Protein Engineering - Siti Julaiha

REKAYASA PROTEIN
Rekayasa protein adalah campuran menarik dari pengetahuan :
Biologi Molekuler Analisa Struktur Kimia Protein Matematika Ekonomi Komputasi atau Bio Informatika Biokimia
Dengan tujuan pengembangan protein untuk sesuatu yang berguna atau berharga di bidang industri, kesehatan, dsbnya.
SEJARAH REKAYASA PROTEIN
TUJUAN REKAYASA PROTEIN

Mengembangkan protein untuk sesuatu yang berguna atau berharga di bidang industri, kesehatan, dll. dengan : Membentuk produk baru dari suatu campuran protein
Merubah struktur atau sifat protein sehingga dihasilkan perubahan pada produk protein dengan target struktur atau sifat yang diinginkan. Merubah protein sehingga dapat diterjemahkan memberikan informasi dan aplikasi lain. untuk
Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain
Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk untuk suatu produk
REKAYASA PROTEIN
Protein Engineering
Rational Protein Design
Nature
Proteins with Novel Properties
Random Mutagenesis
REKAYASA PROTEIN
KEGIATAN REKAYASA PROTEIN : Peningkatan katalisis dengan substrat alami atau kofaktor Peningkatan katalisis dengan substrat nonnatural atau kofaktor Peningkatan katalisis di nonnatural pelarut Peningkatan ligan mengikat
STABILITAS PROTEIN: Peningkatan termostabilitas Peningkatan aktivitas pada pH alternatif Peningkatan aktifitas dalam kekuatan ion yang berbeda Peningkatan protein lipat Penurunan kerentanan terhadap proteolisis Farmakokinetik
REKAYASA PROTEIN
EKSPRESI PROTEIN: Peningkatan tingkat ekspresi di host nonnatural Target ekspresi ke lokasi selular yang berbeda Penambahan tag untuk mendeteksi ekspresi protein Perubahan modifikasi posttranslational SIFAT-SIFAT LAIN:
Menambahkan tag untuk memfasilitasi pemurnian
Mengubah kecenderungan untuk polimerisasi Menambahkan tag untuk memvisualisasikan lokalisasi
Merekayasa mengikat situs alosterik

Mengubah titik isoelektrik Menurunkan imunogenisitas
APLIKASI REKAYASA PROTEIN

Pembuatan enzim
Memproduksi jenis obat obatan

Menghasilkan vaksin antibody tertentu Beberapa Contoh Aplikasi langsung secara komersial sebagai berikut : Menggukanan perancah/scaffold protein berdasarkan domain pada Protein A untuk mengembangkan molekul moleku seperti antibody (Company : Affibody) Menambahkan asam amino yang tidak terkodekan kapada protein, memungkinkan sintesa protein dengan diversity bahan kimia (Company : Ambrx) Menggunakan perancah protein berdasarkan perpindahan untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, membuat penggabungan protein protein (Fusi) dan receptor agonist (Company: BioRexis) Menggunakan perancah protein berdasarkan lectin Tipe C untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, teknologi protein trimerisasi (Company : Borean). Merekayasa proteases untuk menurunkan molekul molekul yang ditargetkan (Company: Catalyst). Menggunakan domain Fibronektin untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, menciptakan protein protein dua fungsi dengan domain ikatan target yang terhubung terhadap domain enzimatik (Company: Compound Therpaeutics).
APLIKASI REKAYASA PROTEIN

Pengembangan peningkatan metode untuk humanisasi antibody (Company: Kalobios) Menggunakan perancah protein berdasarkan lipocalin untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Pieris) Menggunakan perancah protein berdasarkan Kristal gamma untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Scil) Menggunakan perancah protein berdasarkan Sistein Knots untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Selecore) Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap protein protein SMIP seperti antibody (Company : Trubion). Menggunakan teknologi PDA untuk Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap antibody dan menciptakan protein protein domain negative dan protein protein dengan peningkatan sifat propertinya (Company : Xencor). Rancangan dan konstruksi dari protein atau enzim baru dengan teknologi baru/novel atau fungsi fungsi yang diinginkan dengan memodifikasi susunan asam amino menggunakan teknologi rekombinan deokssrinukleaikasid (RDT)
STRATEGI REKAYASA PROTEIN

Rekayasa Protein Protokol mempertimbangkan beberapa strategi dan Pendekatan untuk merekayasa protein : Pendekatan Desain De Novo Pendekatan Desain Rasional, termasuk diantaranya adalah teknik pendekatan mutagenesis Site Directed. Pendekatan Desain Mutagenesis Acak/Random , termasuk diantarnya adalah Evolusi yang diarahkan/Directed Evolusi, DNA Shuffling, dan Mutasi Kimia (Teknik pendekatan Glicosilasi,Pegilasi, Lipida, dll) Teknik Penggabungan protein (Fusion Protein)
STRATEGI DESAIN DE NOVO
Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk stabilisasi geometry backbone Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik menggunakan informasi dari Struktur 3D dari akumulasi Protein Alam dan Ikatan ikatan protein . Contoh: Methionine : Memperlihatkan segmen rigid, central part segmen helix dan daerah buried natural protein. Threonine : segmen flexible Lysine : pembentukan helix yang baik dan mengajukan pada Cterminal Leucine : Helices yang stabil, prefer buried region, ditemukan pada posisi tengah helix Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih (Alpha helical bundel atau Betha barrel dan mempunyai energi rendah untuk target struktur
TUJUAN STRATEGI DESAIN DE NOVO
LIMITASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Limitasi/ Problem: Ketersediaan struktur protein 3-D masih terbatas. Pengetahuan yang terbatas terhadap ilmu ikatan
protein, struktur terhadap fungsi biologsi protein protein tersebut.
Protein architecture vs. Protein folding vs. Biological functions

Desain Komputasional Protein
Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk stabilisasi geometry backbone Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal
Desain komputasi protein dengan algoritme menemukan susunan asam amino untuk mengidentifikasi susunan asam amino yang memiliki energi energi rendah untuk struktur target.

Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik menggunakan informasi dari Struktur 3D Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih
X-RAY KRISTALOGRAFI
memberikan data resolusi tinggi tetapi tidak memberikan informasi waktu tergantung fleksibilitas konformasi protein.
NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)

menyediakan data resolusi agak rendah dan terbatas untuk protein yang relatif kecil, tetapi dapat memberikan informasi waktu bergantung tentang gerak protein dalam larutan.
X-RAY KRISTALOGRAFI
Sinar masuk (datang dari kiri atas) menyebabkan setiap scatterer memancarkan kembali sebagian kecil intensitas sebagai gelombang bola. Jika scatterers disusun simetris dengan pemisahan d, gelombang bola akan selaras (tambahkan konstruktif) hanya dalam arah perbedaan jalan-panjang 2d sin sama dengan multiple integer dari panjang gelombang . Dalam hal ini, bagian berkas yang masuk dibelokkan oleh 2 sudut, memproduksi tempat refleksi
Workflow for solving the structure of a molecule by X-ray crystallography.
X-RAY KRISTALOGRAFI
Diagram Pita ofmyoglobin struktur, menunjukkan alfa heliks berwarna. Protein panjang, molekul linier dengan ribuan atom, namun posisi setiap atom relatif telah ditentukan dengan resolusi sub-atom dengan kristalografi sinar-X.
Karena sulit untuk memvisualisasikan semua atom sekaligus, pita menunjukkan jalan kasar polimer protein dari Nterminus (biru) ke C-terminus nya (merah).
APLIKASI X-RAY KRISTALOGRAFI

X-ray diffraksi image untuk protein myoglobin
Struktur kristal protein pertama dari mioglobin paus sperma, ditentukan oleh Max Perutz dan Kendrew Sir John Cowdery tahun 1958, Hadiah Nobel dalam Kimia. Difraksi sinar-X analisis mioglobin awalnya dimotivasi oleh observasi kristal mioglobin di kolam kering dari darah di atas geladak kapal dari perburuan paus.

NMR adalah pengetahuan stuktur biologi, yang diapalikasikan oleh NMR untuk Kurt Wthrich, who won the Nobel prize in 2002, menginvestigasi jenis protein protein Pacific Northwest National Laboratory's high magnetic field (800 MHz) NMR spectrometer sample loaded.
NMR sample is prepared in a thin walled glass tube.
Protein NMR dilakukan pada sampel air dari protein yang sangat murni. Sampel terdiri dari antara 300 dan 600 microlitres dengan konsentrasi protein dalam rentang 0,1-3 milimol. Sumber protein dapat berupa alam atau dihasilkan dalam sistem ekspresi menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetik.
Panah biru mewakili orientasi ikatan peptidaN - H obligasi yang dipilih dengan menentukan orientasi yang relatif cukup obligasi terhadap medan magnet luar, struktur protein dapat ditentukan, dari catatan 1KBH PDB
Penentuan Nuklir struktur magnetik resonansi menghasilkan ensemble struktur. Struktur hanya akan bertemu jika data cukup untuk mendikte lipatan tertentu. Dalam struktur ini, hanya untuk menjadi bagian dari kasus struktur, dari PDB 1SSU.
APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Struktur unik proteins menghasilkan rancangan : 1. Susunan Potensial Protein dari 100 hundred amino acids ~10130 susunan protein potensial Dilakukan dengan metode Komputasi atau eksperimental.
2. Estimasi Energi pada desain protein Memperlihatkan perubahan energi selama proses folding. Hipotesa Thermodinamic : struktur asli protein diberikan oleh konformasi asam amino yang meminimalkan energi bebas molekul.
Estimasi energi memperlihatkan :
-- Hot spot residu untuk adanya interaksi energi -- Data Statistik terhadap fungsi efektif energi (SEEFs) database struktur protein -- Sifat sifat fisik terhadap fungsi efektif energi (PEEFs) analisa komputasi. -- Sifat sifat empiris terhadap fungsi efektif energi (EEEF) analisa single termodinamik dan multiple site mutasi. -- Kestabilan protein baris multiple ikatan dan daerah konservatis jenis protein (Current Opin. in Structural Biol. 2002, 12:441)

Protein degradation:

Disease and protein folding:
Disease
Exemple: Neurodegenerative diseases

Desain proses komputasional juga berguna untuk merancang model folding inverse bagian protein kedalam rancangan untai yang diasumsikan sebagai rotamer multiple dan perancah tetap. Rotamer yang berbeda dari tritopan asam amino pada posisi tertentu dalam protein. Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal dengan target terhadap stabilisasi gemoteri backbone protein.
Model desain folding inverse (A) partisi protein didesign side-chains mengasumasikan multiple rotamer (merah) dan scaffold tetap (biru). (B-D) rotamer berbeda tritopan asam amino pada posisi tertentu di protein.
Desain komputer untuk faktor tumor nekrosis (TNF) varian pada depicted gold. Mutasi, merah, mencegah desain varian dari ikatan TNF reseptor, biru. Penambahan mutan hasil TNF pada campuran hetrogen trimer, memiliki aktivitas yang dikompromised. Penambahan mutat berlebih TNF menjanjinkan level renda homotrimer aktive native TNF. Gambar berdasarkan pada material suplemen reference 39. Struktur kristal 1TNR digunakan untuk menciptkan representatif struktur
STRATEGI DESAIN rasional
STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN Mendapatkan produk produk gen yang baru dari protein yang ada Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta stabilitas Molekul melalui informasi dari struktur 3 Dimensi protein. Mengidentifikasi susunan Asam Amino seperti mengetahui asam amino memiliki energi terendah untuk merubah struktur ikatannya. Mengembangkan pengetahuan pengetahuan baru tentang karakteristik protein. Merancang protein/enzym dengan sifat yang diinginkan melalui teknik Manipulasi berdasarkan penerapan/ peniruan teknik mutasi alam seperti :
Site Directed Mutagenesis , Error-Prone, PCR-based Penambahan atau penghilangan : PCR-based, nuclease, Kloning Perubahan Domain atau Fusions /penggabungan : Ligation, PCRbased
Sehingga dapat dilakukan analisa terhadap interaksi antara protein-protein, Ikatan DNA , aplikasi karakteristik antibodi , eksplorasi susunan protein, kontruksi hybrid protein, probing promoter dan regulasi regions, serta analisa aktifitas Enzim .
LIMITASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

Pengetahuan tentang ilmu ikatan protein, juga terhadap fungsi biologsi, atau struktur protein sangat terbatas dan sering tidak tersedia Aplikasinya diperkirakan akan sangat sulit dilakukan untuk melihat efek efek dari variasi mutasinya. Strategi desain Site Direkted Mutaganesis memiliki limitasi atau problem dengan Banyaknya librari pada mutan yang dihasilkan
TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

Studi Modern resolusi yang lebih tinggi Ini adalah metode eksperimental untuk dapat memicu lipatan sampel unfolded protein, dan mengamati dinamika yang dihasilkan. Teknik cepat digunakan secara luas termasuk neutron hamburan, ultrafast, pencampuran solusi, fotokimia metode, dan spektroskopi laser suhu melompat. Komputasi juga memprediksi struktur tersier protein. Teknik initio De novo (memprediksi struktur protein berhubungan dengan komputasi), Sangat berbeda dengan Metode lipatan Dinamika Molekul protein. (MD) merupakan perangkat penting mempelajari pelipatan protein dan dinamika di silico. Karena biaya komputasi, simulasi MD lipat dengan air eksplisit hanya terbatas pada peptida dan protein yang sangat kecil. MD simulasi protein yang lebih besar tetap terbatas pada dinamika struktur eksperimental atau berlangsung pada temperatur tinggi. Untuk mensimulasikan prosees lipat yang lama (diluar sekitar 1 mikrodetik), seperti protein lipat ukuran kecil (sekitar 50 residu) atau lebih besar, beberapa pendekatan atau penyederhanaan dalam model protein perlu diperkenalkan.

Teknik untuk mempelajari Protein Folding
Circular Dichroism Spektroskopi
adalah salah satu alat paling umum dan dasar untuk mengukur penyerapan cahaya terpolarisasi sirkular. Dalam protein, struktur seperti lembaran helicies alpha dan beta yang kiral, dan dengan demikian menyerap cahaya tersebut. Penyerapan cahaya ini bertindak sebagai penanda tingkat foldedness dari ansambel protein. Teknik digunakan untuk mengukur keseimbangan protein dengan mengukur perubahan serapan sebagai fungsi konsentrasi denaturant atau suhu. Jenis spektroskopi juga dapat dikombinasikan dengan perangkat cepat-pencampuran, untuk mengukur protein kinetika lipat dan untuk menghasilkan plot chevron. Perkembangan dichroism lingkaran getaran (VCD) melibatkan Fourier Transform (FFT) instrumen, untuk menentukan konformasi protein dalam larutan bahkan untuk molekul protein sangat besar. VCD studi protein sering dikombinasikan dengan difraksi sinar X-kristal protein, FT-IR data untuk solusi protein dalam air berat (d2O), atau perhitungan kuantum ab initio untuk memberikan tugas struktural ambigu yang tak dpt diperoleh dari CD

Spektrometri Circular Dichroism (CD)
-- Mengukur struktur sekunder protein -- Teknik standar untuk mengukur aktifitas optikal protein -- Mengukur perbedaan absorbansi pada struktur sirkular bagian kanan dan kiri melalui cahaya polarisasi dari sample protein The far-UV atau amide region (170-250 nm) untuk ikatan peptida The Near-UV region (250-300 nm) aromatik asam amino

Cahaya linier Terpolarisasi adalah cahaya osilasi terbatas untuk pesawat tunggal. Semua bagian terpolarisasi cahaya dapat digambarkan sebagai jumlah dari dua bagian linear terpolarisasi tegak lurus satu sama lain, sebagai cahaya terpolarisasi vertikal dan horizontal.
Vertically Polarised Light
Horizontally Polarised Light

Amplitudo terpolarisasi Horisontal dan vertikal pada gelombang cahaya yang sama di fase satu sama lain: gelombang cahaya yang dihasilkan (biru) adalah linear terpolarisasi pada 45 derajat.
Jika kedua polarisasi keluar dari fase, gelombang resultan berhenti menjadi terpolarisasi linier. Misalnya, jika salah satu terpolarisasi keluar dari fase oleh gelombang-kuartal, resultan akan heliks dan dikenal sebagai cahaya terpolarisasi sirkular (CPL). Heliks dapat berupa- kanan (R-CPL) atau kidal (L-CPL) dan non-gambar cermin superimposable. Unsur optik yang mengkonversi cahaya terpolarisasi linier dan cahaya terpolarisasi sirkular disebut piring seperempat-gelombang. Piring seperempat-gelombang birefringent, yaitu indeks bias dilihat oleh horizontal dan vertikal terpolarisasi cahaya berbeda. Pelat berorientasi akan mengkonversi cahaya terpolarisasi linier ke sirkular cahaya terpolarisasi dengan memperlambat salah satu komponen linier balok sehubungan dengan yang lain sehingga menjadi fase keluar seperempat-gelombang . Menghasilkan berkas CPL kiri atau kanan.
Left Circularly Polarised (LCP) Light
Right Circularly Polarised (RCP) Light
Ketika pesawat berpotongan yang dilihat dari depan maka gambar berikut terlihat :

Spektrometri Fluorosense
-- Pengukuran yang sempurna untuk memperkirakan perubahan konformasi dari protein

Spektrometri Fluorosense
a. Penglabelan Serotonin N acetiltransferasi (AANAT) dengan fluoresen (FL) dan rhodamin (Rh) , yang mengharapkan terjadinya transfer resonansi energi fluoresen (FRET) untuk AANAT sebagai monomer (no FRET) dan sebagai oligomer (FRET). b . Pelabelan in vivo pada Glutatione S-transferasi (GST) yang mengandung residue sistein N-terminal dengan membran permiable tetrametilrhodamin thioester (TMR).
TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

Susunan Asli Asam Amino ->Missense atau silent mutasi yaitu Perubahan susunan nucleotide tanpa adanya perubahan susunan protein ->Nonsense, perubahan asam amino yang merubah terminal atau ujung-C protein -> Penambahan susunan amino yang merubah terminal atau ujung-C protein -> Pemotongan susunan amino yang merubah terminal atau ujung-N protein

Primer extension (the single-primer method) is a simple method for site-directed mutation
Metode lama yang digunakan pertama kali, Dengan sintesa Oligonucleotide yang di masukkan ke dalam plasmid
Dalam pengembangannya Digunakan double sebagai ganti rantai DNA primer
Keterbatasan :
Banyaknya Library pada Mutan

Teknik Mutasi Deletion atau insertion

Teknik Mutasi Penghilangan dengan menggunakan enzim restriksi

Oligonucleotide /Saturation mutagenesis
GCTAATTGGCGCAGCTAGTCGATGAAATTTGATGCCATACCCGGG GCTAATTGGCGCAGCTAGGAAATGAAATTTGATGCCATACCCGGG Mutagenesis in vitro - Teknik Mutasi Perubahan Domain (Fusion) dengan Enzim Ligasi dan Multiplikasi PCR-Based
Kloning gen dapat bermutasi secara khusus Memungkinkan adanya mutasi Tertentu Komponen Utama - DNA template - Primer mutasi - DNA pol, dNTP Ada banyak variasi sehingga Dapat meningkatkan efisiensi

Oligonucleotide /Saturation mutagenesis
DNA Mismatch Repair Protein, MutH, pRoses untuk mengoreksi kesalahan replikasi organisme hidup; meningkatkan keakuratan replikasi DNA sampai faktor 1000
The first method of site-directed mutagenesis to be developed was the single-primer method (Gillam et al. 1980, Zoller & Smith 1983). As originally described the method involves in vitro DNA synthesis with a chemically synthesized oligonucleotide (720 nucleotides long) that carries a base mismatch with the complementary sequence. the method requires that the DNA to be mutated is available in single-stranded form, and cloning the gene in M13-based vectors makes this easy. However, DNA cloned in a plasmid and obtained in duplex form can also be converted to a partially single-stranded molecule that is suitable (Dalbadie- McFarland et al. 1982).
APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

Melakukan analisa terhadap interaksi antara protein protein, dan folding/unfoloding protein Melakukan permodelan struktur protein. Melakukan analisa terhadap interaksi ikatan DNA, Melakukan eksplorasi susunan protein, Melakukan kontruksi hibrid protein, dan probing promoter Mengekspresikan Protein dan Regulasi region Menganalisa aktifitas enzim. Melakukan modifikasi sifat sifat kimia protein Memproduksi obat dengan misalnya mengefektifkan Ribonukelasi yang digunakan pada terapi tumor. Menghasilkan aplikasi dalam mengkarakteristik jenis antibodi.

Penelitian ekstensif dan studi daerah ikatan 02 (ligand) protein hemoglobin. Dengan struktur hemoglobin terlarut pada kristalografi X-ray , asam amino yang bertugas untuk mengikat ligand pada protein, bersama dengan helix spesifik dan posisinya ditentukan dan dapat ditampilkan. Residu residu yang bekerja pada konjunksi dengan cincin heme porpirin.
Memperlihatakn tetramer hemoglobin dengan empat daerah yang mengikat ligan dengan distal dan proksimal histidines dalam model tongkat biru cerah. Cincin heme porfirin ditampilkan dalam model tongkat merah dan putih.
Gambar ini memperlihatkan peledakan di kawasan yang mengikat ligan. Rantai samping dari asam amino asam amino kunci pada ikatan ligan (O2 dalam gambar) dan cincin heme porpirin ditunjukkan dalam model tongkat. Ruang kuning penuh molekul merupakan heliks sekitarnya yang membentuk hemoglobin.

Menggunakan strategi desain rasional dapat menyarankan mutasi yang mungkin untuk asam amino kunci yang bertanggung jawab atas pengikatan hemoglobin pada ligan. Sebagai contoh, jika diinginkan sterically menghalangi situs pengikat jika hemoglobin, direncanakan membuat situsmutasi untuk memperkenalkan mutasi yang akan memberikan sifat fisik dan elektrokimia yang dikehendaki. Memilih fenilalanin untuk menggantikan leusin pada posisi 29 akan mengisi situs dengan rantai samping aromatic yang besar. Hasil ini dapat dilihat pada gambar berikut A dan B.
Gambar A. menggambarkan daerah yang mengikat atau "saku" dari subunit hemoglobin. Spasi warna hijau diisi domain memperlihatkan residu leusin wild type dan orientasinya pada pocket. Molekul berwarna merah adalah iksigen dan ditampilkan berikatan terhadap grup heme porfirin (molekul flat pada model tongkat).
Gambar B. memperlihatkan daerah yang mengikat setelah leusin wild type telah digantikan oleh sebuah fenilalanin. Strategi rasional fenilalanin mengisi saku hemoglobin dikonfirmasi pada gambar yang didasarkan dari x-ray kristalografi.
APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

Banyak diaplikasikan pada pembuatan obat, seperti :
-Keefektifan Ribonuclease (Rnase) yang digunakan pada therapi Anti tumor, dapat diimproved dengan teknik site directed mutagenesis
APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

Sistem Ekspresi untuk memfungsikan protein aktif
E. coli expression sistem: Protein processing dan folding pET sistem: 36 tipe vector , 15 host strain yang berbeda
(developed by Studier et al., 1986)
-DE3 lysogne: T7 RNA Pol gene, pada kontrol Promoter lacUV5 -pLysS or pLysE: T7 lysozyme, Inhibitor/ penghabat T7RNA Pol, u/pengkontrolan lebih ketat. e.g.,BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS atau E
Polymer chain reaction METODE MULTIPLIKASI PENDUKUNG desain protein
REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

Polymerase chain reaction untuk mengisolasi fragmen DNA secara cepat
PCR (polymerase chain reaction) mencapai akumulasi eksponensial dari target DNA
Berdasarkan urutan DNA yang telah ditentukan
sebelumnya, oligonucleotides pendek (~ 20bp) dikembangkan dan dilengkapi untuk menyusun DNA target yang diapit . Oligonucleotides bertindak sebagai primers untuk menyalin DNA yang serupa (Replikasi DNA).
Primer Oligonucleotide mulai menyalin DNA.

Setiap siklus replikasi menggandakan jumlah target DNA.
Amplifikasi Exponential
Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required to reproduce or display
APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING

PCR Media Mutagenesis
Mutagenesis Oligonukleotida mismatch (site pre-determined) dengan molekul DNA klone. Sel-base oligonukleotida mismatch (alternative PCR-base site directed mutagenesis). Penggunaan mutagenetik oligonukleotide langsung pada nukleotida tunggal yang disubstitusi pada gene. Gene dikloning pada M13 menciptakan rekombinasi DNA rantai tunggal. Primer oligonukleotida melengkapi susunan gen yang dimutasi (A) dan mengandung base non-komplementari yang diinginkan (C). Annealing primer mutagenik, sintesa rantai kedua diperpanjang dengan polimerasi DNA serta celah/gap ditutup dengan DNA ligase. Hasil heteroduplek ditransformasikan ke Ecoli, dua populasi rekombina dapat dikembalikan menjadi wilde type dan mutant homoduplek, yang kemudian diidentifikasikan dengan hibridisasi molecular (dengan primer mutagenic sebagai probe oligonuklotida alel spesifik).

PCR BASED SITE DIRECTED MUTAGENESIS

PCR BASED SITE DIRECTED MUTAGENESIS

PCR Based Turunan Primer Saturated Mutagenesis

PCR Based Turunan Primer Saturated Mutagenesis

PCR MUTAGENESIS UJUNG 5
Primer dimodifikasi pada ujung 5 untuk memulai proses, sebagai contoh, Group yang telah dilabelkan, susunannya mengandung site restriksi yang sesuai, atau promoter phage untuk menggerakkan ekspresi gen.

PCR MUTAGENESIS SITE SPESIFIK
Mutagenesis menghasilkan produk amplifikasi dengan menglokasikan mutasi pre-determinasi spesifik pada segmen central. Reaksi PCR A dan B dihadapkan pada segmen overlapping yang diamplifikasi pada DNA mengandung mutasi (mempertimbangkan mismatching base dengan primer mutant 1M atau 2M). 2 produk dikombinasikan, denaturasi dan reanneal, polimerasi DNA dapat memperpanjang ujung 3 heteroduplek dengan ujung 3 yang tersembunyi. Produk panjang penuh dengan mutasi segmen central diamplifikasi dengan hanya primer outer 1 dan 2.

PCR - Mutasi site-directed Base Tunggal mismatched amplifikasi primer dan template
Dua primer reaksi PCR memproduksi reaksi dengan overlapping dua fragmen DNA ,menampung mutasi yang sama pada daerah overlap . Susunan overlap merubah fragmen menjadi hibridisasi. Dua hibrid diperpanjang dengan DNA polymerase memproduksi duplex fragment. 1 Hibrid recessed 5 ends hilang dari percampuran reaksi.

PCR Metode Exsite TM
Kedua rantai vektor membawa target gen menggunakan PCR tetapi satu dari primer membawa mutasi yang diinginkan. Hasil produksi populasi liner duplex membawa gen mutasi yang dikontaminasikan dengan tingkat rendah pada siklus template DNA aslinya. Template DNA diturunkan dari Sel E-coli dengan sistem modifikasi restriksi intak , kemudian dimetilasi dan disensitifkan untuk restriksi dengan DpnI Endonuklease. DNA linear diproduksi dengan amplifikasi resistan terhadap pembukaan Dpnl dan setelah sirkulasi ligasi blunt-end dikembalikan dengan transformasi ke E-coli. Setiap molekul hibrid mengandung rantai tunggal template metilasi DNA dan unmetilasi amplifikasi yang akan dihancurkan dengan Endonuklease.
Metode Exsite TM untuk menghasilkan mutasi menggunakan PCR. Plasmid parental membawa target gen yang diturunkan dari rantai restriksi-profisien E-coli dan dimetilasi. Sensitivitas dengan Dpnl endonuklease dan dielminasi secara selektif dari hasil pencampuran akhir PCR

PCR Metode Gen Tailor
Menargetkan DNA yang dimetilasi in vitro sebelum langkah mutagenesis dan overlapping primer digunakan. Linier amplifikan yang diproduksi, membawa mutasi yang diinginkan tetapi saat ditransformasikan langsung pada E-coli, Sel Host memperbaiki sirkulasi enzim mutasi DNA linear, sementara Endonukleas McrBC menguraikan Metilattempate DNA, meninggalkan hanya un-metilat, produk mutasi.

PCR Reverse RT-PCR, salah satu metode sensitif untuk mendeteksi dan menganalisa transkripsi mRNA atau RNA lainnya pada porsi yang rendah
RNA tidak dapat digunakan sebagai template PCR, sehingga harus ditranskripsikan dahulu menjadi cDNA dengan reverse transcriptase dari Moloney murine leukemia virus atau Avian myeloblastosis virus, dan duplikat cDNA kemudian diperbanyak. Teknik ini diawali dengan pencampuran mixing short (12-18 base) polymers thymidine (oligo dT) dengan messenger RNA, dan anneal RNA's polyadenylate tail. Reverse transcriptase ditambahkan dan menggunakan oligo dT sebagai primer untuk sintesa first strand cDNA.
Transkripsi
Roche Molecular Biochemicals: PCR Application Manual. RT-PCR

PCR Gene Sekuensi untuk Mutasi
Produk PCR untuk Mutasi gen yang disaring didapatkan dari Genome DNA menggunakan primer intron-spesfik yang mengapit exon atau dengan Reverse Transkripsi PCR.
(A) Genome DNA, Exons 1-4 dapat diamplifikasi secara terpisah dari Genome DNA menggunakan pasangan primer intron yang spesifik (1F + 1R, 2F + 2R) (B) Reverse Transkripsi PCR. mRNA yang dipresentasikan pada sel secara mudah diakses seperti sel darah, memungkinkan konversi ke cDNA. cDNA kemudian digunakan sebagai template pasangan primer exon spesifk menciptakan Fragmen DNA yang overlapping/tumpang tindih.

PCR Perpanjangan Polimorphism Fragmen Restriksi
Metode untuk mendeteksi daerah restriksi polimorp. Alleles 1 dan 2 dibedakan dengan polimorph yang merubah susunan nukleotida dari daerah resktriksi spesifik untuk restriksi nuklease.
Allele 1 mempunyai daerah, alelle 2 mempunyai nukleotida yang telah dirubah. PCR primer didesain sederhana dari susunan mengapit daerah restriksi untuk memproduksi produk pendek. Penghancuran Produk PCR dengan enzime R dan fraksinasi ukuran menghasilkan penulisan sederhana dua alelles.

PCR STRPS
PCR dapat digunakan untuk menghasilkan tandem pendek polimorps yang berulang (STRPs). Penulisan dari dinukleotida CA/TG mengulang polimorphs yang mempunyai tiga alel sebagai hasil variasi pada jumlah pengulangan CA. Pada autoradiograph setiap alel direpresentasikan dengan band utama bagian atas dan dua minor band bayangan. Setiap A dan B mempunyai genotipe A (1,3) dan B (2,2).

PCR Spesifik Alel
Dasar dari PCR spesfik alel :koreksi pasangan base pada ujung 3 Primer PCR. Spesik alel oligonukleotida primer ASP1 dan ASP2 dirancang untuk menyamakan susunan dua alel terhadap posisi daerah sebelumnya pada varian nukleotida, sampai dengan dan berakhir pada varian itu sendiri.
ASP1 mengikat sempurna, melengkapi susunan rantai alel 1, amplifikasi dengan primer yang dilindungi. Namun, ujung C-3 pada ASP2 primer mismatched dengan T susunan alel 1, sehingga amplifikasi tidak dapat dilakukan. Serupa dengan ASP2 mengikat sempurna alel 2 dan memulai amplifikasi, tidak seperti ASP1.

PCR Metode Taqman Assay
Metode sensitif untuk mendeteksi spesifik Alel menggunakan aktifasi exo 5 dan 3 dan primer ketiga dengan Fluor dan Quencher
Penambahan 2 primer PCR konvensional, P1 dan P2, spesifik untuk susunan target, primer ketiga P3, didesain mengikat spesifik susunan target downstream P1. Pelabelan P3 dengan dua fluorophores,. reporter dye (R) pada ujung 5 dan quencher dye pada reporter dye yaitu pada ujung 3. Ujung 3 diblok/dihalangin, P3 primer ketiga tidak dapat dengan sendirinya prime pada setiap sintesa DNA baru. Selama reaksi PCR, Polimerasi Taq DNA mensintesa rantai prima DNA baru dengan P1 dan enzim mendekati primer ketiga, aktifitas proses dari arah 5 3 menurunkan P3 dari ujung 5. Hasil akhir rantai DNA melebihi daerah ikatan P3 reporter serta quenche dye tidak lagi mengikat molekul sama. Reporter dye tidak lagi dekat pada quencher, meningkatkan emisi intensitas reporter yang dengan mudah dideteksi

PCR DOP
Kloning cDNA untuk porcine urate oksidase mneggunakan turunan oligonukleotida yang berhubungan dengan susunan asam amino yang diketahui. Primer sense dikonstruksikan terhadap kodon 7-11 dan dua base yang pertama dari kodon 12, dan primer antisense berhubungan dangan kodon 34-38 (Lee et.al, 1980). Susunan asam amino dipilih untuk mengkonstruksikan primer yang dipilih dari basis kandungan tinggi asam amino yang dispesifikan dengan hanya dua kodon (Asp, Tyr, Lys, Asn, His). Primer mempunya perpanjangan 5 mengandung susunan yang dikenali untuk restriksi nukleases, untuk memfasilitasi kloning subsekuen sel base.

PCR Linked Primer
PCR link primer memungkinkan amplifikasi indiskriminate susunan DNA pada target DNA yang rumit/kompleks.
Molekul Linked (adaptor) adalah rantai ganda oligonukleotida dibentuk dengan ligasi dua rantai tunggal oligonukleotida dilengkapi pada susunan kecuali yang memiliki kompatible tergantung 5 dengan retriksi nuklease tergantung/overhang (kasus ini, GATC 5 tergantung diproduksi oleh Mbol). Setelah ligasi linker terhadap target fragmen restriksi, primer linked-spesifik mengamplifikasi semua fragmen dengan mengikat dua molekul linker yang mengapit.

PCR Genome Walking
Target komplek DNA terdiri dari banyak fragmen dimana susunan anchor (labuhan) dilampirkan, contoh: linker rantai ganda oligonukleotida. Ide untuk menggunakan spesifik primer susunan anchor dan satu susunan spesifik X diketahui dapat untuk membebaskan fragmen fragmen mengandung susunan X dan mendapatkan akses susunan yang tidak teridentifikasi sebelumnya yang berdampingan terhadap X. Pada contoh ini, susunan anchored ditunjukkan hanya pada sisi kiri dari amplifikasi yang jelas dan dimungkinkan dari susunan karakterisasi N1 sebelumnya yang berdekatan dengan susunan X yang diketahui. Variasi metode derivatif telah disusun, seperti PCR buble-linker.

PCR Hot Start
Teknik mengubah cara campuran PCR dengan pemanasan awal. Polimerase aktif, tapi target belum didenaturasi dan Primer mengikat ke lokasi non-spesifik (atau satu sama lainnya). Teknik dilakukan manual memanaskan komponen reaksi pada suhu pencairan (mis. 95 C) sebelum menambahkan polimerase . Atau, sistem yang menghambat aktivitas polimerase pada suhu lingkungan, oleh pengikatan antibodi, atau inhibitor terikat kovalen yang hanya terdisosiasi setelah langkah aktivasi temperatur tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu lingkungan dan hanya diaktifkan pada temperatur tinggi.

PCR Based Error Prone
Menentukan varians baru protein Berdasarkan prinsip Annelaing Taq Polymerase pada pasangan base yang tidak kompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan dalam kondisi PCR yang tidak sempurna.
PCR dengan ketelitian yang rendah! Dicapai dengan: - Peningkatan konsentrasi ion Mg2 + - Penambahan Mn2 + - Konsentrasi yang tidak sama pada keempat dNTPs - Penggunaan dITP - Meningkatkan jumlah Taq polimerase (Polymerase tanpa bukti fungsi pembacaan)

PCR Based Error Prone
Menentukan varians baru protein ERROR PRONE PCR: - Taq Polymerase berannealing pada pasangan base yang tidak kompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan dalam kondisi PCR yang tidak sempurna
STRATEGy directed evolusi
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN

Teknik ini tidak memerlukan pengetahuan struktur, susunan, atau mekasnisme protein, melainkan penerapan pengetahuan dalam : -
Random Mutagenesis
untuk menciptakan perbedaan genetik
- Seleksi atau Screening/penyaringan untuk memilih varian yang memiliki kualitas yang diinginkan. Beberapa tahapan Mutasi dan Seleksi, meniru evolusi alam. Digunakan untuk Menghilangkan mutasi neutral dan merusak.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN Faktor yang menentukan keberhasilan strategi adalah : - Kualitas dan desain Pustaka/Library
- Pemilihan metode Evolusi

- Pemilihan Rekombinasi DNA - Metode Seleksi atau Penyaringan/Screening
LIMITASI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN
Susunan protein yang dikembangkan memiliki sifat yang hampir mirip dengan susunan induk/parental, sepanjang path evolusinya
- Kapasitas metode untuk menciptakan susunan fungsional yang baru sangat terbatas dan membutuhkan libraries yang besar.
PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI
PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN RANDOM MUTASI
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE NONKOMBINASI DOMAIN SWAPPING

Konstruksi aktual dari desain rasio genes domain-swapped genes dapat diselesaikan dengan beberapa teknik.
Metode cassette mutagenesis

Susunan site restriksi mengapit susunan DNA tertentu untuk ditempatkan dan dihancurkan dengan enzim restriksi dan penggantian susunan dengan memasukkannya di antara sitesnya (Wells et.al.1985).
Metode Gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction

Molekul DNA direkombinasikan tanpa menggunakan pembatasan endonuklease (Horton et al 1989). Fragmen gen yang akan direkombinasikan (gen orangtua) dapat dihasilkan dalam polimerase terpisah rantai reaksi (PCRs).
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KASET MUTAGENESIS

Pembatasan situs terjadi secara alami atau artifisial dimulai pada lokasi diinginkan pada gen target dengan oligonukleotida-directed mutagenesis. Pemilihan pembatasan situs didasarkan pada keunikannya terhadap plasmid dan konservasi asam amino akhir urutan pengkodean.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE SPLICING GEN PCR OVELAPPED EXTENSION
Primer didesain hingga ujung produk mengandung urutan komplementer. Ketika produk PCR dicampur, alur memiliki urutan sesuai ujung rantai 3 yang tumpang tindih dan primer satu sama lain. Ekstensi polimerase DNA menghasilkan urutan asli dihubungkan untuk menggabungkan dua fragmen dalam satu langkah kloning, langkah kloning multiple dibutuhkan untuk melakukan swap domain internal. Variasi metode, Protokol PCR tiga langkah membentuk protein chimeric, hanya satu langkah kloning dibutuhkan untuk bertukar dari domain internal (Grandori et al 1997). Metode digunakan untuk menggantikan domain tertentu protein A oleh domain analog protein B. Studi tentang hibrida domain-bertukar dapat dihasilkan .
Gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction (PCR). Arrows represent primers (14), the solid line and dotted lines represent DNA sequences from two different parent genes
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KOMBINASI

Kadang-kadang sulit diketahui mutasi seperti apa yang dapat
menghasilkan sifat tertentu pada suatu protein

Misalnya, untuk meningkatkan termostabilitas suatu protein masih
sulit untuk dilakukan hanya dengan melakukan prediksi pada struktur 3 dimensi (3-D) untuk menentukan asam amino mana yang menentukan sifat ini
Dengan metoda ini dapat dilakukan mutasi pada berbagai tempat
untuk kemudian dilakukan identifikasi protein mutan yang mana yang dapat menghasilkan fungsi yang diinginkan

Pendekatan in vitro acak , tidak perlu prediksi fragmen protein dan posisi crossover Metode ini memiliki beberapa teknik pendekatan yaitu : Pendekatan chimeragenesis acak Metode penyisipan urutan DNA ke lokasi acak gen target. Investigasi hibrida yang dihasilkan untuk mengidentifikasi situs yang menerima insersi fungsional domain protein menjadi perancah. Pendekatan Permutasi melingkar protei Menghasilkan relokasi N-dan C-Termini. Metode digunakan untuk memahami jalur evolusi dan mengidentifikasi situs permisif secara sistematis untuk permutasi melingkar, informasi mengungkapkan modularitas scaffold/perancah. Pendekatan Rekombinasi Homolog Pendekatan Rekombinasi Nonhomolog.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE CHIMERAGENESIS ACAK

Metode sebenarnya dapat melalui Teknik Pendekatan Kombinasi ataupun Nonkombinasi, dengan keuntungan dan kerugian:

Hybrid proteins segments (domains / subdomains) dari paling sedikit dua natural yang berbeda /protein dari orang tua lelaki . Domains dan subdomains struktural motif variasi ukuran dan kekomplekan Tipe HIBRID: -Single crossover hybrids terdiri dari bagian N-terminal satu protein dan bagian C-terminal protein lainnya.

Tipe HYBRID: -Multiple crossover hybrids, Satu atau lebih internal stretches dari susunan asam amino ditempatkan pada segmen yang berhubungan dari enzim lain. -Fusion hybrids, Domain fungsional protein yang terhubung dengan domain protein lainnya, menciptakan produk gabungan/fuse yang lebih besar dari parentnya. Hybrid dapat menyebabkan mutasi, penghilangan dan penambahan asam amino.
Hybrids between human GSTT1-1 and rat GSTT2-2. Susunan Asam amino dari manusia GSTT1-1 dan tikus GSTT2-2 ditunjukkan pada daerah hitam dan abu abu. Segments berhubunganan terhadap G site dan H site diidenkasi. R-h rathuman, H-r humanrat
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI HOMOLOG

Rekombinasi homolog fragmen DNA DNA beberapa orang tua Produk akhir gen. Mekanisme reassembly: Urutan DNA homologi dan gen homologi rendah (< 70%) tidak dapat dikombinasikan. Bias inheren homolog libraries: (posisi crossover pada Daerah tinggi, bukan rendah, kesamaan DNA) Metode berguna dalam domain swapping Gen orangtua berbagi homologi tingkat tinggi. Rekombinasi homolog Menggabungkan fragmen >> dua gen induk, menjelajahi urutan seluruh keluarga enzim dalam satu percobaan.

Knockoutsgen yang dihasilkan oleh rekombinasi homolog

Metoda untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan:
1. Penelusuran (Skrining): semua pustaka yang ada diperiksa secara acak untuk
mencari protein dgn sifat yang diinginkan

2. Metoda seleksi: Pustaka diseleksi sedemikian rupa sehingga hanya yang
memiliki perbaikan sifat yang ditelusuri Protokol diterapkan pada metoda kombinatorial: 1. Metoda pembuatan pustaka kombinatorial dengan keragaman yang tinggi sehingga meningkatkan kemungkinan diperoleh protein dengan sifat yang diinginkan 2. Penentuan metoda yang digunakan untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan

Protokol dasar in vitro homolog gen orangtua
DNA Shuffling
yaitu Teknik evolusi dengan karakterisik berbeda meniru proses desain atau rekombinasi alami reproduksi seksual dan mempercepat proses perancangan melalui seleksi langsung in vitro dengan mencampurkan dan menyesuaikan protein (match) untuk menghasilkan varian lebih, mempertimbangkan : Teknik ikatan/Folding Protein Termostabilitas Aktivitas Enzim
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI HOMOLOGDNA SHUFFLING

Aplikasi teknik : Rekombinasi homolog invitro Beberapa seleksi Pool Gen melalui Fragmentasi acak Random menjadi fragmen kecil dengan penghancuran oleh Enzim restriksi Dnasel. Fragmen dipasang kembali dengan Teknik PCR dan berfungsi sebagai template dan primer.
Fragmen menyelaraskan dan cross-prime satu sama lain untuk replikasi memberikan untai DNA hibrida dengan beberapa komponen dari gen induk yang asli.

Hal hal yang diperlukan : - Penerapan pada susunan susunan > 1 Kb
- Keberadaan daerah Homologous memisahkan daerah daerah yang berbeda (perbedaan wilayah) - Struktur Scafford-like Protein yang memungkinkan proses yang sesuai untuk Shuffling / Pencampuran

DNase I treatment (Fragmentasi 10-50 bp,Mn2+)
Reassembly (PCR tanpa Primers, Extension dan Recombinasi)
Pemanasan dan Renature secara random
PCR amplification
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN REKOMBINASI HOMOLOG FAMILY SHUFFLING

Genes berasal dari gen famili yang sama -> homologous Tinggi -> Family shuffling
High DNA sequence similarity is required

SHUFFLING-COMBINATORIAL LIBRARIES ENHANCED by RECOMBINATION IN YEAST (CLERY) Famili shufling dengan Efisiensi Tinggi berdasarkan multi-step PCR dan Rekombinasi DNA in vivo pada yeast: Statistik dan Analisa fungsi dari Pustaka kombinasi antara Human cytochrome P450 1A1 and 1A2
Valrie Abcassis, Denis Pompon and Gilles Truan* Centre de Gntique Mol?culaire du CNRS, UPR 2137, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France Nucleic Acids Res. 2000, 28: e88
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING ENZIM RESTRIKSI SHUFFLING
Keuntungan Enzim Restriksi Shuffling: Menghasilkan frekuensi chimeras yang lebih tinggi karena tidak menggunakan DNaseI. (Hidrolisis DNaseI pada DNA beruntai ganda lebih memilih lokasi berdekatan nukleotida pirimidin dan akibatnya bisa memulai urutan bias ke rekombinasi tersebut. Kelemahan Enzim Restriksi Shuffling : Situs crossover bias bertepatan dengan pembatasan situs-situs yang sudah ada.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING ENZIM RESTRIKSI SHUFFLING
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLINGSTAGGERED EXTENSION PROSES (StEP)
Staggered extension proses (StEP) adalah variasi lain dari DNA
yang menggunakan terminal primer untuk meniru DNA target melalui PCR dengan ekstensi waktu yang sangat singkat untuk menghasilkan untai pendek DNA yang direplikasi. Rantai tumbuh DNA bertindak sebagai primer dalam siklus berturutturut dan perubahan template direplikasi beberapa kali, mengumpulkan Komponen dari gen induk yang berbeda. Pada proses ini dibutuhkan susunan DNA homolog tinggi
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLINGSTAGGERED EXTENSION PROSES
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLINGSTAGGERED EXTENSION PROSES
Gen hibrid dikonstruksikan dari dua gen homolog. Cloning dari gen hibrid menghasilkan produksi protein hibrid. Hanya satu rantai dari setiap gen ditunjukkan setelah langkah denaturasi awal.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING-REKOMBINASI PRIMING ACAK

Rekombinasi priming acak : -Reassembli /pengumpulan kembali DNA oleh Sintesa interuppting /penyelaan - Chimeragenesis acak pada tempalte transiens (RACHITT)
Aplikasi praktis di bidang rekayasa protein hasilnya seringkali sulit untuk merasionalisasi karena chimeras yang dihasilkan memiliki banyak parents dan beberapa posisi crossover. Tidak signifikan bila tujuannya adalah produk akhir, yaitu enzim direkayasa dengan sifat yang diinginkan.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING- (RACHITT)
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY)
Teknologi pemotongan Tambahan chimeragenesis menghasilkan hubungan struktur dan fungsi protein yang lebih sesuai. Strategi pertama: -Pemotongan incremental untuk pembuatan enzim hibrida (ITCHY-Incremental truncation for the creation Hybrid Enzymes (ITCHY) menghasilkan perpustakaan protein hibrida single crossover antara dua gen induk.
- Hasil ITCHY pada perpustakaan gen melalui pemotongan tambahan pada positi crossover yang didistrusi acak.
Tambahan pemotongan (arrow pertama) dan penambahan pemotongan enzim hibrida (ITCHY) (Seluruh diagram). Dalam ITCHY, perpustakaan pemotongan inkremental dihasilkan oleh penghancuran DNA oleh exonuclease III.
Fragmen yang dihasilkan kemudian diligasikan bersama-sama untuk menghasilkan perpustakaan akhir
Thio-ITCHY, dengan Analog nukleotida trifosfat Pada PCR, dNTP -phosphothioate digabung acak pada frekuensi rendah ke wilayah target pemotongan DNA.
Internucleotide phosphothioate yang dihasilkan menghubungkan ketahanan terhadap hidrolisis exonuclease 3'-5 ', memberi ketahanan DNA target terhadap degradasi dalam pembuatan ExoI berikutnya. Thio-ITCHY berhasil digunakan untuk menggabungkan kembali gen dengan urutan identitas dengan hanya 36% untuk menghasilkan chimeras aktif Keterbatasan utama ITCHY dan Thio-ITCHY adalah Crossover hibrida tunggal hanya dapat dihasilkan dari dua orang tua , membatasi potensi keanekaragaman urutan.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING MIX ITCHY DAN DNA SHUFFLING (SCRATCHY)
Metode rekombinasi homolog berhasil digunakan kombinasi pada metode lain untuk menentukan faktor penentu spesifisitas substrat dan aktifitas enzim pada variasi family protein. Metode digunakan mencari hubungan struktur-fungsi dan mekanisme evolusi protein. Ketika dikombinasikan dengan skrining genetik /teknik pilihan, dapat digunakan untuk mendapat area baru pada enzim. SCRATCHY adalah teknik membuat perpustakaan crossover dengan menggabungkan ITCHY dan DNA Shuffling secara berurutan.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN PROTEIN (SHIPREC)
Sieber,et al. mengembangkan teknik untuk menciptakan crossover satu perpustakaan chimeric antara dua gen parental tanpa bias untuk posisi crossover . Metode rekombinasi homologi urutan independen protein (SHIPREC), dimulai dengan produksi dimer gen yang kemudian terpecah-pecah oleh DNaseI. Fragment ukuran orangtua dipulihkan dan dibalikkan oleh ligasi melingkar dan restriction menghancurkan untuk menghasilkan sebuah perpustakaan enzim hibrida dengan distribusi yang merata dari posisi crossover.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN PROTEIN (SHIPREC) Libraries of Hybrid proteins dari distantly related sequences
Volker Sieber, Carlos A Martinez & Frances H Arnold, Nature Biotech, 2001,19,p456-460
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING EXON SHUFFLING

In vitro exon shuffling merupakan exon domain encoding atau set dari exon pada target gen dan homolog dari yang lainnya.
Gen yang berhubungan diamplifikasi dengan chimeric oligonukleotide pada primer dan template pada reaksi seperti PCR yang menyusun kembali Gen dengan panjang penuh. Step terakhir melibatkan penyaringan Pustaka Exon shuffling untuk fungsi atau property yang diinginkan.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI NON HOMOLOG

Metode rekombinasi non homolog tidak bergantung pada urutan homologi gen orang tua Karena tidak melakukan hibridisasi fragmen homolog , melainkan membuat langkah ligasi berujung tumpul (bluntended) yang digunakan untuk membawa gen fragmen bersama. Akibatnya, tidak ada bias terhadap komposisi fragmen gen ditemui. Dengan metode rekombinasi nonhomolog, Memungkinkan untuk membuat perpustakaan chimeras dari dua gen yang sepenuhnya tidak berhubungan.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI NONHOMOLOG

Metode rekombinasi nonhomolog didasarkan pada pemotongan inkremental, bentuk paling sederhana menciptakan perpustakaan protein yang memiliki satu atau lebih asam amino , dihapus baik dari Catau N-terminus . (Ostermeier et al 1999a).
Pemotongan Tambahan dan metode terkait tergantung pada exonuclease III (ExoIII) protein dan sifat-sifatnya. ExoIII mengkatalisis pencernaan fragmen gen dari 3 'ke ujung 5' pada dikontrol, seragam, dan sinkron tingkat (Wu et al 1976). Aliquots Kecil campuran reaksi dihapus selama langkah pencernaan untuk membuat perpustakaan gen dengan nomor berbeda dari pasangan basa DNA yang dihapus.

Dipandu oleh informasi struktur dan biokimia (independen pada homologi) dihalangi kompleksiti struktur protein & fungsinya Random mutagenesis: (-) perlu pengetahuan detail DNA shuffling: (-) perlu ilmu detail menciptakan enzim hybrid oleh multiple crossover (homolog dependen bersusun tinggi) StEP: Homologi dependen susunan tinggi ITCHY & SHIPREC: HomologyIndependent tetapi terbatas pada single crossovers.
Increased possible crossovers (the darkness of the bar)
APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTION

Meningkatkan enzyme fitness untuk aplikasi yang ditentukan
Enzyme adaptasi: Meningkatkan aktifitas Substrat Baru Substrate specificitas -- Multiple substrates affinity Thermostabilitas-- melting point (Tm) Adaptasi Temperatur: Activitas pada suhu yang berbeda -- Psychrophilic vs. Mesophilic vs. Thermophilic Stabilitas atau aktifitas pada linkungan artificial/buatan -- Solvent vs. aqueous solutions -- Metal ions (protease) Antibiotic resistansi
Antibiotic resistansi Librari generasi mutan acak enzim TEM-1 menggunakan P dan 8 -oxoG mutagenesis Kanan: A-TEM 1 mutan (3D.5) yang dihasilkan oleh random mutagenesis dengan 2.500 kali lipat aktivitas hidrolisis yang lebih tinggi terhadap antibiotic sefalosporin (dari Zaccolo dan Gherardi, J mol Biol 1999).
APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTION

APLIKASI METODE REKOMBINASI Rancangan rekombinan Hemoglobin manusia digunakan untuk menentukan pengganti darah. Looker D, Abbott-Brown D, Cozart P, Durfee S, Hoffman S, Mathews AJ, Miller-Roehrich J, Shoemaker S, Trimble S, Fermi G, et al Nature 356:258-60 , (1992) Efek Penanaman allosterik unik dari buaya kepada hemoglobin manusia, Komiyama NH, Miyazaki G, Tame J, Nagai K Nature 373:244-6 (1995)
Merekayasa mutan HGF/SF dengan ikatan yang dikurangi untuk heparin sulfat proteoglikan dan meningkatkan aktifitas in vivo. Hartmann G., Prospero T., Brinkmann V., Ozcelik O., Winter G., Hepple J., Batley S., Bladt F., Sachs M.
Susunan Asam amino Alignment pada Subtilisin S41(Davail, et.al 1992), S39 (Narinx, 1992), SSII (Wati,1997), BPN (Wells, 1983), E (Stahl Ferrari ,84),Carlsberg (Jacobs,85) dan Termitase (Meloun, 85). Alignmen multiple dilakukan dengan CLUSTAK W (Thompson,94). Residu ditemukan frekuen >50% pada posisi (hitam). Mutasi pada 3-2G7 dilabelkan dengan Kotak terisi. Gap pada susunan (0)

Lineage substilisin varian S41. Varian generasi pertama Yang didapat sebelumnya. (Miyazaki&Arnold, 1999). Tujuh mutasi didapat dari Generasi pertama direkombinasikan oleh StEO dan varian terbaik, 2-6C5 didapat pada generasi Pustaka kedua. Diparentkan /dihubungkan dengan gen orangtua untuk Menciptakan generasi pustaka ketiga oleh PCR Error prone. Hanya nonsinonim mutasi ditunjukkan.

Subtilisin dari struktur yang diketahui. Tujuh mutasi termostabli diidentifikasi padad varian 3-2G7. Kalsium Ca hitam menindikate site ikatan Ca2+ yang ketat dan indikate Ca abu abu site mengikat Ca2+ yang lemah, yang dilokasikan dibelakang loop yang mengandung Ser175 Model diciptakan menggunakan MOLSCRIPT (Kraulis, 1991). Dependasi Temperatur aktifitas spesifik subtilisin S41, 3-2G7, dan SS11.
Divergent evolution leads untuk Adaptasi pada lingkungan yang berbeda
Sebuah trade off antara aktivitas katalitik pada suhu dan thermostabililt rendah

Directed evolution Enzim psychrophilic, Subtilisi S41
Assays pada temperatur yang berbeda
Ar, Aktifiti residu; Ai, activitas inisial Red dots: wild-type clones Menunjukkan reprodukibilitas
3-2G7: 7 mutasi asam amino setelah jumlah siklus shuffling
J. Biological Chemistry, 2000, 275: 31635

Rekayasa Stabilitas Enzim T4 Lysozye Dengan Introduksi pada Iktan S-S

Rekayasa Stabilitas Enzim Triosephospate isomerase dari Yeast dengan menggantikan Asn (deaminasi pada temperatur tinggi)

Rekayasa Aktifitas Enzim Tyrosyl-tRNA synthetase dari B. Stearothermophilus dengan menggantikan Thr 51 (meningkatkan affinitas ATP)

Rekayasa Pengaruh Ca menganalisa Independensi Subtilisin
Saturasi mutagenesis -> 7 dari 10 daerah ditemukan untuk memberikan peningkatan stabilitas Mutan: 10x lebih stabil daripada enzim asli dalam ketiadaan Ca 50 % lebih stabil daripada enzim asli dengan adanya Ca

Mengurangi Sensitifitas Protein
Streptococcus streptokinase, 47 kDa protein yang melarutkan clot darah Komplex dengan plasminogen untuk merubah ke plasmin, yang menurunkan serat pada clot, Plasmin juga menurunkan streptokinase [feedback loop] Membutuhkano administer streptokinase pada 30-90 min infusi[heart attacks] A long-lived streptokinase diadministered sebagai single injection
www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06

Mengurangi Sensitifitas Protein
Streptococcus streptokinase, plasmin sensitivity domain Attacks at Lys59 and Lys382, near each end of protein Resultant 328 AAc peptide has ~16% activity Mutate Lys to Gln Gln has similar size/shape to Lys also no charge Single mutations similar to double to native in binding and activating plasminogen; In plasmin presence, half-lives increased with double as 21x more resistant to cleavage TBD(2003) longer life wanted
www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06

Peroxidase, ink cap mushroom; dye transfer inhibitor Wash conditions: bleach-containing detergents, pH 10.5, 50C, high peroxide concentration (inactivates peroxidas) Random mutagenes or error-prone PCR, followed by DNA shuffling One construct had 114x increase in thermal stability, 2.8x increase in oxidative stability
Mushroom peroxidase

Molecular analysis hybrid peroxidase
ex., Coprinus cinereus heme peroxidase (ink cap mushroom); 343 AAc, heme prosthetic gr Multiple rounds directed evolution to generate mutant for dye transfer inhibitor in laundry detergent Native form or WT is rapidly inactivated under laundry conditions at pH 10.5, 50C and high peroxide concentrations (5-10mM) Combined mutants from site-directed and random mutagenesis led to mutant with 110x thermal stability, 2.8x oxidative stability Additional in vivo shuffling of pt mutations -> 174x thermal stability and 100x oxidative stability
CherryPedersen. 99. Nat Biotech Directed evolution of a fungal peroxidase
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI
Glycosylation PEGylation as a Mimic of Glycosylation 1 Thiol Tag (X: SH) 1 Amine Tag (X: NH2) 2 Amine Tag (X: NH2) 2 Azide Tag (X: N3) 3 Carbonyl Tag (X: C=O) 3 NCL Assembly 4 Olefin Tag (X: =) 4 Hydroxyl Tag (X: OH) 5 Azide Tag (X: N3) 5 Thial Tag (X: SH) 6 Alkyne Tag (X: ) . 6 Disulfide Tag (X: SS) Lipidation 1 NCL Assembly 2 Hydroxyl Tag (X: OH) 3 Thiol Tag (X: SH) 4 Olefins (X: =)
Modifikasi bentuk kualitatif kimia , misalnya, biotinylation untuk tag afinitas, fluoresensi label untuk visualisasi, sering mengabaikan isu-isu strategis utama Tingkat Konversi - beberapa modifikasi metode kimia protein yang dipakai sekarang telah dioptimalkan untuk tingkat yang memungkinkan konversi lengkap. Partial konversi menciptakan kembali kebutuhan untuk pemurnian dimodifikasi dari yang tidak dimodifikasi. Selektivitas - metode yang dirancang untuk chemoselectivity jarang dilakukan dalam konteks protein, yang seringkali mengandung banyak kelompok fungsional sebagai potensial, kompetitif, reaktif partner.
-Teknologi dengan cara: - Menghilangkan atau menambahkan daerah Glycosylation - Merubah sifat biokimia atau aktifitas Protein - Meningkatkan kestabilan protein Dengan Merubah Daerah Glycosylation:
-Menggunakan teknik Mutagenesis Site-Directed untuk menetapkan Daerah glycosylation yang baru. Sebagai contoh Erythropoietin.
-Hubungan direct/langsung antara Karbohidrat yang mengandung Asam Sialik dan serum half-life nya dan aktifitas biologi in vivo. -Hubungan Inverse/berlawanan antara ikatan Reseptor (contoh: Glycosylation yang lebih banyak menyebabkan lemahnya ikatan)
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI Glycosidase:
Glikosida digunakan utnuk mendapatkan informasi tentang group karbohidrat yang dilampirkan pada glikoprotein dan glikopeptida.
Glikosida ada pada dua variasi : =Endoglikosida yang memotong seluruh group karbohidrat dari protein dan exoglikosida yang menghilangkan monosakarida dari ujung nonreduced pada karbohidrat.
Pengurangan ujung diciptakan oleh endoglikosida Endoglikosida diikuti oleh satu atau lebih eksoglikosida dant menganalisa produk menggunakan SDS-PAGE atau beberapa tipe kromatografi cair.
Pengobatan Anemia dengan perlakuan awal Hypothesis : Glikosilasi yang lebih banyak menyebabkan: > half life yang lebih panjang > Lebih aktif > mengurangi afinitas ikatan Produk pemrosesan : HyperglycosylatedEPO (Aranesp)
Hasil In vivo Tidak adanya kehilangan pada fungsi obat Penambahan serum halflife (3fold lebih panjang) Mengurangi frekuensi administrasi
Glycan dimulai dari penggabungan daerah baru yang untuk kebutuhan target sintesis reagen glycan kompleks dengan strategi untuk memulai situs-selektif. Meskipun peran glycans tersebar luas daam fungsi protein , ia hanya muncul pada kasus-kasus dasar. Metode untuk mengakses glycoforms murni atau meniru nya, saat ini mulai memainkan peranan kritis dalam aspek unpicking yang tepat untuk fungsi glycan.
Amine Tag (X: NH2)
Fig. 5 Modification of a protein with a generic 2-methoxy-2-imino activated monosaccharide. a four equivalents of sodium methoxide; b pH 9.5, 2 h, 41 of 59 residues modified. BSA bovine serum albumin
Modification of HSA using squaratemediated coupling. a DMF, Et3N, 40%; b HSA, HCO3 buffer, pH 9.0, 25% of lysine residues modified
Modification ketone handle introduced in the Zdomain of staphylococcal protein A with oxyamine-functionalized N acetylglucosamine. Conditions are a NaOAc buffer, pH 5.5 and b (1) UDP-Gal, -1,4-GalT, (2) CMP-Sia, -2,3-SiaT (Olefin Tag)
Protein Kinases:
Penambahan reversible gugus fosfat pada protein penting untuk transmisi sinyal dalam sel eukariotik dan, sebagai akibat, fosforilasi protein dan dephosphorylation banyak mengatur proses seluler yang beragam. Karena jumlah kinase protein yang dikenal telah meningkat dengan kecepatan yang terus meningkat, maka menentukan protein kinase yang berinteraksi dengan substrat dalam sel dapat dilakukan. Penentuan motif situs konsensus fosforilasi oleh urutan asam amino selaras dari substrat yang dikenal telah terbukti bermanfaat dalam pengerjaan ini. Motif ini dapat membantu untuk memprediksi situs fosforilasi untuk kinase protein tertentu dalam substrat protein potensial.
Protein Phosphatases:
Protein fosforilasi memainkan peran dalam regulasi fungsi dan aktivitas faktor protein dan enzim. Protien fosforilasi dapat ditemukan pada tirosin, serin dan threonie residu. Analisis adanya fosforilasi tersebut, dan efek petugas nya, sering dibantu oleh penghapusan kelompok protein fosfat oleh fosfatase.
-PEGylation (monomethoxypolyethyleneglycol)
-Kovalen lampiran polimer, poli (ethylene glycol) (PEG) secara khusus, untuk protein terapeutik adalah metode mapan (Harrisdan Catur 2003). -Digunakan untuk meniru beberapa efek alam glikosilasi dalam rangka meningkatkan perlindungan protein terhadap degradasi enzimatik, memperpanjang sirkulasi setengah hidup dan meningkatkan daya larut. Prinsip serupa dengan Glycosylation:
Aplikasi pada Protein Drugs menghasilkan : - Secara relatih memiliki half-lives yang singkat - Distribusi tissue/jaringan yang lebar - Potensial untuk Immunogenicity
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN REKAYASA PROTEIN METODE MUTASI KIMIA POSTMIMIK POST TRANSLASI KIMIA TRANSLASI
METODE LIPIDASI
Tipe dominan : myristoylation, prenylation dan palmitoylation. Protein prenilasi alam mengacu pada lampiran pasca-translasi rantai lipid farnesyl (C15) atau geranylgeranyl (C-20) urutan tertentu pada tulang punggung protein dan dimodifikasi di C-terminal protein.
Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: protein farnesyltransferase dan protein geranylgeranyltransferase tipe I dan II. Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantu membran menahan protein, Ex.Ras G-protein membentuk kompleks dengan protein pendampingnya,REP, selanjutnya terprenilasi . Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran penyakit , seperti osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsi normal osteoklas, sel-sel terlibat dalam penghancuran jaringan tulang, dan progeria Hutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan cepat.
Modification of a tyrosine residue with farnesyl or rhodamine by palladiummediated -allyl coupling of an allyl acetate or carbamate precursor. Conditions are a Pd(OAc)2, Triphenyl phosphine trisulfonate (TPPTS), H2O/dimethyl sulfoxide, pH 8.59.0
Carbenoid reactions with tryptophan as an aromatic tag. Although currently nonselective, these reactions highlight a useful new reaction type for protein modification
TEKNIK PENGGABUNGAN PROTEIN (FUSI)

Teknik ini adalah rekayasa protein baru / novel dengan menggabungkan atau menyatukan susunan protein protein berkode pada satu gen terhadap susunan protein berkodekan gen yang berbeda. Contoh yang ada adalah penggunaan An untuk meracuni langsung daerah target. Seperti Denileukin diftitox (Ontax) yaitu terapi yang disetujui FDA untuk Kanker, dengan hasil 30% pasien menglami pengurangan pembesaran tumor sebesar 50%.
Ontak berasal dari Fusion Protein : IL2 + diptheria toxix dan aa 2nd133 human IL2 +1st389 aa of diptheria toxintargets IL2 receptors pada CTCLs untuk membunuh sel. Denileukin diftitox (Ontak) telah disetujui FDA pada terapi kanker Ontak mengikat permukaan sel lymphoma melalui reseptor IL2 Saat Internalisasi, diptheria toxin membunuh sel sel.
TEKNIK ISOLASI PROTEIN

Protein ekstraseluler
Tahapan isolasi Sentrifugasi cairan sel/ medium kultur menghasilkan : Supernatan (crude extract) Pelet (sel & komponen non-protein)
Protein intraseluler
Tahapan isolasi : Cuci jaringan/ sel dengan bufer salin : untuk menghilangkan pengotor/ bahan ekstraseluler Sel mikroba : sentrifugasi & resuspensi dalam bufer Lisis sel memecah/membuka sel ekstrak : homogenat Menggunakan mortar/pestle, homogenizer, sonicator, tissue grinder, cell disruptor, blender Menghasilkan : homogenat Sentrifugasi menghasilkan : pelet (mengandung protein membran) supernatan (crude extract)
KLASIFIKASI METODE ISOLASI PROTEIN vs JARINGAN

Klasifikasi Metode Isolasi Protein Berdasarkan Jenis Jaringan Protein
TUJUAN PEMISAHAN PROTEIN

Tujuan dari Pemisahan Protein adalah kemurnian,
penggunaan bentuk aktif jumlah langkah minimum Memungkinkan waktu yang singkat
JANGAN MEMBUANG BAHAN BAHAN MURNI PADA IMPUPRE PROTEIN PEMISAHAN DILAKUKAN BERDASARKAN KELARUTAN, UKURAN, MUATAN, DAN IKATAN AFINITAS
TEKNIK PENGHILANGAN KOMPONEN NON-PROTEIN
METODE PEMISAHAN PROTEIN

Metode Kromatografi
Protein protein membedakan bentuk dan charge
Ion exchange Kromatografi

Anion and Cation
Gel Filtrasi (size exclusion)

Memisahkan berdasarkan ukuran
Metode Afinitas
Affinitas terhadap ligands Rekayasa afinitas sites, e.g. histidine tag
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN - KROMATOGRAFI

Kromatografi gel filtrasi. Campuran protein dalam volume kecil diterapkan pada kolom yang diisi dengan manikmanik berpori. Karena protein yang besar tidak bisa masuk volume internal manik-manik, mereka muncul lebih cepat daripada yang kecil.
TEKNIK PEMISAHAN KELARUTAN / SOLUBILITAS

Metode Penggaraman/Salting out
Kelarutan sensitif terhadap kekuatan ion. Awal "salting in" dan kemudian "salting out" pada kadar garam tinggi. Pelarut terikat dengan berinteraksi pada garam sehingga tidak cukup untuk melarutkan protein. Kadar garam maksimal pada target protein larut, sentrifuge dan membuang pelet. Tambahkan cukup garam untuk menurunkan protein. Kumpulkan pelet. Pelarut organik Mempunyai prinsip sama dengan penggaram; mengambil keuntungan dari kelarutan yang berbeda. Menghindari total protein denaturasi. pH Protein memiliki kelompok berionisasi berrentang pKs. Ketika muatan total protein nol (titik isoelektrik/pI). Protein paling larut pada pl karena interaksi mereka untuk meminimalkan muatan muatan. Kristalisasi Metode kelarutan dimana protein adalah ppt dapat digunakan untuk menumbuhkan kristal protein. Terjadi ketika protein relatif murni.
TEKNIK PENGENDAPAN AMONIUM SULFAT (SALTING OUT)

Ketika konsentrasi garam yang tinggi hadir, protein cenderung terkumpul
dan mengendap keluar dari solusi: "salting out / penggaraman keluar" Endapan protein yang berbeda pada konsentrasi garam berbeda. pH, suhu dan kemurnian protein memainkan peran menentukan titik salting out. Amonium sulfat adalah garam yang dipilih karena menggabungkan banyak fitur yang berguna:

Efektifitas penggaraman / Salting out pH versalitas Kelarutan tinggi Larrutan dengan temperature panas Harga yang rendah
Amonium sulfat konsentrasi: persentasi kejenuhan Persamaan sederhana untuk perhitungan gram amonium sulfat yang
dibutuhkan untuk membuat suatu solusi X% dari% Xo:

515 (X-Xo) G=------------------------100-0,27X
TEKNIK ISOLASI PROTEIN DIALISIS
TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE
Low salt P+ + Na+ High salt Na+ + P+
IONIC ELUTION pH ELUTION
TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE
TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN ION EXCHANGE
STRONG CATION SO3 Sulpho CH2SO3- Sulphomethyl C3H6SO3- Sulphopropyl WEAK CATION Carboxy
COO-
STRONG ANION CH2N+(CH3)3 Triethylaminomethyl C2H4N+(C2H5)3 Triethylaminoethyl C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl WEAK ANION C2H4N+H3 Aminoethyl C2H4N+H(C2H5)2 Diethylaminoethyl
CH2COO- Carboxymethyl
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN FILTRASI GEL

Porous beads yang terbuat dari
material yang berbeda. Ukuran pores dapat dikontrol. Molekul kecil cukup mudah untuk melalui beads yang lebih besar ukurannya dan berkeliling kemudian mengalir lebih cepat. Pengecualian pada semua protein yang terlalu besar untuk melalui pores. Dapat digunakan sebagai metode preparasi atau digunakan untuk menentukan ukuran molekul. Gels terbuat dari deekstran, agarose or polyacrylamide
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN METODE AFINITAS

Ligan yang memiliki ikatan kuat
terhadap protein ditempatkan pada matriks : Protein dengan ikatan yang diinginkan tetapi yang lain dapat melalui. Elute menggunakan larutan ligan. Selain molekul kecil, juga dapat menggunakan antibody Kemajuan biologi molekuler memerlukan rekayasa grup poli-nya yang mengikat Ni atau menggunakan bagian dari protein lain dan kolom yang mengikat ke protein lain
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN METODE AFINITAS
TEKNIK ISOLASI PROTEIN dan VISUALISASI

Protein bermigrasi pada medan listrik pada tingkat yang tergantung pada muatan total, ukuran, dan bentuk Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan oleh muatan (pemisahan dalam media sebagai gels) pada media Gel berpori (pati / poliakrilamida): gel & pewarnaan Fokus isoelektrik *: protein dipisahkan dalam gel gradien pH berkelanjutan, protein berpindah ke titik pada gel yang sama untuk pl nya, yaitu tak ada muatan. SDS-PAGE *: Sodium Dodecil Sulfat - elektroforesis gel poliakrilamida yang memperlakukan protein dengan deterjen ionik yang memisahkan berdasarkan ukuran SDS mengikat protein @ 1 SDS / 2 aa's sehingga proporsional terhadap massa jenis protein.
TEKNIK ISOLASI PROTEIN SDS PAGE
TEKNIK IDENTIFIKASI PROTEIN DAN QUANTIFIKASI

Identification biasa dilakukan dengan spectrophotometry
spectrophotometers mengukur intensitas cahaya beam sebelum dan sesudah cahaya melewati larutan solveent dengan sampel terlarut padanya, (in a cuvette)... Membandingkan intensitas dua cahaya terhadaap panjang gelombang yagn dilewati.
Percent transmittance...
Rasio dari intensitas cahaya melewati sampel terhadap intensitas cahaya yang bersinar pada sampel dikalikan 100%. Absorbance... adalah logaritma transmittans Instruments... Spectronic 20/ spectrophotometer UV/ Vis
TEKNIK DETEKSI PROTEIN METODE SPEKTROFOTOMETRI

UV absorbance at 280 nm. (measures aromatic aa's)
Colorimetry reactions - colored dye binds to amino acids
Ninhydrin reaction - rx's w amino = blue color (10-9 M)
Biuret test = mg quantities based on Copper ion binds stiochiometrically = violet color Bradford test = ug amounts based on dye Coomassie blue - binds to peptide Fluoroescamine dye = pg quantities... (10-12 M)
Quantifikasi jumlah protein ditampilkan berdasarkan hukum BEER-
LAMBERT linear relationship antara... light Absorbance vs. Conc Protein Standard Curve
TEKNIK QUANTIFIKASI KONSENTRASI PROTEIN DENGAN AKTIFITAS ENZIM

Berkaitan jumlah protein &aktivitas enzim 1 (internasional) UNIT KEGIATAN Enzim jumlah protein yang mengubah 1 micromole dari Substrate ke produk per menit pada 250C pada pH yang optimal UREASE - 1 unit (IU) akan membebaskan 1,0 mole amonia dari urea per menit pada pH 7,0 pada suhu 25 C [Equivalent untuk 1.0 I.U.] 1UNIT KEGIATAN KHUSUS jumlah micromoles dikonversi per min per mg protein yaitu, Unit (seperti di atas) aktivitas enzim per mg protein 1 UNIT KEGIATAN MOLEKUL jumlah unit aktivitas enzim per mole
TEKNIK PURIFIKASI PROTEIN
Protein Purification
TEKNIK PURIFIKASI PROTEIN
APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN

E. coli tidak dapat digunakan untuk menghasilkan beberapa protein terutama yang membutuhkan modifikasi pasca-translasi untuk aktivitas biologis dan beberapa kompleks protein lain yang mengandung beberapa ikatan disulfida. Selain itu, banyak protein disajikan dalam E. Coli adalah akumulasi intra dalam bentuk larut, inklusi bodies tidak aktif, dari aktivitas biologis yang harus dipulihkan oleh denaturasi rumit dan mahal serta proses refolding. Kelemahan E. coli menyebabkan perkembangan penggunaan sistem ekspresi dengan sel hewan / sel tumbuhan. Namun, meskipun sistem tersebut telah terbukti mampu menghasilkan protein aktif yang otentif, sering ditemui kegagalan untuk mengembangkan metode yang sederhana dan efisien, hasil tinggi, biaya rendah untuk produksi protein dalam jumlah besar. Kemajuan dalam protein refolding, translokasi dan peran chaperons molekul dan foldases telah memungkinkan desain strain E. coli rekombinan yang menumpuk protein dalam bentuk terlarut, protein mensekresikan ke periplasm, ekspor ke medium, dan protein langsung ke membran luar sel untuk menampilkan permukaan. Kemajuan ini akan diperkuat lebih lanjut status dominan E. coli sebagai host untuk produksi protein rekombinan.
Figure 2. Keuntungan dan Kerugian produksi pretin pada setiap kompartemen Escherichia coli
untuk menargetkan ekspresi protein ke kompartemen selular tertentu, yaitu, dengan ruang sitoplasma, ruang periplasmic atau medium, terletak pada keseimbangan keuntungan dan kelemahan dari masing-masing kompartemen (Gambar 2).

Expression Systems: Overview
Dalam vektor ekspresi pMal Fusion dan Sistem PemurnianbProtein, kloning gen dimasukkan ke dalam vektor vektor ekspresi pMal turun dari gen laki-laki, yang menyandikan protein-pengikat maltosa (MBP). Hal ini menyebabkan ekspresi protein fusi MBP-yang kemudian dimurnikan oleh pemurnian afinitas satu langkah khusus untuk MBP.
Secreted protein processing with K. lactis. In the nucleus, an integrated expression vector encoding a fusion between the -MF domain (blue) and a desired protein (black) is expressed. A signal peptide in the -MF domain directs entry of the fusion protein into the endoplasmic reticulum (ER) and is removed by signal peptidase (SP). The fusion protein is transported to the Golgi where the Kex protease removes the -MF domain. The protein of interest is then secreted from the cell.

Purifikasi step tunggal chromatographic Target penggabungan protein pada setiap terminal C- or N -Tidak memerlukan proteasis -- T7 promotor menjadmin level ekspresi yang tinggi -- Hasil protein dengan susunan native - Eluted protein dengan C-terminal thioester dapat menjadi ligase untuk ptptida atau protein (Intein Mediated Protein Ligation, IPL Kit memungkinkan fusi dari Tag yang terdiri dari ikatan intein dan domain chitin domain (CBD), pada C-terminus (pTXB1) atau N-terminus (pTYB21) target protein. Dengan adanya thiols, seperti DTT, intein menjalanin pemotongan sendiri yang sepesik yang melepaskan target protein dari ikatan Tag chitin-intein

In Vitro Protein Sintesa Kit:
Sistem Transkripsi/Translasi Sel Bebas Rekonstitusi dari komponen murni seperti translasi E. coli
Komponen Recombinant bebas mengkontaminasi exonucleases, RNases dan proteases Hasilnya protein yang bebas untuk dimoddifikasi dan degradasi Reaksi satu langkah membutuhkan pencampuran hanya dua tabung diikuti oleh penambahan Template DNA hanya beberapa jam Sintesa protein divisualisasikan dengan Pewarnaan Gel Coomassie

Magnetic Affinity
Ideal untuk skrining proteomic throughput yang tinggi, isolasi protein kecil , isolasi immunomagnetic atau percobaan pemisahan sel - Memurnikan tagged protein, antigen, antibodi atau asam nukleat - Pemisahan cepat fase-padat dari larutan - Substrat immobil tetap aktif secara biologis - Elute dalam volume kecil atau digunakan sebagai ligan dalam interakasi pulldown atau target percobaan yang melibatkan DNA atau protein
Magnetic Separation Racks
Protein Tools and Glycomics Overview

Protein Engineering - Siti Julaiha

Uploaded by

Document Information

Copyright

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Protein Engineering - Siti Julaiha

Uploaded by

Copyright:

REKAYASA PROTEIN

Rekayasa protein adalah campuran menarik dari pengetahuan :

SEJARAH REKAYASA PROTEIN

TUJUAN REKAYASA PROTEIN

Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain

Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk untuk suatu produk

Rational Protein Design

Proteins with Novel Properties

Merekayasa mengikat situs alosterik

APLIKASI REKAYASA PROTEIN

Memproduksi jenis obat obatan

APLIKASI REKAYASA PROTEIN

STRATEGI REKAYASA PROTEIN

STRATEGI DESAIN DE NOVO

TUJUAN STRATEGI DESAIN DE NOVO

LIMITASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Protein architecture vs. Protein folding vs. Biological functions

STRATEGI DESAIN DE NOVO

STRATEGI DESAIN DE NOVO

NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)

APLIKASI X-RAY KRISTALOGRAFI

NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)

NMR sample is prepared in a thin walled glass tube.

NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)

APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Exemple: Neurodegenerative diseases

APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

STRATEGI DESAIN rasional

LIMITASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

Vertically Polarised Light

Horizontally Polarised Light

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

Left Circularly Polarised (LCP) Light

Right Circularly Polarised (RCP) Light

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

Dalam pengembangannya Digunakan double sebagai ganti rantai DNA primer

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI

APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

Polymer chain reaction METODE MULTIPLIKASI PENDUKUNG desain protein

REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

Primer Oligonucleotide mulai menyalin DNA.

REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required to reproduce or display

APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING