LAPORAN

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

KELOMPOK 5 ROMBONGAN 1

PERHITUNGAN KOLONI BAKTERI I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Mikroorganisme adalah makhluk yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dibawah mikroskop. Salah satu jenis mikroorganisme adalah bakteri. Bakteri merupakan organisme uniselular yang tumbuh dengan cara pembelahan biner yaitu satu sel membelah secara simetris. Untuk mempermudah penghitungan koloni diperlukan pengetahuan mengenai morfologi bakteri tersebut sehingga media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri tersebut. Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan atau merugikan. Ada hasil metabolisme spesies mikrobia tertentu pada makanan dibutuhkan dan digemari oleh manusia. Akan tetapi ada beberapa species yang dapat merusak makanan dengan pembusukan atau menghasilkan toksin yang berbahaya bagi manusia. Setiap produk yang dihasilkan oleh mikrobia tergantung jumlah mikrobia yang terkandung dalam suatu bahan atau lingkungan. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan proses yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung mikrobia yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitungan mikroskopik, MPN (Most Probable Number), dan hitungan cawan (Fardiaz, 1989). Dari ketiga metode tersebut metode hitungan cawan paling banyak dan mudah digunakan. Oleh karena itulah, pada acara praktikum mikrobiologi dasar untuk perhitungan koloni kali ini menggunakan metode hitungan cawan. B. Tujuan Menghitung jumlah koloni bakteri menggunakan metode hitungan cawan. II. TINJAUAN PUSTAKA Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan

menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) (Penn, 1991). Fardiaz (1989) menyatakan ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu : A. Perhitungan jumlah sel 1. Hitungan mikroskopik 2. Hitungan cawan 3. MPN (Most Probable Number) B. Perhitungan massa sel secara langsung 1. Volumetrik 2. Gravimetrik 3. Kekeruhan (turbidimetri) C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung 1. Analisis komponen sel 2. Analisis produk katabolisme 3. Analisis konsumsi nutrien Dari metode-metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Hal ini disebabkan metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena: 1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung 2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus 3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikrobia yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1993). Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu : 1. Metode tuang (pour plate) 2. Metode permukaan (surface / spread plate) Pada perhitungan menggunakan metode cawan, diperlukan suatu pengenceran agar jumlah koloni mikrobia yang ada pada cawan dapat dihitung dan sesuai standar, yaitu berjumlah 30 300 per cawan. Pengenceran dilakukan secara decimal yntuk memudahkan perhitungan. Perhitungan metode cawan menggunakan rumus sebagai berikut : Faktor pengenceran = pengenceran x jumlah yamg ditumbuhkan Jumlah koloni (SPC) = jumlah koloni x Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Count yang menjelaskan cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut : 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.

3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan sebagai berikut : 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dibelakang koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. 2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka lebih besar dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, yang digunakan adalaha rata-ratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil. 5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak memenuhi syarat diantara 30 dan 300. Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah (Dwidjoseputro, 1978) : 1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium. 2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya rata, ada yang tidak rata. 3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium. 4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang permukaannya kasar dan tidak rata. 5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya suram. 6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan. 7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering. Pada praktikum ini, bakteri yang akan dihitung koloninya adalah Escherichia Coli yang merupakan bakteri gram negative berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif. Ukurannya berkisar pada 0,6 x 2,0-3,0 m (Pelczar, 1986). E. Coli secara normal terdapat didalam usus besar dan termasuk bakteri kolform. Bakteri koliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Hadioetomo,

1993). Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-produk susu. Ada beberapa jenis E. Coli yang bersifat invasif atau meracuni makanan, Contoh E. Coli ini yaitu E. Coli enteropatogenik (EPEC), EIEC (enteroinvasif E. Coli), dan ETEC (enterotoksigenik E. Coli). Selain itu bakteri yang akan dihitung koloninya adalah Lactobacillus acid. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sample bisa di katakan murni (Dilliello, 2002). Terkadang untuk menghitung kuantitas mikroorganisme pada sample dapat di uji dengan cara menghitung jumlah koloni pada agar. Agar lempengan yang telah ditetapkan, disingkat jumlah penjumlahan pada lempengan (Standart plate count) (Dwisaputro, 2002). Standart plate count (perhitunngan jumlah pada lempengan) sangat berguna dalam hal mengetahui kuantitas mikroorganisme pada suatu tempat atau sampel sehingga bisa di ketahui apakah sampel tersebut murni atau tidak murni (Stanier, 2001). Perhitungan koloni: Pour plate : 1 koloni Faktor pengencer Spread plate : 1 10 koloni Faktor pengencer Standart plate count : 30 300 koloni Syarat : Jika kurang dari 2 : Dipakai pengencer terbesar Jika lebih dari 2 : Dipakai rata-rata Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara decimal. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam sample, semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan (Fardius, 1992). Kisaran hitung Seperti yang sampai saat ini diketahui bahwa kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni/cawan atau 25-250 koloni/cawan. Permulaan penentuan kisaran ini berawal dari seorang mikrobiologiwan bernama Nersser (1895) yang menyimpulkan bahwa hitungan cawan yang paling baik adalah cawan yang memiliki 10.000 koloni/cawan yang perhitungannya dilakukan dengan mikroskop pada perbesaran rendah. Tiga tahun kemudian muncul pernyataan bahwa cawan yang mempunyai koloni lebih dari 100 koloni/cawan sebaiknya diabaikan. Selanjutnya pada tahun 1897, Hill menyarankan untuk tidak menghitung cawan yang terlalu banyak jumlah koloninya (overcrowded) karena tidak memberikan hasil yang sesuai dengan kenyataan. Kemudian tahun 1908, orang yang sama menyimpulkan tentang kisaran hitung 40-200 koloni/cawan yang digunakan sebagai landasan pelaporan. Kisaran ini diterima pada Comitee Standard Method of Bacteriology Water Analysis (1915) dan diubah menjadi 30200 koloni/cawan. Pencetus kisaran hitung 25-250 koloni/cawan dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam seminarnya mengenai topik ini. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. Mereka juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni yang tumbuh pada cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya (seperti B. bulgaricus yang distimulus oleh

adanya molds). Breed dan Dotterrer memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Pada analisa ini cawan yang memiliki jumlah koloni 400 dianggap tidak memenuhi syarat, sedangkan cawan yang memenuhi syarat itu sendiri berjumlah antara 50 dan 200 koloni/cawan. Pencetus lainnya adalah Tomasiewicz (1980) yang menyimpulkan bahwa kisaran hitung untuk plate count dengan ulangan 3 kali (triplicate) yaitu 25-250 koloni/cawan. Kesimpulan ini didapat dari data analisa susu (raw milk) pada tiga eksperimen yang berbeda. USP (United States Pharmacopoeial) merekomendasikan untuk menggunakan kisaran hitung antara 25 dan 250 koloni/cawan untuk bakteri pada umumnya dan Candida albicans. Sedangkan kisaran yang disarankan jika menganalisa jumlah Aspergillus niger adalah 8-80 koloni/cawan. ASTM (American Standard Testing and Methods) menyarankan untuk menggunakan kisaran hitung 20-80 koloni/membran jika menggunakan teknik filtrasi membran, 20-200 koloni/cawan untuk spread plate dan 30-300 koloni/cawan untuk pour plate. FDA BAM (Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual) merekomendasikan 25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan. Batas atas kisaran hitung. Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous To Count). ASTM menyarankan untuk melaporkan TNTC sebagai lebih besar dari batas atas, misalnya >200 CFU pada cawan dari pengenceran 1/10, maka pelaporannya adalah >2000 CFU/ml(g). III. BAHAN DAN ALAT A. Bahan 1. Kultur bakteri dalam medium cair 2. Larutan 0,85% NaCl 3. Medium NA B. Alat 1. Tabung reaksi 2. Cawan petri 3. Pipet ukur 1 ml IV. PROSEDURE KERJA IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil pengamatan Perhitungan Koloni Bakteri (Kelompok 5) No. Pengenceran Jumlah Koloni E_Colli Lactobacillus Asidopillus 1. 10 - 2. 10 - -

3. 10 241 464 4. 104 171 447 5. 105 152 292 Perhitungan : E.Colli = Pengenceran 10 241 x = 241.000 Pengenceran 104 171 x = 1.710.000 Pengenceran 105 152 x = 15.200.000 Lactobacillus Acid = Pengenceran 10 464 x = 464.000 Pengenceran 104 447 x = 4.470.000 Pengenceran 105 292 x = 29.200.000 Jumlah koloni (SPC) : Rata2 jumlah bakteri E_Colli pada pengenceran 10 104 dan 105= 241+171+152 3 = 188 Jumlah koloni (SPC) E_Colli = 462,67 x 1/10 104105 = 188 x 1012 Rata2 jumlah bakteri Lactobacillus Acid pada pengenceran 10 104 dan 105 = 464+ 447+292 = 401 3 Jumlah koloni (SPC) E_Colli = 401 x 1/10 104105 = 401 x 1012 B. Pembahasan Metode hitungan cawan dilaksanakan dengan mengencerkan sampel suspensi bakteri Escherichia Coli dan Lactobacillus Acid kedalam larutan garam fisiologi (NaCl) 0,85 %. Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm permukaan (Fardiaz, 1993). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah meikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada satu tabung (Waluyo, 2004). Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memilki sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikrobia untuk menghindari rusaknya sel, selain itu juga harus dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Selain menggunakan larutan garam fisiologi (NaCl) 0,85 %, pengenceran juga dapat dilakukan dengan menggunakan larutan fosfat buffer, larutan Ringer, atau akuades. Namun penggunaan akuades sebaiknya dihindari karena dapat mengakibatkan rusaknya sel akibat perbedaan tekanan osmotik, karenanya pelaksanaan pengencerannya harus cepat. Kedalam larutan pengencer juga dapat ditambahkan butir-butir gelas (glass beads) atau pasir putih yang disterilisasi bersama dengan larutan tersebut untuk melarutkan bahan yang sukar larut. Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran desimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5. Dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Hal ini karena diperkirakan koloni yang terbentuk oleh Escherichia Coli berada pada jumlah yang dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara desimal. Selanjutnya dari masing-masing tabung pengenceran diambil 1 ml untuk dilakukan penanaman

atau plating pada media NA secara aseptik. Plating atau penanaman bakteri adalah proses pemindahan bakteri dari medium lama ke medium baru (Dwidjoseputro, 1978). Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptis atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikrobia yang tidak diinginkan. (Fardiaz, 1993). Media NA digunakan karena merupakan media yang paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 C dalam keadaan terbalik. Cawan petri diinkubasi dalam keadaan terbalik untuk menghindari kontaminasi dari air yang mengembun diatas cawan petri yang mungkin menetes jika cawan petri diletakan pada posisi normal. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata. Prinsip perhitungan koloni bakteri adalah semakin tinggi tingkat pengenceran semakin rendah jumlah koloni bakteri. Dengan kata lain tingkat pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah koloni bakteri. Berdasarkan hasil pengamatan perhitungan koloni bakteri Escherichia Coli dari kelompok 5 hasil perhitungannya menunjukkan bahwa semakin tinggi tingkat pengenceran semakin sedikit jumlah bakteri. Namun pada perhitungan koloni bakteri Lactobacillus Acid kelompok 5 mengalami kegagalan, karena jumlah bakteri berbanding lurus dengan tingkat pengenceran. Hal ini disebabkan terjadinya kontaminan yang berasal dari alat yang digunakan, praktikan ataupun udara. Selain itu bisa juga disebabkan oleh kurangnya kecermatan dan ketelitian praktikan baik dalam proses praktikum ataupun perhitungan. Dari hasil didapat bahwa jumlah koloni bakteri yang terdapat dalam 1 ml kultur E. Coli sampel adalah 188 x 1012 koloni. Menurut Dwidjoseputro (1978), Escherichia Coli mengadakan divisio atau pembelahan biner sel setiap 20 menit. Berdasarkan hal itu, maka dapat diperkirakan jumlah E. Coli setelah 2 hari adalah 2 x 272. Sedangkan jumlah koloni bakteri Lactobacillus Acid dari hasil perhitungan adalah 401 x 1012. Metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan, yaitu (Fardiaz, 1993) : 1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. 2. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan niali yang berbeda 3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar 4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. VI. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Pengenceran merupakan salah satu faktor yang penting dalam penghitungan koloni. B. Saran Sebaiknya proses praktikum dilakukan dengan lebih aseptis untuk mengurangi kontaminan agar data yang didapat lebih akurat.

VII. DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan; Jakarta. Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada; Jakarta. .1989. Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi IPB; Bogor. Schlegel, H., G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press; Yogyakarta. Suriawiria, Unus. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit Angkasa; Bandung. Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press; Malang.