Enzimologa Clnica

(Tema 17)

Enzimologa Clnica.T-17 Enzimolog Cl nica.T1. Los enzimas como catalizadores. Estructura y naturaleza de los enzimas Comportamiento cintico de los enzimas 2.- Medida de la actividad enzimtica. 2.enzim Fundamento. Factores que modifican la actividad enzimtica. Medida de la actividad enzimtica de muestras clnicas Instrumentacin. Optimizacin de las condiciones de medida. Sistemas acoplados. 3.- Los enzimas como marcadores de lesin tisular. 3.lesi Enzimas como marcadores de dao celular Distribucin tisular de los enzimas Patrn isoenzimtico. 4.- Enzimas sricos de importancia diagnstica clnica. 4.s diagn cl Transaminasas (ALT, AST) Amilasa Creatn fosfoquinasa (CPK) Fosfatasa cida (ACP) Fosfatasa alcalina (ALP) Gama glutamil transpeptidasa (GGT) Lctico deshidrogenasa (LDH) 5-nucleotidasa (NTP)

1. Los enzimas como catalizadores.

Naturaleza proteica de los enzimas

1. Los enzimas como catalizadores.

El que una reaccin discurra ms o menos aprisa est en funcin no solo del estado energtico de los compuestos antes y despus sino tambin del propio mecanismo de la reaccin. Durante el curso de la reaccin es necesaria la formacin de intermedios reactivos cuyo nivel energtico es superior a la energa media de las molculas de los reactivos, lo que en la prctica hace que la formacin de esos intermediarios suponga una barrera energtica que impide que la reaccin avance. Cuanto mayor es el nivel energtico de los intermedios reactivos tanto menor es la velocidad.

1.2 Velocidad de una reaccin reacci La velocidad de una reaccin (S P) se define como: v= -d[S]/dt = d[P]/dt
SP
[S] T

[P] T

1.3 El Comportamiento cintico de las cin reacciones catalizadas por enzimas

1.4 Velocidad de una reaccin catalizada por un enzima. reacci

La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima con cintica enzimtica michaeliana es proporcional a la concentracin de substrato, pero es saturable y alcanza un mximo.
Reaccin no enzimtica

Actividad y cantidad de un enzima en una muestra. Actividad cantidad

Actividad de un enzima: moles transformados por unidad de tiempo. Se expresa en Unidades Internacionales (moles transformados/seg). Actividad especfica de un enzima: actividad enzimtica por masa de enzima (moles/seg/mg protena) Concentracin: cantidad de enzima por unidad de volumen, o en su defecto cantidad de actividad enzimtica por unidad de volumen

En bioqumica clnica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en forma de Unidades de actividad enzimtica por ml. enzim ml.

2.- La medida de la cantidad de un enzima en una muestra. 2.-

Fundamento. Optimizacin de las condiciones de medida. Medida de la actividad enzimtica de muestras clnicas Instrumentacin. Sistemas acoplados

2.1 Medida de la cantidad de enzima presente en una muestra: cantidad

Medida de la cantidad de enzima (protena) presente en la muestra. Se utilizan mtodos inmunolgicos Medida de la actividad cataltica correspondiente al enzima presente en la muestra. Se utilizan mtodos espectrofotomtricos

2.1 Medida de la actividad enzimtica. enzim

SP

La velocidad de una reaccin se puede expresar bien como moles de substrato consumidos, o bien como moles de producto formado por unidad de tiempo: v= [S]/ T = [P]/ T La formacin de producto o desaparicin del compuesto de partida puede monitorizarse espectrofotomtricamente midiendo cambios en la absorcin ptica de la solucin que contiene los substratos y el enzima

[S] T

[P] T

Color
Tiempo

1 Unidad de actividad enzimtica se define enzim como aquella cantidad de enzima capaz de transformar 1 mol de substrato por minuto. minuto

2.2 Medida de la actividad enzimtica... enzim

Las condiciones experimentales para la medida de la actividad enzimtica deben ser tales que el grado de conversin de substratos sea pequeo en trminos relativos, de manera que su concentracin global apenas cambie. Si la concentracin de substrato est por encima de la Km (> 5x), el enzima estar actuando a su velocidad mxima; aun habindose consumido una fraccin del substrato, la velocidad de reaccin del enzime ver muy poco afectada. Si las condiciones de velocidad mxima de la reaccin se mantienen durante la duracin del ensayo, existir una relacin lineal entre la velocidad de reaccin y la actividad enzimtica.
V0

Si [S] >> KM

V Vmax
Si [S]= constante

V cte.

2.3 Medida de la actividad enzimtica de muestras biolgicas. enzim biol

Por ejemplo, la actividad LDH se mide mediante la reaccin: Piruvato + NADH Lactato + NAD+ Cada mol de piruvato que es convertido en lactato consume un mol de NADPH, que se transforma en NAD+, por lo que la velocidad de la reaccin es equivalente a la velocidad de formacin de lactato, de NAD+ o a la desaparicin de piruvato o de NADPH

[S] T

SP
[P] T

El NADH absorbe luz de 340 nm, cosa que el NAD+ no hace. La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentracin de NADH (Ley de Beer), y cambios en la absorbancia a 340 nm se corresponde a cambios en la concentracin de NADH.

Absorbancia

Absorbancia = x concentracin x recorrido ptico de la luz

NAD(P)H

A concentracin (molar) concentraci

NAD(P)+

A medida que avanza la reaccin y el piruvato se convierte en lactato, hay un consumo de NADPH, y como consecuencia de ello una disminucin en la absorbancia a 340. La velocidad de la reaccin se mide por la variacin de la absorbancia con el tiempo con un espectrofotmetro.

Absorbancia
Absorbancia a 340 nm

340 nm

Moles consumidos de NAD(PH)/seg

actividad enzimtica

Tiempo

2.3 Medida de la actividad enzimtica de muestras biolgicas. enzim biol

En primer lugar se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta de espectrofotmetro, de manera que las concentraciones de los substratos (Piruvato y NADH) estn por encima de sus respectivos KM. El enzima se aade al aadir la muestra de suero. Se mide entonces la velocidad de reaccin como moles consumidos de NADPH por minuto. Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimtica (IU) Se refiere dichas unidades al volumen que se haba aadido de suero Se expresa el resultado final como Unidades de actividad enzimtica enzim

por ml de suero.

3.- Los enzimas como marcadores de lesin tisular (I) 3.lesi

3.1 Caractersticas de los enzimas utilizados como marcadores: Caracter

Los enzimas que se utilizan en el diagnstico son enzimas intracelulares, cuya concentracin en plasma es muy baja. Su relacin concentracin plasma/concentracin tejidos es < 1:1000 La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha habido lesin (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulacin de enzimas normalmente confinados en el interior de las clulas. La cantidad de actividad enzimtica medible depende de su liberacin al medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminacin. Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular especfico.

3 Los enzimas como marcadores de lesin tisular (II) lesi por qu aumenta su nivel en plasma...?: qu Necrosis de los tejidos Aumento del catabolismo celular (reparacin tisular, cncer) Aumento concentracin intracelular (induccin) Obstruccin en la salida exocrina (-amilasa)

3 Los enzimas como marcadores de lesin tisular (III) lesi

3.2 Distribucin tisular de la actividad enzimtica de enzimas Distribuci enzim con significacin clnica significaci cl

Transaminasas en distintos tejidos

60 50 40 30 20 10 0
Hgado Corazn Msculo Cerebro Rin Pncreas Pulmn Hemates

AST/GOT ALT/GPT
AST: mitocondria y citosol ALT: citoslica

Unidades/g

10

Actividad tisular fosfatasa cida

1200 1000

Unidades/g

800 600 400 200 0 Prstata Rin Pncreas

Fosfatasa alcalina en tejidos

60

Duodeno
50

Hueso Hgado Rin

Unidades/g

40 30 20 10 0

Prstata

11

Creatn fosfoquinasa en tejidos

2500

M.esquel.
2000

Unidades/g

1500 1000 500 0

Cerebro Miocardio M. liso Rin Hgado

Lctico deshidrogenasa en tejidos

M. esquel
160 140 120

Hgado Miocardio Rin Ganglios Pncreas Eritrocitos Pulmn

Unidades/g

100 80 60 40 20 0

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3.- Los enzimas como marcadores de lesin tisular (IV) 3.lesi

3.3 Patrn isoenzimtico de algunos enzimas con significacin clnica Patr isoenzim significaci cl

Estructura de la CPK y sus isoenzimas: isoenzimas:

CPK1 = b2 Cerebro

CPK2 = mb corazn

CPK3 = m2 m. esqueltico

Muestra suero

La CPK est constituida por dos subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de tres isoformas son distintas. En los los tejidos est presente una isoforma distinta.

+ +
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Estructura de LDH y sus isoenzimas: isoenzimas:

LDH1 = 4 LDH2 = 31 LDH3 = 22 LDH4 = 13 LDH5 = 4

La LDH est constituida por cuatros subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de 5 isoformas son distintas que poseen una movilidad electrofortica diferente que permite distinguirlas. En los los tejidos est presente una isoforma distinta.

Distribucin de los isoenzimas de lctico deshidrogenasa en tejidos

200 150 100 50 0
M. esquel Pncreas Rion Pulmn

Hgado

(2

Miocardio

) (1

2 2 3 ) 4 ) (3 ) (4 (5

Eritrocitos

Unidades/g

+ +
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Patrn isoenzimtico de la LDH de suero en infarto de miocardio y en hepatitis aguda

3.- Los enzimas como marcadores de lesin tisular (II) 3.lesi

Magnitud del dao celular da Citoplasmtico: LDH, ALT, CPK, AP Organelas (mitocondrial, microsomal): AST, GT, 5 nucleotidasa Localizacin del dao celular Localizaci da Muy pocos enzimas son especficos de un solo tejidos. Alternativas:
medida de ms de un enzima (p. ej. perfil heptico) isoenzimas

Alteraciones inespecficas de enzimas sricos. inespec s

Factores dependientes de la edad y sexo Factores atribuibles a la conservacin de las muestras

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4.- Enzimas sricos de importancia diagnstica clnica (I). 4.s diagn cl Aspartato aminotransferasa (AST/GOT)
Valores normales: < 40U/ml Aumento importante: Infarto e miocardio, hepatitis, traumatismos Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemlisis

Alanina aminotransferasa (ALT/GPT)

Valores normales: < 50 U/ml Aumento importante: Shock, hepatitis Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,

-amilasa
Valores normales: <50U/ml Aumento importante: pancreatitis aguda y crnica, cncer de pncreas. Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreticos (gastritis, lcera duodenal, peritonitis, obstruccin intestinal.

4.- Enzimas sricos de importancia diagnstica clnica (II). 4.s diagn cl Creatn fosfoquinasa (CPK)
Valores normales: < 160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres Aumento importante: Infarto de miocardio (isoenzima CPK-1) Aumento moderado: miopatas, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular

Fosfatasa cida (ACP)

Valores normales: < 2 U/ml Aumento importante: hipertrofia o cncer de prstata (isoenzima prosttico), hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia obstructiva

Fosfatasa alcalina (ALP)

Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en nios en desarrollo Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vas biliares, cirrosis, hepatomas Aumento moderado: neoplasias seas osteognicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo

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4.- Enzimas sricos de importancia diagnstica clnica (III). 4.s diagn cl Gamaglutamil transpeptidasa (GGT)
Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres Aumento importante: Hepatitis vrica, obstruccin biliar, metstasis hepticas, enf. alcohlica Aumento moderado: infecciones que afectan al hgado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

Lctico deshidrogenasa (LDH)

Valores normales: < 120-230 U/ml Aumento importante: infarto de miocardio (LDH1), hepatitis vricas (LDH4, LDH5) Aumento moderado: hemlisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscular

5 nucleotidasa (NTP)
Valores normales: <9U/ml en el adulto. Aumento importante: colestasis intra o extraheptica, enfermedades hepatobiliares, cncer heptico Aumento moderado:

Enzimas sricos en la enfermedad cardiaca

Creatn fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima mb) Lctico deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1 (15-25%). Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L
Tras el infarto, hay una liberacin de protenas intracelulares de las clulas daadas. La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto), seguida de la CK-MB (pico a 1 da), y finalmente la LDH, cuyo mximo se alcnza den los 2-3 das post infarto

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Enzimas sricos en la enfermedad heptica

Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L Lactato deshidrogenasa < 90 U/L (isoenzima 5) glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L Fosfatasa alcalina < 70 U/L Fosfatasa cida < 0.6 U/L 5 nucleotidasa < 5 U/L

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