METODE OLES

M.Yusuf Irvansyah Nur Alindatus Sa Diyah Syayyida Muslimah Ratna Juwita Ella Ratih Wahyu Dita Dwi Aprillia Rizky Yanuarista

1508100015 1509100061 1509100012 15091000 15091000 15091000 15091000

MIKROTEKNIK

METODE OLES

LATAR BELAKANG

SEDIAAN

SEL HEWAN DAN SEL TUMBUHAN

SITOLOGI KONVENSIONAL

KELENJAR MUKOSA

FUNGSI

SEDIAAN DARAH

HAEMOLIMFA BELALANG DAN PROTOZOA

Sediaan Oles dari Jaringan

Merupakan pembuatan sediaan oles yang paling sederhana Umumnya digunakan untuk jaringan otot atau untuk jaringan yang selselnya mudah lepas

Cara Pembuatan : Gelas benda dibersihkan Jaringan yang masih segar dipotong kecil Jaringan ditekan di atas gelas obyek dengan hatihati Cairan yang keluar dioleskan secara merata

Pembuatan Film Nanah yang Tebal

Cara Pembuatan: Nanah diencerkan dengan serum atau cairan lain Disentrifuge Endapan diencerkan lagi dengan serum Hasil pengenceran dioleskan ke gelas obyek secara merata

SEL DARAH
Darah merupakan suspensi sel dan fragmensitoplasma didalam suatu cairan. Darah terbentuk dari unsur unsur sel dan substansi interseluler yang berbentuk plasma. Darah dikelompokkan menjadi eritrosit, leukosit, dan trombosit. Untuk leukosit dibedakan menjadi granulosit dan agranulosit.

PEMBUATAN SEDIAAN DARAH

Berfungsi untuk mempelajari bentuk sel darah dan menghitung perbandingan antara masing masing jenis sel darah. Bahan yang dipakai diperoleh dari darah hewan dan darah manusia. Terbagi atas pembuatan film darah tebal dan pembuatan film darah tipis.

PEMBUATAN FILM DARAH TIPIS

Jarum franke disterilkan dengan alkohol 70% Ujung jari diusap dengan alkohol 70%

Diambil darah dari ujung jari ke 3, 4 , dan 5

Darah diteteskan diujung gelas objek I ditepi kanan

Dilakukan pewarnaan

Dilakukan fiksasi dengan methyl alkohol

Ditunggu sampai kering

Diambil gelas objek II dan ditarik sedikit kebelakang hingga menyentuh tetesan darah digelas objek

PEMBUATAN FILM DARAH TEBAL

Diolesi gliserin albumin pada gelas objek

Diteteskan darah di sisi kanan gelas objek

Diratakan dengan batang gelas

GAMBAR PERLAKUAN
A = gelas objek I B = gelas objek II

FIKSASI
Suatu usaha manusia untuk mempertahankan elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran Maka dibutuhkan suatu media yang terdiri dari unsur unsur kimia dibuat suatu larutan atau dalam bentuk gas (FIKSATIF)

CARA FIKSASI SEDIAAN OLES

Ada 2 macam fiksasi Sediaan Oles : 1. Fiksasi Sediaan Setelah Kering 2. Fiksasi Sediaan Sebelum Kering
Fiksatif dengan cara ini baik digunakan untuk memfiksasi : 1. Bakteri tdk mengalami perubahaan bentuk 2. Eritosit walau sediaan menjadi kering 3. Leukosit tidak untuk melihat bentuk normalnya)

Fiksatif paling banyak digunakan untuk sedian setelah kering adalah : alkohol alkohol absolute alkohol eter

Fiksatif yang digunakan untuk sediaan oles yang sebelum kering adalah fiksatif yang dapat membentuk uap atau gas (osmic acid 2%)

Cara Fiksasi dengan Osmic Acid

4
1

2
Keterangan : 1 dan 2 adalah satu stel cawan petri 3 adalah sediaan oles dg permukaan film yg menghadap ke bawah 4 adalah batang gelas 5 adalah tetesan osmic acid 2 %

Cara Fiksasi
diletakkan pada cawan petri
sediaan oles diletakkan terbalik scr melintang terhadap batang gelas

1 tetes osmic acid 2 %

dilakukan pewarnaan

dicuci dg aquades

didiamkan selama 3-4 menit (tipis) / 5-10 menit (tebal)

Film Darah Tipis

Difiksasi dg methyl alcohol 3-5 menit Dibiarkan kering sampai saat pewarnaan Apabila tidak segera difiksasi hasil pewarnaan tdk memuaskan Fiksasi dlm keadaan basah, lebih baik hasilnya Selain Osmic acid dpt juga dn uap formaldehyde atau formalin pekat

Film Darah Tebal

Dikeringkan di udara terlindung 18-24 jam sblm pewarnaan Apabila pewarnaan tdk dpt dilakukan dalam waktu 24 jam, dihemolisa dg aquades atau air mengalir 5-10 menit Difiksasi dg methyl alcohol 5 menit

Metode pewarnaan dapat dilakukan dg larutan: Zat-zat warna aniline basis Pewarnaan Gram Pewarnaan Acid Fast Pewarnaan Giemsa Pewarnaan Wright Pewarnaan May Grunwald Pewarnaan Leishman

Setelah pewarnaan, sediaan oles dibiarkan kering dan ditutup dg Clarite, Permopunt, Canada Balsam

Metode Pewarnaan
Sediaan Oles

1. PEWARNAAN GIEMSA

2. PEWARNAAN MAY GRUNWALD

3. PEWARNAAN PAPPENHEIM

4. PEWARNAAN WRIGHT

1. Pewarnaan Giemsa
Dipakai untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, dan sel-sel sumsum Untuk mengidentifikasi parasitparasit darah misalnya protozoa

Prosedur Pewarnaan
Film sediaan oles yang telah kering, diawetkan dalam methyl alkohol selama 5 menit Dikeringkan di udara Seluruh permukaan sediaan oles ditetesi dengan larutan Giemsa yang telah diencerkan selama 30-40 menit Dicuci dengan akuades sampai bersih Dikeringkan di udara Langsung diamati dengan minyak emersi atau ditutup dengan canada balsam dan gelas penutup Diberi label

Hasil Pewarnaan
Sediaan darah homo
Eritrosit berwarna merah muda Nukleus lekosit berwarna ungu kebiruan Sitoplasma lekosit berwarna sangat ungu muda Granula dari lekosit eosinofil berwarna ungu tua Granula dari lekosit netrofil dan lekosit basofil ungu muda

Tidak menunjukkan hasil pewarnaan yang berbeda

2. Pewarnaan May Grunwald

Larutan May Grunwald adalah larutan eosinmethylene blue dalam methyl alkohol (berfungsi sebagai pelarut serbuk May Grunwald dan fiksatif jaringan oles)

Prosedur Pewarnaan
Sediaan oles yang telah kering ditetesi dengan larutan May Grunwald

Larutan May Grunwald diencerkan dan dicuci dengan akuades

Dikeringkan di udara yang tidak berdebu

Sediaan siap diamati atau disimpan

Hasil Pewarnaan
Sediaan darah manusia
Eritrosit berwarna merah muda Nukleus lekosit berwarna biru muda Granula lekosit eosinofil berwarna merah menyala Granula lekosit basofil berwarna biru agak ungu Granula lekosit neutrofil berwarna ungu muda Trombosit berwarna ungu tua

Metode Pewarnaan Pappenheim

Kombinasi pewarnaan May Grunwald dan Giemsa
Tahapan kerja Sediaan oles kering ditetesi My Grunwald 0,25% Biarkan selama 3-5 menit

Tetesi dengan larutan kedua -> sebagai pengenceran dengan aquades yg telah didihkan

Diamkan 5-10 menit

tambhkan larutan Giemsa 3%, diamkan 20-30 menit Dicuci dengan aquades yang telah didihkan Dikeringkan di udara

Eritrosit-> brwarna mrah muda keunguan Nukleus-> ungu tua Sitoplasma-> biru muda Granula leukosit eosinofil-> merah menyala Granula leukosit basofil -> ungu Granula leukosit neotrofil -> ungu muda Trombosit -> ungu tua
(Suntoro, 1983)

Diamati, ditutup dengan canada balsam, dan ditutup gelas penutup

Metode Pewarnaan Wright

Dilarutkan dengn cr dgerus dlm mortir. Sdkit2 dmbh methyl alkohol -> vol.60cc

Bentuk serbuk/cairan

Serbuk-> dilarutkan dlm methyl alkohol (0,1 gr dlm 60 cc)

Tahapan kerja
Diamkan 5-12 menit

Olesan darah kering

Ditetesi lar.wright

Dicuci dengan aquades dingin yg tlh didihkn (menghlngkn zat wrna)

H A S I L

Biarkan 2 menit Disemprot menggunakan pipet tetes Ditetesi dengan lar. Yg sama sbg buffer PH 6,4

-nukleolus eritrosit-> ungu tua -sitoplasma-> ungu muda -granula leukosit eosinofil-> jingga kemerahn - Granula leukosit basofil n neotrofil-> ungu
(Suntoro, 1983)

Dikeringkan, diamati dn dtu2p

Fungsi sediaan oles:

Mengetahui siklus estrus dari hewan mamalia Melihat kromosom dari lekosit medulla osseum

Sediaan oles untuk mengetahui siklus estrus

Bagian yang diambil untuk sediaan adalah vagina smear. Terdapat 3 metode: a. Metode pipet b. Metode currete / spatula c. Metode usap dengan kapas

Metode pipet
Disemprotkan aquadest ke dalam vagina dengan pipet Dihisap kembali air semprotan dengan pipet yang sama Diteteskan ke atas gelas benda Ditetesi zat warna Ditutup dengan gelas penutup

Metode currete / spatula

Diambil sel-sel vagina dengan spatula Dioleskan ke atas gelas benda Ditetesi dengan aquadest Ditetesi zat warna Ditutup dengan gelas penutup

Metode usap dengan kapas

Ujung tusuk gigi dibalut dengan kapas dibasahi dengan aquadest Dinding vagina dikorek hingga sel epiteliumnya terangkat Dioleskan di atas gelas benda Ditetesi zat pewarna Ditutup dengan gelas penutup

Sediaan oles untuk melihat kromosom

Bagian yang akan dibuat sediaan adalah kondisi sel saat mengalami proses metafase. Untuk menjaga sel tepat mengalami metafase diperlukan suatu larutan Langkah-langkah untuk membuat larutan : 1. Larutan Colchicin 0,5% dalam buffer phospat pH 7 2. Larutan hipotonis berupa 1bagian buffer phospat dan 4 bagian aquadestillata 3. Larutan fiksasi Carnoy (1bagian AAG dicampur 3 bagian metahanol)

 Cara kerja: 1.Larutan Colchicin 0,5% disuntikkan pada burung dengan dosis tertentu 2. Burung didiamkan 1,5-2 jam 3. Burung dibunuh dengan cara nerkose 4. Femur dan tibiotarsus diambil dan dibersihkan dari otot 5. Kedua ujung femur dipotong 6. Tulang dipukul-pukul dengan skalpel hingga retak 7. Dikeluarkan sumsum tulang dan dimasukkan dalam larutan hipotonis 8. Sumsum tulang dilepaskan sehingga suspensi terlihat keruh dan ditunggu selama 30 menit

9. Suspensi disentrifugal dengan kecepatan 400rpm selama 5 menit 10. Supernatan dibuang lalu diganti dengan larutan Carnoy sebanyak 3x volume endapan sumsum, didiamkan 5 menit 11. Disentrifugal lagi, supernatannya dibuang dan diganti dengan larutan fiksasi Carnoy yang baru, didiamkan selama 5 menit 12. Disentrifugal lagi, supernatannya dibuang dan diganti dengan larutan fiksasi Carnoy yang baru 13. Dicampur, diteteskan di atas gelas benda bersih dan bebas lemak dengan menggunakan pipet

14. Sediaan ditutup dengan gelas penutup 15. Diberi pewarna