Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE) y Western blot

La electroforesis es un transporte bajo la acción de un campo eléctrico. En el caso de la

electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida, los geles se preparan de modo que sus poros
sean de un tamaño comparable al de las proteínas, y la separación de éstas va a depender de la
densidad de su carga y de su tamaño.
El soporte se prepara a partir de acrilamida (monómero) que forma cadenas largas lineales (polímero).
Para que estas cadenas lineales se unan entre sí se añade bisacrilmida, una molécula que puede
formar parte de dos cadenas lineales a la vez. La polimerización se consigue por la adición persulfato
amónico (que inicia la reacción de polimerización) y el TEMED (N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina) que
propaga la reacción.

La electroforesis se lleva a cabo en presencia de beta-

mercaptoetanol y SDS (condiciones desnaturalizantes)
con el fin romper los puentes disulfuro y dar a las
proteínas una carga negativa neta proporcional al
número de aminoácidos que las componen. Así la
velocidad con que las proteínas migrarán hacia el polo
positivo será inversamente propocional a su tamaño
(peso molecular).
Una vez finalizada la electroforesis, las proteínas
pueden ser detectadas mediante tinción del gel, o si
se desea detectar una proteína específicamente,
mediante western blot.
 El western blot consiste en la transferencia de las proteínas desde los geles a membranas
(nitrocelulosa o PVDF) y su detección con anticuerpos específicos. En conjunto consta de 4 fases
representadas en la figura: transferencia, bloqueo de la membrana, reconocimiento de la proteína y
visualización.

Gel = Proteína

Transferencia por capilaridad

o por la acción de un campo
eléctrico
Membrana
Bloqueo de la superficie de
membrana no ocupada por
proteínas, para evitar la
unión inespecífica de
anticuerpos
Membrana
saturada
Reconocimiento de la
proteína de interés por un
anticuerpo específico (A1)
que es reconocido por un
segundo anticuerpo (A2)
conjugado con un enzima
que permite la visualización
A2 de la proteína (generalmente
Enz
A1 por quimioluminiscencia).
Y así es en el laboratorio:

1. Electroforesis 2. Transferencia

3. Bloqueo de la membrana 4. Detección de la proteína