Mekanisme Molekular yang mengatur

tingkat ikatan Sel DC-T

Klass P.J.M van Gisbergen, Lutz C. Paessens, Teunis B.H.
Geijtenbeek, Y vette van Kooyk

Abstrak

Kapasitas yang tidak dapat dibandingkan antara sel dendritik (DC) dan
Sel T naif primer diperkirakan tergantung pada pembentukan sebuah
synaps imunologis, DC-SIGN, sebuah lektin C-type yang secara khusus
diekspresikan pada permukaan DC, dan berfungsi sebagai sebuah reseptor
adhesi yang memfasilitasi perikatan Sel T yang didasari melaui pengenalan
ICAM-3 glycosilat pada sel T naif. Saat ini, DC-SIGN diketahui juga
memediasi pengikatan patogen-patogen seperti HIV melalui pengenalan
gp120 glikosilat.

Cakupan penelitian ini adalah untuk menginvestigasi apakah DC-SIGN

yang dikenali dari ligand selularnya dan ligand patogenik, dapat
mempengaruhi pembentukan synaps DC dan aktivasi/mobilisasi dari
reseptor adhesi lainnya seperti LFA-1 menuju area kontak sel.
Menggunakan sebuah DC-SIGN deletion mutant, kami menemukan bahwa
DC-SIGN merupakan sebuah reseptor aktif secara konstitutif yang
memediasi ikatan ligand independen pada signaling melalui domain
sitoplasmik. Secara mengejutkan, initial binding dari gp120 dengan DC-
SIGN tidak terjadi dalam peningkatan level adhesi dari LFA-1 dan lingand-
nya ICAM-1 baik dalam DC immature dan sel Raji-DC-SIGN imatur. Walau
bagaimanapun, ligand binding menuju DC-SIGN diinduksi dengan adanya
LFA-1 pada area adhesi. Terlebih lagi, kami dapat mendemostrasikan bahwa
aktivasi dari LFA-1 terjadi dalam DC-SIGN-LFA-1 Ko-Kluster pada membrane
sel. Hal ini mencetuskan ikatan dari ligand menuju LFA-1 yang bersama

1
dengan DC-SIGN, seperti ICAM-3, tetapi tidak dari ligand yang tidak
bersama DC-SIGN, seperti ICAM-1.

Jadi, kami mengusulkan bahwa pada ikatan ligand DC-SIGN dibutuhkan

LFA-1 pada area kontak, menghasilkan pembentukan DC-SIGN-LFA-1 ko-
kluster, serta interaksi-interaksi intial yang dimediasi oleh DC-SIGN dengan
ligand bersifat sementara dan akhirnya bergeser menuju interaksi LFA-1-
dependent yang lebih stabil.

1. Introduksi

Dendritik cells (DC) merupakan penjaga dari system immune.

Terletak dibawah epithelium dan mukosa, DC imatur merupakan sel
imun pertama yang menghadapi pathogen yang masuk, yang
kemudian ditangkap dan diproses untuk dipresentasikan menuju sel T
limfosit. Dalam menangkap antigen, DC menjadi matang dan beredar
menuju lymfe nodus, dimana mereka menginstruksikan sel T
patogen-spesifik untuk berproliferasi dan mengeliminasi pathogen.
Aktivasi Sel T membutuhkan kontak yang berkelanjutan antara DC
dan Sel T, hal ini penting dalam pembentukan immunological synaps.
Synaps yang matang terdiri atas cluster sentral dari kompleks TCR-
MHC (c-smac), dikelilingi oleh cincing terluar dari molekul LFA-1-ICAM-
1 (p-smac) yang menyediakan adhesi yang kuat antara DC dan Sel T.

LFA-1 merupakan reseptor transmembran heterodimer yang

tersusun dari hubungan rantai α dan β secara non-kovalen yang
merupakan golongan integrin reseptor. Penyusun dari FLA-1 termasuk
ICAM-1, ICAM-2, dan ICAM-3. Pengertian terbaru mengenai peran
utama dari reseptor LFA-1 didapat dari study T limfosit, dimana LFA-1
disimpan pada status inaktif di dalam sel T. Pada kontak dengan
ikatan DC dari kompleks TCR yang menginisiasi sinyal inside-out, dan
mencetuskan LFA-1 ke status aktif, memungkinkan integrin untuk
mengikat struktur pasangannya. Perubahan dalam aviditas yang
terjadi mengatur transisi LFA-1 dari status inaktif menjadi status aktif.
Signal inside-out diperkirakan berperan mengatur ulang LFA-1

2
 menjadi cluster melalui pelepasan integrin dari ikatan
sitoskeletonnya. Hal ini meningkatkan aviditas LFA-1 dan
memungkinkan adhesi dari LFA-1 dan ICAM-1.

Penelitian pada pembentukan synapse antara DC dan sel T

belum menyertakan analisa mengenai sifat dari DC-SIGN, sebuah C-
type lectin yang secara spesifik diekspresikan pada DC. DC-SIGN
merupakan reseptor pathogen yang mengikat dan menginternalisasi
HIV-1, HCV, Mycobacterium tuberculosis dan pathogen-patogen
lainnya. DC-SIGN juga berperan penting pada clustering DC-T cell
melalui adhesi ICAM-3 pada sel T. DC-Sign berfungsi pada tingkat
awal pembentukan synapse. Dalam hal ini, DC-SIGN berbeda dari
adhesi molekul FLA-1, yang terlibat pada fase lanjutan dari proses ini.
Karena FLA-1 tidak hanya diekspresikan pada sel T, tetapi juga pada
DC, baik sel T- dan DC-expressed LFA-1, memiliki kontribusi dalam
pembentukan synaps antara DC dan Sel T. Sama denga FLA-1 pada
sel T, LFA-1 pada DC imatur monocyte-derived juga dalam fase
inaktif. Pada Signaling sel T melalui TCR akan mencetuskan aktifasi
LFA-1, baru sedikit hal yang diketahui mengenai signal yang
mencetuskan aktifasi LFA-1 pada DC. Disini, kami telah menguji
apakah DC-SIGN terlibat dalam pengerahan dan Aktifasi LFA-1 pada
DC. Kami telah menemukan bahwa ikatan ligand dan DC-SIGN
menginduksi akumulasi LFA-1 pada area adhesi, tetapi tidak
mencetuskan ikatan ICAM-1 dan LFA-1. Bagaimanapun, hasil kami ini
mengindikasikan bahwa DC-SIGN dapat mengerahkan LFA-1 untuk
menstabilkan interaksi dengan ICAM-3 pada sel T dan bahwa interaksi
inisial sementara yang dimediasi DC-SIGN-ICAM-3 dapat bergeser
menjadi interaksi yang dimediasi LFA-1-ICAM-3 yang lebih stabil.

2. Material dan Metode

2.1.Antibodi dan reagen

3
 Antibodi dari protein-protein dibawah ini digunakan: DC-SIGN,
(AZN-DI dan AZN-D2), LFA-1α-chain, (TS2/4), SPV-L7 dan NKI-L15, LFA-
1 β-cahin (KIM185), LFA-3 (TS2/9), CD14 (immunotech, fullertone,CA),
CD80 (becon and Dickinson &co., Oxnard, CA), CD83 (immunotech)
dan CD86 (pharmingen, san Diego, CA). Recombinant ICAm-1Fc dan
ICAM-3-Fc DNA construct disediakan oleh Dr. D. Simmons. Peleburan
protein diproduksi sebagaimana digambarkan sebelumnya.

2.2.Sel

Transfectan K562 stabil diregenerasikan dengan electroporation

dengan 5 x 106 sel dalam 800 µl RPMI 1640 (Gibco, lifetechnologies
Ltd., Gaithersburg, MD) pada 0.40kV dan 960µF. Untuk menciptakan
K562-DC-SIGN, 10 µg dari DC-SIGN dalam vector pRc/CMV di
transfeksikan kedalam sel k562. Untuk menciptakan K562-DC-SIGN-
GFP dan K652-DC-SIGN(ΔCYT)-GFP, 10 µg dari vector pMX yang
sesuai di co-transfeksikan dengan 2 µg vector pGk-hygkedalam sel
K562. Karena LFA-1 tersusun atas dua rantai co-transfection dari α-
chain didalam pCDM8 dan β-chain di dalam pRc/CMV dibutuhkan
untuk membuat K562-LFA-1. Sama halnya, K562-LFA-1 (L732R) di
buat dan menuju wild-type αL-chain yang mengandung β2-chain
dengan mutasi pada L732R. Secara subsekuen, 10 µg DC-SIGN-GFP di
dalam vector pMX dan 10 µg DC-SIGN(ΔCYT)-GFP di dalam vector
pMX di co-transferasikan dengan 2 µg pGK-hyg kedalam K562-LFA-1
dan K562-DC-SIGN/LFA-1 (L732R), K562-DC-SIGN/LFA-1 dan K562-DC-
SIGN/LFA-1 (L732R). Raji transfectant stabil mengexpressikan DC-
SIGN (Raji-DC-SIGN) dibuat dengan electroporation dari pRc/CMV-DC-
SIGN.

DC imatur merupakan kultur dari monocyt dalam keberadaan Il-4

dan GM-CSF (500 dan 800 U/ml). dalam percobaan, 5-8 hari DC
imatur digunakan.

4
2.3.Analisa Imunofluorosensi

Ekspresi dari molekul permukaan sel ditentukan dengan

immunofluorosence. Sel di inkubasi dengan antibody yang sesuai (5
µg/L) dalam phosphat buffer saline (PBS) yang disuplementasikan
dengan 0.5% bovine serum albumin (BSA) dan 0.01% sodium azide
selama 30 menit pada suhu 4o C, diikuti dengan inkubasi dengan
FITC-labelled (Zymod) atau antibody sekunder PE-conjugated goat
antimouse selama 30 menit pada 4o C. intensitas fluorosence dinilai
dengan FACScan analysis.

2.4.Fluorescent bead adhesion assay

Adhesi dari ligand-coated beads dan sel dilaksanakan

sebagaimana dijelaskan sebelumnya. Singkatnya, strepvidin di
gabungkan secara kovalen dengan carboxylated-modified
TransFuloSpheres. Streptavidin-coated beads diinkubasi dengan
fragmen biotinylated goat anti-human anti-Fc-FAb2. Gp120-coated
beads dibuat sebagaimana dipaparkan sebelumnya. Singkatnya,
streptavidin-coated beads diinkubasi selama 4 jam dengan fragment
biotynilated rabbit anti-sheep anti-Fc-Fab2 pada suhu 4o C.

Penilaian Adhesi Fluorosence bead dilakukan sebagaimana

dijelaskan. Singkatnya, sel di pre-inkubasi dengan blocking atau
antibody inaktivasi (20 – 10 µg/ml) selama 10 menit dalam TSM
(20mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) 0.5%
BSA pada suhu ruangan. Dan secara subsekuen, sel di inkubasi
dengan ligand-coated beads selama 45 menit pada 37o C dalam TSM
0.5%. Adhesi dari bead tersebut dinilai dengan FACScan analysis.
Untuk Memisahkan antara ikatan ICAM-1-Fc dan gp120 coated beads

5
 digunakan TransFluoroSpheres dengan perbedaan fluorosence (488
dan 465 nm).

2.5.Confocal microscopy

Distribusi dari sel-sel LFA-1 atau mutant LFA-1 (L732R) dan DC-
SIGN-GFP co-transfected menjadi K562 ditentukan dengan confocal
laser-scanning microscopy (CLSM). Untuk pelabelan, sel-sel tersebut
difiksasi dengan 1% paraformaldehyde buffered (PFA) selama 15
menit pada suhu ruangan, dicuci dan di inkubasi dengan antibody
primer yang sesuai (10 µ g/ml) dalam PBS yang mengandung 0.55
BSA selama 30 menit pada suhu ruangan. Setelah pencucian, sel-sel
tersebut di inkubasi dengan goat anti-mouse secondary antibodies
9Fluorosence-conjugated, Zymed Laboratories, Inc., San Fransisco,
CA; texas red-conjugated; Jackson immunoResearch Laboratories Inc.,
West Grove) selama 30 menit pada suhu ruangan. Dan secara
subsekuen di lekatkan dengan ply-L-lysine-coated glass slide dan
dianalisa degan CLSM.

Redistribusi dari molekul permukaan sel dpada Raji-Dc-SIGN dan

Imatur DC pada ikatan gp120-coated beads dinilai dengan CLSM.
Non-fluorosent beads di lapisi dengan fp120 dan dibiarkan melekat
pada sel selama 45 menit masa inkubasi pada suhu 37o C. Sel
kemudian dilabel dengan antibody primer yang sesuai dan dideteksi
dengan FITC-conjugated goat anti-mouse secondary antibody
(Zymed). CSLM dilakukan pada 488 (FITC dan GFP) atau 568 nm
(Texas Red) dengan Krypton/argon laser (Bio-Rad. Hercules, CA).
Untuk melokalisasi beads pada permukaan sel, gambaran transmisi
deambil dengan menggunakan microskop phase-contract.

3. Hasil

6
3.1.Ikatan ligand dan distribusi dari DC-SIGN bersifat independen
dari domain sitoplasmik

Kami membuat sebuah transfectant dalam sel k562 yang

mengekspresikan wild-type DC-SIGN berpasangan dengan GFP pada
ekor sitoplasmik. Ekspresi dari GFP dan DC-SIGN dengan pewarnaan
anti-DN-SIGN antibody dikonfirmasikan pada transfectant K562-DC-
SIGN-GFP (Fig. 1A). Untuk menegaskan bahwa GFp-tag tidak
mengganggu adhesi DC-SIGN, sel K562 yang mengekspresikan wild-
type DC-SIGN dibandingkan dengan transfectant K562-DC-SIGN-GFP
dalam fluorosence bead adhesion assay, dengan menilai ikatan
antara gp120 coated bead dengan trasfectant (fig. 1B). Sama dengan
K562-DC-SIGN, sel K562 yang mengekspresikan DC-SIGN-GFP yang
berikatan kuat dengan gp120 beads dan adhesi dihambat dengan
menggunakan DC-SIGN antibody dan Ca2+ chelator EGTA (Fig. 1B).
kami melakukan titrasi Ca2+ untuk menilai lebih lanjut ketergantungan
dengan adhesi antara wild-type DC-SIGN dan DC-SIGN-GFP (Fig 1C).
Ikatan ICAM-3 dan gp120 dengan K562-DC-SIGN dan K562-DC-SIGN-
GFP menunujukan gambaran ketergantungn atas Ca2+, kami
menyimpulkan bahwa GFP-tag yang melekat pada ekor sitoplasmic
dari DC-SIGN tidak mengobstruksi aktivitas adhesive dari DC-SIGB.

Tidak adanya campur tangan fungsional memvalidasi

penggunaan DC-SIGN-GFP sebagai sebuah alat untuk meneliti
molekul ini. DC-SIGN-GFP digunakan untuk menilai peran domain
intraselular dalam ikatan ligand. Sampai saat ini, 36 asam amino
pertama dari coding sequence dari DC-SIGN yang menyusun domain
intraseluler utuh dihilangkan dan sisanya dilebur dengan GFP pada N-
terminus. Transfection dari hasil bentukan DC-SIGN(ΔCYT)-GFP
kedalam sel K562 terjadi dalam ekspresi GFP dan Ekspresi permukaan
dari DC-SIGN (Fig. 1A). Perbandingan dari K562- DC-SIGN(ΔCYT)-GFP
dengan K562-DC-SIGN-GFP dalam fluorocent bead adhesion assay
menunjukan ikatan yang sama antara ICAM-3 dan gp120 dengan

7
transfectant dan ketergantungan Ca2+ dari ikatan ligand dapat
dibandingkan. Jadi, adhesi dari ICAM-3 dan gp120 dengan DC-SIGN
tidak dipengaruhi oleh penghilangan sitoplasmik, mendemonstrasikan
bahwa signaling konstitutif melalui ekor sitoplasmik tidak dibutuhkan
untuk ikatan ligand dengan DC-SIGN.

3.2.Ikatan ligand dan DC-SIGN meredistribusi LFA-1

Kami menilai adakah ada ikatan ligand dengan DC-SIGN

menghasilkan signals inside-out yang mencetuskanLFA-1 menjadi
bentuk adhesif, untuk menginvestigasi hal ini, kami menggunakan
LFA-1 ekspresi Sel Riji yang ditransfeksikan dengan DC-SIGN sebagai
sistem model. Raji adalah sebuah sel dari jalur sel B, yang
mengekspresikan LFA-1 endogen pada level rendah (Fig. 2A). LFA-1
pada sel Raji tidak dapat berikatan dengan ICAM-1 atau ICAM-3 bila
berada pada status inaktifnya (data tidak tersedia). Transfeksi stabil
dari DC-SIGN dan sel Raji tidak mengalterasi tingkat ekspresi dari LFA-
1 yang tersisa dalam jumlah rendah, dan tidak juga menstimulasi
ikatan ligand dengan LFA-1 (data tidak tersedia). Walaupun raji-DC-
SIGN dapat berikatan dengan ligand LFA-1 ICAM-2 dan ICAM-3, adhesi
yang terjadi sepenuhnya dimediasi oleh DC-SIGN (data tidak
tersedia). Jadi, untuk mempelajari signaling dari DC-SIGN dan LFA-1,
Raji-DC-SIGN merupakan sebuah sistem model yang baik dalam
mengekspresikan DC-SIGN aktif dan LFA-1 inaktif.

Untuk menilai interplay antara DC-SIGN dan LFA-1, maka ICAM-1

dan gp120 coated beads dipresentasikan secara stimultan menuju
Raji-DC-SIGN dalam sebuah fluoroscent baed adhesion assay. Kami
memilih ICAM-1 dan gp120, karena ICAM-1 merupakan ligand primer
dari LFA-1 dan tidak mengikat DC-SIGN. Perbandingannya, gp-120
berikatan kuat dengan DC-SIGN, tetapi tidak dengan LFA-1. Hal ini
memudahkan kami untuk menilai apakah ikatan gp120 dengan DC-

8
SIGN terdapat sebuah aktifasi signal ke LFA-1 dan ICAM-1. Untuk
membedakan antara ikatan simultan dari ICAM-1 dan LFA-1 serta
gp120 dan DC-SIGN, ligand-ligand tersebut dilapisi dengan beads
dengan fluoroscent berbeda (488 nm untuk ICAM-1 coated beads dan
645 nm untuk gp120 coated beads). Adhesi dari gp120 dan DC-SIGN
tidak berubah dengan adanya ICAM-1 (Fig. 2B panel bawah). Hasil
mengejutkan dari penelitian ini, ikatan ICAM-1 tidak mengalami
peningkatan dengan adanya gp120 (Fig. 2B, panel atas). Untuk
menginvestigasi signaling DC-SIGN menjadi LFA-1 pada DC imatur
moncyte-derived, percobaan sejenis dilakukan dengan sel-sel ini. DC
imatur mengekspresikan level tinggi dari DC-SIGN dan level rendah
sampai sedang dari LFA-1 (Fig. 2A). Ikatan DC-SIGN spesifik dari
gp120 coated beads tidak mengalami perubahan dengan adanya
ICAM-1 coated beads. Adhesi dari ICAM-1 coated beads menunjukan
sebuah penurunan minor bukannya sebuah peningkatan, ketika
terdapat gp120 beads coated (Fig. 2C, panel atas). Hal ini
mendemonstrasikan bahwa DC-SIGN tidak dapat menimbulkan signal
inside-out yang menginduksi ICAM-1 dengan LFA-1 pada DC imatur.

Kami berikutnya menanyakan apakah interaksi DC-SIGN-ligand

mempengaruhi distribusi LFA-1 dan aviditas LFA-1. Microskopi
confocal digunakan untuk mempelajari distribusi dari LFA-1 pada
permukaan sel dari transfectant Raji-DC-SIGN setelah crosslinking
dengan DC-SIGN. Kami menginkubasi sel Raji-DC-SIGN dengan gp120-
coated non-fluoroscent beads dan ini dihasilkan dalam akumulasi dari
DC-SIGN pada tempat dimana gp120-coared beads diikat (data tidak
tersedia). Secara mengejutkan, LFA-1 juga diakumulasi pada area
kontak dari Raji-DC-SIGN dan gp120-coated beads (Fig. 3A). Efek yang
terjadi bersifat spesifik untuk LFA-1, dimana LFA-3 tidak ter ko-
lokalisasi dengan beads (Fig. 3B). Jadi signal dari DC-SIGN berinteraksi
dengan gp120 menyusun redistribusi dari LFA-1 menuju area kontak
pada DC-SIGN-transfected raji cells. Sama halnya, crosslink dari DC-
SIGN dengan gp120-coated beads pada DC imatur dihasilkan dalam
akumulasi LFA-1 pada area kontak dari DC imatur. Redistribusi dari

9
LFA-1 menuju gp120-coated beads bersifat spesifik karena CD14 tidak
ber-ko-lokalikasi dengan beads tersebut (Fig. 3D). Jadi gp120 dan DC-
SIGN menginduksi pengerahan LFA-1 pada Raji-DC-SIGN dan DC
imatur, tetapi tidak mencetuskan ikatan ICM-1 dan LFA-1.

3.3.Transmisi dari shared ligands antara DC-SIGN dan LFA-1

bergantung pada status aktivasi LFA-1

Reseptor DC-SIGN dan LFA-1, diekspresikan pada permukaan DC,

memiliki sifat adhesi yang overlapping, dan keduanya dapat mengikat
ICAM-3. Untuk mempelajari apakah keberadaan baik DC-SIGN
maupun LFA-1 pada sel yang sama dapat mempengaruhi interaksinya
dengan ICAM-3, maka dibuatlah transfactant single dan double k562
yang mengekspresikan DC-SIGN, LFA-1, ataupun keduanya. Level
ekspresi permukaan dari DC-SIGN dan LFA-1 tidak ditemukan untuk
membedakan antara single dan double transfactant secara
substansial (Fig. 4A). Seperti yang diharapkan, K562-DC-SIGN
berinteraksi dengan ICAM-3, tetapi tidak dengan ICAM-1, dimana
K562-LFA-1 berikatan dengan dengan ICAm-1 tapi lebih berikatan
kuat dengan ICAM-3 (Fig. 4B dan C). Adhesi ini bersifat spesifik karena
blocking anti DC-SIGN antibody menginhibisi ikatan ICAM-3 dengan
K562-LFA-1 (Fig. 4B dan C). Lebih lanjut, stimulasi antibody melawan
LFA-1 menjadi adhesi up-regulasi yang kuat antara ICAM-1 dan ICAM-
3 dengan K562-LFA-1 tetapi tidak pada K562-DC-SIGN (Fig. 4B dan C).
Transfactant double co-expressing DC-SIGN dan LFA-1, K562-DC-
SIGN/LFA-1 bersifat penggabungan atau campuran K562-DC-
SIGN/LFA-1 yang berada dalam Single transfactant yang
mengekspresikan LFA-1 dimana ikatan dari ICAM-3 berada dalam
single trasnfactant yang mengekspresikan DC-SIGN. Jadi, ketika LFA-1
distimulasi, maka ikatan ICAM-1 meningkat, pada saat ikatan dari

10
ICAM-3 secara komplit dimediasi oleh DC-SIGN dan maksimal pada
kondisi standar (Fig. 4D).

Wildtype LFA-1 pada transfactant K562 didistribusikan merata

pada seluruh membrane. Sebuah mutasi tunggal pada posisi 732
rantai-β dari LFA-1 (L732R) telah dilaporkan untuk menyebabkan
reseptor dalam distribusi cluster, meningkatkan aviditasnya, yang
tergambar dengan peningkatan aktivitas ikatan spontan dari LFA-1
untuk ICM-1 (Fig. 4E). DC-SIGN-GFP di ko-transfeksikan dengan wild-
type LFA-1 dan LFA-1 aktif (L732R) pada sel K562 untuk menganalisa
distribusi dari DC-SIGN pada dua tingkat status aviditas LFA-1 yang
berbeda. Level ekspresi rata-rata dari DC-SIGN-GFP dan LFA-1 dapat
dibandingkan antar transfectant (Fig. 4E). Pola ekspresi dari DC-SIGN
adalah homogeny pada K562-DC-SIGN-GFP/LFA-1 yang juga memiliki
ekspresi homogeny untuk wildtype LFA-1, dimana DC-SIGN
dikelompokan …………………………….. ………………………………………
…..[data tidak terbaca]………………………………………………………… …
……………………………………………………………………………………………
…………………………………….. LFA-1 active mengandung mutasi
L732R (Fig.3E).

Kami mempertanyakan apakah keberadaan erat DC-SIGN dan

LFA-1 didalam cluster akan mempengaruhi ikatan ligand terhadap
reseptor-reseptor ini. Kemudian, K562 double transfactant yang
mengekspresikan wildtype DC-SIGn dan LFA-1 aktif (L732R) di analisa
secara fungsional (Fig. 4 F). Adhesi dari double transfactant dengan
ICAM-1 bersifat sama dengan single transfactant yang
mengekspresikan LFA-1 (L732R), bagaimanapun, adhesi ICAm-3 tidak
hanya dimediasi oleh DC-SIGN seperti K562-DC-SIGN (Fig. 4B, E dan
F). Ikatan ICAM-3 dihambat oleh antibody DC-SIGN, bekerja secara
independent, juga dihambat oleh antibody anti-LFA-1 pada double
transfactant (Fig. 4F). Karena hanya single transfactant yang
mengekspresikan DC-SIGN yang menunjukan adhesi dengan dengan
ICAM-3 dibawah kondisi standar (Fig. 4B dan E). hal ini dapat

11
 mengindikasikan adhesi sekuensial daril ICAM-3 dengan DC-SIGN
pertama dan kemudian dengan LFA-1 untuk memungkinkan
terjadinya transmisi in-cis ICAM-3 dari DC-SIGN dengan LFA-1 dan
interaksi kuat LFA-1-ICAM-3.

4. Diskusi

Dalam laporan ini, kami memperluas pengetahuan mengenai

karakteristik adhesi dari DC-SIGN. Pertama, kami menemukan bahwa
signaling melaui ekor sitoplasmik dari DC-SIGN tidaklah dibutuhkan
untuk terjadinya adhesi. Kedua, dalam ikatan ligand ligand kami
menemukan DC-SIGN membutuhkan LFA-1, tetapi tidak ditemukan
pada aktivasi LFA-1. Ketiga, kami mendemonstrasikan bahwa DC-SIGN
dapat memfasilitasi adhesi dari ICAM-3 untuk menjadi aktif tetapi
tidak menginaktifasi LFA-1.

4.1.Peran domain sitoplasmik dari DC-SIGN dalam proses adhesi

DC-SIGN merupakan sebuah reseptor aktif secara konstitutif

yang mengikat ligand seluler ICAM-3 sebagaimana ligand patogenik
gp120. Delesi dari ekor sitoplasmik DC-SIGN menunjukan ikatan
ligand untuk terjadi secara independen dari domain intraseluler.
Transfectants K562 mengekspresikan DC-SIGN-GFP, dimana GFP-tag
tidak mempengaruhi ikatan ligand, dan dapat dibandingkan dengan
ekspresi dari DC-SIGN(ΔCYT)-GFP dengan melihat level maksimal dan

12
ketergantungan Ca2+ dari ikatan ke ICAM-3 dan gp120. Hal ini
menunjukan bahwa adhesi dari ligand dan DC-SIGN tidak
membutuhkan signaling konstitutif, perlekatan pada sitoskeleton atau
protein aksesorsi, dimana ekor sitoplasma sangat diperlukan. Juga,
distribusi dari DC-SIGN di dalam membrane sel tidak tergantung pada
sitoskeleton, seperti cytoplasmic deletion mutant yang menunjukan
gambaran distribusi homogenus, mirip seperti wild-type dari DC-SIGN
(data tidak diperlihatkan). Hal ini kontras dengan LFA-1 yang
membutuhkan interaksi dengan sitiskeleton, untuk menjaga distribusi
homogenousdan yang membenrtuk cluster pada …………………………
……………………… …………………………….……………………………………
………………………………………………………………………….…………………
…………………[tulisan tidak terbaca]……….….…………….…………..……
……… ……………………………………………………………………………………
………………………………………………… DC-SIGN tidak mengalami
pengekangan dari sitoskeleton, yang membuat reseptor ini sangat
cocok untuk memediasi interaksi dengan ICAM-2 pada endothelium
dan dengan ICAM-3 pada T lymphosit muda tanpa aktifasi
sebelumnya.

4.2.Pengerahan LFA-1 melalui ligasi dari DC-SIGN

Walaupun ekor sitoplasmik dari DC-SIGN tidak mentransduksi

sinyal dalam ke luar untuk memungkinkan ikatan ke ligand, hal ini
dapat memediasi signaling dari arah berlawanan, yang kemudian
disebut outside-in signaling dalam proses perikatan ligand. Tentu saja,
dalam ikatan DC-SIGN-transfected Raji cells dari DC-SIGN dengan
gp120 menggerakkan LFA-1 menuju tempat ikatan ligand.
Pengerahan LFA-1 yang sama diobservasi pada DC imatur ketika DC-
SIGN diikat oleh gp120. Jadi, gp120 berikatan dengan DC-SIGN

13
menibulkan outside-in signal yang dihasilkan dalam redistribusi dari
LFA-1 menuju adhesion site (Fig. 5).

Sama seperti LFA-1 pada Sel T, LFA-1 pada DC Imatur dan juga
pada Raji-DC-SIGN, menunjukan gambaran distribusi homogenus dan
tidak mengikat ligand. Dalam pengkelompokan sel T dari LFA-1
menyebabkan terjadinya adhesi molekul dan ICAM-1. Bagaimanapun,
pada DC imatur dan Transfectan Raji, DC-SIGN yang dicetuskan dari
akumulasi LFA-1 tidak terjadi dalam peningkatan adhesi ICAM-1.
Mungkin, kelompok yang terinduksi daro LFA-1 tidak cukup kuat untuk
mendukung adhesi ICAM-1. Secara alternative, signal-signal
tambahan, yang mempengaruhi status afinitas LFA-1, dapat saja
dibutuhkan untuk bekerja secara sinergistikal dengan sinyal daro DC-
SIGN, mempengaruhi status aviditas, untuk secara penuh
mengaktifakan LFA-1 pada DC.

LFA-1 yang terakumulasi dapat bekerjasama dengan DC-Sign

untuk memfasilitasi infeksi HIV-1 pada sel limfosit T CD4+. Transmisi
dari HIV-1 dari DC ke sel limfosit T CD4+ tergantung dari
pembentukan infectious synapse, tempat dimana kontak yang dalam
antara DC dan Sel T. Hal ini telah didemonstrasikan bahwa DC-SIGN
terlibat dalam pembentukan infectious synapse. Dalam ikatan HIV-1
gp120 DC-SIGN dapat memediasi redistribusi dari LFA-1 terhadap
partikel HIV-1 dalam DC. Hubungan LFA-1 dengan ICAM-1 pada sel T
yang berlawanan dapat menyediakan interaksi yang kuat yang
dibutuhkan untuk pembentukan kontak yang dalam antara DC dan
Sel T. tentu saja, keberadaan LFa-1 didalam infectious synapse telah
didemonstrasikan untuk meningkatkan infektifitas viral. Terlebih lagi,
di dalam sebuah interaksi DC-T cell co-culture blocking dan LFA-1–
ICAM-1 secara substasial mengurangi produksi HIV-1.

4.3.DC-Sign versus LFA-1 : sebuah peperangan untuk ligand

14
 Dalam perbandinagn antara double transfectant co-expressing
wild-type LFA-1 dan DC-SIGN-GFP, yang ditunjukan dengan distribusi
molekul adhesi yang tersebar dan non-matching, transfectant co-
expressing dan mutant LFA-1 dengan point mutasi pada posisi 732
dari rantai-β (L732R) terbentuk kelompok, dimana molekel adhesi
membentuk co-assemble. Alsan untuk co-assembly dari transfectant
co-expressing dan mutant LFA-1 dalam cluster tersebut belum jelas.
Mungkin, DC-SIGN melokalisasi lipid raft, yang diperkirakan
mengandung LFA-1. Co-cluster dari mutant LFA-1, tetapi bukan dari
wild-type FLA-1, dengan DC-SIGN-GFP memiliki kemungkinan untuk
dipelajari mengenai ikatan ligand dalam situasi yang dapat
dibandingakan antara pre dan post dari cross-linking dari DC-SIGN
baik Raji transfectant maupun imatur DC.

Co-expression dari wild-type LFA-1 dengan DC-SIGN tidak

menginduksi aktivasi dari LFA-1, karena adhesi untuk ligand LFA-1
ICAM-1 tidak meningkat dan ikatan ICAM-13 tidak dimediasi oleh LFA-
1, tetapi oleh DC-SIGN. Juga co-expression dari LFA-1 aktif (L732R)
dengan DC-SIGN tidak menstimulasi lebih lanjut adhesi LFA-1 dengan
ICAM-1. Bagaimanapun, adhesi dari LFA-1 aktif (L732R) dengan ICAM-
3 diinduksi oleh co-expression dari DC-SIGN. Hal ini dapat
menggambarkan transmisi dari ligand antara DC-SIGN dan LFA-1
daripada aktivasi LFA-1 pada iklatan ICAM-3 dengan DC-SIGn, karena
sama dengan Raji-DC-SIGN dan Imatur DC, adhesi darei ICAm-1
dengan K562-DC-SIGN/LFA-1 (L732R) tidak ditingkatkan dengan
ikatkan dari DC-SIGN dengan ligand (data tidak tersedia). Lebih jauh,
baik antibody anti-LFA-1 dan anti-DC-SIGN menghambat ikatan
dengan ICAM-3 secara independen, mengindikasikan ikatan yang
berurutan antara ICAM-3 dan DC-SIGN dan LFA-1. Hal ini
mengingatkan pada fungsi dari DC-SIGN sebagai reseptor intrans-
acting pada transmisi HIV-1 antara DC dan Sel T Limfpsit CD4 +. Disini,
DC-SIGN berikatan dengan HIV-1 melalui gp120 tetapi tidak

15
 mengizinkan dari DC, terlebih DC-SIGN memfasilitasi transmisi dari
virus yang tertangkap pada CD4 dan reseptor chemokine pada sel T
yang mati akibat infeksi HIV-1. Jadi, transmisi dari ligand DC-SIGN dari
DC-SIGN menuju reseptor lainnya dengan afinitas untuk ligand yang
sama dapat pula terjadi dalam proses adhesi selama homeostasis.
Interaksi inisial DC-SIGN-ICAM-2-dependent yang memediasi
perputaran DC pada endothelium dapat mendahului interaksi kuat
LFA-1-ICAM-2-dependent yang memediasi penangkapan. Demikian
pula, interaksi stabil LFA-1-ICAM-3 dapat diikuti interaksi transient DC-
SIGN-ICAM-3 dalam pembentukan infectious synapse antara DC dan
Sel T untuk memastikan aktivasi sel.

5. Kesimpulan

Karakteristik fungsional dari DC-SIGN mengindikasikan sebuah

peran sebagai molekul adhesi momen pertama dalam ekstravasasi.
Aktivasi sel T dan infeksi HIV-1. Dengan menggunakan cytoplasmic
deletion mutant dari DC-SIGN kami memaparkan reseptor tersebut
untuk bekerja sebagimana mestinya, ikatan ligand ICAM-3 dan gp120
pada struktur yang berlawanan tidak membutuhkan signaling melalui
ekor sitoplasmik. DC-SIGN juga memediasi signal outside-in yang
dibutuhkan tetapi tidak mengaktivasi LFA-1 dalam transfektan Raji-
DC-SIGN dan DC imatur. Dengan menggunakan K562 double
transfectan co-expressing DC-SIGN dan LF-1 kami memaparkan DC-
Sign untuk memfasilitasi ikatan ICAM-3 tetapi tidak untuk ICAM-1
kepada LFA-1 ketika molekul-molekul mengalami ko-lokalisasi didalam
cluster. Sehingga, DC-SIGN diperkirakan untuk memediasi adhesi
initial dan untuk menarik molekul adhesi lainnya seperti LFA-1 yang
mengambil alih ikatan menuju ligand DC-SIGN untuk membentuk
adhesi yang lebih stabil.

16