B12 UV

Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektofotometer adalah alah yang digunakan untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electronelectron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton memungkinkan electronelectron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi. Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum UV maupun tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang lebar. Ini disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul dalam subtingkat-subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa saja dari keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi. Karena pelbagi 4

transisi ini berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang absorpsinya juga berbeda sedikit dan menimbulkan pita lebar yang tampak dalam spectrum itu. Di samping pita-pita spectrum visible disebabkan terjadinya tumpang tindih energi elektronik dengan energi lainnya (translasi, rotasi, vibrasi) juga disebabkan ada faktor lain sebagai faktor lingkungan kimia yang diberikan oleh pelarut yang dipakai. Pelarut akan sangat berpengaruh mengurangi kebebbasan transisi elektronik pada molekul yang dikenakan radiasi elektromagnetik. Oleh karena itu, spektrum zat dalam keadaan uap akan memberikan pita spectrum yang sempit. Panjang gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorban maksimum disebut sebagai panjang gelombang maksimum ()(maks. Penentuan panjang gelombang maksimum yang pasti (tetap) dapat dipakai untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik-karakteristik sebagai data sekunder. Dengan demikian spektrum visibel dapat dipakai untuk tujuan analisis kualitatif (data sekunder) dan kuatitatif. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron akan menyerap cahaya pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang menyerap energi lebih sedikit akan menyerap cahaya pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap caha dalam daerah tampak memiliki electron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap cahaya pada panjang gelombang UV yang lebih pendek. Pemisahan tenaga yang paling tinggi diperoleh bila elektron-elektron dalam ikatan tereksitasi yang menimbulkan serapan dalam daerah dari 120-200nm. Daerah ini dikenal sebagai daerah Ultra Violet (UV) vakum dan relative tidak banyak menimbulkan keterangan. Diatas 200 nm eksitasi elektron. Dari orbital-orbital p dan d, dan orbital terutama sistem konjugasi segera dapat diukur, dan spektra yang diperoleh memberikan banyak keterangan. Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data sekunder atau data pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis yang dapat ditentukan ada 2 yaitu : Pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis. Penentuan panjang gelombang maximum. Umumnya spektroskopi dengan sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak (VIS) dibahas bersama karena sering kedua pengukuran dilakukan pada waktu yang sama. Karena spektroskopi UV-VIS berkaitan dengan proses berenergi tinggi yakni transisi elektron dalam molekul, informasi yang didapat cenderung untuk molekul keseluruhan bukan bagian-bagian molekulnya. Metoda ini sangat sensitif dan dengan demikian sangat cocok untuk tujuan analisis. Lebih lanjut, spetroskopi UV-VIS sangat kuantitatif dan jumlah sinar yang diserap oleh sampel diberikan oleh ungkapan hukum Lambert-Beer. Menurut hukum ini, absorbans larutan sampel sebanding dengan panjang lintasan cahaya d dan konsentrasi larutannya c. Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan. Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisanlapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium. Gabungan Hukum Bouguer-Beer, sering di tuliskan sebagai A = abc atau A = bc Dengan A = absorbans = absorpsivitas molar (jika konsentrasi dalam molar) dengan satuan M-1cm-1 a = absorpsivitas (jika konsentrasi dalam %b/v) dituliskan E1%1cm b = panjang jalan/kuvet c = konsentrasi ( dalam molar atau %b/v) Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi) Maka, A = log (%T) A = log (Po/P), Po adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan

Tranmitasi adalah bagian dari cahaya yang diteruskan sedangakan absorbansi adalah bagian dari cahaya yang diserap oleh larutan Perumusan yang di tetapkan oleh Lambert_Beer ini yang disebut Hukum Lambert Beer memiliki syarat syarat tertentu yaitu Syarat konsentrasi , konsentrasi yang diukur harus encer Syarat kimia , zat pengabsorbansi ( Zat yang dianalisis tidak boleh berasosiasi dengan pelarut menghasilkan produk lain Syarat cahaya , radiasi cahaya yang digunakan untuk mengukur adalah cahaya yang memiliki panjang gelombang agar hubungan antara absorbansiu dan konsentrasi dapat linier Syarat kejernihan, partikel kloid yang menyebabkan kekeruhan Larutan , mengakibatkan terjadinya penyimpangan karena sebagian cahaya yang melewati sampel akan dihamburkan oeh partikel kloid sehingga kekuetan cahaya yang diabsorsi berkurang dari yang seharusnya Pengabsorpsian sinar UV-VIS oleh suatu molekul umumnya menghasilkan eksitasi electron bonding , maka panjang gelombang absorpsi maksimum dapat dikorelasikan denagn jenis ikatan yang ada dalam molekul yang sedang diselidiki Spectrum UV-Vis yang merupakan korelasi absorban (sebagai ordinat dan panjang gelombang sebagai absis merupakan pita spectrum Rentang pembacaan absorban dan transmitan Apabila radiasi elektromagnetik dilewatkan pada suatu larutan denagn itensitas radiasi semula , maka sebagian radiasi tersebut akan diteruskan , dipantulkan dan diserap . Namun itensitas sinar yang dipantulkan dapat diabaikan karena pengerrjaan dengan spektro menggunakan larutan pembanding sebagai standar Pemilihan pelarut Pelarut yang baik 1. Dapat melarutkan cuplikan 2. Dapat meneruskan sinar dari panjang gelombang yang dipakai 3. Tidak mengandung system ikatan rangakap terkonjugasi pada struktur molekulnya 4. Tidak berwarna 5. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis 6. Kemurniannya harus tinggi 7. Polaritasnya disesuaikan dengan senyawa yang dianalisis Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pd sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor (gugus dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron. Kromoforkromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik). Pergeseran-pergeseran :

1. Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energy yang lebih rendah. 2. Hypsokromik(pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih pendek. 3. Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar. 4. Hypokromik, reduksi absortivitas molar.

PEMBAHASAN
Absorption spectrum. The complex was examined in aqueous solution (0.15 mg./ml.) for absorption in the visible and ultraviolet regions with a Beckman spectrophotometer model DU. The absorption curve (Fig. 2) shows pronounced peaks at 274 and 350 mz and broad maxima at 500 and 523 m,u. For comparison the absorption spectrum of cyanocobalamin is also shown. Crude preparations of the complex have a broad maximum at 350-360 m,. After the extraction of free cobalamnins in step 6, this maximum shifts toward lower wavelengths and becomes sharper.
0-75 E 0 300 400 500 600

Wavelength (my)

After the final column electrophoresis it remains constant at 350 mp. The absorption at 274 m,p is mainly due to the peptide part, whereas those at 350 and 523 m,u are due to the cobalamin. The spectrum differs from that of vitamin B12 itself, both in the position and the relative height of the peaks. It is thus impossible to get an accurate estimation of the vitamin B12 content of the complex from the absorption at any particular wavelength. Effect of cyanide on the absorption spectrum.

Addition of trace amounts of cyanide to a neutral or slightly acid solution of the complex is followed by a bathochromic shift of the peaks at 350 and 523 mp. The result is a spectrum of cyanocobalamin type with characteristic absorption at 361 and 550 m,, with extinction coefficients (E"I/, ) of 30 5 and 9-35. These extinction values may constitute a more reliable basis for the calculation of the cobalamin content by comparison with a'cyanocobalamin standard (see Table 2). A cobalamin (molecular weight 1329) content of 14-68% corresponds to a minimal molecular weight of 9053, in fairly good agreement with the value of 9129 from the cobalt content. Infrared ab8orption.

DAPUS