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Procesamiento de Coprocultivos

Procesamiento de Coprocultivos

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AREA MICROBIOLOGIA. SIGNIFICADO CLINICO DE COPROCULTIVOS
AREA MICROBIOLOGIA. SIGNIFICADO CLINICO DE COPROCULTIVOS

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Published by: QUIMICO CLINICO WILLIANS SANCHEZ on Dec 07, 2008
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PROCESAMIENTO DE COPROCULTIVOS
1.
Consideraciones generales
El tracto gastrointestinal contiene una flora normal bacterianamuy amplia y diversa. Aun cuando la acidez del estómago previene la colonización, muchasespecies pueden sobrevivir al pasaje por el estómago y se convierten en flora residente deltracto gastrointestinal bajo. Normalmente el intestino delgado contiene una flora escasa(estreptococos, lactobacilos y levaduras, de 10
1
a 10
3
/ml), pero conforme se alcanza el íleondistal, los recuentos se aproximan a 10
6
- 10
7
/ml, y se encuentran enterobacterias y
 Bacteroides
spp. Los bebés son colonizados en las primeras horas de nacido por bacteriasde la flora normal epitelial, particularmente estafilococos, corinebacterias, bifidobacterias,clostridios, lactobacilos y estreptococos. Con el tiempo, el contenido de la flora intestinalcambia. La flora normal del intestino grueso del adulto comprende principalmente especiesanaerobias, como
 Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium, Eubacterium y Peptostreptococcus.
La razón de especies anaerobias a aerobias, que incluyenenterobacterias, enterococos y otros estreptococos, es de 1000:1. El 80% del peso seco deheces de un adulto normal consiste en bacterias, las cuales son principalmente anaerobias(10
11-12
/g) y aerobias
(E. coli,
10
8
 /g, Proteus, Klebsiella,
enterococos y otras especies, 10
5-7
/g). Después de una terapia antimicrobiana, el intestino grueso puede ser colonizado por  patógenos nosocomíales, tales como St
aphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans,
y bacilos Gram-negativos resistentes, lo cual influencia la flora decualquier infección intraabdominal subsecuente.
 Patogenia de la infección gastrointestinal.
Los agentes etiológicos de infecciones del tracto gastrointestinal puedencausar enfermedad por cuatro mecanismos básicos: I. Producción de toxinas que afectan lasecreción de fluidos, función celular, o función neurológica. El cuadro 1 resume los principales agentes bacterianos involucrados en la producción de toxinas que actúan sobreel tejido intestinal. Las neurotoxinas usualmente se ingieren como toxinas preformadas queactúan sobre el sistema nervioso autónomo (enterotoxina b, toxina emética) o en las unionesneuromusculares (toxina botulínica). Las enterotoxinas, por su parte, poseen un efectodirecto sobre la mucosa intestinal que estimula en forma potente la secreción de fluidos.Estas actúan principalmente sobre el yeyuno y el íleon proximal, donde se lleva a cabo lamayor parte del transporte de fluidos. Finalmente, las citotoxinas actúan destruyendo laestructura de las células intestinales individuales. Cuando estas células son destruidas, sedesprenden de la superficie de la mucosa, dejándola desprotegida y con las funciones deabsorción o secreción dañadas. Además, la destrucción epitelial despierta una fuerterespuesta inflamatoria que acentúa el daño tisular (disentería).II. Crecimiento dentro o cerca de células de la mucosa intestinal, causando disfunción. La mayoríade los virus actúan de esta manera, principalmente en el intestino delgado, y los síndromesdiarreicos no siempre están asociados con la presencia de sangre o leucocitos. Ejemplos de virusque causan cuadros diarreicos son hepatitis A, B y C, rotavirus, agentes Norwalk y adenovirus. III.Invasión del epitelio mucoso, causando destrucción y ocasionalmente invasión y diseminaciónsistémica por el torrente sanguíneo. Ciertos parásitos, como
 Entamoeba histolytica
y
 Balantidiumcoli
invaden el epitelio del colon y causan disentería. Otros parásitos adquiridos por ingestión, como
Trichinella
y
Schistosoma,
 pueden causar diarrea sanguinolenta transitoria por su paso por lamucosa hacia otros sitios del organismo. Las bacterias que invaden las células epiteliales también producen síntomas disenteriformes. Los agentes más comunes son
Shigella
y
 E. coli
enteroinvasiva.Las bacterias penetran la capa superficial de la mucosa, y rara vez alcanzan el torrente circulatorio.Otras bacterias no solo invaden la mucosa sino que penetran los vasos sanguíneos de la submucosay se diseminan sistémicamente.
Salmonella typhi y S. cholerasuis
son agentes etiológicos de fiebreentérica, cuadros sistémicos caracterizados por fiebre, cefalea, vómitos y constipación. Lainvasividad contribuye a la patogénesis de la enfermedad causada por otros serotipos de
Salmonella
 
spp.,
Yersinia enterocolitica, Vibrio parahemolyticus, Campylobacter jejuni, C. fetus, Plesiomonas shigelloides, Edwardsiella tarda
y, posiblemente,
Clostridium difficile.
IV. Adhesión a mucosaintestinal, alterando las funciones normales de absorción y secreción. La capacidad adherente de
Vibrio cholerae
así como de varias cepas de
 E. coli
ha sido extensamente estudiada, y se handescrito factores de colonización antigénicos (CFA), expresados en adhesinas tipo fimbrias ofibrillas. La adhesión le permite a las bacterias colonizar y secretar sus toxinas cerca de las célulasepiteliales. Por otra parte, los cuadros diarreicos producidos por 
Giardia, Cryptosporidium, Isospora
y
Microsporidium
se asocian en parte a su capacidad de adherirse al epitelio intestinal. Elámbito completo de factores de virulencia involucrados en la producción de diarrea estárepresentado en los distintos tipos de
 E. coli,
a saber enterotoxigénica (ECET), toxina lábil (ECLT),toxina estable a (ECSTa), toxina estable b (ECSTb), enterohemorrágica (ECEH), enteroinvasiva(ECEI), enteropatógena (ECEP), localmente adherente (AL), adhesiva y despegable,enteroagregativa (ECEAg) y difusamente adherente (ECDA). Esta bacteria puede producir una ovarias enterotoxinas, ser invasiva, producir colitis hemorrágica o ser adherente/agregativa,dependiendo de genes transmisibles presentes en plásmidos y bacteriófagos.
2. Principios del  procesamiento de muestras
Las enfermedades diarreicas son una causa mucho mayor demorbilidad y mortalidad que las enfermedades más comunes de la sociedad industrializada(cardiopatías, cáncer y accidentes cerebrovasculares), siendo los lactantes y niños pequeños los másafectados, en especial con malas medidas sanitarias y una alimentación deficiente. La diarreainfecciosa aguda es causada por un número de agentes diferentes: bacterias, virus y protozoarios. Ellaboratorio clínico rutinariamente busca las bacterias que más comúnmente causan diarreas, sinembargo, se requiere la colaboración del médico para asegurar la búsqueda precisa de un agente particular. Por consiguiente, se debe obtener una historia clínica completa, que incluya los síntomasdel paciente, hora de iniciación, edad, historia de viajes, consumo de alimentos y tratamiento conantimicrobianos. Cada microorganismo posee mecanismos patogénicos únicos que causan una seriede síntomas, los cuales pueden ser clasificados inicialmente (Cuadro 2). Sin embargo, debe tenersesiempre presente que los microorganismos no se adhieren estrictamente a estas categorías.
Selección, recolección y transporte de muestras
 Muestras aceptables
.
Los principales criterios deaceptación de muestras para cultivo incluyen: • Hisopos rectales de niños o adultos con diarreaaguda. • Muestras no contaminadas con orina. • Seleccionar las porciones que contengan pus,sangre o moco. • Heces formadas en estudios epidemiológicos. • Recibir 2 o 3 muestras de díasseparados incrementa la probabilidad de aislar el patógeno. • Muestras frescas de 1-2 horas, o preservadas como se describe mas adelante.
 Muestras inaceptables
.
Las muestras que no debenaceptarse, se rigen por los siguientes criterios: • Muestras de más de 2 horas no preservadas •Hisopos rectales secos • Varias muestras en un mismo día • Muestras sin datos del paciente, hora y procedencia.
 Recolección de la muestra
.
Para la recolección de las muestras se deben de seguir lassiguientes recomendaciones: • Frascos plásticos con tapa de rosca de cierre hermético. • Hisopos entubos con tapa.
 Preservación y transporte.
Las muestras fecales que no se pueden inocular directamente en los medios de cultivo se pueden preservar a 4 – 6ºC en: • Buffer salino de glicerol(partes iguales de buffer salino de fosfatos 0.033 M pH 7.0 y glicerol) recomendado para
Salmonella
sp. y
Shigella
sp., pero no para
Campylobacter 
sp. y
Vibrio
sp., a menos que seaenriquecido con CaC1
2
(100 mg/l).
Medio de transporte Cary-Blair, apropiado para
Vibrio
spp. y
Campylobacter 
spp, pero noes tan efectivo para recuperar 
Shigella
sp. y es inapropiado para
Clostridium difficile.
Algunos autores recomiendan reducir el contenido de agar de 0.5
%
a 0.16% para elmantenimiento de
Campylobacter 
spp. Otro tipo de muestras se puede preservar ytransportar de la siguiente manera: • Muestras para estudio por 
C. difficile
se debencongelar a -20
0
C hasta su procesamiento. • Hisopados rectales pueden transportarsealternativamente en un caldo Gram negativo (GN). • Contenidos de duodeno, colostomías
 
o ileostomías se transportan en viales. • Biopsias rectales se transportan en contenedoresestériles con agua destilada, no sumergir en formalina.
Medios de enriquecimiento.
Losmedios de enriquecimiento se utilizan para aumentar la probabilidad de crecimiento deciertas especies bacterianas mientras se inhiben microorganismos no deseados. Sonparticularmente útiles en la recuperación de
Salmonella
de heces de portadores y depacientes con infecciones leves por 
Shigella,
donde los números pueden ser tan bajoscomo 200 bacterias/g de heces. El principio de trabajo de los medios de enriquecimientoes el mantenimiento en fase log de
E. coli 
y otros comensales fecales debido a losinhibidores químicos del caldo (desoxicolato, selenito, tiosulfato).
Salmonella
y
Shigella
son menos inhibidas y entran en fase log más rápidamente, lo que aumenta su número.No obstante, con el tiempo la inhibición de coliformes disminuye, por lo que serecomienda subcultivar dentro de las 8 h de inoculado el caldo para evitar sobrecrecimiento. • Caldo Gram-negativo (GN): contiene desoxicolato de sodio, citrato,manitol. Medio poco selectivo, apropiado para
Shigella
spp. y
Salmonella
spp. • Caldoselenito F: contiene selenito de sodio. Medio altamente selectivo para
Salmonella
spp. •Caldo tetrationato: contiene tiosulfato de sodio, sales biliares y carbonato de calcio. Debeagregarse 0.1 ml/tubo de solución yodo-yoduro antes de inocular la muestra. Medioaltamente selectivo para
Salmonella
spp. • Agua peptonada alcalina (pH 8.6): apropiadopara
Vibrio cholerae.
Medios de inoculación primaria.
El microbiólogo debería examinar los especímenes de heces por 
Salmonella, Shigella, Campylobacter, Aeromonas
y
Plesiomonas
spp., y por predominio evidente de
Staphylococcus aureus,
levaduras y
Pseudomonas
spp. Debido al riesgo potencial del cólera, debe incluirse el protocolo deaislamiento para
Vibrio cholerae
en casos sospechosos y en las regiones de mayor incidencia. Cada laboratorio debe evaluar la historia del paciente, la población, lalocalización geográfica y el tamaño del hospital para determinar los medios selectivos derutina y de aislamiento especial. El cuadro 3 resume los principales medios selectivos deinoculación primaria para coprocultivos.
4. Procedimientos.
 Examen directo.
Un examen al fresco de una muestra de heces sin teñir es útil para detectar parásitos y, con experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de
Campylobacter 
y
Vibrio cholerae
a partir de heces frescas. Estos últimos se pueden observar mejor en microscopios de campo oscuro o contraste de fases. 1. Examen a fresco con azul de metileno.Seleccionar una porción de material fecal de un área con sangre y moco y mezclar con una gota delcolorante de azul de metileno de Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3minutos observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares indica la presencia de un posible patógeno invasivo, mientras que el predominio de monocitos se asocia con infecciones por 
Salmonella typhi.
2. Tinción de Gram. Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar unatinción de Gram. Observar predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram-positivos o bacilos Gram- negativos, lo cual puede sugerir una infección por 
Candida, S. aureus
o
 Pseudomonas,
respectivamente. El predominio de bacilos Gram-positivos largos, rectos y con paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de
Clostridium difficile,
aun cuando no es una prueba totalmente confiable de la infección. La tinción de Gram modificada con fucsina básica al0.1% permite la observación de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S) o enalas de gaviota, sugestivo de infección por 
Campylobacter 
spp. Además, puede usarse una tinciónde Giemsa para buscar protozoarios relacionados con cuadros diarreicos.
Cultivo primario derutina.
1. Aislamiento de
Salmonella
sp. y
Shigella
sp. Las muestras que se reciben para ladetección de éstos patógenos deben cultivarse en un medio de enriquecimiento, un medio desoporte, un medio levemente selectivo-diferencial, y un medio moderadamente selectivo. El uso deun medio altamente selectivo no se justifica para uso de rutina, con excepción de la investigación deun brote. Los medios más comúnmente recomendados, de acuerdo con las posibilidades dellaboratorio, son los siguientes: • Medio de soporte: agar sangre (agar tripticasa-soya con
5%
desangre). • Medio diferencial: agar MacConkey o agar eosina-azul de metileno de Levine. •

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