LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK METABOLISME DAN STRES OKSIDATIF

PENGUKURAN KADAR MDA HATI DAN DARAH TIKUS

Oleh: Subandrate (0906575634)

Pengajar: dr. Ninik Mudjihartini, MS

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA 2010

PENDAHULUAN Proses oksidasi mempunyai peran yang penting di dalam tubuh makhluk hidup terutama reaksi-reaksi yang menghasilkan energi, seperti oksidasi glukosa menjadi karbon dioksida dan air. Proses oksidasi dapat berlangsung secara enzimatik dan nonenzimatik. Oksidasi secara enzimatik terjadi secara bertahap dan melibatkan berbagai macam enzim. Sedangkan oksidasi secara non-enzimatik terjadi secara spontan dengan memerlukan logam-logam transisi seperti Cu atau Fe. Oksidasi secara non-enzimatik akan menghasilkan radikal bebas seperti reactive oxygene species (ROS). ROS merupakan senyawa-senyawa turunan oksigen yang bersifat oksidan. Tiap atom oksigen mempunyai dua elektron yang tidak berpasangan pada kulit terluarnya. Atom atau molekul dengan elektron tidak berpasangan merupakan radikal bebas dan sangat reaktif. Reduksi oksigen menjadi air yang merupakan reaksi terakhir pada rantai transport elektron memerlukan empat elektron. Pemberian elektron kepada oksigen selama proses ini dapat membentuk ROS sebagai zat antara dan kebocoran elektron juga berperan dalam pembentukan ROS. Singlet oksigen bersifat lebih reaktif dari oksigen stabil. Pemberian satu elektron kepada singlet oksigen menghasilkan pembentukan radikal superoksida (O2.-). Pemberian elektron kedua (penambahan elektron kepada radikal superoksida) menghasilkan pembentukan peroksida yang kemudian mengalami protonasi dan menjadi hidrogen peroksida (H2O2). Pemberian elektron ketiga membentuk radikalhidroksil (.OH) yang sangat reaktif. Dan akhirnya pemberian elektron keempat menghasilkan pembentukan air. ROS dapat terbentuk di jaringan melalui berbagai mekanisme. Pembentukan ROS dapat terjadi dari reaksi yang dikatalisis oleh xantin oksidase (XO), NAD(P)H oksidase, sitokrom P450, melalui autooksidasi katekolamin dan uncoupling NO sintase (NOS). NO mengandung elektron yang tidak berpasangan dan dapat bereaksi dengan O2.- dan membentuk peroksinitrit (ONOO-) yang merupakan suatu oksidan kuat. Stres oksidatif merupakan suatu keadaan tidak seimbangnya senyawa atau reaksi yang bersifat oksidan dibanding dengan senyawa yang bersifat antioksidan. Oksidan yaitu senyawa atau reaksi kimia yang dapat menghasilkan spesies oksigen yang potensial bersifat toksik (ROS). Salah satu kerusakan yang diakibatkan oleh stress oksidatif adalah peroksida lipid. Peroksida lipid terbentuk sebagai hasil reaksi

antara radikal bebas dengan asam lemak tidak jenuh (PUFA = Poly Unsaturated Fatty Acid) yang merupakan unsur utama membran sel. PUFA merupakan salah satu komponen yang menentukan fluiditas membran. Rusaknya PUFA akan menyebabkan penurunan fluiditas membran yang akan berpengaruh pada fungsi membran terutama sebagai tempat diffusi molekul antar sel ataupun intrasel (membran organel)3. Proses peroksidasi lipid ini dapat dibagi menjadi beberapa tahap yaitu: Tahap inisiasi. Pada tahap ini terjadi reaksi yang menyebabkan satu atom H terpisah dari gugus metilennya (-CH2-). Asam lemak yang tidak memiliki atau hanya memiliki satu ikatan ganda lebih resisten terhadap proses ini dibandingkan PUFA. Di membran dan lipoprotein, terpaparnya rantai samping PUFA pada permukaan luar menyebabkan reaksi ini lebih mudah terjadi . Tahap propagasi. Hilangnya satu atom H mengakibatkan gugus metilen Radikal karbon ini dapat saling Radikal karbon jika bereaksi memiliki satu elektron yang tidak berpasangan.

bergabung membentuk konyugat diene (R-C-C-R).

dengan oksigen akan mengakibatkan terbentuknya radikal peroksil (ROO/ RO2). Hal ini akan menyebabkan reaksi berantai peroksidasi berlanjut. Pada kadar oksigen yang rendah, radikal karbon ini dapat bereaksi dengan sesama radikal, atau atom karbon lainnya (mengambil satu atom H molekul lipid lainnya), ataupun komponen membran lainnya seperti gugus sulfida protein Tahap terminasi. Proses terminasi dapat terjadi karena penggabungan dengan radikal lain sehingga terbentuk senyawa yang bersifat tidak radikal seperti konyugasi diene. Pada tahap terminasi ini juga berperanan senyawa-senyawa atau reaksi-reaksi anti-oksidan seperti asam askorbat, vitamin E dan glutation. Peroksida lipid bersifat tidak stabil dan akan terurai menghasilkan sejumlah senyawa lain yang sangat reaktif dan mudah dilacak, yaitu malondialdehid (MDA)3. Puasa merupakan keadaan yang dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas dalam tubuh. Radikal bebas ini akan memeroksidasi lipid di sel darah, sel hati atau jaringan lainnya. Proses peroksidasi lipid pada sel darah biasanya terjadi lebih dahulu daripada sel hati atau sel lainnya. Adanya peroksidasi lipid ini menunjukkan bahwa sel sedang mengalami stress oksidatif. Pengukuran MDA saat ini sering digunakan untuk mengetahui tingkat kerusakan yang disebabkan oleh proses peroksidasi lipid pada asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) membran atau lipoprotein.

TUJUAN Menetapkan kadar peroksida lipid dalam darah dan homogenat hati tikus. DASAR Asam lemak tidak jenuh (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam tiobarbiturat (thiobarbitiuric acid, TBA), akan membentuk senyawa berwarna merah muda yang menyerap cahaya pada 532 nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid. BAHAN DAN ALAT 1. Plasma darah dan Homogenat hati tikus puasa dan tidak puasa 2. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 20% 3. Larutan tiobarbiturat (TBA) 0,67% (dibuat baru) 4. Akuades ALAT 1. Tabung reaksi 2. Pipet mikro 3. Tip 4. Vorteks 5. Alat sentrifugasi 6. Penangas air 7. Boks es 8. Alat spektrofotometer 9. Kuvet

CARA KERJA . Bahan Hemolisat darah Akuades Larutan TCA 10%, dingin Kocok, pusing, ambil supernatan Larutan TBA 0,67% Blanko 0,25 ml 0,50 ml Uji 0,25 ml 0,50 ml

0,75 ml 0,75 ml Masukkan penangas mendidih, 10 menit. Dinginkan. Kemudian membaca serapan pada panjang gelombang 532 nm

HASIL Pada praktikum dilakukan perbandingan MDA antara tikus puasa dan tikus tidak puasa. Tingkat peroksidasi lipid sel darah dan dan sel hati dapat ditentukan dengan mengkur serapan MDA. Adapun hasil pengamatan dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Serapan MDA darah dan hati pada tikus puasa dan tidak puasa Tikus Puasa Tikus Tidak Puasa Blanko plasma 0.010 0.016 Plasma darah 0.104 0.092 Blanko Homogenat Hati 0.011 0.014 Homogenat hati 0.188 0.179 Setelah diketahui serapan MDA, maka dapat dilakukan perhitungan untuk memperoleh nilai kadar MDA dengan menggunakan rumus:
Kadar MDA = A M keterangan : A = absorbansi = 153.000 M-1 cm-1 M = molar zat

Adapun perhitungan kadar MDA tersebut adalah: Plasma darah tikus puasa = 0,104 0,010 = 153.000 0,094 = 0.614x10-6 M 153.000

Plasma darah tikus tidak puasa = 0,092 0,016 = 0,076 = 0.49 x10-6 M 153.000 153.000 Homogenat hati tikus puasa = 0,188 0,011 = 0,177 = 1.16 x10-6 M 153.000 153.000 Homogenat hati tikus tidak puasa= 0,179 0,014 = 0,165 = 1.07 x10-6 M 153.000 153.000 Berdasarkan hasil perhitungan sehingga kadar MDA pada plasma darah dan homogenat hati pada tikus puasa dan tikus tidak puasa adalah: Tabel 2. Kadar MDA plasma darah dan homogenat hati pada tikus puasa dan tikus tidak puasa Plasma darah (M) Tikus Puasa 0.614x10-6 Tikus Tidak Puasa 0.49 x10-6

Homogenat Hati (M) PEMBAHASAN

1.16 x10-6

1.07 x10-6

Analisis MDA merupakan analisis radikal bebas secara tidak langsung dan mudah dalam menentukan jumlah radikal bebas yang terbentuk. Analisis radikal bebas secara langsung sangat sulit dilakukan karena senyawa radikal sangat tidak stabil dan bersifat elektrofil dan reaksinya pun berlangsung sangat cepat. Radikal bebas merupakan agen yang tidak dinginkan oleh tubuh karena dapat merusak keseimbangan dalam tubuh terutama keseimbangan kadar kolesterol (peroksida lipid).6 Tujuan dari praktikum analisis MDA ini adalah untuk mengidentifikasi peroksidasi lipid yang terdapat pada plasma dan homogenat hati tikus puasa dan tidak puasa. Peningkatan kadar MDA dalam suspensi lazim digunakan sebagai salah satu indikator untuk peroksidasi lipid membran.
5,6

Gambar 1. Proses peroksidasi lipid dan terbentuknya MDA MDA dapat terdeteksi karena MDA jika direaksikan dengan TBA (Tiobarbiturat Acid) akan menghasilkan warna merah muda yang dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang 532 nm.

Gambar 2. Reaksi antara MDA dan TBA membentuk pigmen TBA

Sampel yang digunakan dalam praktikum analisis MDA ini adalah hati tikus Sprague Dawley. Tikus Sprague Dawley merupakan tikus yang mempunyai anatomi yang hampir sama dengan manusia. Tikus ini juga dapat bertahan hidup dengan baik dalam kondisi laboratorium. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kadar MDA baik pada plasma darah maupun homogenat hati tikus puasa memiliki kadar MDA yang lebih tinggi dibandingkan dengan tikus tidak puasa (gambar 1).

Gambar 3. Kadar MDA plasma dan homogenate hati pada tikus puasa dan tikus tidak puasa. Keterangan: (1) Kadar MDA pada plasma (x10-6 M), (2) Kadar MDA pada homogenat hati (x10-6 M).

Jumlah MDA yang terbentuk menggambarkan proses peroksida lipid sehingga dapat dikatakan peroksidasi lipid pada keadaan puasa lebih tinggi daripada keadaan tidak puasa. Kemungkinan ini dapat terjadi karena puasa dapat meningkatkan pembentukan radikal bebas dalam tubuh. MDA merupakan produk hasil peroksidasi lipid dalam tubuh dan terdapat dalam bentuk bebas atau terkompleks dengan jaringan di dalam tubuh. Reaksi ionisasi senyawa-senyawa radikal bebas juga dapat membentuk MDA dan MDA juga merupakan produk samping biosintesis prostaglandin.6 Hasil praktikum menunjukkan bahwa tingkat peroksidasi lipid pada sel hati lebih tinggi daripada sel darah, hal ini tidak sesuai dengan teori yang ada karena

sirkulasi merupakan tempat pertama kali terkena dampak pembentukan radikal bebas. Oleh karena itu, peroksida lipid pada sel darah lebih tinggi dibandingkan dengan sel hati.4,6 Kesalahan pada hasil praktikum dapat terjadi karena adanya beberapa kemungkinan, yakni: (1) teroksidasinya TBA yang digunakan karena penggunaan TBA harus dalam keadaan baru (2) ketidaktelitian dalam melakukan praktikum. KESIMPULAN 1. Penetapan tingkat peroksidasi lipid dapat dilakukan dengan mengukur kadar MDA 2. Peroksidasi lipid pada keadaan puasa lebih tinggi daripada keadaan tidak puasa
3. Peroksidasi lipid pada sel darah lebih tinggi dibandingkan dengan sel hati.

DAFTAR PUSTAKA
1. Jusman, SWA.

Oksidasi Biologi dan Antioksidan. Dalam: Biokimia:

Eksperimen Laboratorium. 2001. Widya Medika, Jakarta.

2. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Harpers Illustrated

Biochemistry. 26th edition. 2003. The McGraw-Hill Companies, Inc.

3. Nelson DL & Cox MM. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4th edition.

2004. 4. Halliwell, B. et al.. 1998. Free Radical in Biology and Medicine. Oxford University Press. London 5. Hanafiah, K.A.. 2005. Rancangan Percobaan: Teori & Aplikasi. PT RajaGrafindo Persada. Jakarta
6. Hermes-Lima, M.. 2004. Oxygen in Biology and Biochemistry: Role of Free

Radical. In: Storey, K.B., editor.

Functional Metabolism: Regulation and

Adaptation. John-Wiley & Sons. New Jersey