Jika dalam analisis suatu unsur tidak memenuhi Hukum Beer, maka absorbansi tidak setara dengan konsentrasi.

Yaitu :

Untuk mengetahui apakah suatu unsur memenuhi Hukum Beer atau tidak maka perlu ditentukan grafik kalibrasi absorbansi vs konsentrasi. Hukum Beer hanya dapat dipenuhi jika dalam range (cakupan) konsentrasi hasil kalibrasi berupa garis lurus, jadi kita hanya bekerja pada linear range. Seringkali sampel yang dianalisa akan memiliki absorbansi yang lebih tinggi dari pada larutan standar. Jika kita berasumsi bahwa kalibrasi tetap linier pada konsentrasi yang lebih tinggi

Gambar 15.11. Kurva standar yang memenuhi hukum Lambert Beer dengan cara yang ramalan kalibrasi yang linier [itu]. Hal ini tidak boleh diilakukan karena bagaimanapun, ketika kita tidak bisa mengetahui apakah hukum Beer masih terpenuhi pada konsentrasi yang lebih tinggi. Jika Hukum Beer tidaklah terpenuhi pada konsentrasi yang lebih tinggi, hasil dari pengukuran akan merupakan suatu kesalahan besar ( ketelitian sangat kecil) Sekalipun standar lebih lanjut disiapkan dan kurva dicoba ke data, ketepatan dari hasil akan sangat lemah dalam kaitan dengan ketidak-pastian di (dalam) membaca konsentrasi dari kurva.

Gambar 15.12. Kurva standar yang tidak memenuhi Hukum Lambert Beer Oleh karena itu, larutan yang memiliki absorbansi lebih tinggi dari larutan standar harus diencerkan sampai memenuhi konsentarasi larutan standar yang telah ada.

Gambar 15.13. Kurva hubungan konsentrasi terhadap absorbansi yang masih memenuhi hukum Lambert-Beer. Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 . Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut maks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil. Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan merupakan suatu tetapan. Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah. (Hukum Lamber-Beer dan syarat peralatan yang digunakan agar terpenuhi hukum Lambert-Beer Baca Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (AC) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 A 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi

tidak linear lagi. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat pada Gambar.

Gambar Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear: 1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna. 2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik. 3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan). Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan berwarna disebut juga metode kolorimetri. Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna (chromogenik reagent). Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna: 1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis. 2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat. 3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik. 4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran. 5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja. 6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehandaki tidak sempurna. 7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai. Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini:

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik. 2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya () besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi. 3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain. 4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai. 5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer. Hukum Beer-Lambert Bagian ini berisi sekilas tentang hukum Beer-Lambert dan menjelaskan pemakaian istilah absorbansi dan absorptivitas molar dalam kaitannya dengan spektrometri serapan UV-tampak. Absorbansi Menghitung absorbansi larutan Jika anda membaca bagian tentang bagaimana spektrometer serapan bekerja, anda akan mengetahui bahwa serangkaian panjang gelombang sinar akan melewati suatu larutan (sel sampel) dan wadah lain yang identik yang hanya berisi pelarut (sel pembanding/referens). Untuk tiap panjang gelombang sinar yang melewati spektrometer, intensitas sinar yang melewati sel pembanding dihitung. Biasanya disebut sebagai Io dengan I adalah intensitas. Intensitas sinar yang melewati sel sampel juga dihitung untuk panjang gelombang yang sama disimbolkan I. Jika I lebih kecil dari Io, berarti sampel menyerap sejumlah sinar. Selanjutnya perhitungan sederhana dilakukan oleh komputer untuk mengubahnya menjadi apa yang disebut dengan absorbansi dengan I adalah intensitas. Intensitas sinar yang melewati sel sampel juga dihitung untuk panjang gelombang yang sama disimbolkan dengan A. Hubungan antara A (absorbansi) dan kedua intensitas adalah:

Umumnya berdasarkan diagram di atas, anda akan mendapatkan absorbansi berkisar dari 0 hingga 1, tetapi dapat pula lebih tinggi dari itu. Absorbansi 0 pada suatu panjang gelombang artinya tidak ada sinar dengan panjang gelombang tertentu yang diserap. Intensitas berkas sampel dan pembanding sama, jadi perbandingan Io/I adalah 1. Log10 dari satu adalah nol. Absorbansi 1 terjadi ketika 90 % sinar pada suatu panjang gelombang diserap 10 % lainnya tidak diserap.

Dalam hal ini, Io/I is 100/I0 (=10) dan log10 of 10 adalah 1. Absorbansi tidak cocok dipakai untuk membuat perbandingan Pentingnya konsentrasi Bagian sinar yang diserap akan tergantung pada berapa banyak molekul yang beinteraksi dengan sinar. Bayangkan anda memiliki zat warna organik yang kuat/tajam. Jika zat warna tersebut berupa larutan pekat, maka akan diperoleh absorbansi yang sangat tinggi karena ada banyak molekul yang berinteraksi dengam sinar. Akan tetapi, dalam larutan yang sangat encer, sangat sulit untuk melihat warnanya. Absorbansinya sangat rendah. Seandainya anda ingin membandingkan zat warna tersebut dengan senyawa lain, namun anda tidak mengetahui konsentrasinya, maka anda tidak akan dapat membuat perbandingan dengan baik tentang senyawa mana yang menyerap sinar lebih banyak. Pentingnya bentuk wadah Seandainya sekarang anda memiliki larutan zat warna yang sangat encer dalam wadah yang berbentuk tabung sedemikian sehingga yang dilewati sinar panjangnya 1cm. Absorbansi tidak akan terlalu tinggi. Selain itu, seandainya anda melewatkan sinar melalui tabung sepanjang 100 cm yang berisi larutan yang sama. Sinar akan lebih banyak diserap karena sinar berinteraksi dengan lebih banyak molekul. Sekali lagi, jika anda ingin membandingkan diantara larutan yang ada, anda juga harus memperhatikan panjang larutan yang dilalui sinar. Konsentrasi dan panjang larutan menjadi pertimbangan dalam hukum Beer-Lambert. Hukum Beer-Lambert Seperti apakah hukum Beer-Lambert Anda akan mendapatkan berbagai simbol untuk beberapa istilah dalam persamaan khususnya untuk konsentrasi dan panjang larutan. Saya akan menggunakan bentuk yang mudah dimengerti dimana konsentrasi larutan adalah "c" dan panjang adalah "l".

Anda seharusnya mengenali bagian kiri persamaan seperti pada definisi absorbansi, A. Anda juga mendapatkan persamaan yang menyatakan A:

Ini lebih mudah diingat daripada yang sebelumnya, tetapi anda harus tetap memahami persamaan untuk absorbansi. Baik juga untuk memahaminya dalam bentuk ini:

Huruf Yunani epsilon dalam persamaan ini disebut absorptivitas molar atau kadang-kadang disebut dengan koefisien absorpsi molar. Absorptivitas molar Jika anda mengatur kembali persamaan di atas menjadi lebih sederhana untuk menerangkan epsilon (absorptivitas molar), anda dapatkan:

Ingat bahwa absorbansi larutan akan bervariasi berdasarkan konsentrasi atau ukuran wadah. Absorptivitas molar diperoleh dari pembagian absorbansi dengan konsentrasi dan panjang larutan yang dilalui sinar. Pada dasarnya, ini memberikan nilai absorbansi standar sinar berjalan sepanjang 1 cm melewati larutan 1 mol dm-3. Hal ini artinya bahwa anda dapat membandingkan antara satu senyawa dengan senyawa lainnya tanpa mengkhawatirkan pengaruh konsentrasi dan panjang larutan. Nilai absorptivitas molar dapat bervariasi. Contohnya, etanal memiliki dua puncak serapan dalam spektrum UV-tampak keduanya dalam spektrum ultra-violet. Dua puncak serapan ini disebabkan oleh promosi elektron dari pasangan bebas pada oksigen ke orbital pi anti-ikatan; atau dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan.