Professional Documents
Culture Documents
PENDAHULUAN
Protein : senyawa berlimpah dlm sel
BM 5000 Dalton - > 1 juta Dalton Senyawa N membendakan protein dg makromolekul lain Total N 13,4 19,1 Protein yg kaya AA basa, N >
Dpt didenaturasikan oleh : panas, alkali, asam, 8M urea, pelarut organik dan detergent serta 6 M guanidin - HCl
Analisis Protein cukup kompleks krn : Bbrp komponen pangan sifat fisikokimia nya mirip protein Nitrogen non protein : AA bebas, peptida kecil, asam nukleat, fosfolipid, gula amino, porfirin, beberapa vitamin, alkaloid, asam urat, ion amonium Total N : >> dr protein
Telur mentah
Ikan tuna Beras pecah kulit Kedelai (kering) Terigu ( hard wheat) Polong-polongan (semua var.)
12,9
24,2 7,5 34,1 13,3 22,3
METODE ANALISIS
KJELDAHL Prinsip : Protein dan komp. Organik pangan dicerna oleh asam sulfat + katalis (total N organik amonium sulfat )
1.
Ditambahkan asam sulfat : konversi Nitrogen mjd amonium sulfat 2. Netralisasi Diikuti dengan distilasi 3. Titrasi
Modifikasi Kjeldahl
Ditambahkan katalis logam : Hg, Cu, Se pd H2SO4 utk
menyempurnakan digestion. Hg paling bagus K2SO4 di+kan utk meningkatkan titik didih H2SO4 shg mempercepat digestion Amonia didistilasi secara langsung dlm larutan asam borat diikuti dg titrasi dg asam standar
PROSEDUR ANALISIS
Bhn padat dihaluskan ( dpt melewati saringan 20 mesh)
1. Digestion
Sampel ditimbang dg akurat dlm labu kjeldahl. Tambahkan asam dan katalis Digest sampai jernih utk menghancurkan semua bhn organik. Reaksi N + H2SO4 = amonium sulfat
Protein
H2SO4 (NH4)2SO4
panas, katalis C, O mjd CO2 H, O mjd H2O 2. Netralisasi dan Distilasi Hasil digest diencerkan dg air. Alkali yg mgd Na tiosulfat di+ kan utk menetralkan H2SO4 Amonia yg terbentuk didistilasi dalam larutan asam borat yg mgd indikator metilen blue dan metil merah
3. Titrasi Ion borat (proporsional dg jml N) ditirasi dg HCl standar H2BO3- + H+ H3BO3 4. Perhitungan Mol HCl = Mol NH3 = Mol N (dlm sampel) Blanko reagent juga hrs dibuat dan dititrasi % N = N HCl x vol. asam koreksi x 14 g N/mol x 100 g sampel
Dimana : N HCl = normalitas HCl ( mol / 1000ml) Vol. Asam koreksi = ml asam std utk sampel ml asam std untuk blanko 14 = Berat Atom N
% protein = % N atau 16
% protein = % N x 6,25
Jagung
Oat Kedelai
16,0
17,15 17,51
6,25
5,83 5,71
Aplikasi
Keuntungan : Dpt diaplikasikan untuk semua jenis pangan Metode relatif sederhana Murah Akurat untuk kadar protein kasar Kelemahan : Mengukur semua /total N organik ( bukan hanya dr protein) Butuh waktu relatif lama ( minimal 2 jam) Ketelitian lebih rendah dr metode Biuret Reagent korosif
2. Metode Biuret Prinsip : Terbentuknya warna ungu (violet-purpulish) yg dihasilkan ketika ion Cu membentuk kompleks dg rantai peptida ( senyawa mgd minimal 2 ikatan peptida, peptida panjang dan semua protein) pd kondisi alkali.
Intensitas warna diukur pd pj gel 540 nm Abs proporsional dg kadar protein pd contoh/sampel
Prosedur
Reagent biuret sebanyak 5 mL dicampur dg 1 mL larutan
protein ( 1 10 mg protein /mL). Dalam reagent termasuk CuSO4, NaOH, KNa tartarat (digunakan utk menstabilkan ion Cu dlm larutan alkali). Dibiarkan pd suhu ruang selama 15 30 menit. Jika campuran tdk jernih, dilakukan sentrifugasi atau penyaringan. Selanjutnya absorbansi diukur pd 540 nm, dan koreksi dg blanko. Suatu kurva stndar juga dibuat yaitu konsentrasi vs absorbansi dg menggunakan bovin serum albumin (BSA)
Aplikasi : Digunakan utk menentukan kadar protein pada serealia, daging, kedelai, dan isolat protein.
Keuntungan : Lebih murah daripada metode Kjeldahl Cepat ( dapat selesai < 30 menit) Metode paling sederhana utk analisis protein Sangat sedikit senyawa pengganggu yg dpt bereaksi dg biuret Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida atau non protein
Kelemahan : Tidak sangat sensitif dibandingkan metode Lowry ( Kandungan protein minimal 2 4 mg protein dlm contoh) Absorbansi dpt dipengaruhi /diperoleh dari pigmen bile jika ada . Konsentrasi yg tinggi dari garam amonium dpt menganggu reaksi Warna bervariasi dari protein yg berbeda ; gelatin (ungu merah jambu). Opalescence dpt terbentuk jika kandungan lipid atau karbohidrat tinggi. Bukan metode absolut; warna harus distandarkan dengan protein yg sdh diketahui (BSA) atau metode Kjeldahl
3. Metode Lowry
Prinsip : kombinasi reaksi Biuret dg reduksi reagent Folin Ciocalteau phenol (asam fosfomolibdat fosfotungstat) oleh residu tirosin dan triptofan dalam protein. Terbentuknya warna kebiruan diukur pd 750 nm ( sensitivitas tinggi utk kons protein rendah) atau 500 nm ( sensititvitas rendah utk konsentrasi protein tinggi)
Prosedur (modifikasi Hartree) : Sampel protein yg akan dianalisis dilarutkan dlm air sekitar 20 100 mg. Larutan K Na tartarat Na2CO3 ditambahkan dan stelah dingin dinkubasikan 10 menit pd T kamar Larutan CuSO4-K Na tartarat NaOH ditambahkan, setelah dingin diinkubasikan pd T kamar 10 menit. Reagent Folin segar ditambahkan, dicampur dan diinkubasikan 10 menit pd 500 C . Absorbansi diukur pd 650 nm Suatu kurva standar BSA dibuat untuk estimasi kons. Protein yg ingin diketahui.
Aplikasi : Krn sensitif maka sering digunakan pd protein biokimia Tdk umum digunakan untuk protein dlm sistem pangan tanpa diekstrak dulu protein dari pangan Keuntungan : Sangat sensitif : 50 -100 x lebih sensitif dr metode Biuret 10 20 x lebih sensitif dr abs uv 280 nm bbrp kali lebih sensitif dr metode ninhidrin Kurang dipengaruhi oleh kekeruhan sampel Lebih spesifik dr hampir semua metode Relatif sederhana ( 1 1,5 jam)
Kelemahan : Warna bervariasi tgt dr sumber protein ( > Biuret) Warna tdk proporsional tajam dg kandungan protein Reaksi diganggu oleh adanya sukrosa, lipid bufer fosfat, monosakarida dan hexoamina Konsentrasi yg tinggi dr gula reduksi, amonium sulfat dan senyawa sulfidril akan mengganggu reaksi
Prosedur : 1. Sampel dilarutkan dlm bufer atau alkali 2. Absorbansi dibaca pd 280 nm dg reagent blanko 3. Konsentrasi protein dihitung dg persamaan : A = abc
Aplikasi : Metode ini telah digunakan untuk menentukan kadar protein pd : Susu dan produk daging. Metode ini tidak digunakan luas dlm sistem pangan Metode ini lebih baik diaplikasikan pd sistem protein yg sdh dimurnikan atau protein yg telah diekstrak dlm alkali atau agen pendenaturasi spt 8 M urea Keuntungan : Cepat dan relatif sensitif ( > Biuret) Tidak ada gangguan dr amonium sulfat dan bufer Non destructive Sering digunakan pd protein yg telah diseparasi dg kolom
Kelemahan : Asam nukleat juga menyerap pd 280 nm Larutan hrs jernih dan tdk berwarna Metode ini memerlukan sistem yg relatif murni
5. Metode Ninhidrin
Prinsip : Asam amino, amonia dan gugus amino primer dlm protein, jika didihkan pd bufer pH 5,5 dalam ninhidrin dan hidrindantin akan membentuk warna ungu Ruhemann
Prosedur : Campurkan 1 mL larutan sampel dg 1 mL larutan Ninhidrin Panaskan dlm waterbath selama 15 menit Tambahkan 5 mL etanol atau propanol, kocok dan dinginkan Baca absorbansi pd 570 nm dg blanko air
Aplikasi : Tidak digunakan secara luas untuk menghitung protein dlm pangan. Dpt digunakan untuk menentukan hidrolisis rantai peptida selama proses pengolahan pangan Keuntungan : relatif cepat dibandingkan Kjeldahl Kelemahan : Adanya sejumlah kecil AA, peptida, amina primer dan amonia menyebabkan estimasi yg berlebihan thd kand. Protein Ketelitian rendah Warna bervariasi terhadap bebrbagai komposisi AA. Prolin abs max 440 nm ; AA lain 570 nm Kurva standar kalibrasi hrs dibuat untuk setiap kali analisis.
dg acara sentrifugasi Asam salisilat dicampurkan dg prosi seimbang dg larutan protein Tingkat kekeruhan diukur dg cahaya yg diteruskan pd 540 nm dg reagen blanko Kadar protein diestimasi dg kurva kalibarsi yg menggunakan metode kjeldahl
Aplikasi :
Metode ini telah digunakan utk mengukur kadar protein terigu dan jagung Keuntungan : Cepat ( selesai dlm 15 menit) Tidak mengukur N non protein kecuali asam nukleat Kelemahan : Protein berbeda digunpalkan dg kecepatan berbeda Kekeruhan bervariasi tergantung kons. Asam Asam nukleat juga digunpalkan oleh reagen asam
Sensivitas : Kjeldahl, Biuret kurang sensitif dibandingkan metode UV, dan Lowry Kecepatan : Penentuan dg metode kolorimetri lebih cepat drpd Kjeldahl Metode yg melibatkan pengukuran dg spektrofotometer biasanya hrs memisahkan dulu materi pengganggu (tak larut) sebelum atau setelah direaksikan dg reagent pewarna
Pertimbangan Khusus
1. Memilih metode utk aplikasi tertentu hrs mempertimbangkan sensiti vitas, akurasi, reproducibility da n sifat fisiokimia pangan. 2. Proses pengolahan pangan spt pemanasan dpt mengurangi extracability protein ( kadar < sebenarnya) utk metode yg melalui tahap ekstraksi. 3. Semua metode kecuali Kjeldahl dan metode UV utk protein yg sdh dimurnikan, membutuhkan protein referensi / standar atau kalibrasi dg metode Kjeldahl. Pemilihan standar yg tepat utk pangan tertentu mrp hal yg sangat penting .
4. Nitrogen non protein terdapat pd hampir semua pangan. Untuk menentukan nitrogen protein, sampel biasanya diekstrak dg alkali dan diikuti dg penggumpalan dg asam trikloroasetat, atau sulfosalisilat 5. Untuk menentukan nilai nutrisi protein pangan ( daya cerna protein dan rasio efisiensi protein =PER), metode Kjeldahl dg faktor konversi 6,25 biasanya digunakan utk kadar prootein kasar