Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

KULTUR JARINGAN TANAMAN A. Pengertian Kultur jaringan tanaman sebagai salah satu aplikasi dari bioteknologi tanaman merupakan budidaya tanaman yang dikerjakan secara in-vitro (dalam wadah tertutup atau dalam botol). Kultur jaringan yang dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel cultuus atau gewebe kultur, menurut Yusnita (2004) didefinisikan sebagai suatu teknik menumbuhkembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in-vitro, yang dicirikan oleh kondisi kultur yang aseptik, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol. Kultur jaringan tanaman akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang dibutuhkan dapat terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi : pemilihan eksplan/bahan tanam, penggunaan media yang sesuai, keadaan yang aseptik dan pengaturan lingkungan tempat tumbuh yang sesuai. B. Dasar Ilmiah Kultur jaringan sesuai dengan definisinya sebagai teknik budidaya sel, jaringan dan organ tanaman dalam suatu lingkungan yang terkendali dan dalam keadaan aseptik, mengandung 2 prinsip dasar yang jelas, yaitu : 1. Bahan tanam yang bersifat totipoten. Pelaksanaan Teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwan mengenai sifat totipotensi (total genetic potencial), yaitu setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

fisiologi yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh jika ditempatkan dalam lingkungan yang sesuai. 2. Budidaya yang terkendali. Sifat bahan yang totipotensi saja tidak cukup untuk kesuksesan kegiatan kultur jaringan. Keadaan media tempat tumbuh, lingkungan yang mempengaruhinya (kelembaban, temperatur, cahaya) serta keharusan sterilitas adalah hal mutlak yang harus terkendali.

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

C. Macam Teknik Kultur Jaringan dan Manfaatnya Beberapa macam kultur jaringan yang dapat diaplikasikan berikut manfaatrnya, antara lain : 1. mengatasi anggrek. 2. Kultur meristem, yaitu kultur jaringan yang sel-selnya masih aktif menggunakan jaringan tanaman yang Kulur biji steril, dapat digunakan untuk yang pada persentase biji tanaman perbanyakan rendah, tanaman misalnya

perkecambahannya

mengalami permbelahan, misalnya tunas lateral tanaman yang masih muda, hal ini biasa digunakan untuk menghasilkan tanaman bebas virus atau penyakit sistemik lainnya. 3. masih aktif Kultur kalus, yaitu kultur jaringan untuk membelah dan belum terdeferensisai untuk menginduksi kalus. Kalus merupakan sekumpulan sel yang membentuk tunas maupun akar. Salah satu manfaat kultur kalus adalah sebagai usaha produksi metabolit sekunder yang merupakan bahan aktif untuk obat-obatan pada industri farmasi. Dibandingkan konvensional, dengan perbanyakan tanaman tanaman kultur secara jaringan perbanyakan secara

mempunyai beberapa kelebihan sebagai berikut : 1. Untuk memperbanyak tanaman tertentu yang sulit atau sangat lambat diperbanyak secara konvensional. 2. Perbanyakan tanaman secara kultur jaringan tidakmemerlukan tempat yang luas. 3. Teknik perbanyakan tanaman secara kultur jaringan dapat dilakukan sepanjang tahun tanpa bergantung pada musim. 4. Bibit yang dihasilkan lebih sehat. 5. Memungkinkan dilakukannya menipulasi genetik. (Yusnita, 2004).

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

ACARA I STERILISASI ALAT DAN PEMBUATAN MEDIA KULTUR

A. Tujuan Praktikum 1. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman 2. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan B. Alat dan Bahan 1. Alat a. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi : Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), lengkap dengan Petridish dan botol-botol kultur. Peralatan diseksi, yaitu pinset besar/kecil, pisau lampu bunsen yang berisi spirtus.

pemes, gunting eksplan. Alat-alat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi dibungkus dengan kertas, kemudian disterilisasi di dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. Setelah disterilisasi, alat-alat tersebut disimpan di dalam oven. b. Peralatan untuk pembuatan media, meliputi : Timbangan Analitik Botol-botol kultur Magnetik stirer pH meter Gelas piala Pipet Plastik pp 0,3 mm Karet gelang Kertas label.

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

2. Bahan-bahan untuk pembuatan media a. Aquadest b. Larutan stok, terdiri atas hara makro dan mikro, vitamin serta ZPT. c. Agar-agar d. Gula e. NaOH 1 N dan HCL 1 N C. Cara Kerja 1. Pembuatan Larutan Stok Bahan-bahan kimia komponen media dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil, oleh karena itu bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk larutan yang disebut sebagai larutan stok. Larutan stok merupakan larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya Sehingga telah larutan dikalikan menjadi stok ini dan menghindari beberapa untuk kesalahan konsentrasi. memudahkan relatif kecil. Langkah-langkah pembuatan larutan stok , meliputi : a. Larutan stok media menjadi beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali konsentrasi. (2) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest dengan volume tertentu, misalnya 500 ml. (3) Memasukkan masinr-masing larutan ke dalam botol dan menyimpannya ke dalam refrigerator. b. Larutan stok zat pengatur tumbuh (1) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan berfungsi

penimbangan

penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumah yang

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Zat pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Cara membuat larutan stok masingmasing ZPT adalah sebagai berikut : (1) 100 ppm = Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 100 mg/l ppm sebanyak 300 ml adalah sebagai berikut : = 30 mg/0,3 l = 30 mg/300 ml (2) 100 ppm = Menghitung kebutuhan bahan IBA 100 100 mg/l ppm sebanyak 100 ml adalah sebagai berikut : = 10 mg/0,1 l = 10 mg/100 ml (3) Melarutkan bahan dengan Alkohol atau NaOH 1 N kemudian ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP dan 100 ml untuk IBA. (4) refrigerator. 2. Pembuatan Media Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch dan Nitsch (1972), Gamborg dkk. B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965), Murashige dan SkoogMS (1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan McCown, 1980). Komponen media kultur yang lengkap sebagai berikut : Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol dan menyimpannya ke dalam

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai Hara-hara makro dan mikro. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi. Vitamin, asam amino dan bahan organik lain. Zat pengatur tumbuh. Suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media. Langkah-langkah pembuatan media (1 liter) adalah

pelarut atau solven.

(Yusnita, 2004). sebagai berikut : (1) Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran yang telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala. (2) Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan, misalnya : Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi BAP 2 = V2 x M2 V1 = 20 ml/L ppm, maka volume larutan stok yang diambil adalah : V1 x M1 V1 x 100 ppm = 1000 ml x 2 ppm Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi IAA 0,5 = V2 x M2 V1 Ket. : V1 = = 5 ml/L volume larutan stok yang diambil

ppm, maka volume larutan stok yang diambil adalah : V1 x M1 V1 x 100 ppm = 1000 ml x 0,5 ppm

M1 = dosis larutan stok yang tersedia V2 = volume media yang akan dibuat M2 = dosis media yang akan dibuat. (3) Menambah aquadest sampai 1000 ml. 8

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

(4) Menambah gula sebanyak 30 gr. (5) Mengatur pH dalam kisaran 5,8 6,3 dengan menambahkan beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCL untuk menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk dengan magnetik stirer. (6) Menambahkan agar-agar 8 gr kemudian dididihkan. (7) Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang lebih 25 ml tiap botol. (8) Menutup botol berisi larutan media dengan plastik. (9) Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. (10) Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk mengantisipaso ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman. 3. Media Penanaman Dalam praktikum ini, media yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm dan IAA 0,5 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4 macam eksplan dengan masing-masing eksplan diulang sebanyak 2 kali untuk setiap mahasiswa / praktikan.

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

ACARA II KULTUR JARINGAN MAWAR A. Tujuan Praktikum. 1. 2. Mengetahui teknik kultur jaringan mawar Mengetahui pengaruh BAP dan IBA terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan mawar. B. Alat dan Bahan 1. Alat a. LAFC lengkap dengan lampu bunsen b. Petridish dan botol-botol kultur c. Peralatan diseksi yaitu pinset besar/kecil dan pisau pemes. 2. Bahan a. Eksplan : mawar b. Media kulltur c. Alkohol 96 % d. Aquadest steril e. Spirtus f. Chlorox (Sunclin) C. Cara Kerja 1. 2. Persiapan eksplan Sterilisasi ekpslan (dilakukan dalam LAFC) Merendam eksplan dalam larutan Dithane M-45 3 mg/l selama 12 jam, dilanjutkan dengan chlorox 5,25 % (Sunclin 100 %) selama 3 menit. 3. Membilas eksplan dengan aquadest steril. Penanaman eksplan Membuka plastik penutup botol media kultur.

10

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Mengambil eksplan dan menanamnya di media kultur dengan pinset. Setelah digunakan, pinset harus selalu dibakar di atas api. Selama penanaman, mulut botol harus selalu dekat dengan api untuk menghindari kontaminasi. Pemeliharaan Botol-botol media berisi eksplan ditempatkan di rak-rak kultur Lingkungan di luar botol harus dijaga suhu, kelembaban dan cahayanya. Penyemprotan botol-botol kultur dengan spirtus dilakukan 2 hari sekali untuk mencegah kontaminasi. Pengamatan selama 5 minggu, yang diamati : Saat muncul akar, tunas, daun dan kalus (HST), diamati setiap hari. Jumlah akar, tunas dan daun, diamati 1 minggu sekali. Deskripsi kalus (struktur dan warna kalus), dilakukan pada akhir pengamatan. Persentase keberhasilan, dilakukan pada akhir pengamatan.

4.

5.

11

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

ACARA III KULTUR JARINGAN NANAS A. 1. 2. B. 1. Alat a. LAFC lengkap dengan lampu bunsen b. Petridish dan botol-botol kultur c. Peralatan diseksi yaitu pinset besar/kecil dan pisau pemes. 2. Bahan a. b. c. d. e. f. C. 1. 2. Eksplan : nanas. Media kulltur Alkohol 96 % Aquadest steril Spirtus Chlorox (Sunclin) Cara Kerja Persiapan eksplan Sterilisai eksplan (dilakukan dalam LAFC) Merendam eksplan dalam larutan Dithane M-45 3 mg/l selama 12 jam, dilanjutkan dengan chlorox 5,25 % (Sunclin 100 %) selama 3 menit. 3. Membilas eksplan dengan aquadest steril. Penanaman eksplan Membuka plastik penutup botol media kultur. Tujuan Praktikum Mengetahui teknik kultur jaringan nanas Mengetahui Alat dan Bahan pengaruh BAP dan IBA

terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan nanas.

12

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Mengambil eksplan dan menanamnya di media kultur dengan pinset. Setelah digunakan, pinset harus selalu dibakar di atas api. Selama penanaman, mulut botol harus selalu dekat dengan api untuk menghindari kontaminasi.

13

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

4. kultur

Pemeliharaan Botol-botol media berisi eksplan ditempatkan di rak-rak Lingkungan di luar botol harus dijaga suhu, kelembaban dan cahayanya. Penyemprotan botol-botol kultur dengan spirtus dilakukan 2 hari sekali untuk mencegah kontaminasi. Pengamatan selama 5 minggu, yang diamati : Saat muncul akar, tunas, daun dan kalus (HST), diamati setiap hari. Jumlah akar, tunas dan daun, diamati 1 minggu sekali. Deskripsi kalus (struktur dan warna kalus), dilakukan pada akhir pengamatan. Persentase keberhasilan, dilakukan pada akhir pengamatan.

5.

14

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

ACARA IV KULTUR JARINGAN PISANG A. 1. 2. B. 1. Alat d. LAFC lengkap dengan lampu bunsen e. Petridish dan botol-botol kultur f. Peralatan diseksi yaitu pinset besar/kecil dan pisau pemes. 2. Bahan a. Eksplan : pisang b. Media kulltur c. Alkohol 96 % d. Aquadest steril e. Spirtus f. Chlorox (Sunclin) C. i. ii. Cara Kerja Persiapan eksplan Sterilisai eksplan (dilakukan dalam LAFC) Merendam eksplan dalam larutan Dithane M-45 3 mg/l selama 12 jam, dilanjutkan dengan chlorox 5,25 % (Sunclin 100 %) selama 3 menit. iii. Membilas eksplan dengan aquadest steril. Penanaman eksplan Membuka plastik penutup botol media kultur. Tujuan Praktikum Mengetahui teknik kultur jaringan pisang Mengetahui Alat dan Bahan pengaruh BAP dan IBA

terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan pisang.

15

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Mengambil eksplan dan menanamnya di media kultur dengan pinset. Setelah digunakan, pinset harus selalu dibakar di atas api. Selama penanaman, mulut botol harus selalu dekat dengan api untuk menghindari kontaminasi. Pemeliharaan Botol-botol media berisi eksplan ditempatkan di rak-rak kultur Lingkungan di luar botol harus dijaga suhu, kelembaban dan cahayanya. Penyemprotan botol-botol kultur dengan spirtus dilakukan 2 hari sekali untuk mencegah kontaminasi. Pengamatan selama 5 minggu, yang diamati : Saat muncul akar, tunas, daun dan kalus (HST), diamati setiap hari. Jumlah akar, tunas dan daun, diamati 1 minggu sekali. Deskripsi kalus (struktur dan warna kalus), dilakukan pada akhir pengamatan. Persentase keberhasilan, dilakukan pada akhir pengamatan.

iv.

v.

16

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

ACARA V SUB KULTUR A. Tujuan Praktikum Mengetahui teknik sub kultur untuk beberapa jenis eksplan yang tersedia B. Alat dan Bahan 1. Alat a. LAFC lengkap dengan lampu bunsen b. Petridish dan botol-botol kultur
c. Peralatan diseksi (pinset besar/ kecil dan scalpel)

2. Bahan a. eksplan : kalus, tunas/buku b. Media kultur c. Alkohol 96% C. Cara Kerja 1. Penanaman Eksplan a. Membuka plastik penutup botol media kultur b. Mengambil eksplan/ memecah eksplan kalus/ tunas/ buku yang ada dan menanamnya di media kultur baru dengan pinset. Setelah digunakan, pinset harus selalu dibakar di atas api c. Selama penanaman, mulut botol harus selalu dekat dengan api untuk menghindari kontaminasi 2. Pemeliharaan a. Botol-botol media berisi eksplan ditempatkan di rak-rak kultur b. Lingkungan di luar botol harus dijaga suhu, kelembaban dan cahayanya c. Penyemprotan botol-botol kultur dengan spirtus dilakukan 2 hari sekali untuk mencegah kontaminasi. d. Aquadest steril e. Spirtus

17

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

3. Pengamatan selama 5 minggu, yang diamati: Saat muncul akar, tunas, daun dan kalus (HST), diamati setiap hari Jumlah akar, tunas dan daun, diamati 1 minggu sekali Deskripsi kalus (struktur dan warna kalus), dilakukan pada akhir pengamatan

18

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Format penulisan laporan : Halaman Judul Halaman Pengesahan Kata Pengantar Daftar Isi Daftar Tabel Acara I Sterilisasi Alat dan Pembuatan Media Kultur A. Pendahuluan 1. Latar Belakang 2. Tujuan 3. Waktu dan Tempat Praktikum. B. Tinjauan Pustaka C. Alat, Bahan dan Cara Kerja 1. Alat 2. Bahan 3. Cara Kerja Acara II Kultur Jaringan Mawar (Rosa sp.) A. Pendahuluan 1. Latar Belakang 2. Tujuan 3. Waktu dan Tempat Praktikum B. Tinjauan Pustaka C. Alat, Bahan dan Cara Kerja 1. Alat 2. Bahan 3. Cara Kerja D. Hasil dan Pembahasan 1. Saat Muncul Akar 2. Jumlah Akar 3. ........ E. Kesimpulan dan Saran 1. Kesimpulan 2. Saran Daftar Pustaka Acara III ................................. Acara IV................................. Acara V.................................

19

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Contoh Halaman Judul / Cover (warna biru muda)

KULTUR JARINGAN
LAPORAN PRAKTIKUM

Di susun oleh : Nama : .. NIM : .. Kelompok : ..

PROGRAM STUDI ................... FAKULTAS ............................................ UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

20

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Contoh Tabel Pengamatan Tabel 2.1. Saat Muncul Akar Tanaman Mawar
Macam Eksplan Ulangan 1 2 3 4 5 6 7 8 X Ulangan 1 2 3 4 5 6 7 8 X Saat Muncul Akar

Mawar

Tabel 2.2. Saat Muncul TunasTanaman Mawar

Macam Eksplan Saat Muncul Akar

Mawar

Tabel 2.3...

21

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Tabel rekapan secara keseluruhan

Macam Ekspla n Ulanga n 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Saat Muncul Akar Saat Muncul Tunas Saat Muncul Daun Saat Muncul Kalus Jumla h Akar Jumla h Tunas Jumla h Daun Persentas e Keberhasil an

Mawar

Nanas

Pisang

Sub Kultur

22

Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan

Jadwal Praktikum Kultur Jaringan No 1. 2. 3. Acara Asistensi Pretest Acara I Sterilisasi & Pembuatan Media Acara II Penanaman Eksplan II Acara III Penanaman Eksplan III Acara IV Penanaman Eksplan IV Acara V Sub-Kultur dan Aklimatisasi Pengumpulan Laporan 2 Minggu setelah Pengamatan Terakhir (1 orang 1 laporan) Responsi 1 Minggu setelah pengumpulan laporan (yang belum mengumpulkan laporan Tidak diperkenankan ikut responsi) Waktu Tempat Ruang Kuliah Lab Kul-Jar Lab Kul-Jar

4.

Lab. Kul-Jar Lab Kul-Jar Lab Kul-Jar Lab Kul-Jar

5. 6. 7. 8. 9.

Nb : Saat penanaman eksplan, setiap kelompok harap datang 10 menit sebelum jadwal yang telah ditetapkan..Harap diperhatikan!!

23