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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZNIA INSTITUTO DE CINCIAS AGRRIAS (ICA) GENTICA PROF. MNICA GUSMO

MARCADORES MOLECULARES

Andria Erdmann 20082009 Eraldo Tapajs 20082029 Giulia Venturieri 20082030 Larissa Soares 20082045 Mery Helen Moraes 20082062 Vitor Hugo Alexandrino 20082086

Jun./ 2009 Belm/PA

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZNIA INSTITUTO DE CINCIAS AGRRIAS (ICA) GENTICA PROF. MNICA GUSMO

MARCADORES MOLECULARES

Pesquisa

apresentada

disciplina de Gentica, ministrada pela professora Mnica Gusmo, para

obteno de nota integral do 2 NPC, do curso de Engenharia UFRA. Florestal da

Jun./ 2009 Belm/PA

NDICE

RESUMO ............................................................................................................................................... 3 ABSTRACT ........................................................................................................................................... 3 1. 2. INTRODUO ............................................................................................................................. 4 MARCADORES MOLECULARES NA AGROPECURIA ................................................... 5 2.1. 2.2. 2.3. 3. Histrico ................................................................................................................................. 5 Aplicaes de Marcadores de DNA no Melhoramento de Plantas ....................................... 7 Aplicaes na Agropecuria Moderna ................................................................................ 8

ISOENZIMAS ............................................................................................................................... 8 3.1. Vantagens e desvantagens das isoenzimas .......................................................................... 9

4.

POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIO RFLP 9 4.1. 4.2. 4.3. Obteno de sondas para deteco dos marcadores RFLP:............................................ 10 Vantagens e limitaes dos marcadores RFLP ................................................................. 10 Base gentica dos marcadores RFLP : .............................................................................. 11

5.

MARCADORES BASEADOS EM REAES DE POLIMERASE EM CADEIA ............. 12 5.1. 5.2. O processo do PCR.............................................................................................................. 12 Vantagens e desvantagens da tcnica de PCR .................................................................. 13

6.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, ou DNA Polimrfico Amplificado

Aleatoriamente) ................................................................................................................................... 15 7. AFLP (Amplified Frament Length Plymorphis, ou Polimorfismo de comprimento de

Fragmentos Amplificados) ................................................................................................................. 18 8. MARCADORES MICROSSATLITES OU SSR (Simple Sequence Repeats_Sequncia

Simples Repetida) ................................................................................................................................ 19 8.1. 9. 10. E Quais as vantagens?......................................................................................................... 20

CONCLUSO ............................................................................................................................. 21 REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................................. 22

RESUMO Marcadores moleculares so utilizados em melhoramento gentico de plantas e animais, por exemplo, permitindo o conhecimento da variabilidade gentica e identificao em nveis genticos intra e interespecficos. Desenvolveram-se tcnicas de marcadores moleculares devido incapacidade que, em muitos casos, o homem possui em determinar fatores genticos que identifiquem um tipo especfico de fentipo de interesse. Caractersticas como abundncia, insensibilidade aos fatores do ambiente e a presena do DNA em todas as clulas do grande vantagem aos marcadores moleculares de DNA, em relao a outros tipos. Desde os anos 70, e ao longo da historias, se desenvolveram tcnicas de maadores moleculares, como RFLP (polimorfismo de tamanho de restrio de fragmento), que em muitos casos vai servir para poder identificar um determinado gene ou seqncia gnica, PCR (Polymerase Chain Reaction) um mtodo de amplificao, de criao de mltiplas cpias, de DNA sem o uso de um organismo vivo, e tcnicas como RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) que se diferencia do PCR clssico que se utilizava de mais de um primer, quanto que o RAPD utiliza apenas um primer especifico.

ABSTRACT Molecular markers are used in genetic improvement of plants and animals, for example, allowing to the knowledge of the genetic variability and identification in genetic levels related. Techniques of molecular markers due to incapacity had been developed that, in many cases, the man possess in determining genetic factors that identify a specific type of phenotype of interest. Characteristics as abundance, no sensitivity to the factors of the environment and the presence of the DNA in all the cells give great advantage to the molecular markers of DNA, in relation to other types. Since 70, and throughout histories, if had years developed techniques of molecular markers, as RFLP (polymorphism of size of restriction of I break up), that in many cases it goes to serve to be able to identify to one definitive gene or gnica sequence, PCR (Polymerase Chain Reaction) is method of amplification, of creation of multiple copies, of DNA without use of organism alive, and techniques as RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) that it is differentiated of the classic PCR that if it more than used of primer, how much that the RAPD uses only one to primer I specify.

1. INTRODUO Os marcadores moleculares vem a ser todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento de DNA. Conceito de marcadores est ligado a incapacidade humana de definir com preciso determinado fator gentico que determina as caractersticas fenotpicas de seu interesse. Uma das formas de ser obter um marcador molecular seria observando uma caracterstica de fcil deteco, como a cor de flor, e relaciona essa caracterstica com outra de difcil determinao, como a resistncia a doenas. provvel que um gene que determina o carter qualitativo esteja localizado no mesmo grupo de ligao do gene que governa a resistncia, desse modo, qualquer fragmento de DNA que esteja prximo ao gene de resistncia poderia ser utilizado como marcador, ou marcador molecular. Em relao a outros tipos de marcadores, os marcadores moleculares possuem certas vantagens por serem muito abundantes, insensveis a fatores do ambiente e o fato do DNA estar presente em todas as clulas do organismo. A idia de que os cromossomos contm as unidades informacionais transferidas de uma gerao para a outra foi proposta ainda no sculo XIX. Entretanto, a identificao e descrio do DNA como a molcula que contm esta informao s ocorreu na primeira metade do sculo XX. Cada cromossomo contm uma longa e nica molcula de DNA, alm de protenas que atuam no empacotamento desta molcula. As tecnologias de anlise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referncia nos cromossomos, tecnicamente denominados marcadores moleculares. A tecnologia de DNA recombinante e o desenvolvimento da amplificao de segmentos de DNA via PCR (polimerase em cadeia), abriram o caminho para uma mudana no paradigma gentico bsico: da inferncia do gentipo a partir do fentipo, onde Mendel foi pioneiro para a anlise direta da variao na sequncia de DNA. Os vrios tipos de marcadores moleculares se dividem em dois grupos: hibridizao ou amplificao de DNA. Entre os identificados por hibridizao esto os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; Botstein et al., 1980) e minissatlites ou locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats; Jeffreys et al., 1985). J aqueles revelados por amplificao incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Williams et al., 1990); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence

Tagged Sites) (Paran & Michelmore, 1993); Microssatlite (Litt & Lutty, 1989); e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Vos et al., 1995). O exemplo de tcnica de hibridizao o RFLP que consiste na fragmentao atravs do uso de enzimas de restrio e hibridizao desses fragmentos com seqncias homlogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia. Na amplificao de DNA, temos como exemplo o polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) ou AP-PCR (Arbitrarily Primed - PCR) surgiu com a idia de se utilizarem iniciadores mais curtos e de seqncia arbitrria para dirigir a reao de amplificao, eliminando assim a necessidade de conhecimento prvio da seqncia, no caso do PCR. O resultado dessa amplificao essencialmente a gerao de impresses digitais genmicas simples e reprodutveis para a identificao de linhagens em gel de eletroforese.

2. MARCADORES MOLECULARES NA AGROPECURIA 2.1. Histrico

A utilizao dos conhecimentos de gentica quantitativa por nomes como Shull, Jones e East revolucionou a indstria agrcola no incio do sculo (Halluer & Miranda, 1988), atravs do desenvolvimento de hbridos de milho. A integrao de disciplinas como fsica, biofsica, bioqumica e gentica resultou, entre outros avanos, na descoberta do DNA como material bsico constituinte dos genes, e culminou no desenvolvimento da biologia molecular (Goodenough, 1984). Recentemente, o desenvolvimento de mtodos rotineiros de clonagens, sequenciamento, avaliao da expresso gnica, e de anlise estatstica e computacional, vem oferecendo possibilidades sem precedentes no estudo de gentica. O uso de marcadores em gentica e melhoramento remonta ao incio do sculo, quando em um estudo com ervilhas, Bateson e Punnett indicaram a possibilidade de existncia de reduplicao (mais tarde rebatizada de ligao) entre genes controlando os caracteres cor da ptala e forma do gro de plen (Bateson e Punnett, 1905). Thomas Hunt Morgam foi o primeiro a demonstrar claramente que havia uma exceo a um dos postulados de Mendel, isto , que nem todos os genes tm segregao independente. Pelo contrrio, esto ligados em grupos pelo mesmo filamento de material em que residem, os cromossomos (Morgam, 1910). Seu pupilo, A. H. Sturtevant, em 1913, expandiu estas idias e foi pioneiro no desenvolvimento do primeiro mapa gentico, o da mosca-de-fruta Drosophila. Em se tratando

de plantas, um dos primeiros mapas a ser desenvolvido foi o de milho, em 1933e logo depois o de tomate, em 1934. O advento de tcnicas moleculares baseadas na anlise de polimorfismo de enzima e mais tarde de fragmentos de DNA, possibilitou a rpida proliferao do uso de marcadores moleculares no estudo de aspectos bsicos de gentica vegetal bem como em programas de melhoramento gentico. Vrias aplicaes foram imediatamente sugeridas, como a sinalizao de caracteres por marcadores, com imediato uso em introgresso gnica; o rpido desenvolvimento e saturao de mapas genticos com mltiplas aplicaes em gentica e melhoramento; ou a associao de marcadores com regies do genoma que controlam caracteres quantitativos. Deste conjunto de idias bsicas nasceu a possibilidade de se utilizar marcadores moleculares em programas de melhoramento gentico, quer para caracteres qualitativos como quantitativos, seja em pesquisa bsica ou aplicada. O melhoramento de plantas tem tido papel fundamental no desenvolvimento da agricultura, gerando novas variedades em espcies de interesse agronmico. O aumento na eficincia de seleo, o melhor conhecimento e caracterizao do germoplasma e a maximizao dos ganhos genticos tm sido objetivos de melhoristas de plantas do mundo inteiro. Os melhoristas de plantas tm tradicionalmente selecionado variabilidade com base no fentipo (aparncia de um indivduo). Esta estratgia tem sido de sucesso para caractersticas de alta herdabilidade (fentipo reflete a constituio gentica do indivduo), mas nem sempre para caractersticas de baixa herdabilidade (fentipo pode no refletir o gentipo). Pelo fato de a maioria das caractersticas selecionadas no melhoramento de plantas ser de natureza quantitativa, estratgias como teste de prognies e seleo em geraes avanadas tm sido utilizadas para minimizar as dificuldades da seleo. Estas, contudo, no diminuem ou evitam os efeitos da interao gentipo x ambiente, que podem mascarar o fentipo. Este a expresso do gentipo (constituio gentica de um indivduo) sob condies ambientais especficas, e assim pode mudar. Desta forma, selecionar o fentipo como perseguir um alvo mvel, que muda com o ambiente. Uma forma de evitar este problema seria selecionar indivduos superiores com base no gentipo, pois este independe do ambiente e no muda durante o ciclo de vida de um indivduo. Embora isto parea difcil, novas tecnologias esto disponveis que permitem ao melhorista acessar e selecionar variabilidade a nvel de DNA.

2.2.

Aplicaes de Marcadores de DNA no Melhoramento de Plantas

As etapas fundamentais de um programa de melhoramento de plantas so: obteno da variabilidade gentica; seleo de indivduos superiores; e avaliao de materiais genticos promissores para lanamento comercial. Apesar de ganhos genticos significativos terem sido obtidos na seleo de caractersticas de interesse na maioria das espcies de importncia agronmica, a expectativa de progresso gentico e obteno de indivduos ainda melhores permanece. Por esta razo, os melhoristas de plantas tm buscado formas de continuar obtendo ganhos genticos, tornando cada vez mais eficiente cada uma das etapas do programa. A essncia deste progresso est em o quanto o fentipo de um indivduo expressa o seu gentipo. Por isso que o uso de marcadores moleculares pode auxiliar o melhoramento de plantas, pois possibilita acessar diretamente o gentipo de um indivduo. Assim, entre as principais aplicaes de marcadores de DNA em programas de melhoramento de plantas esto: o monitoramento e organizao da variabilidade gentica; a seleo assistida por marcadores moleculares; e a proteo de cultivares (Lee, 1995). Cabe salientar, contudo, que estas aplicaes no devem ser generalizadas a todos os programas de melhoramento, e no tero a mesma importncia em todas as espcies de plantas. Isso porque o modo de reproduo, as caractersticas de interesse, o valor da unidade de seleo, o progresso gentico j obtido e outros aspectos pertinentes variam grandemente entre espcies e programas de melhoramento. Por isso, identificar as caractersticas de interesse e estabelecer objetivos claros para um programa de melhoramento so passos que precedem a questo: como os marcadores de DNA podem auxiliar o programa? Como outras tecnologias, os marcadores moleculares tero grande impacto e utilizao em algumas situaes, mas no em todas. Assim, cabe aos melhoristas junto com os especialistas na rea molecular decidirem caso a caso se devem ou no utilizar esta tecnologia. Para tomar esta deciso, contudo, necessrio vislumbrar o potencial de aplicao dessas tcnicas, o qual discutiremos a seguir. Responder a questo como os marcadores moleculares podem auxiliar o melhoramento de plantas? no difcil. O difcil e nem sempre claro responder quando, em que situaes, utilizar marcadores moleculares?. Em termos de variabilidade gentica, marcadores moleculares permitem: compreender e organizar a variabilidade gentica de um programa de melhoramento de forma nica, isto , acessando variabilidade de DNA, que no influenciado pelo ambiente como so, por exemplo, os caracteres morfolgicos e fenotpicos em geral de uma planta. A primeira conseqncia disto a possibilidade de planejar os cruzamentos de um programa de forma a maximizar as diferenas genticas entre gentipos

elites, diferenas essas que muitas vezes no podem ser observadas a nvel de fentipo. A segunda a possibilidade de organizar o germoplasma do programa em pools gnicos, facilitando a escolha e diminuindo o nmero de combinaes a serem feitas pelo melhorista.

2.3.

Aplicaes na Agropecuria Moderna

A anlise de DNA, hoje rotina em programas avanados de melhoramento de plantas e animais em diversos pases do mundo, fornece a mais alta preciso na identificao individual e estudos de vnculo gentico, transformando-se em uma ferramenta complementar do melhoramento para a seleo de indivduos superiores. Marcadores moleculares tm essencialmente duas grandes aplicaes na agropecuria de preciso: Fornecem perfis genticos nicos de elevada preciso e reprodutibilidade tambm denominados "fingerprints" ou impresses digitais de DNA que individualizam geneticamente plantas ou animais para fins de proteo varietal, bem como permitem discriminar com absoluta certeza seus descendentes diretos Fornecem pontos de referncia em genomas complexos que podem ser utilizados em geraes de melhoramento como marcadores diagnsticos de distncia ou diversidade gentica, ou ainda como marcadores selecionveis ligados a genes de interesse agropecurio, facilitando e acelerando os processos convencionais de seleo e recombinao de indivduos superiores

3. ISOENZIMAS O termo isoenzima define um grupo de mltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorrem em uma espcie, como resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas de acordo com Moss, 1982, citado por Ferreira & Grattapaglia, 1995. As isoenzimas tm sido utilizadas no estudo de disperso de espcies, na anlise de filogenias, no melhoramento de plantas possibilitando a deteco de ligao gnica com caracteres mono e polignicos, identificao de cultivares, introgresso gnica, avaliao de germoplasma e, de forma mais limitada, na seleo indireta de caracteres agronmicos (Borm, 1997; Ferreira e Grattapaglia, 1998). As isoenzimas desempenham a mesma atividade cataltica, mas podem ter diferentes propriedades cinticas e podem ser separadas por processos bioqumicos. O nmero de isoenzimas de determinada enzima est relacionado ao nmero de compartimentos subcelulares onde a mesma reao cataltica realizada (Gottlieb, 1982, citado por FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).

O princpio bsico da tcnica reside no uso de eletroforese geralmente em gel de amido (Smithies, 1955) e na visualizao do produto enzimtico por mtodos histoqumicos (Hunter & Markert, 1957). A anlise isoenzimtica envolve basicamente trs etapas: Extrao de protenas do tecido vegetal Separao destas protenas atravs de eletroforese e colorao histoqumica do gel O que permite a visualizao do produto em forma de uma banda. 3.1. Vantagens e desvantagens das isoenzimas

As isoenzimas fornecem ampla informao gentica para diversas aplicaes. uma tcnica relativamente barata e acessvel, que, embora em pequeno nmero, mais de um loco isoenzimtico pode ser analisado rpida e simultaneamente. Por isso, mesmo hoje, com tcnicas mais modernas, as isoenzimas continuam sendo uma classe de marcadores muito til para anlises genticas que no requeiram amostragem ampla do genoma. Alelos isoenzimticos so co-dominantes, isto , gentipos heterozigotos e homozigotos de determinado loco so facilmente identificados, permitindo estimar parmetros como freqncias genotpicas e allicas e, a partir destes, coeficientes de diversidade gnica e heterozigosidade (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). A desvantagem que quando a investigao requer cobertura mais ampla do genoma, como no caso de mapeamento gentico ou caracterizao detalhada de germoplasma, as isoenzimas apresentam duas limitaes bsicas: o nmero total de locos que podem ser detectados no genoma e o nmero de alelos por loco. Outras limitaes das isoenzimas como marcadores so: modificaes ps-traduo das enzimas, produzindo as isoenzimas conformacionais, as quais diferem em estruturas secundrias e tercirias; polimorfismo enzimtico em resposta a condies ambientais; diferenas na atividade isoenzimtica associadas a estdios diferentes de desenvolvimento, dentre outras (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; BORM, 1997)

4. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIO RFLP Por RFLP entende-se o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA, que evidenciado pela fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio e observado por hibridizao destes fragmentos com sequncias homlogas de

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DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia. Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas. H 25 anos os marcadores RFLP foram estudados pela primeira vez em um experimento destinado detectao de mutaes em DNA de vrus. Em pouco tempo estes marcadores tornaram-se ferramenta importante em vrias reas de biologia e tm sido utilizados para aprofundar o conhecimento de diferentes temas biolgicos. RFLP constitui uma das classes de marcadores moleculares mais amplamente utilizadas em gentica e melhoramento de plantas.

4.1.

Obteno de sondas para deteco dos marcadores RFLP:

Os clones a serem utilizados como sondas podem ser obtidos de muitas formas, as mais comuns sendo: _ Atravs da transcrio reversa de mRNA do organismo em estudo, produzindo-se uma biblioteca de molculas de DNA complementar. _ Atravs de fragmentos de DNA genmico clonados ao acaso. _ Atravs da amplificao via PCR de sequncias conhecidas utilizando primers especficos. _ Atravs de bandas RAPD selecionadas e obtidas de gel de eletroforese e amplificadas via PCR.

Na seleo dos clones que sero utilizados como sondas, objetiva-se selecionar os clones que no contenham sequncias de DNA repetitivo. Sondas contendo sequncias de moderadamente repetidas no genoma so muito teis na obteno da impresso digital gentica, especfica para cada indivduo.

4.2.

Vantagens e limitaes dos marcadores RFLP

Os marcadores RFLP cobrem todo o genoma do organismo, o uso de RFLP aumenta, portanto, a probabilidade de se encontrar associaes significativas entre marcadores e genes. Os marcadores RFLP, possuem expresso co-dominante, o que torna possvel identificar em cada loco estudado gentipos heterozigotos e homozigotos, gerando mais informao a nvel gentico, permitindo uma anlise detalhada da ao gnica e interao entre alelos em estudos de mapeamento e caractersticas qualitativas.

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Marcadores RFLP mostro variao gnica na sequncia de nucleotdeos de regies que codificam produtos gnicos. O nmero de marcadores RFLP praticamente ilimitado. Marcadores baseados em DNA tem alta estabilidade, podendo ser extrado e conservado e reutilizados por longos perodos de tempo. A tcnica de marcadores moleculares utilizada tem de ser extremamente eficiente na gerao de dados e possa em algum momento ser automatizada , a tcnica de RFLP apresenta uma sria limitao neste aspecto, uma vez que envolve vrios passos intensivos em mo de obra. Inexistncia de uma biblioteca de sondas disponvel, ou seja somente depois da obteno das sondas adequadas , possvel iniciar qualquer tipo de anlise gentica. O uso de RFLP requer pessoal tcnico especializado na manipulao de DNA recombinante,instalaes adequada ao manuseio e djeto de material radioativo. . Outra caracterstica de marcadores de DNA em relao a isoenzimas a alta estabilidade do DNA, que pode ser extrado, conservado e reutilizado por longos perodos de tempo. As membranas de hibridizao tambm podem ser conservadas e reutilizadas por 15 ou mais vezes, o que assegura que o processo de obteno das mesmas seja compensado por seu prolongado uso.

4.3.

Base gentica dos marcadores RFLP :

O polimorfismo observado na tcnica de RFLP ocorre porque o DNA de indivduos geneticamente distintos difere na sequncia de nucleotdeos ao longo da fita. Ao ser submetido clivagem com uma enzima de restrio, o DNA de indivduos geneticamente distintos cortado nos stios de retrio, gerando fragmentos de diversos tamanhos. A base gentica do polimorfismo observado resulta de mutaes nos stios de restrio ou de inseres, delees e rearranjos entre estes stios. A tcnica de RFLP desenvolve-se na seguinte ordem, aps a extrao, o DNA dos indivduos tratado com enzima de restio, que o corta em um grande nmero de pomtos (stios de restrio), gerando uma grande quantidade de fragmentos, dependendo do tamanho do genoma. As diferenas na sequncia de DNA dos indivduos resulta na clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que so separados atravs de eletroforese em gel de agarose. As diferenas nos tamanhos dos fragmentos no podem ser visualizadas diretamente no gel. Para efetuar a deteco dos marcadores RFLP, os fragmentos separados no gel pela

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eletroforese so transferidos para uma menbrana de nylon ( ou nitrocelulose ) por capilaridade ou vcuo atravs de um processo denominado Southern Blot. Como a menbrana colocada sobre o gel, a ordem dos fragmentos separados por eletroforese mantida na transferncia , depois os fragmentos so fixados covalentemente na menbrana atravs de alta temperatura em, forno vcuo ou comluz ultra-violeta. Por fim a visualizao de fragmentos polimrficos entre os inmeros fragmentos transferidos para a menbrana feita atravs da hibridizao de pequenos fragmentos clonados de DNA denominados sondas, com sequncias homlogas do DNA imobilizado na menbrana, assim somente os fragmentos fixados na menbrana que so homlogos ao DNA da sonda sero visualizados entre os milhares de fragmentos resultantes do corte com enzima de restrio.

5. MARCADORES BASEADOS EM REAES DE POLIMERASE EM CADEIA A tecnologia da PCR foi concebida em meados da dcada de 80 (Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985). Desde ento causou uma revoluo na biologia e na pesquisa, visando o entendimento dos processos biolgicos fundamentais na rea de melhoramento gentico de plantas e animais domsticos. Uma vez que essa tcnica possibilitou a gerao de grandes quantidades de segmentos especficos de DNA in vitro pela ao de DNA polimerase, podendo ser facilmente detectados a olho nu em gel de eletroforese atravs de corantes especficos. O PCR deu origem a vrias variaes, uma das variaes desta tcnica o RAPD.

5.1.

O processo do PCR

Uma quantidade pequena de DNA genmico (cerca de 10ng) colocada em um tubo de ensaio ao qual so adicionados uma soluo-tampo contendo magnsio, dois primers especficos, os quatro desoxinucleosdeos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) e a enzima de DNA polimerase. O tubo colocado em um termociclador e submetido a vrios ciclos de amplificao de 30 a 40 ciclos (Viana et al.,2003).

O ciclo de PCR envolve trs etapas, em cada etapa deve-se esperar 1min para que a prxima etapa comece. Desnaturao (em alta temperatura 94C). Anelamento (a temperatura deve ser reduzida rapidamente para 35C a 60C, dependendo do tamanho e seqncia do primer utilizado, permitindo a hibridizao DNADNA de cada primer com as seqncias complementares que flaqueiam a regio alvo).

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Extenso (temperatura novamente elevada a 72C, a enzima polimerase realiza a extenso a partir de cada terminal 3`OH dos primers. Esta extenso envolve a adio de nucleotdeos utilizando como molde a seqncia-alvo, de maneira que uma cpia desta seqncia feita no processo, esse processo se repete por algumas dezenas de vezes sempre dobrando a quantidade j existente).

5.2.

Vantagens e desvantagens da tcnica de PCR

O PCR permite que a amplificao da cadeia seja feita mesmo em quantidades mnimas de DNA (ordem de picograma 10-12g ou nanograma 10-9g) e termina a reao com grande quantidade de DNA da seqncia especifica alvo (Viana et al.,2003). A desvantagem desse processo a necessidade do conhecimento prvio das seqncias de nucleotdeos que flanqueiam a seqncia de DNA de interesse. Em vista disso, o PCR apresenta-se de inicio como uma tcnica invivel para a obteno de marcadores moleculares, com exceo de alguns genes de seqncia j conhecida (Viana et al.,2003). Para se conhecer o sequenciamento gentico necessrio clonagem e depois sequenciamento, geralmente utiliza-se RFLP para o sequenciamento da regio. O primeiro teste de PCR foi feito com uma seqncia de DNA comum E. coli. No entanto, a enzima no suportava as altas temperaturas da etapa de desnaturao. O processo s passou a ser vlido quando foi testado em DNA polimerae extrada de uma bactria termoflica, a Thermus aquaticus, tornando possvel a automatizao do processo e a sua popularizao (Viana et al.,2003) Essa metodologia vem sendo utilizada por vrios pesquisadores como ferramenta para estudar polimorfismos entre diferentes microorganismos (Villa et al., 1995; Vago et al., 1996; Gomes et al., 1997; Lages-Silva et al., 2002; Oliveira et al., 2003). A utilizao do marcador molecular gentico PCR bastante acentuado no setor agronmico, porm no setor florestal os marcadores que mais se destacam so os RFLP e o RAPD (CNCIO,et al.,1995; Ccio, 1995; Esbrisse, 1995; Lima, 1996).

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Imagem 1. Etapas principais da tcnica de PCR

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6. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, ou DNA Polimrfico Amplificado Aleatoriamente) Uma tcnica que foi desenvolvida no final da dcada de 80. O grande avano na rea de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990, com a idia de utilizar primers mais curtos e de sequncia arbitrria para dirigir a reao de amplificao, eliminando assim a necessidade do conhecimento prvio de sequncia. Diferentemente do PCR clssico, essa tcnica no requer o conhecimento prvio da regio a ser amplificada, para o desenho dos primers. No RAPD utilizado um primer nico, de aproximadamente 10 nucletdeos. A tcnica no contexto da anlise Mendeliana, demonstra a identificao de marcadores genticos para melhoramento. Alm de facilitar e acelerar os estudos que j ocorriam com as espcies tradicionais (ex: milho, tomate, arroz) a tecnologia RAPD permitiu a realizao de estudos em espcies anteriormente no contempladas. As aplicaes incluem: (1) Obteno de fingerprints (impresses digitais) genmicos de indivduos,

variedades e populaes; (2) Anlise da estrutura e diversidade gentica em populaes naturais, populaes de melhoramento e bancos de germoplasma; (3) Estabelecimento de relacionamentos filogenticos entre diferentes espcies; (4) Construo de mapas genticos de alta cobertura genmica e a localizao de genes de interesse econmico. Para que haja amplificao de um fragmento RAPD no genoma, duas sequncias de DNA complementares ao primer arbitrrio devem estar suficientemente adjacentes (< 4000 pares de bases) e em orientao oposta, de maneira a permitir a amplificao exponencial de um segmento de DNA pela DNA polimerase. Em funo da grande quantidade de DNA produzido, este segmento pode ser visualizado na forma de banda num gel de eletroforese. Cada primer arbitrrio dirige a sntese de vrios segmentos de DNA simultaneamente em diversos pontos do genoma, resultando em vrias bandas no gel. Dados exerimentais de mapeamento gentico em diversas espcies indicam que os locos de marcadores RAPD esto distribudos ao acaso ao longo do genoma, sem evidncias de agrupamento de marcadores em regies especficas. As sequncias internas dos segmentos amplificados pertencem a todas as classes de abundncia de DNA no genoma, desde sequncias de cpia nica at altamente repetitivas. A competitividade de um stio de amplificao arbitrria determinada pela homologia com o primer utilizado. Claramente, segmentos RAPD so amplificados mesmo que a

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homologia entre os stios de iniciao e o primer no seja perfeita. O pareamento perfeito na extremidade 3 do primer, a partir da qual a polimerizao inicia, parece ser mais crtico que o pareamento na extremidade 5. Algum nvel de no homologia permitido, o que varia com a composio de bases. Pareamento CG so mais estveis que AT, o que afeta diretamente o tempo de residncia do primer no stio de iniciao da amplificao. Se este tempo for muito curto, a estabilizao do pareamento do primer com o stio de iniciao no DNA molde ser prejudicado. Como resultado, o segmento poder no ser amplificado, gerando em uma banda fraca no gel. Uma caracterstica fundamental dos marcadores RAPD o fato deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominncia neste caso no se refere ao conceito clssico de interao gnica entre alelos, e sim do ponto de vista da interpretao relativa entre gentipo e fentipo de um indivduo. Ao se observar uma banda RAPD no gel, no possvel distinguir se aquele segmento se originou a partir de uma ou duas cpias da sequncia amplificada. A tcnica RAPD detecta apenas um alelo em cada loco. A ausncia de banda representa o conjunto de todos os outros alelos daquele loco que no podem ser amplificados. Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam um comportamento dominante, existe a possibilidade de se amplificar marcadores co-dominantes, ou seja, amplificar ambos os alelos de um loco. A tcnica de PCR consiste numa reao em que uma pequena e especfica regio do genoma submetida hibridao pela sntese da Polimerase do DNA. A PCR ocorre em vrios ciclos, onde, em cada um deles, a cadeia especfica teoricamente dobra de tamanho. Abaixo est representado um ciclo de uma PCR, onde a polimerase do DNA uma esfera verde, a cadeia "antiga" azul, um primer azul claro e o outro verde, os nucleotdeos so vermelhos, assim como a cadeia sintetizada no presente ciclo:

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Atualmente esto disponveis comercialmente mais de 1.000 diferentes tipos de primers de 10 nucleotdeo cada um, o que permite a amplificao de grande nmero de fragmentos do genoma. Cada um desses fragmentos potencialmente um marcador molecular. Vantagens e limitaes dos marcadores RAPD: Alm das vantagens j mencionadas, a tcnica de RAPD se baseia na amplificao do DNA, o que resulta em vrias vantagens prticas, que podem ser resumidas em simplicidade e rapidez. A obteno de dados pelo menos duas ordens de magnitude mais rpida que a tcnica de RFLP, que baseada na hibridizao do DNA. Por no utilizar sondas, eliminada a necessidade de istopos radioativos ou marcao no radioativa. Outra grande vantagem, a quantidade mnima de DNA necessria para a anlise genotpica de um indivduo (da ordem de dezenas de nanogramas). Permite ainda, gerar uma grande quantidade de polimorfismo de segmentos de DNA, distribudos por todo o genoma do organismo, oferecendo a possibilidade de amostrar regies de DNA repetitivo, uma vez que os primers utilizados para a deteco de variao ao nvel de DNA so arbitrrios, ao contrrio das sondas RFLP que so pr-selecionadas para regies de cpia nica. Esta tecnologia tambm adequada para a construo de mapas

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genticos ao nvel intra-especfico. RAPD rene, portanto, a simplicidade da visualizao direta dos marcadores de DNA. O uso desta, no requer experincia aprofundada em biologia molecular e nem tampouco instalaes sofisticadas de laboratrio. uma tecnologia bastante acessvel. No entanto, a principal limitao dos marcadores RAPD o baixo contedo de informao gentica por loco. Apenas um alelo detectado, o segmento que amplificado, enquanto que as demais variaes allicas so classificadas conjuntamente como um alelo nulo. Gentipos heterozigotos no podem ser diretamente discriminados dos homozigotos por RAPD, esta limitao comumente descrita como dominncia dos marcadores. Outra limitao o desconhecimento prvio da base gentica das bandas RAPD. Uma banda RAPD observada no gel s pode ser considerada um marcador de comportamento Mendeliano depois de verificada sua segregao de parentais para descendentes.

7. AFLP (Amplified Frament Length Plymorphis, ou Polimorfismo de comprimento de Fragmentos Amplificados) A anlise de AFLP representa uma tecnologia recente para a obteno de um grande nmero de marcadores moleculares distribudos em genomas de pro e eucariotos. O ensaio de AFLP combina a especificidade, resoluo e poder de amostragem da digesto com enzimas de restrio com a velocidade e praticidade de deteco do polimorfismo via PCR. Desde seu desenvolvimento (Zabeau, 1993), esta tcnica tem sido utilizada de forma crescente para finalidades de fingerprinting, mapeamento gentico localizado e construo de mapas genticos, principalmente em espcies de plantas cultivadas que apresentam uma baixa taxa de polimorfismo de DNA. Base gentica e deteco de marcadores AFLP: A anlise de AFLP consiste em quatro etapas. Na primeira etapa, o DNA genmico total do indivduo clivado com duas enzimas de restrio. Na segunda, adaptadores especficos so ligados aos terminais dos fragmentos genmicos gerados pela clivagem. Na terceira etapa, uma frao dos fragmentos gerados amplificada seletivamente via PCR, utilizando primers especificamente desenhados para reconhecer sequncias nos adaptadores. Na quarta e ltima etapa, a subpopulao de fragmentos amplificados separada em gel de alta resoluo. Vantagens e limitaes dos marcadores AFLP: A vantagem que mais destaca esta tecnologia das demais o grande nmero de fragmentos que so gerados e resolvidos num nico gel. O ndice de multiplex do ensaio AFLP, ou seja, o nmero de marcadores

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simultaneamente analisados em um nico gel, o mais alto entre as tecnologias disponveis. A tcnica de AFLP , portanto, muito eficiente na amostragem ampla e simultnea de um genoma. A segunda vantagem o grande poder de deteco de variabilidade gentica, que explora simultaneamente o polimorfismo de presena e ausncia de stios de restrio, tal como no ensaio de RFLP, e a ocorrncia ou no de amplificao a partir de sequncias arbitrrias, tal como no ensaio de RAPD. Consegue-se com isso uma flexibilidade significativa na obteno de marcadores polimrficos. Outra vantagem a maior robustez do ensaio AFLP quando comparado com o ensaio RAPD. Isto se deve basicamente ao fato de que primers bem mais longos so utilizados na etapa de PCR, o que aumenta significativamente a especificidade da amplificao, evitando com isso a competio que ocorre durante a PCR no ensaio RAPD. AFLP rene, portanto, a vantagem da PCR especfica com a vantagem da RAPD em se explorar sequncias arbitrrias. De forma anloga aos marcadores RAPD, a principal limitao dos marcadores AFLP o baixo contedo de informao gentica por loco. Apenas um alelo detectado, ou seja, o fragmento que amplificado. As demais variaes allicas so classificadas como um alelo nulo. Marcadores AFLP so, portanto, marcadores dominantes e os dados tm natureza binria. A anlise de marcadores AFLP envolve um maior nmero de etapas do que a anlise RAPD. Uma maior quantidade de reagentes necessria juntamente com maior nmero de equipamentos de biologia molecular. O DNA necessrio deve ser mais puro, o que demanda protocolos de extrao mais elaborados. So necessrias etapas de digesto enzimtica e ligao de adaptadores. Em outras palavras, a digesto parcial ou m qualidade do DNA pode facilmente levar a interpretaes errneas do polimorfismo.

8. MARCADORES MICROSSATLITES OU SSR (Simple Sequence Repeats_Sequncia Simples Repetida) Entre os marcadores moleculares disponveis atualmente, os microssatlites destacam-se por ser uma classe altamente informativa e de fcil utilizao para a anlise gentica. So utilizados de formas diversas com vrias aplicaes. Apesar da disponibilidade de um grande volume de seqncias genmicas em bancos de dados, a maioria das espcies de plantas, animais e microrganismos precisa desse tipo de informao.

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No incio dos anos 80 vrios experimentos que mostravam que o genoma de indivduos eucariotas so abarrotados de classes de sequncias repetidas; ento foram chamadas de Sequncia Simples Repetida (SSR), mais tarde tambm foram denominadas de microssatelites. Os Microssatlites foram observados em vrios organismos. Nas plantas foi descoberto que os stios de microssatlites so largamente distribudos com uma frequncia de microssatlites uma a cada 50 mil pares de bases. Sua presena foi constatada em 34 espcies vegetais, sendo que o elemento repetido mais comum foi o di nucleotdeo AT. E ainda tem sido utilizado no di-nucleotdeo mapeamento gnico de diversas culturas. nico Cada ilha microssatlite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc.) compe um loco gentico altamente varivel, com vrios alelos, e muita informao. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco. alelo As sequncias SSR so detectadas por PCR feita em gel de eletroforese utilizando utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta resoluo. A visualizao das bandas no gel pode ser feita diretamente por colorao com brometo de etdio, nitrato de prata ou atravs de autoradiografia ao se utilizar primers marcados com radioistopos na reao de PCR. Cada loco de microssatlite analisado ao se utilizar o para de primers construdo especificamente para sua amplificao. Mais do que um loco pode ser analisado de cada vez quando os alelos que de cada loco tm tamanhos suficientemente diferentes e migram para zonas separadas no gel. Nestes mtodos de genotipagem denominados multiplex, mais do que um par de primers especficos utilizado simultaneamente na mesma reao de PCR. Locos SSR parecem ser o estveis, possuem expresso co dominante, ou seja, ambos os alelos de um indivduo co-dominante, heterozigoto so visualizados e so altamente multiallicos, numa populao onde potencialmente todos os alelos daquele loco podem ser detectados e discriminados. alelos

8.1.

E Quais as vantagens?

Esses marcadores so os que possuem o mais elevado contedo de informao de polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares. Por causa disso, toda e qualquer populao segregante pode ser utilizada como populao referncia para estudos de ligao e regante mapeamento gentico. Assim, a escolha da populao para mapeamento no mais precisa ser feita com base na distncia gentica, mas visando a populao mais informativa do ponto d de vista das caractersticas biolgicas ou econmicas de interesse. Os SSR so muito mais

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frequentes e distribudos ao acaso, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma eucarioto. Com sua importancia, o nvel de recursos e o nmero de laboratrios envolvidos foram desenvolvidos milhares de marcadores SSR como parte do projeto de mapeamento do genoma humano. Entretanto, a maior limitao da tecnologia microssatlites a grande quantidade de trabalho necessrio para o desenvolvimento prvio dos marcadores. A limitao bsica que existe hoje para a aplicao mais ampla desta tecnologia na anlise gentica e melhoramento de plantas refere-se grande quantidade de trabalho envolvida, exigindo pessoal especializado e equipamento sofisticado para o sequenciamento automtico aliado ao alto custo de um empreendimento desta natureza. Alm disso, para vrias espcies de plantas, principalmente de hbito algamo, o elevado nvel de diversidade gentica no DNA, detectvel com tcnicas mais acessveis, no justifica o investimento necessrio para o desenvolvimento de marcadores MICROSSATLITES.

9. CONCLUSO A tendncia que as tcnicas avancem a tal ponto em que os diagnsticos no sero dados baseados num marcador deste ou daquele loco, mas da sequncia completa de DNA, ou de locos especficos. Alm disso, com tantos marcadores, qual utilizar? De acordo com os padres tcnicos de cada espcie, os recursos financeiros e o tempo disponvel ser escolhido o melhor mtodo para cada ocasio.

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10. REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS

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