ED 9 : protomique

Constance Delaby Caroline Kannengiesser

Dcembre 2007 Facult de mdecine X. Bichat-PCEM2

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Plan gnral de lED Gnralits Stratgies didentification dune protine, Les mthodes Exercices Avantages et limites des mthodes
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Gnomique & Protomique

Gnomique : ADNg : Relativement constant
mutations somatiques (rparation), recombinaison V-D-J dans lymphocytes) environ 30 000 gnes Homme

Protomique : monde dynamique molcules htrognes

variabilit pour un gne donn > 500 000 protines Homme

Grande diversit protique : - squence - modifications pr, co et post traductionnelles - repliement - assemblage : complexes de 2 80 partenaires
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Expression dun gne

Gnome
constant dans toutes les cellules dun organisme (sauf vnements somatiques)

Ninforme pas sur degr dexpression/activit des protines dans une cellule

taux dARNm :

Protome : dynamique varie au cours du dveloppement

varie dun type cellulaire lautre (spcificit tissulaire) varie selon tat physiologique vs pathologique
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ADN gnomique
transcription Processing Et Splicing alternatif

ARNprem

Isoformes

ARNm a
traduction

ARNm b Protine B

ARNm c Protine C

Protine A

Modifications post traductionnelles Glycosylation, Phosphorylation, Adnylation, Hydroxylation, Sumoylation.

Protolyse

protine

protine protine

protine protine protine

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compartimentalisation

dgradation

activit

interaction

Analyse du protome au cours du dveloppement

1 GENOME

PROTEOME 1
closion des oeufs

PROTEOME 2
chenille

PROTEOME 3
chrysalide

PROTEOME 4
papillon

dveloppement

Bases molculaires des cancers

7 Hanash S, nature 2006

La protomique
= ltude du protome, cest--dire lensemble des protines constituant
-un compartiment cellulaire (ex: les protines nuclaires), -une cellule, -un tissu -ou un organisme vivant entier

-permet notamment :
la recherche et lidentification systmatique de lensemble des protines constituant un organisme, un tissu lidentification des protines constituant un complexe protique (interactions protines-protines) la recherche et lidentification de protines impliques dans des voies de signalisation par exemple par une analyse diffrentielle (sauvage/mutant).

Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification : a) MALDI-TOF

b) ESI

4 Autres approches : SELDI-TOF

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Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle (E2D)

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification :

ESI
MALDI-TOF

4 Autres approches : SELDI-TOF

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1 a) mthodes sparatives : chromatographie bidimensionnelle des protines : 2D-LC 2 dimensions 1re dimension : chromatofocalisation quilibration de la colonne avec un tampon basique
injection de lchantillon injection de tampons de plus en plus acide les protines les plus basiques lues en premier car non retenues Elution progressive des protines en fonction de leur pHi (gradient de pH linaire dans la colonne) Etape trs rsolutive, trs reproductible
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1 a) mthodes sparatives : chromatographie bidimensionnelle des protines : 2D-LC 2me dimension : chromatographie en phase inverse HPLC
injection dans la colonne des protines rcupres de la premire dimension quilibration de la colonne avec H2O gradient H2O-acto-nitrile (luant de plus en plus hydrophobe) les protines rcupres en premier sont les plus hydrophiles Elution en fonction de lhydrophobicit Trs rsolutif, rapide Stryer Figure 4.6. High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC).
(1) thyroglobulin (669 kd), (2) catalase (232 kd), (3) bovine serum albumin (67 kd), (4) ovalbumin (43 kd), and (5) ribonuclease (13.4 kd).

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Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification : a) MALDI-TOF

b) ESI

4 Autres approches : SELDI-TOF

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1 b) Les mthodes sparatives : E2D

Aspect quantitatif Mthode la plus fiable pour tudier - labondance
Diffrentes tapes : - les modifications post-traductionnelles

Prparation des chantillons Focalisation isolectrique SDS-Page Coloration des gels

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2 dimensions

1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Prparation des chantillons rompre les interactions entre molcules :
libration des polypeptides individualiss et solubiliss ne pas modifier les chanes polypeptidiques libres : inhibiteur des phosphatases, protases, glycosidases liminer les sels maintenir les protines sous forme soluble
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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

2 dimensions en 2 temps :

1re dimension: Focalisation isolectrique:

vitesse de migration des protines dans un champ lectrique proportionnelle la charge charge protique proportionnelle la entre le pH du milieu et le pI de la protine gradient continu de pH Ampholytes
(poly-lectrolytes ionisables chargs + ou -)

(born : acide fort lanode, base forte la cathode)

Champ lectrique

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

1re dimension: Focalisation isolectrique:

STRYER Figure 4.11.

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

2me dimension : SDS - Page

STRYER Figure 4.12.

Coloration des gels (bleu de coumassie, nitrate dAg, fluorescence)

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

19
Introduction to proteomics, Liebler

1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Focalisation isolectrique +
Gradient continu de pH immobilis -

SDS - Page

Coloration au nitrate dAg

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Exemples dapplications

Protomique dexpression

Recherche de marqueurs diagnostiques Caractrisation Molculaire de maladies

Etudes toxicologiques

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Protomique dexpression

Foie souris wT

Foie souris KO

Analyse dimages (logiciels PD quest, image master 2D platinium)

Comparaison images multiples Dtection des spots Appariement (gel matching) Analyse des donnes

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Petrak J et al, Proteomic analysis of iron overload in human hepatoma cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

Identification des protines spares
dcoupage des spots

dintrt

digestion protique (trypsine) : peptides identification des peptides par spectromtrie de masse
bases de donnes comparaison de squence

vrification
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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

2D-DIGE : E2D diffrentielle en fluorescence liaison de cyanine (Cy2, Cy3, Cy5) sur les rsidus Lysine liaison sur fonction amine des Lys
faible PM des cyanine pas de modification de la charge des protines spectres de fluorescence diffrents

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

2D-DIGE : E2D diffrentielle en fluorescence
Extrait protique 1 Cy5 Extrait protique 2 Cy3

Extrait protique 1/2 Cy2 standard interne

E2D (un gel pour trois chantillons) Lecture 1 Lecture 2 Lecture 3

(normalisation donc pas de variation inter gel)

Analyse diffrentielle qualitative et quantitative (standard interne)

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1 b) Electrophorse bidimensionnelle : E2D

2D-DIGE : E2D diffrentielle en fluorescence Exemple

sain

malade

Lanalyse dimages dun gel DIGE plus aise car migration des 3 chantillons sur le mme gel
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Avantages et limites des mthodes Chromatographie bidimensionnelle des protines 2D-LC

(+) mthode non destructive, les protines sont intactes (+) reproductibilit (+) interface avec la spectromtrie de masse (-) coteux (-) compatibilit avec spectromtrie de masse limite en fonction des dtergents utiliss
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Avantages et limites des mthodes E2D

Rsolution et sparation
(+) on peut voir les phosphorylations, glycosylations (car focalisation) (-) la densit des spots doit rester raisonnable

Gamme dynamique quantitative Spectre danalyse

(-) concentrer les chantillons au max

(-) protines trs basiques / haut PM sont difficiles voir

Reproductibilit

(-) variabilits techniques et biologiques

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Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification : a) MALDI-TOF

b) ESI

4 Autres approches : SELDI-TOF

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2 mthodes de purification : Purification de complexes par chromatographie daffinit

Fonctionnalit des protines complexes protiques

fonctionnalit dfinie par lassociation entre protines

Stratgie classique couplage ligand-rsine

adsorption molcule dintrt dsorption molcule dintrt
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Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification : a) MALDI-TOF

b) ESI

4 Autres approches : SELDI-TOF

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3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI MS : spectromtrie de masse :

Principe = mesurer la masse molaire de biomolcules en les sparant en fonction de leurs rapports m/z avec une grande sensibilit et une bonne rsolution. galement possible de fractionner les chanes polypeptidique au niveau des liaisons peptidiques ou au niveau des chanes latrales pour obtenir des informations sur la squence ou la composition en acides amins. La structure d'un spectromtre de masse : La source d'ionisation qui permet de produire des ions en phase gazeuse (de type MALDI ou ESI). L'analyseur qui permet de sparer les diffrents ions en fonction du rapport m/z. Le dtecteur qui permet de convertir le courant ionique en courant 33 lectrique mesurable.

Temps de vol a besoin d'une source d'ion puls. Au contraire, des analyseurs stabilit de trajectoire de type quadrile ou trappe ionique peuvent fonctionner en mode continue. 34 un temps de vol est facilement compatible avec une source de type MALDI alors que les sources ESI sont compatible avec les analyseyrs quadripole et trappe ionique

3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI

MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation chantillon-matrice fix sur support solide
ionisation et dsorption laser analyseur, sparation en fonction du rapport m/z dtecteur enregistrement analyseur de masse
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3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI

Mthode dionisation : MALDI
Analyte-matrice (absorbe du laser)

LASER

Dsorption dions caractristiques de lchantillon

Ions positifs Ions ngatifs

Analyseur de masse
Plaque mtallique
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3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI

Mthode dionisation : MALDI

Introduction to proteomics, Liebler

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3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI Lanalyseur temps de vol : T.O.F Principe :

acclration des ions de masse diffrente une nergie cintique uniforme Temps de vol diffrent pour parcourir une distance donne

Expulsion des ions de la source dionisation par paquets

Acclration sous une diffrence de potentiel Vs

Introduction to proteomics, Liebler

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3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI

STRYER Figure 4.16. MALDI-TOF Mass Spectrometry. (1) The protein sample,

39 embedded in an appropriate matrix, is ionized by the application of a laser beam. (2) An electrical field accelerates the ions formed through the flight tube toward the detector. (3) The lightest ions arrive first. (4) The ionizing laser pulse also triggers a clock that measures the time of flight (TOF) for the ions. [After J. T. Watson, Introduction to Mass Spectrometry, 3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p. 279.]

3 a) Mthodes didentification : MS-MALDI

STRYER Figure 4.17. MALDI-TOF Mass Spectrum of Insulin and -lactoglobulin. A mixture of 5 pmol each of insulin (I) and -lactoglobulin (L) was ionized by MALDI, which produces
predominately singly charged molecular ions from peptides and proteins (I + H+ for insulin and L + H+ for lactoglobulin). However, molecules with multiple charges as well as small quantities of a singly charged dimer of insulin, (2 I + H)+, also are produced. [After J. T. Watson, Introduction to Mass Spectrometry, 3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p. 282.]

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3 b) Autre Mthode dionisation : ESI ElectroSpray ionization

= ionisation par lectrospray chantillon en solution production de gouttelettes charges partir de lanalyte dissout en solution vaporation du solvant, diminution de la taille de la gouttelette dsintgration des gouttelettes : micro-goutelettes plus charges ions dsolvats -> spectromtrie de masse
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3 b) Autre Mthode dionisation : ESI

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Stratgies didentification dune protine

1 Mthodes sparatives : a) chromatographie bidimensionnelle
b) lectrophorse bidimensionnelle

2 Mthodes de purification : chromatographie daffinit 3 Mthodes didentification : a) MALDI-TOF

b) ESI

4 Autres approches : SELDI-TOF

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4 Approche SELDI-TOF SELDI = Surface Enhanced Laser Desorption Ionization support : surface dchange chromatographique
reverse (molcule hydrophobes) molcules hydrophiles change cationique (cations) change anionique (anions) affinit (anticorps, ligand enzyme, ADN) Choix de la barrette en fonction de lanalyse
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4 Approche SELDI-TOF

Daprs S Lehman, Montpellier

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Daprs S Lehman, Montpellier

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4 Approche SELDI-TOF
Dpt des chantillons (srum, extraits tissulaires) dans les puits

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4 Approche SELDI-TOF
Lavages (stringence croissante pour liminer le non spcifique)

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4 Approche SELDI-TOF
Ajout dEAM (energy absorbing molecules) Pour faciliter la dsorption et lionisation dans le TOF-MS Desorption-Ionisation Laser Analyse spectromtrie de masse TOF

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4 Approche SELDI-TOF

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Avantages et limites des mthodes SELDI

(+) Rsolution et sensibilit identification directe de partenaires si couple MS (-) limites suppose une connaissance priori des proprits biochimiques
des protines tudies reproductibilit (sensibilit) analyse simultane dune protine dans diverses conditions

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Identification des protines

identification automatique : criblage des banques de donnes
Comparer spectre de la protine inconnue aux spectres virtuels de toutes
les protines de la banque Spectre virtuel digestion enzymatique in silico Spectre de masse des fragments

ou : tape dinterprtation du spectre exprimental en aa

squence potentielle ensuite compare aux squences de la banque
logiciels danalyse tolrants (insertion, substitution, dltion)

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exercices

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Applications des approches protomiques

Protomique diffrentielle Identifications de marqueurs de maladies
Outil pour la protomique clinique (ex SELDI TOF) dtecter la maladie un stade prcoce ou la susceptibilit la maladie

Analyse des glycosylations Analyse des phosphorylations

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Place de la bioinformatique et des mathmatiques re post gnomique, protomique, mtabolome

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