Universit Abou Bekr Belkaid Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

Travaux dirigs
Exercice N 1 La carboxymthylcellulose (CM-cellulose) est un support changeur de cations, obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxymthyls (- CH2 COOH). Quelle est la proportion des groupements carboxymthyls chargs gativement aux pH suivants : 1; 4,76 ; 7 et 9 (on considrera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxymthyls est 4,76). Des protines suivantes : pHi de : Ovalbumine 4,6 Cytochome c 10,65 Lysozyme 11 Quelles sont celles qui sont retenues par la CM cellulose pH 7 ? (On considrera que les interactions protine CM cellulose, sont uniquement lectrostatiques). Exercice N 2 La dithylaminothylcellulose (DEAE-cellulose) est un support changeur danions, obtenue en substituant la cellulose par des groupements dithylaminothyls : -CH2CH2+NH CH2 CH3

CH2 CH3 Quelle est la proportion de radicaux DEAE chargs positivement aux pH suivants : 2; 7; 9,4; 12? (On considrera que le pK de lamine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). Des protines suivantes : pHi de Srumalbumine 4,9 Urase 5 Chymotrypsinogne 9,5 Quelles sont celles qui, pH 7, sont retenues par la DEAE cellulose ? (On considrera que les interactions protine DEAE cellulose sont uniquement lectrostratiques). Exercice N 3 On veut sparer lacide L-glutamique, la L-lysine par chromatographie sur une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonates (- SO3-). Les pH isolectriques de lacide L- glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont progressivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, 25 C. On dpose ces 3 acides amins sur la colonne, pH 2, puis on amne progressivement le pH 7. Quels acide amins sont lus et dans quel ordre ? (On considrera que les interaction acide amin rsine sont uniquement lectrostatiques). Exercice : N 4 On dtermine le volume dlution, Ve au cours dune chromatographie sue Sephadex, des protines suivantes dont on connat le poids molculaire. MM Ve (ml) - Aldolase 145 000 52 - Lactate dshydrognase 135 000 57 - Phosphatase alcaline 80 000 92 - Ovalbumine 45 000 131 - Lactoglobuline 37 100 143 1 Porter Ve en fonction de log Mr. Que remarquez-vous ? 2 Pour la glucokinase, Ve = 105 ml. Dterminer son poids molculaire laide du graphique prcdent.

Exercice : N 5 Acide Amin pK (-COOH) pK (-NH2) pK (r) Leucine 2.4 9.6 Aspartate 2.1 9.8 3.8 Histidine 1.8 9.2 6.0 Glycine 2.3 9.6 Glutamine 2.2 9.1 Arginine 2.2 9.0 12.5 On veut sparer ces acides amins par chromatographie sur rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonates (-SO3-). On dpose ces acides amins sur la colonne pH 2, puis on amne progressivement le pH 10. Quels acides amins sont lus et dans quel ordre ? (On considrera que les interactions acides amin-rsine sont uniquement lectrostatiques.

Exercice : N 6 Etude dun mlange de protines. 1 Fractionnement sur changeurs dions. Les groupements actifs de la rsine utiliss sont des fonctions acides sulfoniques (-SO3H). La rsine est quilibre pH 5,6 par lavage un tampon appropri, jusqu ce que leffluent ait la mme composition que le tampon. Phi MM Cytochrome c 10,6 Chymotrypsinogne 9,5 23240 Srumalbumine 4,8 68500 Globuline 6,6 150000 Ensuite le mlange protique est quilibr pH 5,6 et dpos dans la colonne. On fait passer du tampon pH 5,6. a) Expliquer le comportement des 4 protines du mlange avant lution. On lue ensuite la colonne par un tampon dont le pH augmente progressivement. Le diagramme dlution suivant est obtenu.

b) Pourquoi se place t-on 280 nm pour tablir le diagramme dlution ? Quelle autre longueur donde auriez vous choisi pour obtenir le mme genre de diagramme ? c)Interprter ce diagramme et identifier les 3 protines A, B et C. Remarque : on considre que les interactions entre l'changeur et les protines sont purement lectrostatiques et que la force ionique du milieu est ngligeable. d) Sachant que la teneur en fer du cytochrome c est gale 0,418 p.100, dterminer sa masse molaire minimale (Fe = 55,85 ). Fractionnement par gel-filtration. Le gel utilis est le Sephadex G100 dont le domaine de sparation est compris entre 4 000 et 150 000. a) Principe du fractionnement ; l'aide d'un schma appropri, illustrer le principe de la chromatographie dexclusion molculaire. b) Fractionnement du mlange protique : le mlange protique est dpos: au sommet dune colonne de Sephadex G100. Dterminer le volume d'lution des diffrentes protines du mlange et donner l'allure du diagramme d'lution obtenu. (Le Volume mort de la colonne V0 dtermin par passage du bleu dextran (MM = 2.106) est de 40 ml ; le volume total de la colonne Vt est de l50ml ; la relation suivante est vrifie Kav= -a logMM +b, avec a=0,6 et b = 3,1.) c) Sachant que le volume d'lution du cytochrome c est de 108 ml, dterminer sa masse molaire. le rsultat obtenu est il en accord avec celui de la question 1d ? Les protines pures obtenues doivent dabord tre dbarrass des sels minraux qui ont servi les prcipiter, d) comment procderiez vous pour les liminer Exercice : N 7 Soit le chromatogramme suivant :

1) Calculez les Rf (facteurs de rgression) des diffrents acides anims (aa1, aa2, aa4) et du mlange X. Rf aa1 = Rf aa2 = Rf aa3 = Rf aa4 = Rf mlange X =

2) Aprs avoir rcupr les diffrents acides anims ainsi que le mlange X, on trempe laa1 dans une solution de b dimthyl amino benzaldehyde 1% dans lactone contenant 10% de lacide chlorhydrique fumant (ractif dErlich) on obtient une coloration violette intense. Laa2 tant lhydroxyproline. Laa3 ragit avec la ninhydrine en donnant une coloration jaune rvl lisatine. Conduit une raction positive. Le nitroprussiate de Na donne avec lion S une coloration violette rouge, en prsence de laa4 conduit une raction positive (violet rouge). En dduire la composition du mlange X en justifiant vos rponses. Exercice 8 : Aprs chromatographie sur couche mince de gel de silice, des substances A, B, C, D, et rvlation on a trouv les valeurs de Rf suivantes dans le systme de solvants indiqus : Butanol H20 A B C D 0,23 0,24 0,38 0,41 Iso propanol-Hcl 0,31 0,20 0,60 0,56 Ethanol CH3 COOH 0,42 0,51 0,40 0,53 0,09 0,62 0,64 0,10

a) Reprsenter sur papier millimtr de prfrences, la position de chacune des 4 substances dans chaque systme de solvant. Pour chaque solvant les 4 substances sont dposes au mme endroit sur la ligne de dpart. Le front de migration du solvant est de 10 cm de cette ligne de dpart. b) Que reprsente le Rf de chaque substance ? c)Quelle (s) est (ou sont) la (ou les) condition (s) donnant la meilleure sparation des quatre Pourquoi ? composs ?