BIOTECHNOLOGIE VE VROB ERGOCORNINU

Bc. Radka Zajcov

Obsah
1 2 3 4 5 vod historick pohled na danou technologii ................................................................. 3 Biologick aktivita produktu............................................................................................... 4 Princip technologickho procesu ........................................................................................ 5 Charakteristika biotechnologickho initele ....................................................................... 5 Mechanismy a regulace vzniku produktu ........................................................................... 7 5.1 5.2 6 Biosyntza ergocorninu ............................................................................................... 7 Regulace vzniku produktu ........................................................................................... 9

Popis technologie a technologickho zazen .................................................................. 10 6.1 6.2 Submerzn kultivace .................................................................................................. 10 Povrchov (stacionrn) kultivace ............................................................................. 13

7 8 9 10

Izolace a purifikace konenho prepartu......................................................................... 14 Aplikace prepartu ............................................................................................................ 15 Ekonomick aspekty procesu ............................................................................................ 16 Seznam pouit literatury .............................................................................................. 17

1 vod historick pohled na danou technologii

Nmelov alkaloidy, mezi kter ergocornin pat, jsou pirozenmi sekundrnmi metabolity parazitick houby palikovice nachov (Claviceps purpurea), kter nejastji napad ito a jednodlon trvy (1). U z pirozenho vskytu nmelovch alkaloid plyne prvn pouvan zpsob zskvn tchto slouenin. Jedn se o parazitickou produkci skleroci na umle infikovanm it. Tento zpsob produkce se v nkterch ppadech pouv dodnes, ale m znan omezen. Pro tento typ produkce byly vypstovny modifikovan kmeny pedevm Claviceps purpurea ale i jinch mikroorganism (1). Jeliko parasitick produkce je vzna na ron obdob, cena byla stle relativn vysok a spoteba vzrstala, byla snaha vytvoit kmeny vhodn pro saprofytickou produkci na umlch kultivanch mdich. Problm byl ale v neznalosti biosyntzy alkaloid, co vedlo k nespchu pi pokusu o saprofytickou produkci alkaloid (2, 3). Byly pipraveny kmeny pro povrchovou kultivaci, ale produkce touto cestou nebyla zavedena, protoe bu byl obsah alkaloid velmi mal, nebo zazen pro povrchovou kultivaci znan sloit. Proto byla v padestch letech minulho stolet vyvinuta technologie submerzn kultivace v aerovanch, promchvanch bioreaktorech, kter ale skt mnoh skal (4). V sedmdestch letech Kybal a Vlek vyvinuli relativn jednoduch zazen pro povrchovou (stacionrn) kultivaci, kter ale byla do praxe uvedena jen v ppad produkce alkaloid ergotoxinov skupiny (2). Technologie Parazitick produkce Pozitiva Propracovanj technologie nkdy jedin mon Stle nejastj zpsob produkce Celoron provoz Lep kontrola podmnek pro produkci alkaloid ne u parazitickho zpsobu Negativa Vzanost na ron obdob a podneb Bezpenost ohledn en nmele

Saprofytick submerzn produkce

Saprofytick stacionrn produkce

Nzk poizovac a provozn nklady Celoron provoz

Vysok poizovac a provozn nklady Pouvn protipnivch psad (sniuj produkci) Vysok nroky na udren sterility asto ni obsah alkaloid ne u parazitick produkce Nestabilita produknch kmen Mon odlinosti v jednotlivch kultivanch vacch (kad vak je samostatn reaktor)

Tabulka 1: Klady a zpory pouvanch technologi

2 Biologick aktivita produktu

Ergocornin (Obrzek 1) pat do ergotoxinov skupiny peptidickch nmelovch alkaloid. Na organismus psob stejn jako ostatn nmelov alkaloidy dky podobnosti sv struktury s pirozenmi neurotransmitery serotoninem, dopaminem a noradrenalinem (Obrzek 2).

Obrzek 1: Struktura ergocorninu

Obrzek 2: Srovnn struktury ergolinu a pirozench neurotransmiter (1) Pesn mechanismus inku nebyl dosud objasnn dky obrovsk diverzit

noradrenalinovch, dopaminovch a serotoninovch receptor a schopnosti alkaloid psobit na receptory jak agonisticky tak antagonisticky (2). Vtinou bv pouvn ve sv hydrogenovan form, protoe ta je mn toxick ne nehydrogenovan. Byly popsny inky dihydroergocorninu na prtok krve perifernmi oblastmi a hypertenzi. Prtok krve periferiemi po podn dihydrergocorninu stoup, zatmco tlak u hypertonik kles. Oba inky jsou dny dilatac cv (5).

U smsi mesylt hydrogenovanch ergotoxin byly popsny dal pozitivn inky. Dihydroergotoxin mesylt posiluje inek tricyklickch antidepresiv (p. Nortryptilin), co umouje pouit tchto antidepresiv i u tzv. geriatrick deprese, kter bv asto spojena s njakou formou staeck demence. Projevuje se zde tedy dal inek dihydroergotoxinu a to, e pzniv ovlivuje prbh staeckch demenc (6). V mozku dochz ke stimulaci syntzy protein centrlnho nervovho systmu a inhibici adenylcyklzy stimulovan katecholaminy (7).

3 Princip technologickho procesu

Pro produkci ergocorninu byly vypracovny dv technologie submerzn a povrchov. Oba technologick procesy zanaj zpracovnm produknho kmene zskanho z nkterho depozitu, kde jsou tyto kmeny uchovvny tak, aby byly zachovny jejich vlastnosti. Vsledkem zpracovn pvodnho materilu je inokulum, kter je vhodn pro dal rst. Inokulem jsou okovna mdia v Erlenmeyerovch nebo podobnch bakch, kter jsou pak po uritou dobu inkubovna na tepakch. Tento proces me probhnout v jednom i nkolika stupnch a nsledn jsou pomnoen mycelia pevedena do laboratornch bioreaktor, kde pokrauje proces zvtovn mtka a k produknm reaktorm nebo jen k zskn dostatenho mnostv inokula pro povrchovou kultivaci v igelitovch vacch. dan produkt se vtinou vyskytuje jak v myceliu, tak v kultivanm mdiu. Je tedy nutn zpracovat oboj. Pro izolaci ergocorninu se pouv v obou ppadech ada extrakc pomoc bnch rozpoutdel a produkt je zskn vtinou jako adukt s poslednm rozpoutdlem, ppadn je ergocornin v njak form jet podroben hydrogenaci na dihydroergocornin.

4 Charakteristika biotechnologickho initele

Bylo popsno nkolik destek fyziologicky izolovanch i geneticky modifikovanch kmen, kter produkuj ergocornin vtinou ve smsi a dalmi alkaloidy. Absolutn vtina z nich je modifikac Claviceps purpurea (2). Ne vechny popsan kmeny se hod pro prmyslovou kultivaci a produkci ergocorninu. V nsledujcm pehledu je uvedeno nkolik kmen, u kterch byly popsny technologie. Kmen OKI No. 88/1972 (8) byl vylechtn ze skleroci Claviceps purpurea s vysokm obsahem alkaloid bez pouit mutagennch technik ve tech inokulanch krocch
5

v opakujcch se cyklech. Pi pouit vtho mnostv fosforu, je pro pechod do produkn fze nutn pdavek chloridu sodnho do mdia. Pdavek 0,1 1% dusinanu amonnho podpo rst mikroorganism a produkci alkaloid. Nejvyho obsahu alkaloid je v kultue dosaeno 6. a 7. den kultivace, kdy obsah alkaloid vztaen k mnostv biomasy je okolo 30 mg/g. Sloen alkaloid produkovanch tmto kmenem je uvedeno v nsledujc Tabulce 2. Tento kmen je uloen v Nrodnm stavu pro veejn zdrav (Orszagos Kozegeszsegugyi Intezet) v Budapeti v Maarsku.
Ergokryptinin Ergoconinin 5% 4%

Ergokryptin Ergocornin
Ergosin Ergometrinin

30% 28%
5% 4%

Ergometrin
Ostatn ve vod rozpustn alkaloidy

22%
4%

Tabulka 2: Sloen alkaloid produkovan kmenem OKI No. 88/1972 (8) Kmen MNG 00186 (9) byl stejn jako OKI No.88/1972 vylechtn v Maarsku. Jako zkladn materil byla pouita sklerocia Claviceps purpurea sebran z pirozen infikovanho ita. MNG 00186 byl vsledkem opakovan selekce a obohacovn kmene produkujcch alkaloidy. Selekce probhala na zklad toho, e kolonie produkujc alkaloidy jsou na specifickm mdiu fialov na rozdl od ostatnch blch. Rst tohoto kmene je pomalej ne u bn se vyskytujc kultury palikovice a netvo konidie. Kmen produkuje sms alkaloid, z n 55-60% tvo ergocornin, 25-30% -ergokryptin, a malou st tvo -ergokryptin. Kmen je uloen v Maarsk nrodn sbrce kmen. Kmen IMET PA 130 (9) byl pipraven mutac a na mdich obsahujcch organick nebo anorganick zdroje dusku, cukr, organick kyseliny a bn anorganick soli schopn produkovat alkaloidy ergotoxinov skupiny a ergometrin. Tento kmen je uloen v Centrlnm institutu pro mikrobiologii a experimentln terapii v Jen v Nmecku. CCM F-725 (10) byl vytvoen mutacemi z kmene CCM F-508, kter byl neekonomick z dvodu malho mnostv alkaloid a patnho pomru mezi a -ergokryptinem. CCM F508 byl postupn vystaven inku t mutagen. Prvnm byla kyselina dusin o koncentraci 0,0030 0,0045M, dalm ethylmethansulfont o koncentraci 0,01M a poslednm byl 5-bromuracil ve smsi se sulfathiazolem v pomru 4:1. Tento kmen produkuje sms

ergocorninu, -ergokryptinu a -ergokryptinu v pomru 6:5:1 a je uloen v eskoslovensk sbrce mikroorganism J. E. Purkyn v Brn.

5 Mechanismy a regulace vzniku produktu

5.1 Biosyntza ergocorninu
Pi biosyntze peptidickch nmelovch alkaloid samostatn vznikaj ergolinov a peptidick skelet, kter jsou nsledn spojeny multienzymovm komplexem. Biosyntza kyseliny lysergov je znzornna na Obrzku 3.

Obrzek 3: Schma biosyntzy ergolinovho skeletu u rodu Claviceps (2)

Cyklick skelet tvoen temi aminokyselinami vznik v multienzymovm komplexu d-lysergyl peptidov syntetzy (LPS), kter je tvoena dvma podjednotkami. Aminokyseliny ani kyselina lyserogov nemohou bt do etzce inkorporovny voln. Proto mus bt aktivovny vazbou pes sirn mstek na protein. V LPS1 podjednotce jsou aktivn msta pro zabudovn aminokyselin do pozice I nebo II (viz. Obrzek 4). dn z aminokyselin nevykazuje vjimenou afinitu k aktivnmu mstu, kter slou k zabudovn aminokyseliny do pozice I. Proto o sloen vslednho ergopeptinu rozhoduje pouze sloen prosted, ve kterm se organismus nachz. Toho se d vyut v zen kultivanho procesu. Naopak aktivn msto k zabudovn aminokyseliny do pozice dv znan upednostuje L-fenylalanin. Do pozice III je u rodu Claviceps vdy inkorporovn L-prolin. (2)

Obrzek 4: Substrty inkorporovan do d-lysergylpeptidlaktmu d-lysergylpeptid syntetzou a jejich relativn afinity. (2) Podjednodka LPS2 aktivuje kyselinu lysergovou a zan tak syntzu cyklickho tripeptidu. Na nsledujcm obrzku (Obrzek 5) je znzornno schma funkce LPS pi biosyntze ergotaminu. Pro syntzu ergocorninu, pak sta eliminovat L-fenylalanin z prosted a nahradit jej valinem.

Takto vytvoen laktm je nsledn oxidovn pomoc oxygenz m vznik hydroxylov skupina a posledn oteven kruh v peptidick sti se samovoln uzave. (2)

Obrzek 5: Schma syntetickch krok katalyzovanch LPS. Lev horn roh kadho diagramu znzoruje aktivn msto LPS2, ostatn pak aktivn msta LPS1.(2)

5.2 Regulace vzniku produktu

Primrn metabolismus je vdy zce specifikovan, protoe jakkoli chyba ve stavebnch kamenech organismu by mohla mt fatln dsledky. Zato sekundrn metabolity, kter nemaj pmou souvislost se ivotaschopnost organismu, maj znan volnj regulaci, a proto konenm vsledkem bv asto sms rznch slouenin. Stejn tak je to i u divokch kmen Claviceps. V ppad, e danm produktem je pouze nkolik vybranch slouenin, je nutn zsah do syntetickho systmu mikroorganismu a regulace vzniku produktu pomoc sloen kultivanho mdia (1).
9

Z uhlkatch zdroj je nutn pouvat sloitj cukry, kter jsou mikroorganismem he metabolizovny, protoe syntza alkaloid bu v rstov fzi neprobh, nebo jen v minimln me. Pout jako substrt glukzu nen vhodn z dvodu katabolick represe. Pro dobr vyuit sacharzy je nutn do kultivanho mdia pidat sekundrn zdroj uhlku napklad nkter intermedit citrtovho nebo glyoxaltovho cyklu (2). Pro vtinu sekundrnch produkt je mal obsah anorganickho fosforu v mdiu stimulujcm prvkem. Fosfor je bhem prvnch dn kultivace akumulovn v myceliu, kde zastavuje rst a nastartuje produkci alkaloid. Naopak vy obsah fosforu me vyvolat degradaci vzniklch alkaloid (2). V mdiu mus bt tak ptomen vhodn zdroj dusku. Tento prvek je dleit jak pro rst, tak pro syntzu alkaloid. Problmem me bt nalezen vhodnho zdroje pro oba dva procesy (2). Dle je syntzu produktu mon ovlivnit pdavkem prekurzor do mdia, pH, teplotou a mnostvm kyslku v reaktoru. V ppad ergocorninu je mon do kultivanho mdia pidvat mal mnostv valinu (9).

6 Popis technologie a technologickho zazen

6.1 Submerzn kultivace
Submerzn produkce ergocorninu je podstatn bnj ne stacionrn kultivace a proto je popsno nkolik technologi, kter maj mnoho spolench rys. Technologie popsan Wackem a dalmi (8) pouv produkn kmen OKI No. 88/1972 popsan ve. Tento kmen je po 30 dn kultivovn na pevnm kultivanm mdiu SB 010 o sloen popsanm v Tabulce 3. Vznikne souvisl vrstva mycelia, kter je po oddlen z agarovho povrchu suspendovna a homogenizovna ve vod. Do 750ml Erlenmeyerovch bank, kter obsahuj po 200 ml SC 100 mdia, je pidno po 20 ml suspenze zskan v pedchozm kroku a baky jsou 6 dn protepvny pi teplot 24C. est den jsou baky po dvou pouity jako inokulum pro ti 10l bioreaktory, z nich kad je naplnn 6l sterilnho SB 101 mdia. V tchto reaktorech probh dalch pt dn kultivace pi 25C s rychlost aerace 0,5l vzduchu/l.min a mchnm 240 ot./min . Na konci tohoto obdob je obsah vech t reaktor spojen (18l) a pouit jako inokulum pro produkn prmyslov reaktor o objemu 300l, kter obsahuje 200l sterilnho SC 101 kapalnho mdia. Reaktor je mchn rychlost
10

300 ot/min a provzduovn rychlost 9m3 vzduchu za hodinu. Kultivace probh est dn pi teplot 25C, piem mezi 55 a 60 hodinou kultivace je pH udrovno na hodnot 4,5 pomoc pdavku hydroxidu amonnho. Po ukonen kultivace je obsah alkaloid 1246 mg/L, z eho 646 mg/L tvo sms ergocorninu a ergokryptinu. SB 010
Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dusinan vpenat Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn Vlknit agar voda 100,0g 10,0g 10,0g 1,0g 0,25g 0,25g do pH 5,2 25,0g zbytek do 1000ml

SC 100
Sacharza Kyselina citronov Sran hoenat Dihydrofosforenan draseln Chlorid sodn Hydroxid amonn voda 100,0g 10,0g 0,3g 0,5g 10,0g do pH 5,2 zbytek do 1000ml

SB 101
Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dusinan vpenat Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Chlorid sodn Hydroxid amonn voda 100,0g 10,0g 1,0g 1,0g 0,5g 0,3g 10,0g do pH 5,2 zbytek do 1000ml

SC 101 (l)
Sacharza Kyselina citronov Chlorid sodn Dusinan amonn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn Voda 100,0g 10,0g 10,0g 1,0g 0,3g do pH 5,2 zbytek do 1000ml

Tabulka 3: Sloen kultivanch mdi I.

Dal technologie byla popsna Wackem et al. v roce 1983 (9) a pro produkci ergocorninu pouv jin produkn kmen a to MNG 00186. Pro kultivaci je pouita 25 dn star kultura MNG 00186 rostouc na St agar (Blake) mdiu, kter je sekrbnuta a homogenizovna ve 100ml fyziologickho roztoku. V tlitrov kuelov bace s jednm litrem GK kultivanho mdia je pak tato suspenze pouita jako inokulum. Baka je pak 44 hodin protepvna pi teplot 24C. Pot je obsah baky peveden do 15l laboratornho bioreaktoru, kter obsahuje 10l TC-54 mdia. Kultivace probh pi teplot 24C po ti dny pi mchn 240 ot./min a aeraci 0,25 l/l/min. Vsledn kultura je pouita pro inokulaci 100l St mdia v 150l reaktoru, kter umouje rychl pidvn prekurzor. Nsledujcch 6 dn probh kultivace pi 22C, aeraci 0,35l/l/min a rychlosti mchn 150 ot./min. Druh, tet a pt den je do reaktoru pidno po 100g valinu a 20g isoleucinu. Na konci estho dne je v reaktoru obsaeno 320mg/L ergocorninu, 60mg/L -ergokryptinu a 160mg/L ergokryptinu. Sloen pouitch kultivanch mdi je uvedeno v Tabulce 4.
11

St agar mdium (Blake)

Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Chlorid sodn Hydroxid amonn Prkov agar voda 100,0g 10,0g 1,0g 0,25g 0,25g 1,0g do pH 5,2 - 5,3 25,0g zbytek do 1000ml

St
Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Chlorid sodn Hydroxid amonn voda 100,0g 10,0g 1,0g 0,25g 0,25g 1,0g do pH 5,2 - 5,3 zbytek do 1000ml

GK
Trypcasin Kyselina citronova Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn voda 7,0g 4,1g 0,3g 0,3g do pH 5,7 5,8 zbytek do 840ml

TC-54
Sacharza Kyselina citronov Chlorid sodn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn Voda 100,0g 10,0g 10,0g 0,5g 0,5g do pH 5,7 5,8 zbytek do 1000ml

Tabulka 4: Sloen kultivanch mdi II.

Patent spolenost VER Arzneimittelwerk Dresden z roku 1978 (9) popisuje technologii zaloenou na produknm kmeni uloenm pod slem IMET PA 130. Tento kmen je opt modifikac Claviceps Purpurea. Zkladn materil pro ppravu inokul je uchovvn v uzavench konzervch, kde jsou uloeny spory lyofilizovan v odstednm mlku. Obsah konzervy je suspendovn v 5% sladin a penesen na pevn kultivan mdium (SC1) obsaen v prmyslovch zkohrdlch sklennch lahvikch o objemu 500ml. Po 14 dnech inkubace pi teplot 24C kad lahvika obsahovuje 3x109 spor, kter lze uchovvat po dobu 10 msc pi teplot 4C. Takto pipraven inokulum je pouito pro naokovn dvou ocelovch 18l bioreaktor, z nich kad obsahuje 10l kultivanho mdia A (LCA). Kultivace zde probh 7 dn za mchn 360 ot./min a aeraci 2,5 l vzduchu/min. Podly vytvoen v tchto reaktorech jsou spojeny a pouity jako inokulum pro 180l kultivanho mdia B (LCB) obsaenho v 250l bioreaktoru ze speciln oceli. Po pti dnech mchn rychlost 160 ot./min a aeraci 0,5l vzduchu/l.min, je kultura pevedena do 2000l nerezovho bioreaktoru, kter obsahuje 1400l kultivanho roztoku C (LCC). Zde probh kultivace 7 dn za mchn rychlost 160 ot./min a aerac 0,6l/l/min. V ppad nutnosti je do vech reaktor pidvna protipniv psada. Sedm den kultivace je celkov mnostv alkaloid 2430mg/L, z eho 1150mg/L tvo egocornin.
12

SC1
Sacharza Dusinan sodn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat heptahydrt Chlorid draseln Sran eleznat heptahydrt Corn steep Agar pH 3% 0,3% 0,1% 0,05% 0,05% 0,001% 1% 3% 6,8 - 6,9

LCA
Sacharza Citrt amonn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Sran eleznat Sran zinenat 10% 1,5% 0,05% 0,03% 0,001% 0,0004%

LCB
Sachazza Kyselina citronov Hydroxid amonn (25%) Dusinan vpenat Dihydrogenfosforenan draseln Chlorid draseln Sran hoenat Sran eleznat Sran zinenat pH 10% 1,4% 1,0% 0,05% 0,025% 0,01% 0,03% 0,001% 0,0004% 5,5

LCC
Sacharza Kyselina citronov Chlorid draseln Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Sran eleznat Sran zinenat Hydroxid amonn 20% 1,75% 0,02% 0,075% 0,03% 0,003% 0,0012% do pH 5,3

Tabulka 5: Sloen kultivanch mdi III

6.2 Povrchov (stacionrn) kultivace

Zazen pro stacionrn kultivaci bylo patentovno J. Kybalem a V. Vlkem v roce 1974 (4). Kultivace se provd na povrchu kapalnho mdia, kter je obsaeno ve sterilnch igelitovch vacch. Pouv se kmen s oznaenm CCM F-725 (10). Steriln kultivan pytel je naplnn mdiem a sterilizovn a ochlazen na pijatelnou teplotu. Pot je horn st vaku propchnuta dutou kovovou jehlou a vak je sten naplnn sterilnm vzduchem. Tato jehla je nahrazena kovovou i sklennou trubikou o prmru odpovdajcm velikosti vaku a lehce zenm koncem, kter je napojena na zdroj inokula. Po inokulaci zstv trubika na mst a slou jako pvod kyslku pi kultivaci. Plyny vznikajc pi kultivaci jsou odvdny podobnou trubikou ppadn lpe nkolika drami v horn sti pytle. Jakkoliv zpsob odvodu odpadnch plyn mus zajistit mrn petlak v kultivanm pytli, aby byla zachovna sterilita. Kultivan vaky jsou uloeny v policch, kter jim poskytuj oporu a zrove je pod dnem police chladic potrub, kter odvd teplo uvolovan pi utilizaci uhlkatch zdroj. Jeliko jsou tyto police skldny na sebe, dochz k chlazen kultivanch vak ze spod i ze shora. Kultivan vaky jsou na konci kultivace likvidovny. Na Obrzku 6 je znzornno zazen pro stacionrn kultivaci.
13

Obrzek 6 : Prmyslov uspodn povrchov kultivace (4) : 1) Dmychadlo, 2)mi prtoku vzduchu,
3) tcestn kohout s kontrolnm ventilem, 4) vzduchov filtr, 5) kultivan vak v polici, 6) by-pass ventil, 7) dupliktor pro ppravu kultivanho mdia, 8) manipulan stolek, 9) transportr, 10) mic ventil

7 Izolace a purifikace konenho prepartu

Veker prmyslov izolace alkaloid jsou zaloeny na extrakce v systmu rozpoutdel, z nich nkter, kter jsou pouita ve starch patentech, nejsou dnes pouiteln pro prmyslovou vrobu (nap. ethery, nkter chlorovan rozpoutdla) (11). Li se izolace ze stacionrn a submerzn kultivace. V ppad stacionrn kultivace ergocorninu je zpracovvno pouze mycelium, protoe peptidick nmelov alkaloidy v tomto ppad tm nepechz do mdia. U submerzn kultivace se dky stihovmu napt a dalmu namhn mycelia dostv do mdia nezanedbateln st peptidickch alkaloid a tud je nutn zpracovat cel obsah bioreaktoru (2). V patentu publikovanm Wackem a dalmi v roce 1975 (8) je popsn systm rozpoutdel chloroform-isopropylalkohol, chloroform- metanol, metanol-voda a chromatografie na alumin.

14

Izolace produktu popsan spolenost VER Arzneimittelwerk Dresden (9) pot se zpracovnm mdia a mycelia oddlen. Kultivan mdium je po ukonen kultivace naedno stejnm mnostvm vody a zfiltrovno. Zpracovn filtrtu zan pravou pH na 8,5 pomoc 25% hydroxidu amonnho. Takto upraven filtrt je extrahovn ethylacettem na dvoustupovm protiproudm extraktoru. Extrakt je pak na vakuov odparce opaen na dvacetinu svho pvodnho objemu, smsen s dvojnsobnm objemovm mnostvm chloroformu a ponechn 15h pi 4C. Z roztoku vypadnou krystalky ergometrin-chloroformovho aduktu, kter jsou oddleny filtrac. Ve filtrtu se nachz ergotoxin, kter je z nj zskn ve form krystalickho ergotoxinbenzenovho aduktu. Filtrt je zpracovn pomoc aluminy a ethylacettu v kolonovm nebo mchanm uspodn, ethylacettov podl je odpaen a k odparku pidn benzen na 15h pi 4C. Ergotoxin-benzenov adukt je pak zpracovn bu kyselinou ethansulfonovou v ethanolu na ethansulfont, nebo hydrogenac v dioxanu na Ra-Ni na dihydroergotoxin-bzi, z n je opt vytvoen ethansulfont pomoc kyseliny ethansolfonov. Mycelium je ti hodiny extrahovno acetonem pi 20C. Po filtraci je vodno-acetonov extrakt okyselen kyselinou fosforenou na pH 2-3 a extrahovn petroletherem a sms petrolether-xylen (1:1), U tk fze je upraveno 25% hydroxidem amonnm pH na 8-9a je extrahovna ethylacettem. Acettov fze je promyta vodou v pomru 1:1, odpaena pi 30C na vakuov odparce na desetinu objemu, zreagovna s dvojnsobnm objemovm mnostvm chloroformu a umstna do 4C pes noc. Suspenze je odfiltrovna a filtrt je odpaen na desetinu objemu stejn jako v pedchozm kroku. Odpaen filtrt je peitn na aluminov kolon ethylacettem. Elut je odpaen a rozputn v toluenu a krystalovn pi teplot 4C za zisku ergotoxin-toluenovho aduktu.

Aplikace prepartu
K lb se pouv pedevm hydrogenovan semisyntetick analog

dihydroergocornin a to v ekvimolrn smsi s dalmi alkaloidy ergotoxinov skupiny ve form soli. Dihydroergotoxin mesylt je ekvimolrn sms dihydroergocorninu,

dihydroergocristinu a dihydroergokryptin (: 2:1) (6). Pouv se na lbu staeckch demenc p. Alzheimerova choroba), perifernho i centrlnho prokrven a pi vysokm nitroonm tlaku. Pouit dihydroergotoxinu u staeckch demenc je znan kontroverzn,
15

protoe v poslednch letech byla provedena kontrolovan studie, ve kter nebyl zpozorovn rozdl mezi lbou placebem a dihydroergotoxinem.

9 Ekonomick aspekty procesu

Saprofytick produkce dlouho nebyla schopn konkurovat tradin parazitick produkci nmelovch alkaloid. V poslednch letech se situace obrac dky pokrokm v molekulrn genetice, genetickm inenrstv a biochemii, co ale nic nemn na finann nronosti kultivanho procesu. Saprofytick submerzn kultivace je nron jak na poizovac, tak na provozn nklady. Zazen pro tento typ produkce mus bt z vysoce kvalitnch slitin a monost sterilizace jak kultivanch mdi tak zazen samotnho. Vechny dnes pouvan technologie jsou zeny pedevm vpoetnmi systmy, kter rovn pedstavuj nemalou investici. Piblin stejnou nebo vy investici pedstavuj nklady na downstream procesy. Provozn nklady se skldaj pedevm z nklad na sterilizan pru a elektrickou energii nutnou pro chod celho zazen, z eho nejvt zt pedstavuj pkony mchacch elektromotor. Jeliko jsou cel technologie zeny softwarem, je zde spora na lidsk sle. Saprofytick povrchov kultivace nen tak nron na poizovac nklady co se kultivace samotn te, ale nklady na downstream procesy se od submerzn kultivace pli neli.

16

10 Seznam pouit literatury

1. ehaek Z., Sajdl P.: Ergot Alkaloids. Chemistry, Biological Effects, Biotechnology, Academia, Praha, 1990 2. V knize: Ergot The Genus Claviceps (Ken V., Cvak L. ed.) , Harwood Academic Publishers, Amsterodam, 1999 3. Kybal J., Protiva J., et al. (SPOFA): US Patent 3110651; 1963 4. Kybal J., Vlek V.: Biotechnology and Bioengineering 1976, 18, 1713-1718 5. Hayes D.W., Wakim K.G. et al.: The Effects of Dihydroergocornine on the Cirkulation in the Extremities of Man, 1948 6. Griffith R.W., Singer J. (Sandoz, Inc.): US Patent 4593031; 1986 7. Udvardy Nagy ne Cserey Pechny E., Budai M., et al.( Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 4390625; 1983 8. Wack G., Nagy L. et al.(Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 3884762; 1975 9. Wack G., Kiss J. et al. (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 4369252; 1983 10. Borowski E., Braun K. et al. (VEB Arzneimittelwerk Dresden): US Patent 4086141; 1978 11. Strnadov K., Kybal J. et al. (SPOFA): US Patent 4447540; 1984 12. Cvak L., Holan J. et al. (IVAX Pharmaceuticals s.r.o.): US Patent US 2007/0161795 A1; 2007

17