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Projet ANR P3N

Nanoparticules de copolymres autoassembls : Des premires corrlations structure-fonction biologique aux applications la thrapie photodynamique

1. Introduction 1. PDT 2. Vectorisation passive 3. Stratgie 2. Conception et caractrisation de nanoparticules auto-assembles base de copolymres
3. Caractrisation AFFFF des systmes dintrt 4. Caractrisation de lencapsulation de principes actifs 5. Etudes In-vitro 1. MCF7 2. HCT116 6. Conception et caractrisation de micelles fluorescentes pour le traage intracellulaire et le FRET

O2 O2 O2 EOR

EOR

Tissu malade O2

EOR

Phophorbide (a)

Destruction du tissu Par photo-oxydation du substrat biologique H2 O H2 O H2 O

Photosensibilisateur

Cur lipophile Lipophile (Forme des agrgats en milieu aqueux) Agrgats non actifs Peu slectif

PB:

H2 O H2 O

- Solubilisation de la Pho en phase aqueuse sous forme monomre - Augmentation de la slectivit (vectorisation passive)

Micelles de copolymres blocs et vectorisation mdicamenteuse

Trs nombreux travaux dans le dveloppement nouvelles stratgies pour la vectorisation mdicamenteuse.

Furtivit Passive Mise profit de leffet EPR pour augmenter la biodistribution au niveau tumoral

Effet EPR

Nano-objet non reconnu par les barrires immunitaires

Accumulation naturelle sur le lieu dinflammation

O MeO O n O m H

Polymre amphiphile blocs PEO-PCL

PEO

PCL

Autoassemblage

Avantages : :
Biocompatible, biodgradable (FDA) Micelles stables infrieures 100 nm

Peu opsonisable (PEO) (amliorer la biodisponibilit)

: Pheophorbide (a)

2. Conception de nanoparticules auto-assembles base de copolymres

Taille , structure et stabilit des auto-assemblages en phase aqueuse : dpendant des conditions de prparation
Mthode par cosolvant, dite directe Solubilisation du polymre et du PS dans un solvant commun, ajout de leau Avantages - Simplicit - Reproductibilit PEO-PCL 2000-2600 5000-1400 5000-4000 5000-11000 5000-32500

DLS

AFM

2000

2600

Sphres de Dhmoyen 20 nm Diamtre du cur de 12 nm (SANS), 9 nm (TEM) Stabilit 14 j Dhmoyen 20 nm TEM

Scattered intensity (cm )
-1

1x1 m

SANS
10

100 nm Dmoyen 9,2 nm

0.1 0.01 0.1 q ( )

-1

DLS 50000 1400

AFM

Sphres Dhmoyen 100 nm

Stabilit 6 j
Dhmoyen 100 nm TEM 1x1 m

125 nm

10

DLS

AFM

5000

4000

Sphres Dhmoyen 22 nm Dcoeur 13,4 nm Stabilit 14 j Dhmoyen 22 nm TEM

40 nm Dmoyen 13,4 nm

11

DLS 5000 11000

Sphres : Dhmoyen 30 nm Dcoeur 19,2 nm Stabilit 24 h TEM Dhmoyen 30 nm

125 nm Dmoyen 19,2 nm

12

DLS 5000 32500

Sphres : Dhmoyen 50 nm Stabilit 24 h Dhmoyen 50 nm

125 nm Dmoyen 40,2 nm

13

Mise au point dune technique de prparation des micelles de copolymres : Reproductible Simple Faiblement toxique pour les systmes biologiques Dh (dls) 20002600 50004000 50001400 500011000 500032500 20 22 100 30 50 20 40 D (MET) 10 13 Stabilit 6 jours 6 jours 14 jours 24h 24h

3 systmes intressants dun point de vue taille et stabilit

14

3. Caractrisation en Asymmetric flow field flow fractionation (AFFFF) des systmes 5000-1400, 5000-4000 et 2000-2600

15

La cellule dAFFFF

Entre

Flux 1

Sortie
Dtections : RI, DLS, SLS, UV

Membrane
Flux 2

Pas de contact avec solide : Pas de force de cisaillement Sparation selon D (coefficient de Stokes-Einstein), et donc selon Dh Dh fonction linaire du temps de rtention (tr) Corrlations entre Dh (tr) et Dh (DLS) Dtermination de nombreuses grandeurs physiques de chaque population dun chantillon (Dh, Dg, Mn, Mw, Nagg .)

16

Dh (nm) DLS

Dh (nm) tr

Mn (g/mol)

Mw (g/mol)

NAgg

Ip (Mw/Mn)

50004000

26,8 (20%)

26,7

2,19 x 106 (4%)

2,22 x 106 (4%)

246

1.014 (6%)

Systme intressant : taille, distribution, reproductibilit

17

Dh (nm) DLS

Dh (nm) tr

Mn (g/mol)

Mw (g/mol)

NAgg

Ip (Mw/Mn)

20002600

20.2 (13%)

19.5

1.69 x 106 (2%)

1.71 x 106 (2%)

367.4

1.013 (3%)

Systme intressant : taille, distribution, reproductibilit

18

Dh (nm) DLS 85,0 (2%)

Dh (nm) tr 77,1

Dg (nm) 76,2

Dg/Dh (qels) 0,9

Dg/Dh (tr) 0,99

Mn (g/mol)

Mw (g/mol) 6,05 x 106 (1%)

NAgg

Ip (Mw/Mn ) 1.40 (1%)

4,31 x 107 (1%)

6739

Systme exclure : Faible population de nano-objets (1-2 %)

19

LAFFFF sest avre tre une technique trs performante pour la caractrisation des nano-objets

Dtection de populations invisibles par mthodes de caractrisations classiques (TEM, DLS) Exclusion du systme PEO-PCL 5000-1400

Validation de lintrt des systmes 2000-2600 et 5000-4000 pour lapplication vise

20

4. Encapsulation du principe actif Phophorbide (a)

21

[Pheo] = 2,9x10-5 M H2O H2O H2O Poly-caprolactone Poly-oxyde d thylne

H2O

H2O
2,5

Ethylne Caproglycol lactone UV/Vis

H2O + NPs Caprolactone Ethy-Gly Dialyse 14h H2O NPs

2,5 2 1,5 1 0,5

2
1,5 1

UV/Vis avant aprs

0,5
0

0
400 500 600 700 800

400

500

600

700

800

22

Les micelles sont-elles capables de dsagrger la Pho ?

Spectre dabsorption du pho. en prsence de micelles Spectre dabsorption du Pheo. Ag
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 water

[pol] = 4mg.ml-1

Ratio npheo/npolym

Ag

methanol acetone epsilonecaprolactone DM F

absorbance

AFIFFF
690 wavelength in nm

dichloromethane

0 640

2000-2600 5000-4000

R phophorbide / polymres = 1/10 R phophorbide / polymres = 1/5

23

Taux de chargement maximum ? Determination en AsFFFF

Concentration polymre constante (4mg.ml-1) npheo/npolym npheo/npolym

1/10

Pas de changement de tailles ni de distribution des NPs avec le taux de chargement

Taux de chargement maximum : 1 phophorbide / 10 polymres Rsultat en adquation avec analyses UV/Vis

27

Taux de chargement maximum ? Determination en AsFFFF

Concentration polymre constante (4mg.ml-1) npheo/npolym

Pas de changement de tailles de la NP avec le taux de chargement

Taux de chargement maximum : 1 phophorbide / 5 polymres Rsultat en adquation avec analyses UV/Vis

28

Quelle est lintensit de fluorescence diffrents taux de chargement?

Intensit de fluorescence et activit photochimique sont lies (pheo Absorption monomre) 670 nm
-1/50-1/30-1/20-1/10-

ex = 410 nm
1,00E+07 8,00E+06 6,00E+06

Signal

2000-2600

QUENCHING Fluorescence 670 nm

1/50 1/30 1/20 1/10

4,00E+06
2,00E+06 0,00E+00 630 650 670 690

710

Qt pheo

Intensit de fluorescence maximum entre 1/30 et 1/20 Mme constat avec le systme 5000-4000

29

Dtection de la libration doxygne singulet dans le milieu

(JP Souchard)
-

: Phophorbide (a)
-

acide anthracne 9,10-dipropionique (AADP)

1O 2

endoperoxide

( < )
-

NaN3 sans O2 NP+Pheo

 NPs Rendent soluble la Pheo en solution aqueuse et sous sa forme monomre Charge maximale en Phophorbide monomre dtermine : AFFFF et UV
2000-2600 5000-4000 R phophorbide / polymres = 1/10 (soit 37 Phophorbide) R phophorbide / polymres = 1/5 (soit 50 Phophorbide)

Dtermination de la charge efficace en Fluorimtrie :

2000-2600 5000-4000 R phophorbide / polymres = 1/30

R phophorbide / polymres = 1/30

La Pheo encapsule est capable de librer de l1O2 dans un milieu physiologique

Validation des systmes

22

5. Etudes In-Vitro

32

Evaluation de la phototoxicit et de la fluorescence intra-C sur MCF7.

Intracellular fluorescence (ua, 107 cells MCF7, 3h) 12000
Pheo/micelle CI50 4,1x10-8M Pheo CI50 10,2x10-8M 10-8 2,5 5 7,5 10-7 2,5 5,0 10-6

Photocytotoxicity (MCF7, test MTT (3h))

100 80 60 40 20 0 C (mol.L-1)

10000 8000 6000 4000 2000 0 Pheo/micelle Pheo 5 x10-7 M 5x10-7 M

Phototoxicit augmente : CI50 divise par 2.5

1.6 fois plus de Pheo dans les cellules. Influence positive des NPs

Microscopie champ large sur cellules HCT 116 Phophorbide seul Phophorbide-Nanoparticules
500

Cytomtrie de flux

Fluorescence intensity

400 300 200 100 0 0 20 40

NPs 37C
NP 1/50 37C NP 1/50 4C NP 1/30 37C NP 1/30 4C Pheo 37C Pheo 4C

NPs 4C

Pho
60 80 100 120 140 time (min)

Microscopie confocale sur cellules HCT 116

Localisation Prinuclaire du phophorbide Les nanoparticules ne modifient pas la localisation sub cellulaire Entre rapide et abondante 37 C Fluo intracellulaire *25! Entre non bloque 4C avec Nano Endocytose + autre

22

4. Conception de micelles marques

Marquage du compartiment hydrophobe des micelles avec de la Fluorescine

PEO-PCL

PS

PEO-PCL-FI

Fluorescine (FI)

Suivi du devenir de la micelles In-Vitro

PEO PCL

Systme FRET (Etude du relargage de la drogue en temps rel)

PEO Schma de synthse

PCL

CH2CL2, DMF
DCC, DpTS N-Fmoc-Gly

CH2Cl2 DMF FI-NHS, Ipr2EtN

PEO-PCL-FI RMN 1H GPC

37

Caractrisation des micelles marques en AsFFFF Abs 495 nm signals

1 0,8

8% 4% 2% 0% % en masse de PEO-PCL-FI

Signal UV

0,6 0,4 0,2 0 5 -0,2 7 9

11

13

15

Temps (mins)

20.2 nm - Le polymre PEO-PCL-FI sincorpore bien dans la micelle - Pas de modification de dispersit ni de taille des micelles

1. FRET

Conditions

ex = ex D

Perte de la FRET
em D em D em A

Relargage Dstructuration

Augmentation de lmission du donneur Dcroissance de lmission de laccepteur

Systme PS + micelles-FI FI PS

2,5

ex
1,5 1

PS(3%)

Cpol = 4 mg.ml-1 CR.B = 3% (nPS /npol) = 2,9x10-5 M ex = 459 nm

12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 450 500 550 600 650 700

0,5

NP-FI (4%) NP-FI (2%)

0 400 -0,5 450 500 550 600 650

NP-FI 2%

NP-FI 2% + PS 3% NP + PS 3%

18000000 16000000 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0

450 500

NP-FI 4%

NP-FI 4% + PS 3% NP + PS 3%
550 600 650 700

Conception de systmes auto-assembls PEOPCL : Caractrisation pousse des systmes dintrt (DLS, AFM, TEM, AFFFF) Deux systmes intressants : PEO-PCL 2000-2600 et 5000-4000 Encapsulants et solubilisants efficaces de la Pheo sous sa forme monomre Dtermination charge maximale et charge efficace Systmes capables de librer de loxygne singulet Etudes In-vitro encourageantes : MCF7 : Phototoxicit 2,5 fois suprieure HCT116 : - 25 fois plus de fluorescence dans les cellules 37 C - Entre nettement plus rapide et abondante avec NPs - pntration cellulaire par endocytose + autre mcanisme dterminer Pas de changement de la localisation intracellulaire du phophorbide Adressage nuclaire Conception de micelles marques et dun systme FRET efficace suivi intracellulaire des micelles seules Etudes du relargage et du mcanisme dentre par FRET

Anne-Franoise Mingotaud Patricia Vicendo Christophe Mingotaud Jean-Pierre Souchard

Lquipe IDEAS

Les collaborateurs Frdric Violleau Mireille

Christophe Chassenieux
Interfaces Dynamiques et Assemblages Stimulables

Et dautres ! Joris Marie-Anne Clara Marion Florence Arielle Fernanda Florence

Franck Surreau Stphanie Bonneau Rachid Kerdous

Luc Wasungu Marie-Pierre Rols