LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK METABOLISME DAN STRES OKSIDATIF

PENGUKURAN KADAR GSH HATI TIKUS HATI DAN DARAH TIKUS

Oleh: Ika Superti Daruningrum

Pengajar: dr. Ninik Mudjihartini, MS

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA 2012

PENDAHULUAN Glutation (l- -glutamyl-cysteinyl-glisin) merupakan suatu tripeptida yang terdiri dari asam glutamat, sistein dan glisin. Senyawa tersebut memiliki gugus sulfhidril/tiol (-SH) yang terdapat pada asam amino sistein. Gugus sulfhidril inilah yang menyebabkan GSH berperan sebagai pendonor elektron yang kuat (nukleofil) dalam menangkal radikal bebas. Glutation dalam tubuh berada dalam dua bentuk yaitu bentuk tereduksi (GSH) dan bentuk teroksidasi yang disebut glutation disulfida (GSSG). GSH memiliki berat molekul 307,3 g/mol sedangkan GSSG memiliki berat molekul = 612,6 g/mol. Pada jaringan sehat GSH:GSSG adalah 9:1. Kadar GSH dalam tubuh bervariasi tergantung jaringannya. Hati tikus normalnya mengandung 7-8 mol GSH/g jaringan. Glutation dalam plasma hanya 0,5% dari yang terkandung dalam darah, sedangkan dalam eritrosit mengandung 99,5%. Pada eukariot, 90% GSH terdapat di sitosol, 10% terdapat di mitokondria dan beberapa persen berada di retikulum endoplasma (RE). Di dalam tubuh, GSH mempunyai peran sebagai antioksidan dengan cara mereduksi radikal bebas secara langsung atau sebagai kofaktor enzim antioksidan seperti glutation peroksidase dan glutation transhidrogenase. Fungsi utama GSH adalah mendetoksifikasi obat, xenobiotik atau pestisida yang dikatalisis oleh enzim GSH-S-transferase. GSH juga berperan mempertahankan gugus tiol (-SH) pada protein esensial, dengan mereduksi ikatan disulfida pada protein, yang dikatalisis oleh enzim tiol transferase.

Pada keadaan stres oksidatif diperkirakan konsentrasi GSH akan menurun yang mungkin disebabkan oleh terpakainya GSH dalam menangkal radikal bebas tersebut

sehingga GSH akan teroksidasi menjadi glutation disulfida, atau aktivitas enzim glutation reduktase yang berkurang karena kekurangan NADPH sebagai kofaktor enzim tersebut atau karena proses kerusakan sel hati sehingga hati tidak dapat mensintesis GSH. Puasa adalah keadaan yang juga dapat meningkatkan radikal bebas. Percobaan kali ini ingin melihat perbedaan GSH darah dan hati tikus dalam keadaan berpuasa dengan dalam keadaan tidak berpuasa. Hati merupakan organ yang mengandung GSH dengan kadar yang paling tinggi dibandingkan dengan jaringan yang lain. Kadar GSH yang tinggi ini setara dengan aktivitas jalur HMP shunt yang tinggi di jaringan hati. Di samping itu, hati banyak mengandung mitokondria oleh karena keperluan energinya yang tinggi. Konsumsi energi yang tinggi ini menyebabkan sel hati rentan terhadap berkurangnya ketersediaan oksigen. Akibat peningkatan ROS di mitokondria, terjadi penurunan kemampuan antioksidan sehingga terjadi stres oksidatif. Di pihak lain, akibat stres oksidatif dapat terjadi kerusakan makromolekul di dalam jaringan tubuh (terutama hati) sehingga terjadi kerusakan berbagai jaringan. Puasa merupakan salah satu kondisi yang meningkatkan stres oksidatif akibat kenaikan proses katabolisme. Percobaan kali ini akan melihat perbedaan GSH darah dan hati tikus dalam keadaan berpuasa dengan dalam keadaan tidak berpuasa.

Gambar 1 Sumber ROS pada rantai pernafasan di dalam mitokondria. Komponen rantai transport elektron terdiri atas kompleks I (NADH-ubikinon oksidoreduktase); kompleks II (suksinat-ubikinon oksidoreduktase); kompleks III (ubikinol-sitokrom c oksidoreduktase); kompleks IV (ferisitokrom c-O2 oksidoreduktase); kompleks V (ATP sintase) (tidak ditampilkan pada gambar) dapat dihambat oleh berbagai senyawa. Kompleks I dan situs Q1 dari kompleks III melepaskan ROS ke arah

matriks yang ditanggulangi oleh MnSOD, GSH, GPX dan GRase. Sebaliknya situs Qo melepaskan ROS ke arah ruang antar membran, jauh dari jangkauan antioksidan yang terdapat di matriks.

TUJUAN Menetapkan kadar GSH dalam darah dan homogenat hati tikus. PRINSIP Senyawa dengan gugus SH direaksikan dengan senyawa asam ditiobisnitrobenzoat (DTNB), suatu senyawa yang mengandung ikatan -S-S-. Senyawa dengan gugus -SH akan mereduksi DTNB sehingga pecah menjadi tionitrobenzen, yang dalam suasana alkali akan berwama kuning dan menyerap cahaya secara maksimum pada panjang gelombang 412 nm. Karena reaksi ini stoikiometrik, maka jumlah senyawa dengan gugus -SH yang ada dapat dihitung secara spektrofotometrik. BAHAN DAN ALAT BAHAN 1. Plasma darah dan homogenat hati tikus 2. Larutan standar larutan glutation 2 mg/mL (dibuat baru) dalam dapar fosfat pH 8 3. Dapar fosfat 0,1 M pH 8 4. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 5% 5. Larutan DNTB 0.00396 gr/ml (dibuat baru) dalam dapar fosfat 0.1M pH 7 ALAT 1. Tabung reaksi 2. Pipet mikro dan tip 3. Alat sentrifugasi 4. Alat spektrofotometer 5. Kuvet CARA KERJA Cara pembuatan larutan standar larutan glutation, pipetkan ke dalam tabung reaksi: Larutan Glutation ( L) 1 0 Konsentrasi standar (duplo) ( g/mL) 2 3 4 5 1 2 4 5

6 10

Dapar fosfat 0,1 M pH 8.0 (mL) TCA 5% (mL)

1.8

1.799

1.798

1.796

1.795

1.790

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Campur hingga homogen Pindahkan 0.8 mL campuran dari masing-masing tabung ke dalam tabung lain. Ke dalam 0.8 mL campuran tersebut tambahkan: DNTB (mL) 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 Sisa campuran pada masing-masing tabung (1.2 mL) digunakan sebagai blanko Baca serapan semua tabung pada panjang gelombang 412 nm Cara pengukuran sampel (duplo):
1. Ke dalam 50 L plasma darah dan homogenat hati ditambahkan 1.78 mL

dapar fosfat 0,1 M pH 8.0.

2. Ditambahkan 0.2 mL TCA 5%, campur hingga homogen. 3. Sentrifugasi pada 1500 g selama 5 menit, suhu 4o C. 4. Ambil 0.8 mL supernatan, lalu tambahkan 0.01 mL DNTB. 5. Diamkan selama 1 jam. 6. Sisa larutan supernatan digunakan sebagai blanko.

7. Baca serapan pada panjang gelombang 412 nm

HASIL Dari percobaan ini dapat ditetapkan kadar GSH darah dan hati. Kadar GSH dalam jaringan hati lebih tinggi dibandingkan dengan darah baik keadaan berpuasa maupun keadaan tidak berpuasa. Kadar GSH pada keadaan tidak berpuasa lebih tinggi daripada keadaan berpuasa baik pada jaringan hati maupun pada darah. Hal ini dapat dilihat dalam table di bawah ini. Tabel Serapan dan Kadar GSH Darah dan Hati Tikus Tabung Blanko Konsentrasi 1 g/mL Konsentrasi 2 Konsentrasi 3 Konsentrasi 4 Konsentrasi 5 g/mL g/mL g/mL g/mL Rata-Rata A 0.000 0.141 0.147 0.157 0.161 0.165 0.168 Kadar ( g/mL) -

Konsentrasi 6 g/mL

Darah tikus puasa Darah tikus tidak puasa Homogenat hati tikus puasa Homogenat hati tikus tidak puasa

0.159 0.188 0.192 0.244

3.96 9.24 9.97 19.4

Dari kurva standar GSH, dihasilkan persamaan garis: y = 0.0055x + 0.1372 dengan R = 0.9579 (y untuk serapan dan x untuk kadar). Dari hasil persamaan garis kurva standar GSH, maka didapatkan kandungan GSH darah dan hati tikus seperti yang tampak pada tabel di atas. PEMBAHASAN Hasil percobaan di atas dapat dilihat bahwa kadar GSH lebih tinggi pada keadaan tidak puasa dibanding dengan keadaan puasa. Hal ini sesuai dengan keadaan bahwa puasa dapat meningkatkan pembentukan radikal bebas dengan peningkatan kadar malondialdehid (praktikum sebelumnya). Peningkatan radikal bebas pada keadaan puasa ini memicu penggunaan GSH untuk menangkal radikal tersebut sehingga jumlahnya menurun. Demikian pula perbedaan antara GSH di jaringan hati dengan darah. GSH di hati lebih tinggi dari pada darah. Sirkulasi merupakan tempat pertama kali terkena dampak pembentukan radikal bebas. Oleh karena itu, glutation tereduksi di darah lebih

banyak terpakai untuk menangkal radikal bebas dibanding jaringan hati sehingga kadarnya menurun. KESIMPULAN 1. Dapat ditetapkan kadar GSH darah dan hati tikus dalam keadaan puasa dan tidak puasa 2. Pada keadaan berpuasa kadar GSH lebih rendah dibanding keadaan tidak berpuasa. Kadar GSH dalam darah lebih rendah dibandingkan kadar GSH hati. DAFTAR PUSTAKA
1. Jusman, SWA.

Oksidasi Biologi dan Antioksidan. Dalam: Biokimia:

Eksperimen Laboratorium. 2001. Widya Medika, Jakarta.

2. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Harpers Illustrated

Biochemistry. 26th edition. 2003. The McGraw-Hill Companies, Inc.

3. Nelson DL & Cox MM. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4th edition.

2004.