Universit Abou Bekr Belkad Tlemcen

Enseignants : F.Lahfa & A.Bedrane

Fractionnement cellulaire

Prvoir des feuilles fraches dpinards et de la gaze. Il est demand chaque tudient de lire attentivement le polycopie et de traduire le protocole exprimental sous forme dun schma gnral. Coordonner les diffrentes tapes du TP entre les binmes, de faon synchroniser les centrifugations.

Important : Equilibrer les tubes 2 2 entre les diffrents binmes. Toutes les manipulations doivent tre ralises dans la glace 0c. 50g de feuilles dpinards sont laves leau courante puis leau distille. Scher les feuilles, les dbarrasser des grosses nervures, puis les couper en petits morceaux. Placer le matriel biologique dans un mixer et jouter 150ml de milieu dextraction froid. Broyer faible vitesse pendant quelques secondes un intervalle court pour viter daltrer les structures cellulaires. Verser lhomognat cellulaire sur lpaisseur de gaze. Recueillir le filtrat sur un nombre pair de tubes. Centrifuger 10mn 5000t/min et +4c. Au terme de cette centrifugation, nous dnommerons le surnageant S et le culot C . 1-Chloroplastes : 1- isolement : reprendre le culot C par 1 2 ml de milieu de lavage (pour chaque tube). regrouper les diffrents culots repris et centrifuger nouveau 10min 5000t/min et +4c. Au terme de cette centrifugation, nous obtenons surnageant S1 et un culot C1 chaque culot est repris par 1ml de milieu de lavage. raliser une observation au microscope optique (G100+huile immersion) avec C1 et S1. Comparer. 2- purification des chloroplastes : Afin dliminer les contaminations ventuels, les chloroplastes sont purifier sur gradient discontinu de saccharose. a- prparation du gradient : les solutions de saccharose 0.75 M, 1.5M et 3M vous sont fournies prtes lemploi. Dposer soigneusement laide dune pipette pasteur et contre la paroi du tube 3ml de solution de saccharose 3M, 1.5M puis 0.75M.

Remarque : Eviter toute manipulation brlante qui risquerait de perturber le gradient. b - purification proprement dite : dposer 1.5ml de la prparation de chloroplastes au sommet du gradient. Observer. Centrifuger 20mn 5000t/min et 4c. Observer. Prlever dlicatement laide dune pipette pasteur, la phase susceptible de contenir les chloroplastes.

Remarque : ne pas perturber le gradient car il servira ultrieurement. Observer au microscope photonique (G100 +lhuile immersion). Conclure 2-noyaux et mitochondries : En raison de leur petite taille, ces organites ne peuvent tre observ distinctement au microscope photonique. Au cour de ce TP, vous aurez les localiser dans les diffrentes fractions obtenues, grce des colorants spcifiques que sont : -le vert de Janus 1% en solution aqueuse pour la mise en vidence des mitochondries. -la fuschine basique pour la mise en vidence des noyaux.

1-observer au microscope photonique (G100+huile immersion) la fraction 3M et la fraction S aprs addition de chacun des colorants spcifiques (1goutte) sur des lames distinctes. 2- redistribuer les surnageants S sur un nombre pair de tubes. centrifuger nouveau 10min 5000t/min (+4c) vous obtenez un surnageant S2 et un culot C2 reprendre le culot C2 par1ml de milieu de lavage fractionner en 2 volumes identiques, savoir : * 0.5ml+12 gouttes de vert de Janus (fraction M) *0.5ml+12 gouttes de fuschine basique (fraction N), Que vous dposez respectivement sur 2 tubes (M et N) ayant pralablement reu 3ml dune solution de saccharose 2.2M. centrifuger 20min 5000t/min (+4c) Remarque : Organiser votre TP de faon synchroniser cette centrifugation (20min 5000t/min) avec celle de la purification des chloroplastes. observer lil nu les tubes M et N au terme de la centrifugation prlever dlicatement laide dune pipette pasteur, la zone o la coloration est la plus intense. observer au microscope photonique (G45 et G100 +huile immersion). Conclure.

N.B :

regrouper les fractions chloroplastes purifis par les diffrents binmes, qui serviront lors dun TP ultrieur. Il vous est demand, dinclure dans votre compte rendu de TP un schma gnral rcapitulatif des diffrentes tapes.