1.3 Prosedur Kerja Teknik Identifikasi Bakteri 1.3.

1 Sterilisasi Alat Sterilisasi peralatan dilakukan dengan cara membersihkan seluruh peralatan yang akan digunakan pada kegiatan identifikasi bakteri. Peralata disterilkan dengan menggunakan tiga macam sterilisasi yaitu sterilisasi basah, sterilisasi kering ataupun pembakaran, proses sterilisasi disesuaikan dengan jenis peralatan yang digunakan. Peralatan yang telah digunakan dibersihkan kembali dan disimpan dalam rak atau tempat yang sudah disterilkan dan bebas dari kontaminasi. 1.3.2 Pengambilan Ikan Sampel Ikan sampel yang berasal dari pengiriman setelah dilakukan pencatatan kelengkapan datadatanya. Setelah itu sampel dibawa ke laboratorium untuk segera diperiksa dengan langkahlangkah sebagai berikut: a) Dilakukan pengamatan gejala klinis ikan sampel kemudian dilakukan pembedahan. b) Ditentukan organ target untuk pengujian bakteri yang berasal dari organ insang, hepatopankreas, daging, hati, dan ginjal. c) Selanjutnya dilakukan inokulasi pada median yang bersifat umum. d) Setelah sampel ikan diambil dan dipisahkan, kemudian tentukan organ target yang akan diperiksa. e) Pemeriksaan dilakukan secara eksternal maupun internal f) Selanjutnya ikan tersebut dibersihkan kemudian dilakukan pemisahan organ target. g) Setelah ditemukan organ target selanjutnya organ tersebut digunting dan diletakkan di atas kaca preparat. 3.3.4 Penyiapan Media (PUSKARI 2008) Berdasarkan kegunaannya, media terbagi menjadi 3 yaitu sebagai berikut:

1. Media umum adalah media yang paling umum digunakan dalam laboratorium bakteriologi. 2. Media selektif adalah media yang mengandung zat-zat tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih tanpa menghambat pertumbuhan bakteri yang duiinginkan. a) Tryptic Soy Agar (TSA) TSA merupakan media kultur universal, hampir semua jenis bakteri bisa tumbuh pada media ini. 1) Timbang TSA sebanyak 40 gram. 2) Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam Erlenmeyer yang diberi stirrer magnetic. 3) Panaskan diatas hot plate hingga mendidih. 4) Sterilisasi dengan autoclave 121oC selama 15 menit. 5) Tuangkan ke dalam cawan petri atau tabung reaksi yang sudah disterilkan. 6) Simpan dalam laminari dengan suhu kamar (27oC) selama 24 jam lalu masukkan ke refrigerator. b). Tripel Sugar Iron Agar (TSIA)

1) Timbang TSIA sebanyak 65 gram. 2) Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam Erlenmeyer yang diberi stirrer magnetic. 3) Panaskan diatas hot plate hingga mendidih. 4) Sterilisasi dengan autoclave 121oC selama 15 menit. 5) Tuangkan ke dalam tabung reaksi yang sudah disterilkan. 6) Atur dalam posisi miring (slant position) 7) Simpan dalam laminari dengan suhu kamar (27oC) selama 24 jam lalu masukkan ke refrigerator.

c). Motility Indol Ornitin (MIO)

1) Timbang MIO sebanyak 31 gram. 2) Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam Erlenmeyer yang diberi stirrer magnetic. 3) Panaskan diatas hot plate hingga mendidih. 4) Sterilisasi dengan autoclave 121oC selama 15 menit. 5) Tuangkan ke dalam tabung reaksi yang sudah disterilkan. 6) Simpan dalam laminari dengan suhu kamar (27oC) selama 24 jam lalu masukkan ke refrigerator. 3.3.5 Isolasi dan Pemurnian Sumber isolasi pada ikan adalah semua bagian tubuh yang mengalami kelainan patologi yang diduga disebabkan oleh penyakit bakterial dari bagian tubuh eksternal maupun internal.

SEKTOR 0

SEKTOR I SEKTOR II SEKTOR III Gambar 13. Isolasi dan Pemurnian (Laminem (2003))

Keterangan: SEKTOR 0 SEKTOR I : adalah tempat mula-mula penggoresan. : merupakan pengenceran pertama, garis-garis goresan harus saling terpisah. SEKTOR II : merupakan pengenceran kedua.

SEKTOR III : merupakan pengenceran terakhir.

Setelah dilakukan isolasi, diperlukan pemurnian dengan tujuan untuk mengidentifikasi mikroorganisme penyebab penyakit dengan cara mengambil koloni bakteri yang tumbuh dominan atau terbanyak dengan asumsi bahwa bakteri yang dominan tersebut merupakan bakteri penyebab penyakit.

3.3.6 Pembuatan Pereaksi (Pewarnaan Gram) (PUSKARI 2008)

a). Gram A

1) Bahan:

   

Kristal violet Ethanol (95%) Amonium oksalat Akuades

2 gram 20 ml 0,8 gram 80 ml

2) Cara pembuatan:

  

Kristal violet dicampur dengan ethanol sampai homogen Amonium oksalat juga dilarutkan dalam akuades Kemudian keduan larutan dicampur jadi satu dan didiamkan selama 24 jam, lalu disaring

b) Gram B

1) Bahan:

  

Potasium Iodida (Kl) Akuades Iodine

2 gram 300 ml 1 gram

2) Cara pembuatan:

 

0,Larutkan Kl dalam 20 ml akuades dan tambahkan iodine Setelah larut, tambahkan akuades 280 ml ke dalam larutan

c) Gram C

1) Bahan:

 

Ethanol absolute Aceton

95 ml 5 ml

2) Cara pembuatan:

Larutkan kedua bahan hingga homogen

d) Gram D

1) Bahan:

  

Safranin Ethanol 95% Akuades

0,25 gram 10 ml 90 ml

2) Cara pembuatan:

 

Larutkan safranin dalam ethanol Kemudian tambahkan akuades dan larutkan sampai homogen

3.3.7 Uji Biokimia (PUSKARI 2007) 1. Uji pengecatan Gram

a) Gelas benda dibersihkan menggunakan alcohol kemudian dipanggang diatas bunsen sampai kering. b) Bakteri dari biakan agar miring umur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1 ose di atas gelas benda yang telah ditetesi akuades steril, kemudian diratakan, dikeringkan dan difiksasi di atas lampu Bunsen. c) Pengecatan dimulai dengan penggenagan laruran Gram A selama 1 menit kemudian dibilas menggunakan akuades dan dikering anginkan. d) Setelah dikering anginkan, larutan Gram B diteteskan dan didiamkan selama 1 menit. e) Pencucian dilakukan menggunakan air mengalir kemudian dikering anginkan. f) Larutan peluntur (Gram C) diberikan selama 30 detik kemudian dicuci meggunakan akuades dan dikering anginkan. g) Cat penutup (Gram D) digenangkan selama 2 menit kemudian dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. h) Morfologi sel bakteri dan sifat Gram diamati menggunakan mikroskop pembesaran 1000 kali. Bakteri Gram positif berwarna violet, sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah.

2. Uji Oksidasi

a) Bakteri diambil dari biakan agar miring umur 24 jam menggunakan ose bulat, kemudian diinokulasikan pada kertas saring yang ditetesi reagen oksidase sebanyak 1-2 tetes. b) Pengamatan dilakukan sekitar 10-15 detik. Jika muncul warna ungu/biru di atas basahan reagen maka bakteri menghasilkan enzim oksidase, sebaliknya jika tidak terjadi peruahan warna pada basahan reagen oksidase maka bakteri tidak menghasilkan enzim oksidase.

3. Uji Katalase

a) Gelas benda ditetesi larutan H2O2 3% sebanyak 1-2 tetesi. b) Bakteri diambil dari biakan agar miring umur 24 jam, kemudian dimasukkan pada genangan H2O2 3% (pengambilan bakteri lebih baik menggunakan tusuk gigi steril). Apabila timbul gelembung gas maka bakteri mampu menghasilkan enzim katalase, sebaliknya jika tidak timbul gelembung gas maka bakteri tidak mampu menghasilkan enzim katalase.

4. Uji Oksidasi / Fermentasi

a) Bakteri diambil dari biakan agar miring umur 24 jam dengan ose lurus. b) Dua media O/F (dengan glukosa) pada tabung reaksi diinokulasi bakteri, dimana salah satu tabung ditutup dengan paraffin cair steril. c) Dua media O/F yang tidak diinokulasi juga diperlukan sama seperti di atas sebagai kontrol negatife. d) Dua tabung media O/F tanpa glukosa juga diinokulasi dan satu tabung ditutup dengan paraffin cair steril.

e) Kemudian tabung-tabung tersebut diinokulasi 24 jam atau lebih. Jika media yang ditutup paraffin berubah warna dari biru menjadi kuning, maka bakteri mampu memanfaatkan karbohidrat pada kondisi anaerob melalui proses fermentasi sehingga bakteri dikatakan bersifat fermentatife. Apabila perubahan warna menjadi kuning hanya mampu memanfaatkan karbohidrat pada kondisi aerob melalui proses oksidasi sehingga bakteri dikatakan bersifat oksidatif.

5. Uji Tripel Sugar Iron Agar (TSIA)

a) Timbang TSIA sebanyak 65 gram. b) Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam Erlenmeyer yang diberi stirrer magnetic. c) Panaskan diatas hot plate hingga mendidih. d) Steril dengan autoclave 121oC selama 15 menit. e) Tuang ke dalam tabung reaksi yang sudah steril. f) Atur dalam posisi miring (slant position). g) Simpan dalam laminari dengan suhu ruang 27oC selama 24 jam kemudian masukkan ke dalam refrigerator.

6. Uji Motility Indol Ornitin (MIO)

a) Timbang MIO sebanyak 31 gram b) Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam Erlenmeyer yang diberi stirer magnetic. c) Panaskan diatas hot plate hingga mendidih d) Steri dengan autoclave 121oC selama 15 menit. e) Tuang ke dalam tabung reaksi yang sudah steril.

f) Simpan dalam laminari dengan suhu ruang 27oC selama 24 jam lalu masukkan ke refrigerator.

7. Uji Gelatin

a) Bakteri diambil dari biakan agar miring umur 24 jam dengan ose bulat. b) Bakteri diinokulasi pada medium gelatin dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. c) Setelah dilakukan inkubasi, medium diletakkan pada refrigerator selama 15 menit kemudian diamati perubahan yang terjadi. Apabila medium masih tetap cair maka bakteri memiliki enzim gelatinase sehingga medium masih tetap cair maka bakteri memiliki enzim gelatinase sehingga mampu memecah gelatin, sebaliknya apabila medium menjadi padat maka bakteri mampu menghidrolisis gelatin.

8. Uji Gula

a) Bakteri diambil dari biakan agar miring umur 24 jam dengan ose bulat. b) Bakteri diinokulasikan pada medium gula yang dilengkapi dengan tabung durham. c) Sebagai control, bakteri juga diinokulasikan pada medium yang serupa tetapi tanpa gula, kemudian diinkubasi. d) Bakteri dikatakan mampu memfermentasi gula apabila terjadi perubahan warna medium tetap merah atau berubah menjadi merah jambu maka bakteri dikatakan tidak mampu memfermentasi gula. Jika pada tabung durham terlihat gelembung udara berarti bakteri tersebut menghasilkan gas.