Investigador Responsable: Dra.

Ana María Adamo

Colaboradores: De Moliner, Karina L. (a cargo de los estudiantes)

Millanovich, Verónica L.
Aparicio, Evangelina
Milanesio, Berenice

Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y

Bioquímica. UBA. IQUIFIB-CONICET.

Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes

 Antecedentes
• El grupo de investigación con el cual trabajamos,
hace unos años, se interesó por estudiar la
importancia de la Ubicuitina en la degradación de
proteínas en el sistema nervioso central.
•
Sistema Nervioso
Las principales células de este sistema son las neuronas.

• Se subdivide en el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central. Este último

está constituido por el cerebro, el cerebelo, el tronco cerebral y la médula espinal.

• El sistema nervioso central tiene dos tipos de formaciones: La sustancia gris, y la sustancia
blanca, compuesta por las prolongaciones nerviosas, dendritas y axones.

• Las funciones del axón son el transporte tanto de organelas como de otros componentes
celulares y la conducción del impulso nervioso.

• Los axones están recubiertos por mielina.

Dendrita Axón Terminal

Nodo de Ranvier
Soma

Axón
Célula de Schwann
Núcleo Mielina
 Sistema Ubicuitina-
Proteosoma
El sistema Ubicuitina-proteasoma es un camino proteolítico caracterizado por
su alto grado de especificidad y selectividad. Este sistema está involucrado
en:

•La regulación del ciclo celular

•La diferenciación y el desarrollo
•La respuesta celular a efectos extracelulares y al estrés
•La modulación de los receptores de superficie celular y canales
iónicos
•La reparación del ADN
•La regulación de la respuesta inmune e inflamatoria
•La biogénesis de organelas
 Ub
Ub Ub
ATP
Ub Ub
E1
Ub Ub
E1
R-Ub

U
b
Ub
E2 Ub
Ub
E2 E3 Ub
U K
Sustrato
Proteico
Ub
E3
E3

U K
Sustrato
Proteico
 GAP-43
• La GAP-43 es una fosfoproteína específica de las neuronas.
• Está localizada en la superficie interna de la membrana plasmática.
• La función precisa de esta proteína no se conoce completamente pero
probablemente participe en los mecanismos de traducción de señales a
nivel de la membrana del terminal nervioso.
• El nivel de esta proteína está controlado por la estabilidad de su ARN
mensajero pero no se sabía nada acerca de su degradación.
• El grupo de investigación con el que estamos trabajando ha demostrado
que la GAP-43 es degradada vía el sistema Ubicuitina-proteosoma (Journal
of Neuroscience Research, 2005), sin embargo, no se conoce aún el sitio
subcelular donde se produce la conjugación de esta proteína con ubicuitina
para su posterior degradación.
 Microscopía Confocal

GAP-43 Ubicuitina Superposición

 Objetivo
• Poner a punto la técnica de fluorescencia por
complementación con el objeto de utilizarla para
estudiar la localización subcelular donde se lleva
a cabo la conjugación de la GAP-43 con
ubicuitina.
Nuestro Sistema
Plásmidos
 Amplificación de los
•
Plásmidos
Las colonias seleccionados se cultivaron durante toda la noche a 37ºC.
Purificación de los Plásmidos
 Electroforesis
• se hizo una electroforesis, tras una digestión enzimática, para
comprobar la presencia de los plásmidos en las muestras.

• Esto comprobó la presencia de los plásmidos en

las bacterias
 Cuantificación
• La cantidad total de ADN se realizó midiendo la absorbancia de
una alícuota de las soluciones conteniendo los plásmidos a 260
nm y a 280 nm. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular
la concentración de ADN. Una absorbancia igual a 1 corresponde a
una solución de 50 μg/ml. La concentración de ADN en la muestra
(μg/ml) es igual a 50 x A260 nm. El cociente de absorbancias
260/280 se utiliza para evaluar la pureza de la preparación. Un
cociente inferior a 1.8 indica que hay impurezas.
 Condiciones de la Transfección
Vectores: YN-Ub
Jun-CC

Linea celular: NIH 3T3

Agente utilizado para la transfección:

Lipofectamina.
 Cultivo Celular
• Para ver la degradación de la GAP-43 utilizamos células que no expresan
esta proteína, fibroblastos NIH-3T3.
• Se cultivaron a 37ºC, bajo atmósfera de 5% de CO2 en DMEM alta glucosa
conteniendo suero fetal bovino 10% v/v, antibióticos penicilina 50 U/ml y
estreptomicina 50 mg/ml.
 Transfección Transiente de la
Línea Celular Fibroblastos NIH-3T3
Diluir el ADN
en D-MEM

Diluir la
Lipofectamina
Lipido Complejo
en D-MEM
cationico ADN-Lípido

Incubar la ADN
mezcla 45 min.

Agregar los complejos

a las células en un
60-70% confluentes Fibroblastos
Incubar de
NIH-3T3
5 a 7 Hs..

Cambio de medio. D-MEM

alta glucosa, 10% SFB.
 Transfección de Células
• Se sembraron las células sobre cubreobjetos polilisinados.
• Se transfectaron con cada plásmido individualmente y se realizaron
cotransfecciones con ambos plásmidos.
• Después de 24hs en cultivo las células se observaron en un microscopio de
fluorescencia.
• Se pudo obtener una visualización directa de los
conjugados de Jun con ubicuitina en las células
transfectadas con ambas construcciones. En la imagen de
las células transfectadas con ambos plásmidos se observa
fluorescencia verde principalmente en el citoplasma que
rodea al núcleo. Por otro lado, las células transfectadas con
los plásmidos individualmente no muestran una
fluorescencia marcada y la distribución de la misma es
diferente a la de las células cotransfectadas.
 Conclusión
• Los resultados presentados demuestran que se cumplieron los
objetivos propuestos. La visualización de los conjugados de
ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas
generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen
inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando
anticuerpos específicos. Esta técnica tiene limitaciones ya que no
permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo.
• La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por
Deyu Fang y Tom K. Kerppola es una herramienta útil para la
visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Una
vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado
para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier
proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del
grupo de trabajo, este sistema podrá ser utilizado para
caracterizar la conjugación de GAP-43 con ubicuitina.
• Además, cabe destacar que se utilizaron técnicas de biología
molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y
compresión de diversos procesos celulares.