0,7 1.2 1.8 8 2.,

, 1,4

7 3

3,5
10,0

8
10

7.0 7,4 6,5 5,6 69 ,

6-8

4,0
4,3

;o o
AAM
SRC AHH
Nonal

130, 0 123,

8,2 7.2 5,2

8
10
t,

3,8
4,3 4,0 3,5-5,0

, 3

7,9

112, , 1

(1)

Desvio-padro ei relao adia para sexo e idade segundo as tabelas de Karques e col. (45).

94

TABELA III - Dados clnicos e laboratoriais em pacientes pberes sen dficit de GH (Grupo IB)
Noae Sexo Idade cron. (anos) (kg) Peso Altura Idade Idad* ssea (anos) Ritto cresc. (c/ano) (g/dl) Hciog. Prot. tot. (/dl) lifil) Aib.

cW11
0,7 1.4 1,8 1,9 2,6

(c ) 140, 1 132, 5 152.8 142, 6 142,0 146, 5 141 ,4 128.0 126. 5 135,0 138, 4 141 , 7

(-DP)

(D

estat. (anos)

HTT JHS HSP SCN PHR AVC

JCES

1 M
M H H N M F F

12,8 13,0 15,4 15,0 15,2 16,5 17,5

34,4 28,7 39,1 34,0 30,0 39,7 30,1 31,2 25,2 25,7 31,3 25,2

L,5 2.8 2,2 2,9

10,5

9 9
1 1 12 10 13 13

6,6 95 , 8,7 8,4 5,3 9,8

12.7 14,1 12,3 13,8 12,7 11,9 12,0

6,5 6.3 6.2

6,0

*.3
4. J

8,7
13,0 11,5 11,0 12,0 10,7

4.0
4

."

3
3,4 4,2 1,5 , 3,3 2,i , 2,7 2, 8 ,

71 , 5,7 7,2 7,0 6.7 6? , 61 , 75 . 6-8

4,2
3,8*

zi .
3,2

4,1 4,3 3.7

"

CAC
JA9A

9,7
11,8 11,9 13,1 15,8

0
l.P
it 5

8,0 7,7 3,5

10,0 10,5

9
1 1 10 12 1 1

4.5 4,4 61 , 69 , 4,8

14,1 13.1 ll.. 12.6 13,5 12-16

E:
KBH AS
Noral

F F F

1.2 3,4

3,5
4,4 3,5-5,0

(l)

Desvio-padrSo tu relao a ifdia para seio e idade segundo as tabelas de Marques t col. (45).

95

EZ) e verminose em 5 (RTS, JHS, MSP, AVC e A S ) . Todos os outros exames laboratoriais g e r a i s , bem

como o Rx de crnio e o caritipo (este ltimo realizado ape nas em MAN, AHM, JAB e EZ) mostraram-se normais. 0 Rx de mos e punhos revelou retardo da idade ssea em todos os pacientes, sendo compatvel com a idade esta tural em 13 casos.

3.

AVALIAO HORMONAL BASAL

(TABELAS IV

V)

As concentraes sricas de T , T. e TSH apresenta ram-se dentro dos limites da normalidade em todos os pacientes, assim como a SmC, quando correlacionada com a idade cro nolgica e sexo. No Grupo IA, a testosterona e o estradiol -se em nvel inferior a 27 ng/dl t 10 pg/ml, situaram

respectivamente. do que

J no Grupo IB, os valores de T foram sempre maiores

60 ng/dl,enquanto que os de E_ peimaneceram abaixo da sensibilidade do ensaio (10 p g / m l ) . Foram detectados nveis

cos normais de LH e FSH em todas as meninas pberes.

96

TABELA IV

Avaliao hormonal basal em pacientes sem d f i c i t de G (Grupo IA) H

SiC

pr-pberes

Noie

T 3

TSH

(/.l)
FCS

(ng/dl) 180

Wdl)
9,0

UuiM)
2,1

(ng/dl) 13,6

(pg/il)

M0

ei
1

(0,08-1,D "'
HAN

1,2 (0.22-2,8)

189

10,1

2,9

16,0

FFH

6.2 (0.22-2,8) 2.9 (0,22-2,8)

181

10,9

3.3

20,6

RTS

188

10,7

*.2

20,0

JAU

2,7 (0,2>-2,8)

180

9,0

1.0

11,0

AO D

2.8 (0,28-3.7)

170

11,0

2.6

25,0

AN A

1,* (0,28-3.7) 2,9 (0,90-5,6)

181

9,6

2,3

25,0

SRC

181

10,0

1.2

26,0

AM H

0,60 (O.U-4,5)

152

8.7

< 10

Nonal
(1)

80-200

4,5-11,5

0,8-5,0

3-27

< 10

Valores noraais para sexo e idade cronolgica.

97

TABELA V - Avaliao hormonal basal em pacientes pberes sem dficit de GH (Grupo IB)
fcoe StC (U/.l) KTT 1.7 (0.28-3,7) (D 1.5 (0,28-3,7) 2,3 (0,91-3,1] 2,5 (0,90-5,5) 2,8 (0.91-3.1) 6,1 (0,91-3,1) 1,3 (0,91-3,1) 3,7 (0,41-4,5) I 3 (ng/dl) 160 T 4 (tig/dl) 8,0 TSH (|iUI/i!) 1.0 (ng/dl) 542

JKS

178

9,7

1.6

153

SP

160

468

SCN

185

9,8

257

PMR

195

11.2

1,8

65

AVC

188

10,0

3,0

445

JCES

168

9,5

3,7

76

CAC

200

8,2

1.7

< 10

JA8A (0,99-6,8) EZ 2,0 (0 ,99-6 .8) 6,8 ,20-5 .9) (1 1,6 (0 ,71-4 .1)

190

11,0

2,9

< 10

150

9,0

1.7

< 10

HBtt

161

8,4

3,0

< 10

AS

160

10,0

1.5

< 10

Noraal

80-200

4,5-11,5

0,8-5,0

> 50

< 82

(l) Valores nonais para sexo e idads cronolgica.

98

4.

TESTES FARMACOLGICOS DE ESTMULO

4.1.

TESTE DE TOLERNCIA INSULINA (TABELAS VI, VII E VIII) igual para a

Em todos os testes, foi obtida hipogl icerniu ou inferior a 45 mg/dl, considerada estmulo efetivo liberao de GH.

Todos os pacientes queixaram-se de mal-es-

tar geral, nuseas, sudorese e sonolncia, no sendo necess rio, no entanto, interromper o teste devido a perda de conscincia em nenhum deles. Trs pacientes (FFH e ADO do Grupo IA e AVC do Gru po IB) apresentaram nveis basais elevados de GH, provavelforam pertenGH

mente devido a "stress" na hora do teste, e, porisso, excludos da comparao com os demais. Os outros 7

centes ao Grupo IA partiram de concentraes basais de menores do que 3,0 ng/ml.

Aps administrao a insulina.es A

tes nveis elevaram-se acima de 7,0 ng/ml em 5 (71,4%).

mdia dos picos de GH, incluindo o doente JAM no qual no hou ve aumento dos nveis hormonais durante o teste, 10,3 + 1,7 ng/ml. _ No Grupo IB, 11 pacientes partiram de concentraes basais de GH inferiores a 3,6 ng/ml. Aps o estmulo hipoglj^ foi de

cmico, estes nveis ultrapassaram 7,0 ng/ml em 10 (90,%). A mdia dos picos de GH foi de 15,3 + 2,8 ng/ml, no sendo es_ tatisticamente diferente (p = 0,47) da obtida no Grupo IA.

99

TABELA VI - Nveis de GH em condies basais (B) e de pico (P) em pacientes sem dficit de GH
Pacientes pr-pheres (Grupo IA]) GH (ng/.l) Clonidina Noae ITT ) P P B FCS MAN FFH RTS JAN ADO AAN SRC AHM 3, 0 1, 1 8, 9 1, 8 3,tO 9,,2 ,5 I, 1 <1, , 1,,8 10,3 12,2 12,6 6,1 3,3 21,8 11,6 16,9 11.7 2.3 1,3 1,5 <1.1 1,3 <1.2 1,6 1,1 2,5 11. 4 13, 3 9, 8 11. 5 23, 6 4, 0 , 2*.,3 3 22,, 6 12,, Pacientes pberes (Grupo IB) GH (ng/.l) ITT Clcnidina B MTT JHS MSP SCN PMR AVC JCS CAC JAdA < 1,2 2,0 1,4 1,4 < 1.3 13,9 3,6 1,8 1,9 < 1,3 < 1,3 1,3 1,7 0,2'J P 7,2 6,1 16,3 26,9 33,4 9,2 21,2 10,1 8,2 7,1 21,1 11.1 15,3 2,5 0.1C B 1.2 <i.o 1,2 1,8 <1.3 2.1 1.6 1.1 <1.2 1,3 1.5 2,1 p < 1.2 15,4 1,6 30,4 38,0 6,7 4,6 15,4 3.9 5,6 3,5 18,6 12,2 3,5

Noie

EZ
M8H AS a EPM 1 ,9 0 ,30 10,3 11.7 1.5 0,16 14.,8 2

(1) Mdia das concentraes de GH nos teipos de -30 e 0 inutos. (2) Para o clculo da dia, as concentraes de GH que carai abaixo ia sensibilidade consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio. forai

(3) Os pacientes FFH, ADO e AVC fora excludos do clculo das idias no ITT por apresentarei valores basais elevados de GH,

100

TABELA VII - Nveis sricos de GH nos testes de tolerncia insulina e clonidina em pacientes pr-pberes sem dficit de GH (Grupo IA)
Note Dosagei -30 3,5 79 GH G GH G I.I 85 9.5 87 2,6 81 3,1 88 7,3 88 1.3 93 0 2,5 85

ITT
15 2,2 30 <1.1 30 6.5 22

(0,1 U/kg) 45 30 10,3 38 5,8 54 12,6 49 2,2 45 1,4 38 21,8 45 <1,3 40 5,1 27 3,7 14 4,2 1.2 8,7 53 4,7 54 8,7 55 8,3 71 1,5 54 17,2 53 9.7 59 5,9 53

60 8,0 72 6,2 69 3,6 77

90 5,7 43 12,2 53 2.7 74 6.1 71 1.6 58 9.0 60 9,8 73 9,7 53 10,2 41 7,9

-30 3,2

Clonit ina (0 .0375 0 30 60 1,4 1,5 11,4

gV)
90 5,1 1.'

FCS HAN FFH R1S JAM ADO AAH SRC AHH

Mdia (3)

1.2

1.5

1.6

1.7

7,9

13.

77
8.3 81

1.9

<1,2

<1,2

<1.2

9,8

<1.1

<1.1

<1.1

<1.1

11,5

G
GH G GH G GH G GH G GH G GH

78 2,9 88 11,1 8! I. 92

55 1,8 23 14,2 47 2,4 21

73 3.3 79 2,3 69 11,6 92 16,9 67 11,7 51 8.4 2,0

^,2

1,4

<1.2

5.1

23,5

<1,2

<1,2

<1,2

3,0

4,0

<'

1.6
<1.1

1,6

3,5

24,3

6,0

t.

1,2

1.3

1,7

15,2

87 2,0 77 2.1 0,37

90 1,6 74

36 1,8 37 1,6 0,21

e,:
6,3 1,2

2.8

2,2

1.4

12,5

5,8

2.

1,7
r 27

1,7 0,26

1.4 0.11

1.5 0.25

6,9 2.6

10,3 2,0

.. 2,

EPM
(1) GH (ng/l).

1,4

(2) Glice.ia (ig/dl). (3) Para o clculo das (dias, as concentraes de GH que cairai abaixo da sensibilidade forai considir*das iguais ao vaior da sensibilidade do respectivo ensaio.

,. L. U. '

101

TABELA VIII

- Nveis sricos de GH nos testes de tolerncia insulina e clonidina em pacientes pberes sem dficit de GH (Grupo IB)
ITT (0,1 U/kg) Clonidina (0,0375 iq/i')

j |
j '

Noie

Dosagea

-30
GH

0
<lt2

15
<1>2

30
lf2

45
7 9

60
? 2

90
6>1

I3
l>3

<I>2

30
<1>2

60
'

90
<! 2

TT

G
JHS

(2' '

<1>2

'

'

<lt2

'

80 1,9 91 1,6 73 1,4 83

82 2,1 85

19 2,2 43

28 6,1 39

42 3,1 57

45 2,2 64

52 <l,0 <I,0 <l,0 73 9,6 74 1,5 15,4 14,0 6,2

GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH

<1,2 <1,2 10,0 17,6 16,3 74 30 40 56 61 1,4 80 2,0 59 1,4 44

1,2 <1,2 <1,2 <1,2

1,5

1,1

SC

"

18,1 26,9 15,6 60 %?. 77

1,8

1,9

2,7 30,4 24,7 10,C

PBR

<1,3 <1,3 <1,3 11,3 24,8 26,2 33,4 <1,3 <1,3 81 77 34 39 36 35 44 15,6 12,2 74 75 3,7 89 2,1 83 1,2 95 3,5 96 1,6 79 2,6 90 4,7 40 6,6 54 1,6 45 2,1 45 2,8 27 7,2 49 9.1 45 9,1 60 7,4 78 4,5 84 6,3 72 9,2 69 5,0 63 10,1 84 1,8 87 6,7 84 1,8 2,5

9,2

38,0 26,1 13,0

1.6

<l,0

6,1

6,7

*VC

\ 1,5 1,8 1,3 4,6 3,6 1,4

!

JCE$

21,2 14,2 34 51 1,5 38 2,1 38 3,6 40 5,5 66 8,2 77 5,6 62

i 1,3 0,9 1,2 2,0 16,4 *.

CAC

<!,2 <1,2

1,4

3,9

1,4 <1,2

JABA

11

<1,3 <1,3 <1,3 87 84 44 <1,3 '1,3 68 73 <1,2 93 1,6 1,4 94 1,7 2,0 46 <1,2 40 2,0

1,3

1,3

<!,3

2,0

5,6

1,5

"

BM

21,1 19,3 19,2 17.0 36 39 47 60 1,4 27 7,3 8,4 51 11,1 66 5,1 84

1,4

1,7

1,5

2,1

2,5

3.5

1,9

2,3

2,7

18,6

3,7

2,3

AS

G GH

Hftia^ EPH

12,0 12,4 10.1 2,1 2,6 2,8

1,4

1,5

2,2

10,0

9,6 2,8

*,4 1,1

0,22 0,22 0,45 2,3

0,08 0,14 0,63 3,6

(1) GH (ng/.l). (2) Gliceaia (g/dl). (3) Para o clculo das adias, as concentraes de GH que carai abaixo d? sensibilidade fora consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.

102

Em ambos os c upos, a c o n c e n t r a o mxima de GH ocor reu entre 30 e 90 minutos aps injeo da insulina, mais fre q u e n t e m e n t e no tempo 60 (7 p a c i e n t e s ) . 0 cortisol s foi dosado no paciente F C S , mostrando uma resposta normal ao estmulo h i p o g l i c m i c o (Tabela X V I ) .

4.2.

TESTE DA CLONIDINA

(TABELA VI, VII E V I I I ) dos

Na maioria dos testes, houve discreta r e d u o

nveis pressricos associada a leve sonolncia, o c o r r e n d o entre 60 e 120 minutos aps administrao da c l o n i i n a . da foi de 10,9 + 1,8 mmHg para a presso sistlica 5,9 +_ 1,1 mmHg para a diastlica. Todos os pacientes partiram de nveis b a s a i s de GH inferiores a 2,5 n g / m l . No Grupo IA (9 p a c i e n t e s ) , a r e s p o ^ Coji foi e A que de

ta clonidina foi maior do que 7,0 ng/ml em 8 ( 8 8 , 9 X ) . siderando todos os 9 pacientes, a media dos picos de GH de 14,8 + 2,4 ng/ml, no sendo estatisticamente (p = 0,26) da obtida no ITT. No.Grupo IB (12 p a c i e n t e s ) , a clonidina

diferente

promoveu apenas

Incremento na concentrao de GH acima de 7,0 ng/ml em 5 (41,7%).

A mdia dos pico de GH, incluindo os 7 p a c i e n t e s ng/ml,

com resposta inferior a 7,0 ng/ml, foi de 12,2 + 3,5

no sendo estatisticamente diferente da obtida no m e s m o teste no Grupo IA (p = 0,28) nem da observada no ITT no G r u p o (p = 0 , 1 5 ) . IB

Entretanto, os nveis de GH observados nos dife

103

rentes tempos do teste da clonidina foram discretamente infe riores aos do ITT (Fig. 2 0 ) . Em ambos os grupos, a concentrao mxima de GH ocor reu entre 60 e 120 minutos aps administrao da clonidina, mais freqentemente no tempo 60 (9 pacientes).

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

Este teste s foi realizado no paciente FCS, revelando respostas hipofisrias normais de LH, FSH, TSH e PRL. a

Os nveis basais elevados de PRL deveram-se provavelmente "stress" na hora do teste (Tabela X V I ) .

5.

SEGUIMENTO

(FI6S. 21 E 22)

Todos os pacientes apresentaram ritmo de crescimen to adequado, com exceo de FCS e ADO. Durante a evoluo,

foi observada pubarca em ADO aos 12,5 anos e incio da pube dade em SRC aos 14,8 anos, permanecendo pr-pberes os demais componentes do Grupo IA. J no Grupo IB, houve progresso

discreta dos sinais puberais em todos os pacientes.

104

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

FIG. 2 0 - NVEIS SERICOS DE 6H ( MEDI A ERRO PADRO

DA MDIA) NOS TESTES DE TOLERNCIA INSULINA { ) E CLONIDINA ( * * ) EM PACIENTES PBERF.S SEM DFICIT DE GH.

105

M-TURA cm

90
80 70 60 150 140 30 120

110
00 90
i i i i i i i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS IG. 21 - RITMO DE CRESCIMENTO DE 21 PACIENTES DO SEXO MASCULINO COMPARADO COM O GRA'FICO DE MARQUES E C 0 L . ( 2 8 ) . ( ) INCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( t ) INCIO DA PUBERDADE.

106

AS

CAN
iiIIiiiIIIiii i
i i , i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS FIG. 22 - R I T M O DE CRESCIMENTO DE 9 PACIENTES DO SEXO FEMININO COMPARADO COM O GRAFICO DE MARQUES E COL. ( 2 8 ) . ( * ) INCIO DO TRATAMENTO COM GH. ) INCIO DA PUBERDADE.

107

GRUPO

2:

PACIENTES COM DFICIT DE GH Foram includos neste grupo 10 pacientes que preer

cheram 3 ou mais dos seguintes critrios: a) b) c) d) presena de sinais tpicos de nanismo hipofisrio; ritmo de crescimento redu2ido; dosagem srica diminuda de SmC; pico de liberao de GH menor do que 5,0 ng/ml err 2 t e s tes de estmulo (ITT e c l o n i d i n a ) . A etiologia do distrbio hormonal foi considerada

idioptica em todos os pacientes com exceo de FSGS, na qual foi diagnosticado craniofaringioma. Entretanto, suspeitou-se de doena hipofisria familiar em 4 (ARC, P C S , CC e JAS) devido presena de consanginidade entre os pais. Em 4 pacientes (RJSC, PCS, CAN e FSGS), foi feito o dia nstico de deficincia hipotaimica-hipofisria mltipla pelos nveis sricos basais reduzidos de T e T. e/ou respostas subnormals

dos demais hormnios hipofisrios aos estmulos de hipoglicf? mia, TRH e LHRH. Os outros 6 pacientes (ARC, FK, AMAS, WL,

CC e JAS) foram classificados como dficit isolado de GH.

1.

AVALIAO CLNICA 1.1. IDADE E SEXO Foram estudados 7 meninos e 3 meninas, com idade

entre 5,0 e 16,1 anos.

108

1.2.

HISTRIA DO DFICIT

ESTATURAL

O retardo de crescimento foi notado pelos familiares nos primeiros 6 anos de vida. Com exceo de vitaminas, antes de

nenhum paciente tinha recebido qualquer tratamento procurar o HC-FHUSP.

1.3.

ANTECEDENTES

INDIVIDUAIS

Todas as gestaes evoluram sem intercorrncias, com durao de 9 meses. Os 10 partos foram por via vaginal,

sendo 3 plvicos e associados a cianose do recm-nascido. Apenas 1 criana nasceu corn peso inferior a 2.500 g e nenhuma com altura abaixo de 48 cm. Foi observado retar-

do do desenvolvimento neuro-psico-motor no paciente PCS e um baixo aproveitamento escolar em RJCS e PCS. As condies de (PCS,

nutrio foram consideradas inadequadas em 4 crianas

WL, CC, CAN) e as de afeto domiciliar em apenas 1 (ARC). No foram relatadas outras patologias importantes em nenhum dos

doentes, a no ser criptorquidia tratada com Pregnyl en AMAS, asma brnquica em RJCS e verminoses prvias. Dois pacientes (JAS e FS6S) referiram incio do d senvolvimento puberal aos 14 e 15 anos, respectivamente, do os demais pr-pberes.

109

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITRIOS

A mdia da altura dos pais foi menor do que 158 cm em apenas 1 paciente (FSGS), sendo observada consanginidade entre os pais de 4 (ARC, PCS, CC e JAS). Foi relatado nanis mo acentuado (no investigado) s em 1 irmo de ARC, no sen do referidas outras patologias lias. relewntes nas demais fam' |

1.5.

INTERROGATRIO

COMPLEMENTAR poliria,

A paciente FSGS apresentava polidipsia,

nictria e hemianopsia bitemporal no associada a cefalia. Nenhum dos outros doentes referia sintomas neurolgicos, hipotireoidismo ou de hipocortisolismo. de

1 .6. EXAME FSICO Sete pacientes (ARC, RJSC, FK, PCS, CC, CAN e JAS)

apresentavam sinais tpicos de nanismo hipofisrio como nariz em sela e adiposidade abdominal, associados a pele ressecada e reflexo aquileu lentificado em 2 (RJSC e P C S ) . No foram a

detectadas outras anormalidades em nenhum dos pacientes,

no ser presena de fronte olmpica e esclera a2ulada em CC. Seis meninos e 2 meninas foram considerados pr-p beres ao exame fsico, sendo classificados como Grupo 2A (Tabela I X ) . No Grupo 2B (pberes), constitudo por apenas 2

nc
elementos (Tabela X) a paciente FSGS apresentava pubarca e

telarca (estdio II de T a n n e r ) , enquanto que JAS tinha test culos com 3,2 cm de dimetro.

2.

AVALIAO L A B O R A T O R I A L E RADIOLGICA GERAL E X)

(TABELAS

IX

As protenas sricas totais encontravam-se diminu das em 4 pacientes (PCS, WL, CC e C A N ) , sendo detectada hipo_ albuminemia discreta em apenas 1 (CAN). Foi constatada verde

minose em 3 pacientes (WL, CC e FSGS) e graus variveis

anemia normoctica normocrmica ou microctica hipocrmica em t o d o s , com exceo de FK. Os demais exames laboratoriais e ^

tavam dentro dos limites da normalidade. 0 Rx de crnio de FSGS revelou sela trcica con cii menses a u m e n t a d a s , desdobramento do assoalho, e calcifica> suprasselar, sendo confirmado o diagnstico de tumor cstico com extenso intra e suprasselar pela tomografia computadori zada. Nos demais pacientes, o estudo radiolgico no mostrou nvel da sela trcica.

anormalidades ao

A idade ssea estava retardada em todos os pacient e s , no sendo compatvel com a idade estatural em apenas (AMAS e W L ) . 2

ill

TABELA IX - Dados clnicos e laboratoriais em pacientes pr-pberes com dficit de GH (Grupo 2A)
Noae Sexo Idade cron. (anos) (kg)

Peso (-DP)

Altura

Idade

Idade ssea (anos)

fcito cresc. (c/ano)

Heio.

Prot. tot.

Alb.

1
ii

( D

(c) 98, 6
114, 6 119, 2 113, 0
12*. 133,

-DP) (

( D

tstat. (anos)

(s/l)
11.9

(g/dl)

(s/<^
4.1 3,9
4,6 3,7 4.0 3,5 3.7

AC R RJSC F K PCS AHAS L, C C

CAN
Noraa!

K M
H

9,7
10,0 10,0 12,9

15.7 25,0 26,2

2. 4 0,9 0,8 2, i,

5,6 3.5
2. 8 5,4

3,2 5,7
6.5

3 5
7

4,2
2.0 5,5 3,4

6.5 6.1
8.4 5,5 6.4

5
ii *

11,0
13,2 10,4 11,4 11,4

K M H F F

5,5 7.2 9,0 2,0

1.7

6
10 12

21,0 15,3 29,0 12.2 10,3

3.0 2. 7 2, 1
3,5

5,2 *.7
4 7 85

2,9 1,2 15 .
2,9

J :! .

5.8 5,0
5.0

.
p
* -

5.0
9.6

87 4
84 7

2
1,5

H.3
10,3

3,4
3,5-5.0

12-15

6-B

(l)

Oesvio-padro e relao a dia para sexo t idade segunda as tabelas it Karques e col. (45;.

112

TABELA X

Dados c l n i c o s e laboratoriais em pacientes pberes com d f i c i t de G H (Grupo 2B) Idad: estat. (anos) 67 . 8,2

< jj

Note

Peso Sexo Hade cron. (1) (anos) (kg) (-DP) X F 14,5 16,1 21.5 25,7 3, 1 3. 4

Altura (c.) 120,9 128, 8 (-DP) (1) 5,6 4,8

Idad; ssea (anos) 9 9

Ritio tresc. (ct/ano) 3.2 2,8

(fl/dl) 11,7 10,9 12-16

Alb. Prot. tot. ig/dl) (g/dl) 63 , 62 . 6-8

(<).

JS A FSGS Nor.al
(l)

4.0 4.4 3,5-5,0

O e s v i o - p a d r o em r e l a o a d i para seno e idade segundo as t a b e l a s de Par-ques e c o l .

113

3.

AVALIAO HORMONAL BASAL

(TABELAS XI E XII)

A SmC, quando correlacionada com a idade cronolgi ca e sexo, mostrou-se diminuda em todos os pacientes, nveis sricos reduzidos de T 3 e/ou T , associados a valores normais de TSH, foram observados em 3 (RJSC, PCS e FSGS), confirmando a presena de hipotireoidismo secundrio. A testosterona srica situou-se em nvel inferior

a 2? ng/dl em todos os meninos do Grupo 2A, enquanto que, no Grupo 2B, JAS mostrou um valor de 50,1 ng/dl. J o estradiol
i

srico caiu abaixo da sensibilidade do ensaio (10 pg/ml ) em todos os pacientes de ambos os grupos.

; ;

4.

TESTES FARMACOLGICOS DE ESTMULO

4.1.

TESTE DE TOLERNCIA XIV E XV)

INSULINA

(TABELAS

XIII,

Nveis de glicemia inferiores a 40 mg/dl ocorreram entre 15 e 30 minutos aps administrao da insulina em todos os testes. Apesar dos sintomas desagradveis de hipoglicemia

observados em todos os pacientes, no foi necessrio i n t e r romper o teste devido a perda de conscincia em nenhum. Com exceo de JAS, todos os pacientes partiram de nveis basais de GH iguais ou menores do que 1,0 ng/ml , no

114

TABELA XI

Avaliao hormonal basal em pacientes pr-pberes com d f i c i t de G H (Grupo 2A)

Noae

SiC

(u/.D
ARC (0.22-2,8)' RJSC < 0,10 (0,22-2,8) < 0,10 (0,22-2,8) PCS 0,13 (0,28-3.7) 0,14 (0,90-5,6) < 0.10 (0,91-3,1) < 0,10 (0,18-2,4) < 0,10 (0,41-4,5)

3 (ng/dl) 100

TSH (\iUlfil) 4,2

T (ng/dl) 16,0

(w/dl)
7,7

(pgM)

>1! (1)

122

3.7

2,9

8,2

147

7,5

3,7

6.4

75

4,0

2,2

13.0

AMAS ML
CC

156

11.5

1.0

25,0

93

7,4

42

23,0

135

8C ,

< :c
2,0

CAN

97

8,3

< IO
3-27 < 10

Norial

80-200

4,5-11,5

0,8-5,0

(1) Valores noriais para sexo e idade cronolgica.

115

TABELA XII

Avaliao hormonal ba:al e pacientes pberes com m d f i c i t de G H (Grupo 2B)

Nose

SC (U/.l)

T (ng/dl) 97

T dig/dl) 10,7

TSH (jiUl/dl) 2,2

(ng/dl) ( p 9 M ) 50,1

JAS

0,10 (0,90-5,6)' 0,10 (0,71-4,1)

FSGS

37

3,9

2,7

< 10

Norial

80-200

,5-11,5

0,8-5,0

> 5C

< 82

(l) Valores noraais para sexo e idade cronolica.

116

havendo incrementos acima de 1,4 ng/ml aps o estmulo hiooglicmico em nenhum. No pacientes JAS, a concentrao de GH

elevou-se de um basal de 1,9 ng/ml para um mximo de 3,5 ny/ml no tempo 3 0 . No G r u p o 2A, a mdia dos picos d e t e c t a d o s aps injeo de insulina foi de 0,89 +_ 0,08 n g / m l , estatisticamente menor (p < 0,01) do que a obtida no Grupo IA. Houve uma dis

criminao completa entre os nveis de GH o b s e r v a d o s nos diferentes tempos do ITT no Grupo 2A quando comparados do Grupo IA (Fig. 2 3 ) . No foi calculada a mdia dos picos nem realizada a comparao estatstica do Grupo 2B com os d e m a i s , j que este era constitudo por apenas 2 pacientes q u e , alm de tudo, ccn os

apresentavam secrees nitidamente d i f e r e n t e s de GH. Nos pacientes em que houve discreto aumento dos nveis de GH durante o teste, os entre 30 e 90 m i n u t o s . Com relao ao cortisol (Tabela X V I ) , os nveis sj? ricos basais m o s t r a r a m - s e normais em todos os pacientes. Aps estmulo h i p o g l i c m i c o , a resposta foi c o n s i d e r a d a subnormal em apenas 3 (RJSC, PCS e F S G S ) , confirmando a deficincia do hormnio adrenocorticotrfico (ACTH) ou dor do ACTH (CRF). do hormnio liber^ valores mximos foram observados

TABELA XIII

- Nveis de GH em condies basais (B) e de pico (P) em pacientes com dficit de GH

Pacientes pberes G^upo 2B) fvtis d GH ( n q M ) No* ITT Clonidina

Pacientes pr-pberes (Grupo 2A) Hveis de GH (nq/il] ffoae ITT Clondina

B
ARC
RJSC 0,6 0,6 < 0,9 1.0 0.7 < 0,6 < 0,6 < 0,6 0,70 0,05 0,8 <: 0,6 0,9 < 0,9 0,9 0,6 1,3 0,6 0,7 1,0 1,0 0,9 1.2 2.3 1,3 0.7 0,5 1,1 0,18 FSGS 1.0 1,9 0,9 3,5

B 1,2
lfk

J,7 U,8

M
0,9 1.0 0,8

JAS

n
PCS
AKAS

XL CC
CAN
Hidia

0,8 0.7 0,7

0,89 0,08

o.ei
0,08

EPH

(1) Mdia dos nveis de GH nos teipo; de -30 e 0 linutos. (2) Para o clculo da adia, as concentraes de GH que cara* abaixo da sensibilidade forai consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.

118

TABELA XIV - Nveis sricos de GH nos testes de tolerncia insulina e clonidina em pacientes pr-pberes com dficit de GH {Grupo 2)
Nose Dosage -30 GH, , (2) G GH G GH G PCS GH G ANAS GH 6 "L GH G GH G GH G GH 0,7 72 0,6 86 <0,9 89 1,1 75 0,8 77 <0,6 104 <0,6 81 <0,6 56 0,73 0,06 0 <0,6 61 0,7 86 <0,9 82 0,9 73 0,6 78 <O,6 72 <0,6 76 <0,6 58 0,68 0,10 ITT 15 <0,6 39 1,0 40 <0,9 26 1,0 43 0,6 50 0,6 48 0,6 34 <0,6 28 0,73 0,06 (0,1 U/kg) 30 45 0,6 30 1,3 25 <0,9 39 0,8 36 <0,6 30 0,7 39 0,7 32 0,7 11 0,78 0,08 <0,6 32 0,8 32 <0,9 40 0,7 36 0,8 39 <0,6 44 42 "0,6 17 0,71 0,04 Clonidina (C.0375 i g V ) 0 30 60 90 <0.6 1,2 0.9 0,9

60 <0,6 38 1,2 33 <0,9 80 0.8 49 0,8 " 0,7 51 0,6 34 <C,S 22 0,77 0,07

90 0,8 43 1,4 40 <0,9

-3C <0,6

120 1,0

ARC

0,9

0,9

0.9

1,0

1,0

0,9

<O,9

<0,9

<0,9

<0,9

<0.9

<0,9

1,0 35 0,3 67 0,8 56 <0,6

0,9

0,9

1,2

0,7

0,9

0,9

0,6

<0,6

2,3

1,0

1.6

2,3

1,1

1,6

1,3

0,5

<0,5

0,5

0,6

<0.6

<0,5

C,7

0,6

CC

nu Hdia^ EPH

<0,6 27 0,85 0,09

C,

<C,5

<C,5

<C.:

:,6

<O,-:

0,80 0,05

0,83 0,12

1,2 0,20

0,77 0.C5

0,90 0,11

1,0 0,19

(1) GH (ng/il). (2) Gliceiia (*g/dl). (3) Para o clculo das id;as, as concentraes de GH que carai abaixo da sensibilidade forat consideradas iguai* ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.

119

TABELA XV - Nveis sricos de GH nos testes de tolerncia insulina e clonidina em pacientes pberes com dficit de GH (Grupo 23)
No Dosage -30 GH G GH G 1,2 78 1,7 88 0 <0,9 74 2,1 82 ITT (0,1 U/kg) 15 30 45 <0,9 37 2,9 35 <0,9 24 3,5 26 <0,9 26 2,4 53 Clonidina (0,0375 g/') 0 30 60 90 1,1 1,3 1,7 1,5

60 <0,9 33 2,1 46

90 <0,9 36 2,8 62

-30 1,1,

120 1,2

FSGS

1,8

1,1

1,6

4.8

3,7

2,0

"'

(1) GH (ng/il). (2) Gliceiia (g/dl).

120

4.2.

TESTE DA CLONIDINA

{TABELAS

XIII,

XIV

XV)

Houve reduo de 10,8 + 2,8 e de 5,0 + 1,6 imiHg nos _ nveis da presso arterial sistlica e diastlica, respectivamente. Esta queda ocorreu entre os 60 e 120 minutos do tes

te e foi acompanhada por leve sonolncia, de maneira semelhan te observada no Grupo 1. Todos os pacientes partiram de concentraes basais de GH iguais ou inferiores a 1,4 ng/ml. Aps administrao

da clonidina, no houve incremento acima de 2,3 ng/ml em nenhum, com exceo de JAS, que mostrou um valor mximo 4,8 ng/ml no tempo 60. No Grupo 2A, a mdia dos picos ps-cionidina de 0,81 *_ 0,08 ng/ml. foi de

A anlise estatstica mostrou que esmesmo

te valor era menor (p < 0,01) do que o observado no

teste no Grupo IA, mas no diferente (p = 0,37) do obtido no ITT no Grupo 2A. Houve tambm uma discriminao completa e

tre os nveis de GH observados nos diferentes tempos do teste da clonidina no Grupo 2A quando comparados com os do Grupo IA (Fig. 2 3 ) . No Grupo 2B, no foi calculada a mdia dos picos nem realizada a comparao estatstica com os demais pelas razes anteriormente especificadas. Os tempos de pico, nos testes em que houve discreto aumento dos nveis de GH, ocorreram entre 30 e 90 minutos aps grupos

121

GH ( ng/ml)

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

F!G. 2 3 - NVEIS SRICOS DE GH ( MEDIA ERRO PADRO DA MDIA} NOS TESTES DE TOLERNCIA INSULINA (,*,) E CLONIDINA (^--4,06) EM PACIENTES PR-PBERES SEM DFICIT ( - , * - * ) E COM DEFICINCIA (c^-o aa) DE GH.

122

administrao da c l o n i d i n a , sendo mais precoces do que Grupo 1.

no

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

(TABELA

XVI)

Todas as dosagens basais de TSH, PRL, LU e FSH foram normais, com exceo do valor elevado de PRL observado nos pacientes PCS e FSGS, sugestivo de distrbio h i p o t a l m i co. Aps estmulo com TRH, os incrementos do TSH e PRL foram considerados subnormals em apenas 1 (CAN) e 2 (FSGS e

C A N ) pacientes, r e s p e c t i v a m e n t e , indicando uma baixa reserva hipofisria destes h o r m n i o s . Em RJSC, a resposta exagerada do TSH sugeriu um distrbio hipotalmico. Com exceo de CAN (teste no r e a l i z a d o ) , todos os pacientes responderam ao LHRH com elevao dos nveis sricos de LH e FSH, excluindo uma deficincia hipofisria total d e tes hormnios. 0 aumento das gonadatrofinas foi considerado crianas

normal nos 2 pacientes pberes, ao passo que, nas

p r - p b e r e s , no foi possvel avaliar o grau de r e s p o s t a , j que, nesta fase, a hipfise normal pode no responder ao estimulo agudo com LHRH.

123

TABELM

XVI - Resposta do corfisol (F), TSH, PRL, LH e FSH ao estmulo hipoglicmico, TRH e LHRH em 11 pacientes com baixa estatura
ITT ;Iic. (0,1 /kg) F (ytg/dl) TRH (200 pgj LriRH LH (II/'!) (IQQ
uq)

Ho,e

(ig/dl)

TSH (pUl/iI) PRL (pg/.I)

FSM (ui/ii

8 FCS ARC RJSC F K PCS A!US M L 82 66 86 85 74 77 88 78 5/ 85 76

70-110

P
20,0 30,4 5,3 25,6 12,8 34,0 31,0 27,0 32,0 20,1 15,0 16-42

8
2,2 4,2 2,9 3,5 2,2 1,6 4,2 1,6 2,8 1,1 2,9 1-6

P
26,0 12,0 58,3 16,9 <,,8 23,8 7,9 4,9 10,3 26,5 6-30

B
34,6 5,4 8,7 5,9 32,1 98,6 29,3 29,1 31,1 55,4

30 30 25 26 36 30 39 32 1 1 26 24

16,5 20,5 6.0 8,3 8,8 15,0 7.1 13.0 21,5 10.1 6,7 5-17

3,0

21,6 12,3 12,:

4.1 1,9 2,8 0,8 3.3 3.3 6.7 3,4

10,0

5.8 7.4 2.0

5,6 4.6

5,7 10,5 2.0

6,4 4,8

4,9
11,7 23,0 30,9

8,1 7,1 5,0

19,6 13,7 7,5

9,9 3,0

13,8 9,4

c c
CN A JAS FSCS Nonal
(1) (2) (3) (4) (5)

8,6

4,4
21.1 2-16 21,? 15-98 11,6 16 ,

26,7 25 3 13-97
C5i

2.7
12,'

85 , 20,', 4-"- (5

-17 3-17

2-9

Basal - ldia dos nveis horaonais no teipos it -30 e 0 cinutos. Nadir. Pico de concentrao horaonal aps estaulo. Valores noraais segundo Nery (52). Respostas noriais para pacientes pberes.

124

5.

SEGUIMENTO

(FIGS. 21 E 22)

Todos os pacientes foram seguidos por um

perodo

mnimo de 6 meses, com exceo de FSGS, a qual foi submetida a cirurgia transfenoidal 3 mesr aps a avaliao inicial, Neste

sendo confirmado o diagnstico de craniofaringioma.

perodo, a nica medicao administrada foi 1-tiroxina (50 a 100 ug por via oral) aos pacientes com hipotireoidismo firmado laboratorialmente. Com exceo de ARC e FK, todos os demais pacientes apresentaram ritmo de crescimento reduzido, sendo que apenas WL entrou em puberdade aos 15,7 anos. Aps iniciado trata(0,1 U/kg con-

mento com GH extrado de hipfises humanas no HC-FMUSP

de peso administrados por via intramuscular 3 vezes por semana), houve acelerao da velocidade de crescimento em RJSC, CAN. CC e

VIII

I SCUSSAO

COM:1-

A : '' V-.R/SP

126

A clonidina, administrada na dose oral de 0,15 mg/ra*, comprovadamente um potente agente estimuiador da secreo de GH. Isto foi demonstrado pela primeira vez por picos de GH Gil-Ad e acima de

col. (23,24) em 1979, que observaram

10 ng/mi (mdia + erro padro da mdia: 34,4 + 4,5 ng/ml ) em _ todos os elementos de um grupo de 18 crianas e adolescentes com baixa estatura sem distrbio endccrino. Fm escudo sero?1han te, Romero e col. (63) relataram picos de GH de 21,9 +_ 4,0 ng/mi, com resultados falso-negativos (resposta menor do que 7,0 ng/ml) em 14,3%. Em trs estudos (16,39,66) em que o teste da cloni dina (0,15 mg/m* ) foi comparado com o ITT (0,1-0,15 U/kg ou

4 U/m 2 ) em pacientes com nanismo no hipofisrio, foi observado maior pico de liberao de GH, associado a menor i n c i dncia de rc.ultados falso-negativos, no primeiro teste. Sa]_ ti e col. (66) relataram picos ps-clonidina de 13,7 ^1,9 ng/ml, sendo menores ou Iguais a 8,0 ng/ml em 9,7% dos paciente1;. Fraser e col. (16) no encontraram respostas inferiores J a

7,5 ng/ml em nenhum teste da clonidina, cuja mdia dos picos foi de 18,8 + 1,6 ng/ml. Picos muito mais elevados durante

127

este teste (36,5 + 9,9 ng/ml) foram observados por _

Lanes

col. (39) no nico estudo em que apenas crianas pr-pberes foram avaliadas, com 5,8% de respostas inferiores a 10 ng/.-ni A eficincia de liberao de GH provocada pela clonidina foi considerada equivalente e no superior do ITT em apenas um trabalho (30), que consistiu na investigao de 64 pacientes coro baixa estatura em diversos centros da Gr-Bretanha. En-

tretanto, algumas objees foram feitas quanto validade dos resultados deste ltimo estudo, j que as dosagens de GK foram realizadas en, diferentes laboratrios e os pacientes nem sempre estavam em jejum no dia do teste da clonidina (16). 0 teste da clonidina (0,15 mg/m 2 ) tambm mostrou-se superior ao do 1-dopa (120-250 mg ou 300 :ng/n>*) e ao da argi nina (0,5 g/kg). Em dois estudos (62,71) realizados em pacj^ maior pico

entes com nanismo no hipofisrio, foi observado

de liberao de GH (16,3 + 0,95 e 13,1 + 1,76 ng/ml) e nenor _ ndice de resposta inferior a 7,0 ng/ml (6 e 0%, respectiva mente) no teste da clonidina. Devido ocorrncia de hipotenso por vezes severa (47) associada dose de 0,15 mg/m 7 , a clonidina foi testada em quantidades menores com o intuito de se reduzir a incid cia de efeitos colaterais e, ao mesmo tempo, manter eficincia adequada de liberao de GH. Romer e col. (62) estudaram, nanismo

em 1982, a secreo deste ho mnio em pacientes com

no hipofisrio aps administrao de 0,05, 0,10 e 0,15 mg/m*

123

de clonidina, no observando diferenas estatisticamente sig nificantes nas respostas obtidas com estas 3 doses. Neste

mesmo ano, Laron e col. (41) propuseram a realizao Jo teste da clonidina com a dose fixa de 0,025 mg e compararam-no com o ITT (0,1 U/kg). Em 12 pacientes com baixa estatura consti

tucional, sem meno ao estgio puberal, os autores r e l a t a ram picos de GH e resultados faiso-negativos (resposta menor do que 10 ng/ml ) de 21,8 + 4,9 ng/ml e 16,7% para o ITT, _ e

de 30,6 + 8,8 ng/ml e 8,3% para a clonidina, sendo este lti _ mo associado a redues da presso sistlica de 5 a 10 mmHg. Concluram, portanto, que a clonidina, mesmo na pequena dose de 0,025 mg, era um agente liberador de GH mais potente que o estmulo hipoglicmico. Entretanto, dois estudos subseqentes (11,40), reji lizados em grupos de crianas pr-pberes com nanismo no hj^ pofisrio, demonstraram que o teste da clonidina coro dose in ferior a 0,15 mg/m 2 , embora adequado para avaliar a reserva do

hipofisria de GH, no era to eficiente quanto inicialmente proposto por Laron e col. (41). No trabalho realizado por

Dammacco e col. (11) em 1983, o teste da clonidina (0,035 mg/m2) foi comparado com o da arginina (0,5 g/kg). Os resultados

revelaram picos de liberao de GH semelhantes (16,7 + 2,44 ng/ml para a clonidina e 15,69 + 2,56 ng/ml para a arginina), _ mas

menor incidncia de resultados falso-negativos (pico7,0 ng/ml) no teste da clonidina (16,7*) do que na arginina (25S). Houve

129

r e d u o dos nveis pressricos ps-clonidina de

11,5 i 0,8 mmHg

para a sistlica e de 7,5 +_ 0,7 mmHg para a diastlica. J no e s t u d o de L a n e s e col . ( 4 0 ) , publicado em 1985, a foi t e s t a d a nas doses fixas de 0,100 e 0,050 mg clonidina (corresponem Os

d e n t e s , e m m d i a , a 0 , 1 1 9 e 0,0619 m g / m 2 , respectivamente) 10 (Grupo A ) e 14 (Grupo B) crianas, respectivamente.

picos de GH foram de 14,5 +_ 2,0 e 11,6 +_ 1,6 ng/ml nos Grupos A e B, r e s p e c t i v a m e n t e , com ndice de respostas (menores do que 10 ng/ml) de 10 e 3 6 % . subnormais

Houve decrscimo se14 a

m e l h a n t e da p r e s s o arterial nos 2 g r u p o s , variando de

15,3 mmHg para a sistlica e de 2,3 a 4,0 mmHg para a diast lica. Neste m e s m o trabalho, 9 crianas com baixa estatura de

i d i o p t i c a foram estudadas com uma dose de 0,100 ug/m 2

c l o n i d i n a e uma nica coleta de sangue aos 60 minutos, sendo o b s e r v a d o s picos maiores ou iguais a 10 ng/ml em todas. 0 t e s t e da clonidina com a dose de 0,0375 mg/m 2 foi, neste p r o j e t o , avaliado no que diz respeito eficincia

de liberao de GH e incidncia de efeitos colaterais indj; s e j v e i s , p a r t i c u l a r m e n t e hipotenso e sonolncia. to, ele foi c o m p a r a d o com o ITT (0,1 U / k g ) , Para taji

considerado por hipoem

m u i t o s autores o teste padro de avaliao da reserva f i s r i a de GH ( 3 2 , 4 8 , 5 8 ) . Os 2 testes foram

realizados

g r u p o s d i s t i n t o s de crianas e a d o l e s c e n t e s , para se estudar tambm a possvel influncia da puberdade sobre a do GH c l o n i d i n a . resposta

130

A avaliao clinica, laboratorial e radiolgica ge ral obe-deceu s recomendaes propostas por Underwood & Van crianas hormnios

Wyk no que se refere investigao diagnostica de com baixa estatura ( 7 4 ) . As dosagens basais dos

tireoidianos, gonadotrofinas e SmC contriburam para descartar a presena de hipotireoidismo, disgenesia gonadal em neninas pberes e nanismo hipofisrio, respectivamente. 0 ITT foi padronizado segundo critrios previamente estabelecidos na literatura (18,20,35,36,56,59,64,72,77), com coletas de sangue at os 90 minutos aps administrao da insulina, j que, neste teste, o pico de GH geralmente ocorre entre os 30 e 90 minutos. A coleta no foi continuada at os 120 minutos para no perpetuar em demasia os efeitos cola terais desagradveis associados em todos os pacientes. 0 teste da clonidina 0,0375 mg/m*, escolhida por foi realizado corresponder a corc a dose de exatamente um hipoglicemia, observados

quarto do valor inicialmente preconizado na literatura (0,15 mq/rn*) e ser prxima da dose de 0,035 mg/m z , j previamente testada e associada a boa eficincia de liberao de GH e baixa inci^ dncia de efeitos colaterais ( 1 2 ) . Foi ponderado tambm que, embora criasse problemas na hora de sua preparao, a deveria ser corrigida para a superfcie corprea, que todas as crianas recebessem,proporcionalmente, quantidade da droga. de a dose modo mesma

131

A transformao da clonidina em p e posterior diluio em gua foi a nica maneira simples encontrada de se

preparar diferentes micro-doses da droga, individualizadas para cada paciente, j que o menor comprimido comercializado contm 0,1 mg. Embora no se conseguisse uma soluo comple

tamente homognea de clonidina em gua, este procedimento fa cilitou tambm a administrao da droga a crianas que se re cusassem a engolir o comprimido. As amostras de sangue aps administrao da clonidina foram coletadas a cada 30 minutos durante 2 horas, j

que, em todos os estudos prvios (11,16,23,30,39,40,41,62,63, 66, 7 1 ) , o pico de GH ocorreu entre 60 e 120 minutos. 0 fato de que os tempos de coleta no foram idnticos neste teste

e no ITT no invalida a comparao entre eles, j que corres pondem a estmulos provocativos diferentes da secreo de GH, embora ambos com provvel ao ao nvel de receptores a-adre nrgicos centrais.(38,44 ) . Em todos os testes,o GH foi determinado por mtodo prprio de RIE completamente desenvolvido, caracterizado adequado s necessidades deste projeto. Todos os soros e de

um mesmo paciente foram dosados em um nico ensaio, evitand -se,dessa maneira,a Influncia da variao nterensaio. mtodo foi ajustado de modo a apresentar sensibilidade redor de 1,0 ng/ml e preciso mxima no intervalo de 5,0 0 ao a

30,0 ng/ml, correspondente maior parte dos picos de liberj^

132

o de GH observados nos testes provocativos.

No se procu-

rou obter maior sensibilidade porque no era a finalidade des te projeto estudar valores basais de GH. A especificidade do ensaio foi demonstrada pelo baixo grau de imunorreatividade

cruzada do anti-soro anti-GH com os demais hormnios hipofisrios e pela ausncia de efeitos no especficos do meio de incubao sobre a reao antgeno-anticorpo. A c 1 assificao dos 31 pacientes em portadores

(Grupo 1) e no portadores (Grupo 2) de dficit de GH, basea da nas caractersticas clnicas, ritmo de crescimento, dosagem basal de SmC e resposta aos testes provocativos, obede-

ceu a critrios previamente estabelecidos na literatura (32, 58,74,75). Foi possvel a incluso de pacientes com patolo-

gias diversas no Grupo 1, j que estudos prvios (35) demons^ traram que a resposta do GH aos testes provocativos no dj_ ferente nestas doenas quando comparadas entre si ou com indivduos normais. Em todos os pacientes includos no Grupo 2, o na-

nismo hipofisrio foi fortemente suspeitado na avaliao cl^ nica pela severidade do dficit estatural e/ou presena de

sinais tpicos, confirmando a importncia do exame clnico. 0 ritmo de crescimento, considerado um dos parmetros mais importantes na deciso de se submeter ou no um p^ ciente com baixa estatura a investigao laboratorial extensa (74), permitiu uma boa discriminao entre os pacientes

133

com e sem deficit de GH.

Todos com exceo de 2 pacientes do

Grupo 1, embora situando-se abaixo do percentil 1 0 , acompanha ram a curva normal de crescimento, enquanto que isto ocorreu em apenas 2 crianas do Grupo 2 durante o perodo de observa o. No foi encontrada explicao adequada para a velocida

de de crescimento normal nestes dois ltimos pacientes. Embo ra eles pudessem apresentar alguma forma de GH biologicamente ativo mas imuncligicamente no ensaivei ( 7 4 ) , a presena de SmC diminuda praticamente excluiu esta hiptese. A dosagem srica de SmC, freqentemente como teste de tr'agem para excluir o diagnstico de utilizada nanismo

hipofisrio (74,75), mostrou-se normal em todos os pacientes includos no Grupo 1 e diminuda nos do Grupo 2, p o s s i b i l i tando uma completa diferenciao entre el&s. Em crianas aci

ma de 5 anos de idade, faixa etria em que se enquadravam ^o dos com exceo de 1 paciente estudado neste projeto, res normais de SmC praticamente excluem deficincia (75). valode GH

Por outro lado, valores baixos esto freqentemente

associados a outras patologias, como hi potireoidi smo e desnjj trio, e no permitem estabelecer o diagnstico de nanismo hipofisrio ( 7 5 ) . Alis, a dosagem srica normal de SmC, apontada como um dos melhores ndices do estado nutricional adequado de um indivduo (74), foi tambm utilizada para des^ cartar a presena de graus mais severos de desnutrio qualquer um dos pacientes do Grupo 1, principalmente em quando

134

associada a c o n c e n t r a e s basais baixas de GH. Embora um assunto controvertido, a maioria dos auto res considera um pico de GH acima de 7,0 ng/ml como resposta normal a qualquer teste de liberao deste hormnio (32 74). 48

Este valor est de acordo com os resultados obtidos nes

te e s t u d o , j que todos os pacientes includos no Grupo 1 apresentaram picos de GH maiores do que 7,0 ng/ml em pelo menos um teste p r o v o c a t i v o . Por outro lado, apenas um pacien-

te pbere do Grupo 2 mostrou resposta maior do que 2,3 ng/ml, sendo ainda inferior a 5,0 ng/ml. Segundo os critrios pro-

postos por Milner e col. ( 4 8 ) , este paciente poderia ser cias sificado como dficit parcial de GH. A c o m p a r a o entre o teste da clonidina e o ITT no grupo de crianas pr-pberes demonstrou que a mdia dos picos de liberao de GH foi maior (embora no estatisticamente s i g n i f i c a n t e ) no primeiro teste, o qual estava tambm associado a menor incidncia de respostas faiso-negativas. resultados obtidos foram mais compatveis com os relatados por Dammacco e c o l . (11) com a dose de 0,035 mg/m' e por Lanes e col. (40) com a dose fixa de 0,1 mg. Entretanto, foram dose Os

n i t i d a m e n t e Inferiores aos de Laron e c o l . (41) com a

fixa de 0,025 mg e aos de Lanes e col. (39) com a dose i n i cialmente preconizada na literatura de 0,15 m g / m 2 . Estes d de

dos reforam a idia inicial de que os maiores valores

pico,obtidos por Laron e col (41) com a menor dose de cloni-

COV'

135

dina j testada, talvez se devam ao fato dos autores includo crianas e adolescentes em um mesmo grupo, j na puberdade, as respostas do GH aos estmulos clssicos so maiores do que na infncia (19).

terem que

provocativos

No grupo de pacientes pberes, o mesmo estudo comparativo revelou que a mdia dos picos de liberao de GH

foi menor (embora no estatisticamente significante) no teste da clonidina, o qual apresentou tambm incidncia muito maior de resultados faiso-negativos do que o ITT. A mdia dos pi-

cos ps-clonidina neste grupo foi tambm inferior observada nas crianas pr-pberes, fato curioso levando-se em considerao que a puberdade geralmente est associada a respostas mais exacerbadas de GH (19). No houve correlao entre a presena de resposta inadequada e a superfcie corprea ou sexo do paciente. A obesidade, freqentemente associada a

respostas subnormals de GH (73), no estava presente em nenhum paciente. A nica hiptese proposta para explicar estes para

resultados que a dose de clonidina, embora corrigida a maior superfcie corprea apresentada

pelos adolescentes,

tenha sido insuficiente para provocar uma eficiente liberao de GH nestes pacientes, os quais necessitariam de quant^ dades da droga proporcionalmente maiores do que crianas. Es ta posb'bi idade implicaria talvez em uma menor sensibilidade dos receptores o 2 -adrenrg1cos centrais clonidina na

poca da puberdade, contrariamente ao que ocorre

com os de-

135

mais estmulos provocativos da secreo de GH. Com relao aos efeitos colaterais, a sonolncia e hipotenso observadas no teste da clonidina foram semelhan-

tes s relatadas nos trabalhos em que a droga foi administra da nas doses de 0,035 mg/m z (12) ou 0,025 mg ( 4 1 ) . A reduo dos nveis pressricos foi, no entanto, inferior observada com a dose de 0,15 my/m 2 (23,39,62,66). Por outro lado, o em

ITT resultou em sintomas desagradveis de hipoglicemia

todos os pacientes, no havendo, no entanto, perda de consci ncia em nenhum. Conclui-se, pois, que o teste da clonidina deve

ser preferencialmente realizado com a dos? de 0,0375 mg/m 2 em crianas pr-pberes. Nesta dose, a eficincia de liberao

de GH ainda maior do que a do ITT, ao passo que os efeitos colaterais so muito mais discretos e menos perigosos do que os observados ou no teste realizado com 0,15 mg/m 2 ou no ITT. 0 teste da clonidina (0,0375 mg/m*) deve, portanto, ser considerado o teste provocativo de eleio para excluir o diag nstico de nanismo hipofisrio em crianas pr-pberes, que

correspondem maior parte dos pacientes que procuram o endo crinologista por baixa estatura. Nos pacientes pberes, a clonidina, na dose de

0,0375 m g / m 2 , um agente liberador de GH muito menos potente do que o estmulo hipoglicmico. Esta dose, portanto,

deve ser utilizada apenas em teste complementar para excluir

137

d e f i c i n c i a de GH neste grupo ou, p r e f e r e n c i a l m e n t e , deve ser s u b s t i t u d a pela dose de 0,15 m g / m 2 . F i n a l m e n t e , quando os r e s u l t a d o s do teste da cloni dina (0,0375 m g / m 2 ) so associados aos do ITT, o d i a g n s t i c o de n a n i s m o hipofisrio pode ser e s t a b e l e c i d o com segurana prxima a 1 0 0 % , sugerindo que ambos devam ser r e a l i z a d o s p a c i e n t e s com suspeita clnica desta p a t o l o g i a . em

IX -

CONCLUSES

139

le)

O teste da clonidina (0,0375 m g / m 2 ) apresenta naior efi cincia de liberao de GH e menor incidncia de efeitos colaterais graves do que o ITT {0,1 U / k g ) , devendo, por tanto, ser considerado o teste provocativo de eleio em

para excluir o diagnstico de nanismo hipofisrio crianas pr-pberes. 29)

Nos pacientes pberes, o teste da clonidina (,0375 mg/m2) apresenta incidncia muito maior de resultados falso-ne gativos do que o ITT (0,1 U / k g ) , devendo, portanto, ser utilizado apenas como teste complementar para deficincia de GH. excluir

3S)

Quando os resultados do teste da clonidina (0,0375 mg/n 2 ) so associados aos do ITT (0,1 U / k g ) , o diagnstico de

nanismo hipofisrio pode ser estabelecido com segurana prxima a 100%, sugerindo que ambos devam ser realiza-

dos em pacientes com suspeita clnica desta patologia.

X - REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1.

ABRAHAM, G. materials.

Radioimmunoassay of steroids in biological Acta Endocrinol., 75{Suppl. 183):1-42,1974.

2.

ABRAHAM, G.E. 17B .

Solid phase radioimmunoassay of oestradiol,

J. Clin. Endocrinol., 29:866-70, 1969.

3.

AMATO NETO, V. & CORRA, L.L. fezes.

Exame parasitolgico de

So Paulo, Sarvier, 1980.

4.

BROWN, B.A.

Hematology: principles

and

procedures.

4ed. Philadelphia, Lea & Febiger, 1934.

5.

CHAMBERS, J.W. & BROWN, 6.M.

Neurotransmi tter regulation

of growth hormone and ACTH in the rhesus monkey: effects of biogenic amines. 1976. Endocri no!ogy, 98:420-8,

6.

CHAPMAN, G.E.; RENWICK, A.G.C.; LIVESEY, J.H. Isolation of human pituitary hormones from frozen glands.

The

J. Clin. Endocrinol. Metab., 53:1008-13, 1931.

7.

CHARD, T.

Ammonium sulfate and polyethylene glycol as antigen-antibody

reagents to separate antigen from complexes.

Methods Enzimol., 70:280-90, 1980.

8.

CHRAMBACH, J.M.; YADLEY, R.A.; BENDAVID, M.; D.

RODBARD,

Isohormones of human growth hormone. I. Characte

rization by electrophoresis and isoelectric focusing in polyacrilarpide gel. Endocrinology, 93:843-57, 1973.

9.

CRYER, P.E. & DAUGHADAY, W.H.

Growth hormone. In:

TINI, L. & BE^SER, G.H. eds. Clinical neuroendocrinology. New York, Academic, 1977. p.243-77.

10.

D'ABRONZO, F.H.

Receptores do hormnio de crescimento So Paulo, 1985. (Tese de Douto-

no fgado humano.

ramento, Faculdade de Medicina, USPi.

11.

DAMMACCO, F.; DAMMACCO, A.; CAVALLO, T.; TORELLI, C ; FREZZA, E.

BAFUNDI, N. ;

Low oral dose of clonidine:

an effective test of growth hormone reserve (letter). J. Pediatr., 103(3) :501-2, 1983.

12.

DAUGHADAY, W.H.

The anterior pituitary. 7ed.

In: WILSON,

J.D. & FOSTER, D.W. eds. endocrinology.

Williams textbook of

Hhiladeiphia, Saunders, 1985. p.563-613.

13.

D E L I T A L A , G.; M A I O L I , M.; P A C I F I C O , A.; B R I A N D A , S.; P A L E R M O , M.; M A N N E L L I , M. C h o l i n e r g i c receptor control

m e c h a n i s m s for L-dopa, a p o m o r p h i n e and c i o n i d i n e - i n duced growth h o r m o n e secretion in man. Endocrinoi. Metab., 57:1145-9, 1983. J. Clin.

14.

D E S B U Q U O I S , B. & AURBACH, G.D.

Use of p o l y e t h y l e n e peptide 33:

glycol to s e p a r a t e free and a n t i b o d y - b o u n d h o r m o n e in ratioimmunoassay. 732-8, 1971.

J. C l i n . E n d o c r . ,

15.

EKINS, R.P.

T h e o r e t i c a l aspects of s a t u r a t i o n analysis. In vitro

In: INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY A G E N C Y .

p r o c e d u r e s of radioisotopes in m e d i c i n e : proceedings of the symposium on..., held in Viena, 8-12 September 1969. V i e n n a , 1970. p.325-53.

16.

F R A S E R , N . C . ; S E T H , J.; BROWN, N . S .

Clonidine

is

b e t t e r test for growth hormone d e f i c i e n c y than insulin hypoglycaemia. Arch. Pis. Child., 58:355-8, 1983.

17.

F R A S I E R , S.D.

A review of growth h o r m o n e

stimuiati on

tests in c h i l d r e n .

P e d i a t r i c s , 53(6 ):929-37, 1974.

CO: \

18.

FRASIER, S.D.

The serum growth hormone response

to

hypoglycemia in dwarfism.

J. Pedi atr., 71:625-38, 1967.

19.

FRASIER, S.D.; HILBURN, J.M.; SMITH JR, F.C. Effect of adolescence on the growth hormone response to glycemia. J. Pediatr., 77:465-7, 1970. hypo-

20.

FROHMAN, L. A.; ACETO JR., T.; MACGILLIVRAY, M.H. Studies of growth hormone secretion in children: normal, hypo pituitary and constitutionally delayed. Endocrinol., 27:1409-17, 1967. J. C1i n.

21.

GAINES DAS, R.E.

Calibration and assessment of standards-

-Problems encountered in the comparison of radioimmunoassay dose - response curves. CORRIE, J.E.T. eds. In: HUNTER, W.M. &

Immupoassays for clinical chemistry.

Edinburgh, Great Britain, Churchill Livingstone, 1983. p.632-9.

22.

GANONG, W.F.; WISE, B.L.; REID, I.A.; HOLLAND, J.; KAPLAN, S.; SHACKELFORD, R.; BORYCZKA, A.T. Effect of

spinal cord transection of the endocrine and pressure responses to intravenous clonidine. endocrinoiogy, 25(2):105-10, 1978.

blood Heuro-

23.

G I L - A D , I.; T O P P E R , E.; L A R O N , Z. g r o w t h h o r m o n e s t i m u l a t i o n test. 1979.

Oral c l o n i d i n e as a Lancet, 2:278-9,

24.

G I L - A D , I.; T O P P E R , E.; L A R O N , Z.

Oral c l o n i d i n e as a Lancet,

g r o w t h h o r m o n e stimulation test ( l e t t e r ) . 2:1242, 1979.

25.

G O C K E , D.J.; G E R T E N , M . S . ; S H E R W O O D , L.M.; H.

L A R A G H , J.

P h y s i o l o g i c a l and pathological v a r i a t i o n of plasma C o r r e l a t i o n with renin activity

a n g i o t e n s i n II in man. and sodium b a l a n c e . 48, 1969.

Ci re . R e s . , 24/25(Suppl . 1 } : 131-

26.

G O L D , M . S . ; D O N A B E D I A N , R.K.; REDMOND J R . D . E . - i n d u c e d i n c r e a s e in serum growth h o r m o n e : role of epinephrine-mediated s y n a p s e s . endocrinology, 3:187-94, 1978.

Clonidinepossible

Psychoneuro-

27.

G R E E N W O O D , F.C. & HUNTER, W . M .

The p r e p a r a t i o n of 1 3 1 I .

-labelled human growth h o r m o n e of high s p e c i f i c r a d i o activity. B i o c h e m . J., 8 9 : 1 1 4 - 2 3 , 1 9 6 3 .

28.

GREENWOOD, F.C.;

HUNTER, W.H.; HARRIAN, V.J.

GrowthBrit.

- h o r m o n e levels in c h i l d r e n and a d o l e s c e n t s .

M e d . J. t 5374:25-6, 1 9 6 4 .

29.

G R E U L I C H , W.W. & PYLE, S.J.

Radiographic

atlas

of

skeletal development of the hand and wrist. Stanford University, T!59.

Stanford,

30.

THE HEALTH Services Hunan Growth Hormone

Committee.

Comparison of the intravenous insulin and oral clonidine tolerance tests for growth hormone secretion. P i s . Child., 5 6 : 8 5 2 - 4 , 1 9 8 1 . Arch.

31.

H E N R Y , R.J.

Clinical chemistry: principles and techniques.

New York, Harper & Row, 1 9 6 4 .

32.

HO, K.Y.; EVANS, W . S . ; THORNER, H.O.

Disorders

of

prolactin and growth hormone secretion. c r i n o l . Metab., 14(l):l-32, 1985.

Clir.. Endo-

33.

HUNTER, W.M.

Optimization of RIA: some simple guidelines.

In: HUNTER, W.M. & CORRIE, <^.T. eds. Ircmunoassays for clinical chemistry. Livingstone, 1983. Edinburg, Great Britain,Churchill p.69-75.

34.

ISAKSSON, O.G.P.; JANSSON, J-0; GANSE, l.A.M.

Growth

hormone stimulates longitudinal bone growth d i r e c t l y .

Science, 216:1237-8, 1982.

35.

KAPLAN, S.L.; ABRAMS, C.A.L.; BELL, J.J.; C O M E , F.A.; GRUMBACH, M.M. Growth and growth hormone. I. Changes

in serum level of growth hormone following hypoglycemia in 134 children with growth retardation. Pediet. Res., 2:43-63, 1968.

36.

KAPLAN, S.L.; ABRAMS, C.A.L.; BELL, J.J.; CONTE, F.A.; GRUMBACH, M.M. Serum growth hormone response to

insulin induced hypoglycemia in disorders of growth. J. Pediatr., 67:956-9, 1965.

37.

KOBINGER, W.

Pharmacologic basis of the cardiovascular In: ONESTI, G.; KIM, K.E.;

actions of clonidine. MOYER, J. eds.

Hypertension: mechanisms and management. p.369.

New York, Grune & Stratton, 1973.

38.

LAL, S.; TOLIS, G.; HArtTIH, J.B.; BROWN, G.M.; H.

GUYDA,

Effect of clonidir.e on growth hormone, prolactin, hormone

luteinizing hormone, follicle-stimulating

and thyroid-stimulating hormone in the serum of normal men. J. Clin. Endocrinol. Metab. 41:827-32, 1975.

39.

LANES, R.; HURTADO, E.

Oral clonidine - An effective

growth hormone releasing agent in prepubertal subjects. J. Pediatr., 100(5):710-4, 1982.

40.

LANES, R.; RECKER, B.; FORT, P.; LIFSHITZ, F. Low-dose oral clonidine. Amer. J. Pis. Child., 139:87-8,1985.

41.

LARON, Z.; GIL-AD, I.; TOPPER, E.; KAUFMAN, H.; JOSEFS^ BERG, Z. Low oral dose of clonidine: an effective Acta

screening test for growth hormone deficiency. Paediatr. Scand., 71:847-8, 1982.

42.

LEWIS, U.J.; SINGH, R . N.; TUTWILER, G.F.; SIGEL, M.B.; VANDERLAAN, E.F.; VANDERLAAN, W.P. hormone: a complex of proteins. Res., 36:477-508, 1980. Hunan growth

Recent Prog. Horm.

43.

MANN, H.B. & WHITNEY, D.R.

On a test of whether one of than

two random variables is stochastically larger the other. Ann. Math. Statist., 18:50-60, 1947.

44.

MARTIN, R.C.

The hypothaiamus, hypophysis and thymus. Endocrine physiology. p.815-85. New York,

In: MARTIN, R.C.

Oxford University, 1985.

45.

M A R Q U E S , R.M.; M A R C O N D E S , E . ; B E R Q U , E . ; P R A N I , Y U N E S , J. C r e s c i m e n t o e d e s e n v o l v i m e n t o em c r i a n a s e a d o l e s c e n t e s b r a s i l e i r o s . e peso. 1982.

R.;

pubertrio I I . Altura

S o P a u l o , E d i t o r a B r a s i l e i r a de C i n c i a s ,

46.

MARSHALL, W.A. M. eds. p.141-81 .

Puberty.

I n : F A L K N E R , F. & iANNER, J. New York, Plenum, 1978. V . 2 ,

Human growth.

47.

MASSARANO, A.A.

C l o n i d i n e and i n s u l i n t e s t s for growth A r c h . P i s . Child., 50

hormone deficiency (letter). {4):399, 1985.

48.

MILNER, R.D.G. & BURNS, E.C. growth h o r m o n e d e f i c i e n c y . 944-7, 1982.

I n v e s t i g a t i o n of suspected Arch. Pis. Child., 57:

49.

MORRIS, B . J .

Specific

radioactivity

of radioimmunoassay a re-evaluation.

t r a c e r s determined

by s e l f - d i s p l a c e m e n t : 1976.

C l i n . Chim. A c t a , 7 3 : 2 1 3 - 6 ,

50.

MUNRO, A . C . ; CHAPMAN, R . S . ; Production of primary In:

TEMPLETON, J . G . ; FATORI, D. radioimmunoass?y. Immunoassays

antisera for

HUNTER, W.M. & CORRIE, O . E . T . e d s .

for

clinical

chemistry.

Edinburgh, 1983.

Great

Britain,

Churchill

Livingstone,

p.447-55.

51.

NAKASONE, A . ; saio

PUPO, A . A . ; anticorpo

PIERONI, para

R.R.

Radioircunoende

com d u p l o

dosagem de h o r m n i o Arq. Bras.

crescimento Metabol.,

humano no s o r o . 1978.

Endocrinoi.

22(1 ) : 2 9 - 3 3 ,

52.

NERY, M.

Avaliao

da f u n o

pituitria

anterior

em de

pacientes

com d e f i c i n c i a So P a u l o ,

idioptica 1983.

de h o r m n i o

crescimento. Faculdade

( T e s e de

Doutoramento,

de M e d i c i n a ,

USP).

53.

NICOLAU, W . ; BILHARINHO, E.

VILLARES, B.M.;

S.M.;

CARDIA, G . ;

PALOMINO,

A.;

BLOISE, W . ;

ASSIS, L . M . ; cie

MATTAR, crescimento Arq. Bras.

Extrao

e purificao congeladas

de h o r m n i o

de h i p f i s e s Endocrinol.

humanas

(hGH-HC). 1984.

Metabol.,

28(4):83-6,

54.

ODELL, W . ;

SKOWSKY, R . ;

ABRAHAM, G . ;

HESCOX, M . ; FISCHER, and

D . ; GROVER, P.K. steroid 1972.

Production of a n t i s e r a f o r p o l y p e p t i d e Biol. Reprod.,

radioimmu.ioassay.

6:427-42,

55.

ONESTI, G.; SCHWARTZ, A.B.; KIM, K.E.; SWARTZ, C.; BREST, A.M. Pharmacodynamic effects of a new anti-

hypertensive drug, Catapress (STI55). 39:219-28, 1969.

Circulation,

56.

PARKER, M.L.; HAMMOND, J.M.; DAUGHADAY, W.H. The arginine provocative test: an aid in the diagnosis of somatotropism. 1967. J. Clin. Endocrinoi., nypo-

27:1129-36,

57.

PHILLIPS, L.S. & VASSIPOULOU-SELIN, R.

Somatomedins.

New England J. Hed., 302(7):371-80, 1980.

58.

PREECE, M.A.

Diagnosis and treatment of children with Clin. Endocrinol. Metab.,

growth hormone deficiency. n ( l ):l-24, 1982.

59.

RAITI, S.; DAVIS, W.T.; BLIZZARD, R.M.

A comparison of arginine Lancet,

the effects of insulin hypoglycemia and infusion on release of human growth hormone. 2:1182-3, 1967.

60.

RODBARD, D.

Quality control for RIA:

Recommendations ATOMIC

for a minimal program. ENERGY AGENCY.

In: INTERNATIONAL

Radioimmunoassay and related procedures

in medicine: proceedings of the international in... held in Berlin from 31 October to 4 1977. Vienna, 1978. V.2 p.21-36.

symposium November.

61.

RODBARD, D.

&

LEWALD, J.E.

Computer

analysis

of Acta

radioligand assays and radioimmunoassay data. Endocrinol., 64(Suppl. 147 ):79-103, 1970.

62.

ROMER, T.E.; RYMKIEWICZ-KLUCZYNSKA, B.; Z.

BOGONIOWSKA,

Oral clonidine for screening of growth hormone Pan. Med., |4:231-5, 1982.

deficiency.

63.

ROMERO, F.M.; PALOMINO, A.A.; RUIZ-CABAL, J.E.; ORTEGA, J.C.; GUERRERO, F.R.; GARCIA, J.J.C. "Test" con clo

nidina oral como estmulo de la hormona del cresci miento. Anal. Esp. Pediatr., 14(4):254-8, 1981.

64.

ROOT, A.W.; ROSENFIELD, R.L.; BONGIOVANNI, A.M.; EBERLEIN, W.R. The plasma growth hormone response to

insulin-induced hypoglycemia in children with retardation of growth. Pediatrics, 39:844-52, 1967.

65.

ROULSTON, J.E.

Validation of the self-displacement

technique for estimation of specific radioactivity of rac"ioimmunoassay tracers. Ann. Clin. Biochem..

16:26-9, 1979.

66.

SALTI, R.; GALLUZZI, F.; BECHERUCCI, P.; SEMINARA, S.; CALZOLARI, C ; INNOCENTI, S. ; LA CAZA, C. clonidine: an effective provocative test of hormone release. Oral growth

Helv. Paediat. Acta, 35:527-31, 1981.

67.

SCATCHARD, G.

The attractions of proteins for

snail

molecules and ions. 1949.

Ann. N. Y. Acad. Sci . , 51^:660-72,

68.

SCHACTERLE, G.R. & POLLACK, R.I.

A simplified method

for the quantitative assay of small amounts of protein in biologic materials. Anal. Biochem., 51:654-5, 1973.

69.

SCHMITT, H.; SCHMITT, H.; FENARD, S.

Evidence

for of by

an alpha-sympathomimetic component in the effects Catapresan on vasomotor centers: antagonism piperoxan. Eur. J. Pharmacol., 14:98-100, 1 9 7 1 .

70.

SIEGEL, S.

Won parametric statistics for the behavioral p.131-44.

sciences. New York, McGraw-Hill, 1956.

71.

SLOVER, R.H.; KLINGENSMITH, G.J.; GOTLIH, R.W.; RADCLIFFE, 0. A comparison of clonidine and standard

i. . . C . .M.

provocative agents of growth hormone. Child., 138^314-7, 1984.

Amer. J. Dis.

72.

STIMMLER, L. & BROWN, G.A.

Growth hormone

secretion

provoked by insulin-induced hypoglycaemia in children of short stature. Arch. Pis. Child., 42:232-8, 1967.

73.

TOPPER, E.; GIL-AD, I.; BAUMAN, B.; JOSEFSBEPG, Z.; LARON, Z. Plasma growth hormone response to oral in Res.,

clonidine as compared to insulin hypoglycemia obese children and adolescents. 16(Supplement):127-30, 1984. Horn. Hetab.

74.

UNDERWOOD, L.E. & VAN WYK, J.J. growth.

Normal and aberrant Williams

In: WILSON, J.D. & FOSTER, D.W.

textbook of endocri no!ooy. 1985. p.155-205.

7ed. Philadelphia, Saunders,

75.

UNDERWOOD, L.E.; D'ERCOLE, A.O.; VAN WYK, J.J. Somatomedin C and the assessment of growth. Clin. North Amer., 27:771-82, 1980. Pediatr.

76.

VAITUKAITIS, J.; ROBBINS, J.B.; NIESCHLAG, E.; 6.T. A method for producing specific antisera

ROSS, with

small doses of immunogen.

J. Clin. Endocr., 33:988-

91 , 1971.

77.

WESTPHAL, 0.

Growth hormone release during

insulin

tolerance test in normal children. Scand. , 182(Suppl.):39-42, 1968.

Acta Paeci at.

78.

YALOW, R.S. & BERSON, S.A. immunoassay procedures. ENERGY AGENCY.

General aspects of radio In: INTERNATIONAL ATOMIC

In vitro procedures with radioisotopes held

in medicine: proceedings of a symposium on..., in Vienna, 8-12 September, 1969. p.455-79. Vienna, 1970.