Eur. J. Biochem.

97, 251 -256 (1979) Kontrol hormonal Metabolisme Glikogen Protein fosforilasi Fosfatase Inhibitor-1 in vivo di Respon untuk Adrenalin J. Gordon Foulkes dan COHEN Philip Departemen Biokimia, University of Dundee (Diterima 9 Januari 1979) Inhibitor-1 telah terbukti terfosforilasi di otot rangka in vivo. Pada hewan yang diberi normal tingkat fosforilasi adalah 31 i 7% dan nilai ini meningkat 70% f 12 menyusul intravena suntikan adrenalin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fosforilasi inhibitor-1 mungkin sama sama pentingnya dengan fosforilasi kinase fosforilasa dalam mengangkat tingkat fosforilasa a. Peran inhibitor-I dalam metabolisme dibahas Siklik AMP awalnya diidentifikasi sebagai heatstable senyawa yang terbentuk dalam hati dalam menanggapi adrenalin, yang dapat menggantikan hormon dalam meningkatkan proporsi hati fosforilasa di homogenat [l]. Penemuan ini berarti bahwa siklus AMP baik harus mengaktifkan fosforilasa kinase yang dikonversi b fosforilasa ke, atau menghambat fosforilasa fosfatase yang dikonversi fosforilasa sebuah untuk h. Selanjutnya, ditemukan bahwa jika fosforilasa kinase diinkubasi dengan Mg-ATP kegiatan itu meningkat dan bahwa reaksi ini dirangsang oleh siklik AMP [2]. Pada akhirnya, hal ini menyebabkan penemuan protein siklik-AMP-tergantung enzim kinase,

yang merupakan jejak kontaminan endogen di suci persiapan kinase fosforilasa, bertanggung jawab untuk fosforilasi dan aktivasi enzim 131. Temuan ini menyarankan bahwa adrenalin merangsang glikogenolisis melalui urutan reaksi ditunjukkan di bawah ini, dan sekarang ada bukti-bukti bahwa masing-masing peristiwa berlangsung di otot rangka di vivh (ditinjau dalam [4,5]). Dibesarkan Caz terfosforilasi Diaktifkan Ditinggikan Adrenalin fosforilasa protein siklik --- phosphoAMP kinase kinase sebuah rylase Temuan ini tidak mengecualikan Namun kemungkinan AMP siklik yang mungkin juga meningkatkan tingkat fosforilasa melalui penghambatan fosforilasa fosfatase, dan kepentingan dalam regulasi ~~~ EnzymPs. Fosforilasa (EC 2.4.1.1); kinase fosforilasa (EC 2.7.1.38); protein kinase (EC 2.7.1.37); phosphatase protein (EC 3.1.3.-); glikogen sintase (EC 2.4.1.11). Singkatan. Siklik AMP, adenosin 3 ': 5'-monophosphate. fosfatase fosforilasa diintensifkan berikut kesadaran bahwa ini hanyalah salah satu kegiatan dari enzim multifungsi disebut protein phosphatase 1 [S]. Enzim ini juga yang mengkatalisis dephosphorylation dari fosforilasa kinase dan glikogen sintase [4-71,

dan oleh karena itu masing-masing melakukan dephosphorylation yang reaksi yang menghambat glikogenolisis atau mengaktifkan sintesis glikogen. Perubahan dalam kegiatan ini enzim sehingga akan diharapkan untuk mempengaruhi keadaan fosforilasi beberapa yg menukar satu sama lain enzim. Setelah laporan oleh Brandt et al. [8,9] bahwa hati dan otot ekstrak mengandung trypsinlabile tahan panas protein (s) yang menghambat fosfatase fosforilasa, Huang dan Glinsmann menunjukkan adanya dua inhibitor protein-stabil panas fosforilasa fosfatase dalam otot rangka, yang mereka disebut inhibitor-1 dan inhibitor-2. Mereka membuat kunci pengamatan bahwa inhibitor-1 hanya menghambat fosforilasa fosfatase ketika terfosforilasi oleh siklik-AMP-dependent protein kinase [lo, 11 1. Inhibitor-1 telah dimurnikan untuk homogenitas dalam laboratorium dan struktur dan interaksi dengan protein fosfatase-1 telah ditandai secara ekstensif [12-161. Namun pertanyaan yang beredar utama yang harus dijawab sebelum peran fisiologis inhibitor-1 dapat dianggap sebagai keprihatinan didirikan, fosforilasi protein ini in vivo. Dalam hal ini kertas kami menunjukkan bahwa inhibitor-1 memang terfosforilasi dalam otot rangka in vivo dan bahwa derajat

dari fosforilasi meningkat drastis oleh adrenalin. Sebuah account awal bagian dari pekerjaan ini disajikan [17]. 252 Fosforilasi Inhibitor-1 di viw PROSEDUR PERCOBAAN E. \-l "Strategi rimental Dalam rangka untuk memperkirakan tingkat fosforilasi protein in vivo perlu untuk mengekstrak jaringan bawah kondisi yang mencegah fosforilasi lebih lanjut dan dephosphorylation dari mengambil tempat, tetapi yang tidak merusak aktivitas biologis. Ini adalah biasanya dicapai oleh homogenisation di hadapan EDTA dan natrium fluoride. EDTA chelates ion magnesium dan menghambat kinase protein, sedangkan natrium fluorida merupakan inhibitor kuat protein fosfatase. Pada penelitian ini, alternatif prosedur untuk menghancurkan enzim interconverting dapat digunakan, mengingat stabilitas ekstrim inhibitor-1 menjadi asam. Inhibitor-1 tidak dipercepat atau tidak aktif ketika jaringan otot yang diambil dalam 1,5 - 2'5 () asam triklorasetat. Selanjutnya, sejak inhibitor-1 hanya protein phosphatase inhibitor dalam nya terfosforilasi bentuk, tingkat fosforilasi dapat diukur lebih sederhana, dengan melaksanakan pengujian sebelum dan sesudah fosforilasi maksimal dengan

siklik-AMP-dependent protein kinase. Muterials L-Epinefrin (adrenalin) dan sapi pankreas insulin diperoleh dari Sigma Chemical Co (Poole, Dorset, Inggris), L-askorbat asam dari BDH Chemicals Ltd (Poole, Dorset, Inggris) dan [Y-~ ~ PIATP dari Pusat Radiokimia (Amersham, Bucks, Inggris). Natrium pentobarbitone dibeli sebagai 20 ",, (w / v) larutan dari bulan Mei Sr Baker (Dagenham, Essex, Inggris) dan Sephadex GlOO (kelas prima) dari Pharmacia G.B. Ltd (London, Inggris). Preparat setiap proteinnya ion Pro Semua protein diisolasi dari kelinci kerangka otot. Fosforilasa b [Aku 81, fosforilasa kinase [I91 dan inhibitor-1 [I21 telah dimurnikan untuk homogenitas dan fosforilasa 32P-label telah disiapkan dari fosforilasa b fosforilasa menggunakan kinase dimurnikan dan [)-. 32P] ATP [6]. Protein fosfatase-1 dimurnikan 300 - 400 kali lipat, dan disimpan pada - 20 "C, dalam 50 mM Tris-HCl / l O mM. EDTA pH 7.0 (25 "C) (buffer A), mengandung 50 mM mercaptoethanol, 6 mM MnC12 dan 50'x gliserol [20]. Subunit katalitik siklikAMP-protein kinase tergantung sangat dimurnikan dengan kromatografi pada CM Sephadex [21]. Protein ditentukan dengan metode Bradford [26].

Pengujian Protein-Fosfatase 1 dan Inhibitor-I Pengukuran ini dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [6,12]. Satu unit protein fosfatase-I adalah jumlah yang melepaskan 1,0 nmol fosfat per menit dari fosforilasa 32P-label yang, di bawah kondisi standar. Satu unit inhibitor-1 adalah bahwa jumlah yang menghambat 0,02 unit protein fosfatase Saya sebesar 50% dalam uji standar. Fosforilasi dan Aktivasi Inhibitor-I Inhibitor-aku maksimal terfosforilasi dengan inkubasi dengan subunit katalitik dari siklik-AMPdependent protein kinase dan Mg-ATP. inkubasi ini mengandung subunit katalitik cukup untuk mengatasi kehadiran inhibitor protein spesifik siklikAMP-dependent protein kinase yang mencemari inhibitor-1 pada tahap awal dalam pemurnian [12]. Dephosphorylation dari Inhibitor-I Inhibitor-I dephosphorylated dan tidak aktif oleh protein fosfatase-1 di hadapan mangan ion [13]. Fraksi yang mengandung inhibitor-1 (0,05 ml) karena itu diinkubasi dengan 0,15 unit protein fosfatase-I (0,05 ml) dalam buffer A mengandung 6 mM MnC12 dan 1,0 mg albumin bovine serum / ml. The dephosphorylation inhibitor-1 telah selesai dalam 2 jam kondisi ini.

Injeksi 'Adrenalin Adrenalin dilarutkan dalam 10 mM asam askorbat. Sebuah alikuot 0,1-ml (250 pg) ditambahkan untuk 3,0 ml 10% natrium pentobarbitone dan campuran itu disuntikkan ke dalam vena telinga marjinal perempuan Selandia Baru Kelinci putih (3 -4 kg bobot badan). Kontrol percobaan dilakukan dengan cara yang sama kecuali adrenalin yang dihilangkan. Injeksi Insulin Insulin dilarutkan dalam 3 mM HCI dan glukosa dilarutkan sebagai solusi 20 (w / v) dalam 0,1 5 M NaC1. Glukosa (2 g / kg berat badan) ini dikelola intraperitoneal dan insulin (3 unit / kg berat badan) disuntikkan ke dalam vena telinga marjinal 10 menit kemudian. Setelah min 25 lebih lanjut, hewan-hewan diberi dosis yang mematikan dari pentobarbitone natrium. Dalam percobaan kontrol penyuntikan kedua glukosa dan insulin dihilangkan. Isolasi Inhibitor-I setelah aktivasi dalam vivo Pada 45 detik setelah suntikan, kelinci itu exsanguinated, dikuliti, dan otot dari tungkai belakang dan kembali dihapus, dan ditempatkan di es. Otot (Sekitar 700g) adalah cincang dan homogen pada rendah kecepatan dalam blender Waring dalam 4 jilid. dari% es dingin 1,5 ', atau 2 '%; trikloroasetat acid/4.0 mM EDTA, seluruh J. G. Foulkes dan P. Cohen 253

operasi yang selesai dalam 8 menit yang asli injeksi. homogenat itu disentrifugasi pada 6000 g x untuk 45 menit dan supernatan (pH 2,5 f 0,1) tertuang melalui wol kaca. Solusi 100% (b / v) triklorasetat asam kemudian ditambahkan perlahan ke supernatan untuk memberikan konsentrasi akhir 15% (b / v). Setelah berdiri pada 4 C selama paling sedikit 3 jam, suspensi itu disentrifugasi pada 20000 g x selama 10 menit. Supernatan dibuang, endapan resuspended di 0,5 M Tris-HCl pH 8.0 (25 C) dan suspensi disesuaikan dengan pH 7,4 dengan 10 hidroksida amonium M untuk memberikan volume akhir 200 ml. Suspensi itu didialisis di 4 '; C selama 20 jam, terhadap 5 mM Tris-HCI pH 8.0 (25-C) dengan satu perubahan buffer dialisis. The endapan berat dihapus oleh sentrifugasi pada 20000 x g selama 10 menit (langkah 1) dan supernatant dipindahkan ke botol kaca 200 ml kerucut. labu The direndam dalam bak air mendidih selama 15 rnin dan didinginkan sampai 4 C di es. Ini diendapkan protein dihilangkan dengan sentrifugasi pada 20000 xg selama 10 menit dan supernatan lyophilised. The beku-kering bahan dilarutkan dalam 20 ml air (langkah 2) dan amonium sulfat padat ditambahkan untuk membawa solusi untuk kejenuhan 60 2,. Setelah berdiri di 4 "C selama 4 jam,

suspensi disentrifugasi pada 20.000 xg selama 20 menit, endapan dipekatkan dalam 200 mM Tris-HC1 pH 7,5 / O 1 mM. EDTA (langkah 3), dan didialisis semalam terhadap buffer ini mengandung 45 '%, etanol pada 4 C. The diendapkan protein dihapus oleh sentrifugasi pada 20000 xg selama 10 menit dan supernatan didialisis melawan buffer A untuk menghapus etanol, dan lyophilised. Bahan beku-kering yang dipekatkan di air (langkah 4) dan dikenakan gel filtrasi Sephadex GlOO prima diequilibrasi dalam buffer A (langkah 5). HASIL Kegiatan 'Inhibitor-aku di trikloroasetat-Asam E.utructs dari 'Skeletal Muscle 1,5-15 Y4) asam trikloroasetat ekstrak otot ditemukan mengandung 1,0 x lo6 unit inhibitor-1 per 1000 g jaringan berikut fosforilasi maksimal protein dengan kinase siklik-AMP-dependent. Ini adalah serupa dengan yang diperoleh oleh prosedur standar yang melibatkan homogenisation dalam larutan encer EDTA pada pH 7,0 dilanjutkan dengan perlakuan panas pada 90 "C [12]. Aktivitas spesifik inhibitor-1 pada tahap ini (Langkah 1) adalah 3-4 kali lipat lebih tinggi daripada yang diperoleh setelah pemanasan ekstrak encer EDTA otot pada 90'C (Tabel 1) [12]. Jika 1,5 - 15 (x triklorasetat ekstrak

dipanaskan dalam penangas air mendidih-selama 15 menit, aktivitas spesifik meningkat menjadi 12.000-16.000 unit / mg menunjukkan bahwa inhibitor-1 sudah terwakili 7 -% 9 ', protein pada tahap ini (Tabel 1). Tabel 1. Purificution Qf inhihitor-l ufier phosp IOR ~ ~ lutictiini vivo 750 g otot kelinci digunakan dalam persiapan masing-masing. Kegiatan Tertentu diukur setelah fosforilasi maksimal dengan siklik-AMPdependent protein kina: Volume langkah khusus phos-Yield Kegiatan phorylation A. Kontrol Atiii? Iol.v 1. 2 - 15 'I),: trichloro2. Perlakuan panas 3. 60 '%, amonium ekstraksi asam asetat dan konsentrasi sulfat pengendapan natant eluat 4. Etanol 45 super5. Sephadex GI00 B. ADRC, iiaIinc,-trentrtl 1. 2-15 ', 7) trikloroasetat ekstraksi asam

2. Perlakuan panas dan konsentrasi 3. 60 ';:, amonium sulfat pengendapan 4. 45 yd3 etanol supernatant 5. Sephadex GI00 eluat I 196 20 2.0 2.5 180 20 2.0 2.7 3 200 12000 29 000 46000 145000, ' 4 300 I6 000 52 000 83000

148 000 " 33 31 36 38 32 58 57 59 60 56 100 95 44 24 100 95 53 26 Aktivitas spesifik tabung puncak Fosforilasi Qf Inhibitor-I in vivo Fosforilasi Persentase inhibitor-1 diukur setelah langkah 1 dari pemurnian, dengan membuat tiga pengukuran berikut. Pertama, aktivitas inhibitor diukur tanpa pretreatment apapun;

kedua, aktivitas inhibitor total diukur setelah fosforilasi maksimal oleh katalitik subunit protein kinase siklik-AMP-dependent; ketiga, aktivitas inhibitor diukur setelah maksimal dephosphorylation oleh protein-fosfatase 1. Percobaan khas diilustrasikan dalam Gambar 1 dan Ringkasan hasil diberikan dalam Tabel 2. Ketika bahan diperoleh pada langkah 1 diinkubasi dengan protein fosfatase-I, aktivitas inhibitor benar-benar hancur (Gambar l), menunjukkan bahwa inhibitor-2 absen. Sejak inhibitor-2 dapat diendapkan dengan 15? <) trikloroasetat asam tanpa kehilangan aktivitasnya (JG Foulkes, kerja yang tidak dipublikasikan) nampaknya protein ini telah dieliminasi selama sentrifugasi awal dari 1,5 -% 2 '; homogenat asam triklorasetat (Lihat Prosedur Eksperimental). Jika otot ini homogen dengan 4mm EDTA / 50 mM sodium fluoride, bukannya 4 mM EDTA / 2 2, 254 Fosforilasi Inhibitor-1 di vioo Waktu (h) Gambar. 1. Penentuan persentase fosforilasi inhihitor-1 pada tahap I Qf pur (FIC, asi di normal, hewan kontrol fi.d (A) atau hewan injrc.terl nYth adrmaline (B). Solusi diinkubasi dengan subunit katalitik dari protein kinase siklik-AMPdependent dan Mg-ATP untuk mendapatkan maksimal diaktifkan inhibitor-1 (0) atau dengan protein fosfatase-1 untuk mendapatkan tidak aktif inhibitor-1 (0). Sebuah etelah sebuah inkubasi 2-jam dengan

protein fosfatase-1 solusi dipanaskan di 1OO'C selama 2 menit untuk menonaktifkan protein fosfatase dan kemudian diinkubasi selama lebih 90 menit dengan protein kinase dan Mg-ATP (0). t segitiga menunjukkan incubations kontrol di mana protein kinase (v) atau protein fosfatase1 (V) dihilangkan trikloroasetat asam, dan kemudian dipanaskan pada 90 C selama 15 menit, serupa tingkat fosforilasi diamati dengan hasil yang ditunjukkan pada Tabel 2. Konfirmasi bahwa Fosfatase Protein Inhibitor Terdeteksi pada Langkah 1 Apakah Identik dengan Inhibitor-1 Inhibitor protein fosfatase terdeteksi pada langkah 1 benar-benar dihancurkan oleh inkubasi dengan protein fosfatase-1, dan inhibitor tidak aktif sepenuhnya bisa diaktifkan kembali oleh inkubasi dengan katalitik subunit protein siklik-AMP-dependent kinase dan Mg-ATP (Gbr. 1). Untuk membuktikan bahwa bahan penghambatan di langkah 1 itu identik dengan inhibitor-1, sebuah prosedur baru dikembangkan untuk memperoleh sangat murni inhibitor 1, yang tidak seperti prosedur standar [12] copurified baik terfosforilasi dan dephosphorylated bentuk protein. Hasil dari penelitian ini adalah diringkas dalam Tabel 1. Hal ini dapat dilihat bahwa persentase fosforilasi tetap konstan di seluruh prosedur di kedua kontrol dan adrenalinetreated persiapan. Pada langkah terakhir filtrasi, gel

Sephadex G100, yang hambat co materi-dielusi dengan inhibitor-1 dengan nilai / V Vo dari 1,45 (Gbr.2). The alasan untuk kegiatan total yang lebih rendah dari inhibitor-1 di Gambar. 2 B adalah karena berukuran lebih kecil alikuot dimuat. Aktivitas spesifik pada tahap ini (145000-150000 unit / mg) hanya sedikit lebih rendah dari inhibitor murni-1 terisolasi oleh prosedur standar (1 80.000 unit / mg [12]), dan elektroforesis di 10 gel polyacrylamide di hadapan natrium sulfat dodesil menunjukkan utama protein-pewarnaan band dengan mobilitas dibedakan dari inhibitor-1 (tidak digambarkan). Ketika Tabel 2. Phosphorylution # / inhibitor-1 in vivo Persentase inhibitor-aku dalam bentuk terfosforilasi aktif diukur setelah langkah 1 dari pemurnian seperti yang dijelaskan dalam teks. Percobaan biasanya dilakukan menggunakan dua atau tiga hewan, huruf a percobaan untuk f menunjukkan dilakukan dalam jangka waktu 60 menit pada hari yang sama Percobaan Inhibitor dalam bentuk diaktifkan dari Normal insulin-adrenalinefed diperlakukan diperlakukan kontrol hewan hewan .. o//0 32 "58 33 23 68

34 23 76 42 24 90 24 32 '69 23 '25 59' Standar deviasi 31 f 7 25 f 4 70 f 12 gel diiris dan diuji tanpa inkubasi sebelumnya dengan protein kinase siklik-AMP-dependent dan MgATP, aktivitas inhibitor ditemukan mengelusi di posisi pita protein-pewarnaan utama (tidak ilustrasi). DISKUSI Hasil yang dijelaskan dalam makalah ini menunjukkan bahwa-1 adalah inhibitor fosforilasi pada kelinci rangka J. G. Foulkes dan P. Cohen 255 otot in vivo dan bahwa tingkat fosforilasi meningkat drastis oleh adrenalin. Tingkat fosforilasi rata-rata 31 k 7 "/; pada hewan makan normal, dan nilai ini meningkat menjadi 70 12 pada hewan yang telah disuntik dengan adrenalin. Toth et al. [22]> nd Tao et al. [23] juga melaporkan bahwa adrenalin meningkatkan konsentrasi inhibitor tahan panas dari fosfatase fosforilasa dalam otot rangka tikus in vivo tetapi mereka tidak menetapkan bahwa protein ini 8t A Aku

L 0 x) 40 60 80 00 120 Elusi volume (RNL) Gambar. 2. Gc.1, jiltrution inhibitor-aku pi-c, purution.s. Aliquot dari materi dari kontrol (A) atau adrenalin yang diobati (B) binatang dikenakan gel filtrasi Sephadex (300-100 prima (45 x 2,5 cm) diequilibrasi dalam buffer A (langkah 5). Fraksi yang diuji untuk protein phosphatase inhibitor aktivitas langsung (O), setelah preincubation dengan protein kinase siklik-AMP-dependent dan Mg-ATP (0) dan setelah preincubation dengan protein fosfatase-I dan mangan ion (v). Tingkat aliran 18 ml / jam dan fraksi 2,0-2,5-ml dikumpulkan. inhibitor-1, juga tidak menentukan tingkat fosforilasi protein. Kami telah menunjukkan sebelumnya bahwa inhibitor-1 adalah terfosforilasi oleh protein siklik-AMP-dependent kinase in vitro pada tingkat yang sama dengan fosforilasa kinase dan glikogen sintase [14] yang merupakan mapan fisiologis substrat untuk enzim ini di otot (lihat [4,5] untuk review). Konsentrasi inhibitor-I di otot (01:05) sebanding dengan fosforilasa kinase (14:05) dan glikogen sintase (14:08) dan lebih tinggi dari protein cncentration fosfatase-1 [13]. Karena hambatan konstan (KJ adalah 1,5-2 nM in vitro [13], ada cukup jelas

inhibitor-1 untuk menghambat sebagian besar protein fosfatase-1 pada otot. Selain itu, inhibitor-1 menghambat fosfatase fosforilasa, fosforilasa kinase fosfatase dan glikogen sintase fosfatase kegiatan protein fosfatase-1 dengan cara yang sama, menunjukkan bahwa perubahan keadaan fosforilasi inhibitor-1 akan diharapkan untuk mengatur keadaan fosforilasi beberapa enzim yg menukar satu sama lain. Hasil ini, ditambah dengan pekerjaan ini, memberikan bukti yang kuat bagi keterlibatan inhibitor-1 di kontrol glikogenolisis oleh adrenalin. Nampaknya bahwa fosforilasi inhibitor-1 mungkin sama sebagai penting sebagai aktivasi fosforilasa yang kinase dalam peningkatan fosforilasa tingkatan oleh adrenalin (Gbr. 3). Kami telah menyarankan bahwa protein fosfatase-1 adalah mungkin enzim yang dephosphorylates inhibitor 1 in vivo [5]. Alasan untuk membuat pernyataan ini adalah bahwa-inhibitor 1 tidak menghambat dephosphorylation sendiri oleh protein fosfatase-1, bahkan pada konsentrasi setinggi 13:00 [5,13]. Selanjutnya, itu dephosphorylated dengan konstanta kinetik yang sama kepada mereka untuk dephosphorylation substrat lainnya ini [13] enzim. Hal ini menunjukkan bahwa inhibitor-1 dapat

menjadi substrat yang dephosphorylated preferentially in vivo. Adrenalin Diaktifkan siklik-AMP-dependent Aku Diaktifkan terfosforilasi Aku n t c i v e t d Layang - n aku t c i v e t d ' fosforilasa p U r t o e i n fosfatase-I Gambar. 3. Stiniulution dari glj.cogenoly.si.s dalam otot rangka melalui phosphorylution simultanrous dari phosphoryluse inhibitor-I, kinusc, und gljcogrrt sj.11 thase 256 JG Foulkes dan P. Cohen: Fosforilasi Inhibitor-I di iliiw Inhibitor-aku seharusnya tidak hanya membuat keadaan fosforilasi enzim yg menukar satu sama lain dari glikogen sangat peka terhadap kecil metabolisme perubahan dalam konsentrasi intraselular siklik AMP, tetapi juga untuk perubahan kecil dalam kegiatan protein fosfatase-1 (asalkan protein fosfatase Saya adalah enzim yang dephosphorylates inhibitor 1 in vivo). Selain itu, karena protein fosfatase Aku dephosphorylates situs terfosforilasi oleh protein lain daripada protein kinase siklik-AMP-dependent kinase [6], inhibitor-1 mungkin merupakan mekanisme memperkenalkan kontrol oleh AMP siklik menjadi protein yang terfosforilasi oleh kelas-kelas lain

protein kinase. Bukti terbaru menunjukkan protein yang fosfatase-1 mungkin terlibat dalam pengaturan selain metabolisme glikogen, dalam jaringan proses selain otot [24]. Dalam hal ini inhibitor-1 bisa memiliki peran yang lebih luas, tergantung pada jaringan distribusi tersebut. Tidak ada bukti bahwa inhibitor-1 dapat diaktifkan oleh protein kinase lain selain siklus-AMPdependent protein kinase. Oleh karena itu akan menjadi bunga untuk menguji pengaruh insulin pada keadaan fosforilasi inhibitor-I in vivo, mengingat mengklaim bahwa menghasilkan insulin penghambat siklikAMP-dependent protein kinase dalam otot [25]. Tabel 2 menunjukkan hasil percobaan awal sedikit yang pengaruh insulin pada tingkat fosforilasi inhibitor-1 telah diselidiki. Setelah suntikan insulin, tingkat phoysphorylation adalah 25 47 <dibandingkan dengan 31 7% untuk makan normal kontrol. Perbedaan ini secara statistik tidak signifikan, dan selain itu, dalam dua percobaan (e dan f, Tabel 2) di mana kontrol dan insulin-diperlakukan hewan yang diproses pada hari yang sama, derajat dari fosforilasi sedikit lebih tinggi di insulintreated binatang (Tabel 2). Ini jelas akan penting untuk menguji pengaruh insulin dalam lebih rinci, di bawah kondisi yang lebih terkontrol, dengan menggunakan belakang diperfusi

ekstremitas persiapan. Karya ini didukung oleh hibah dari Penelitian Medis Dewan, London dan Asosiasi Diabetes Inggris. Gordon Foulkes adalah penerima beasiswa pascasarjana dari Medical Research Council dan Philip Cohen adalah penerima Wellcome Trust Fellowship Khusus. DAFTAR PUSTAKA Aku. Robinsin, G. A,, Butcher, Sutherland Sr RW, EW (1971) di AMP siklik, hal 1 - 16. Academic Press, New York. 2. Krebs, G. E.. Cinta, D. S., Batvold, G. E.. Trayser. K. A., Mayer, WL Sr Fischer, EH (1964) Bioc / iemi.stry, 3,1022 1033. 3. Walsh, D. A.. Perkins, JP Krebs &, EG (1968) J. Biol. Chem. 243, 3763-3765. 4. Nimmo, H. G. Cohen Sr. P. (1977) Adv. C, / ~ 'Ul' Clic lYJtidlR,. Cs. 5. Cohen, P. (1 978) Curr. Top. Ci4l. RcJgul. 14, 11 8-196. 6. Antoniw, J. F., Nimmo, H. G., Yeaman. S. Cohen J. Sr. P. 7. Cohen, P., Nimmo, G. A. Antoniw Sr. J. F. (1977) B ~ (JC / I ~ aku J. V J. 8. Brandt, H., Killilea, SD Lee Sr, EYC (1974) Bioclicw?. 9. Brandt, A.. Lee, E. Y. Killilea C. Sr. S. D. (1975) Bioc, / wr??. 10. Huang, Glinsmann Sr FL, WH (1976) FEBS Lrtt. 62. 1 1. Huang, F. L. Sr Glinsmann, W. H. (1976) Eur. J. Biochem. 70, 12. Nimmo, G. A. Sr Cohen, P. (1978) Eur. J. Biochm 7?. 87, 341 13. Nimmo, G. A. Cohen Sr. P. (1978) Eur. J. Bioc, hem. 87, 353 14. Cohen, P., Rylatt, D. Nimmo B. Sr. G. A. (1977) FEBS L.c, tt.

15. Shenolikar, S., Foulkes, JG 91 Cohen, P. (1978) Bioi.liem. Soc. Truns. 6, 935-937. 16. Cohen, P., Nimmo, GA, Shenolikar, S. Sr Foulkes, JG (1978) dalam Cyclic A'ucleotides di Cell Ri, gulution (Wollenberger, A., Krause, E. G. Pinna Sr. L., eds) Tekan Pergamon, Oxford, hal 161-169. 17. Foulkes, JG Sr Cohen, P. (1979) 3 Eropa S oii ~ wzpo.sium Hormon Cell und Regulution ut Lr Bisc1imher.g I978 (van der Molen. H. G., Dumont, J. E. Sr Numez, J., eds) Elsevier: Tekan Holland Utara Biomedis, hal 115-126. 18. Fischer, H. Sr E. Krebs, E. G. (1958) J. Bio /. Chem. 231. 19. Cohen, P. (1973) Eur. J. Biochem. 34, 1 - 14. 20. Antoniw, J. F. Sr Cohen, P. (1976) Eur. J. Biochem. 68,45-54. 21. Beavo, J. A,, Bechtel, Krebs Sr PJ, EG (1974) Met1zod.s Enzymol. 38, 299-308. 22. Toth, G.. Gergely, P., Parsadanian, H. K. Sr Bot. C. (1977) Actu Biochim. Biophys. Acud. Sci. Hung. 12. 389-398. 23. Tao. S., Huang, F. L.. Lynch, Glinsmann SC A., W. H. (1978) 24. Burchell, A,, Foulkes, J. G., Cohen. P. T. W., Condon, G. D. 25. Larner. J., Huang, L. C.. Brooker, G., Murad, Sr F. Miller, T. 26. Bradford, M. M. (1976) Dan. Bioclzem. 72. 248-254. 8, 145-166. (1 977) Bioclzen?. J. 162, 423-433. 162.435 - 444. Biophys. RRS. Commun. 68. 45 - 54.

Biophys. R1J.s. Commun. 63, 950-956. 326-329. 41 9 -426. 351. 365. 76, I82 - 186. 65-71. Biochem. J. 176, 347-350. Sr Cohen, P. (1978) FEBS Biarkan /. 92. 68-72. B. (1974) Fed. Proc. 33, 261. JG Foulkes dan Cohen P., Departemen Biokimia, Institut Ilmu Kedokteran, Universitas Dundee, Dundee. Inggris, 4HN DDL