A ANLISE DE DNA POR ELETROFORESE

Co autores: Elisete Marcia Corra Patrcia Abro Possik

Eletroforese de DNA em gel

A anlise de DNA por eletroforese uma das tcnicas fundamentais nos laboratrios de pesquisa e de diagnstico. O princpio baseado no fato da molcula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo eltrico, migra em direo ao plo positivo (ando). A velocidade da migrao depende do tamanho da molcula. Por isso em um dado momento da eletroforese molculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz. O tipo de matriz que usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido diferena no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separao de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separao de fragmentos pequenos, de at 1kb. Alternativamente para a resoluo de fragmentos superiores a 1 kb podese utilizar a agarose com baixo ponto de fuso (Low Melting) que um tipo de agarose derivada de sntese orgnica. Apesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em soluo, isto , quando no polimerizada, ser neurotxica. Assim, a preparao do gel exige certa cautela. Alm disso, a preparao mais laboriosa, requerendo a mistura

de componentes adicionais poliacrilamida para ajudar na polimerizao e mais tempo para que a polimerizao ocorra propriamente. J o gel de agarose feito apenas atravs da mistura de um tampo e agarose, no apresentando toxicidade. A polimerizao mais rpida e o gel pode ser reciclado aps o uso, isto , pode ser reutilizado na elaborao de outros gis. Alm disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como mtodo analtico ou preparativo, isto , quando o fragmento de DNA recuperado e purificado a partir do gel. Entretanto, visualizao do DNA, dependendo o gel de do mtodo pode utilizado ser para a

agarose

desvantajoso.

Frequentemente se utiliza a colorao com brometo de etdio (EtBr), uma substncia mutagnica. Em adio, para a visualizao do DNA corado com EtBr, necessria a utilizao de transiluminador de luz ultravioleta. Para a utilizao de tal aparelho e para a o uso do brometo de etdio, necessrio o cuidado com a biossegurana no somente do manipulador, mas de todos os que compartilham o uso do laboratrio. Se houver a necessidade de separar fragmentos maiores do que 50 kb necessrio utilizar a eletroforese em campo pulsado (pulsefield gel electrophoresis PFGE), que consiste, simplificadamente, de um gel submetido a uma corrente eltrica que se alterna em direes perpendiculares. A seguir sero discutidas as quatro etapas necessrias para a realizao da eletroforese em gel de agarose, a saber: preparao do gel, aplicao das amostras, corrida eletrofortica e a anlise e o registro dos resultados.

Preparao do gel:

A agarose, um polissacardeo extrado de uma alga marinha vermelha e formado por resduos de D e L galactose unidos por ligaes glicosdicas (13) e (14), um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. Por isso, para se preparar um gel de agarose procede-se

de modo similar a preparao de uma gelatina. Dissolve-se uma quantidade em gramas do p de agarose, ajustando-se a concentrao apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra (Tabela 20.1), em um dado volume de tampo de eltroforese. Os dois tipos de tampo mais utilizados so TAE (Tris-acetato-EDTA) e TBE (Trisborato-EDTA).

Aquece-se a mistura em forno microondas ou utilizando um bico de bunsen, at que a soluo fique homognea e transparente. Aguarda-se a diminuio da temperatura at aproximadamente 50C e verte-se em uma forma (um tipo de molde especfico para o preparo do gel).

Tabela 20.1: Concentraes de agarose indicadas para a resoluo dos fragmentos de DNA.

Concentrao de agarose (% [w/v])

Faixa de tamanho dos fragmentos de DNA eficientemente separados (kb) 0,5 10,0 0,4 6,0 0,2 3,0 0,1 2,0

1,0 1,2 1,5 2,0 Adaptado de Sambrook e Russel (2001).

Sobre a soluo ainda morna coloca-se um pente (uma tira de teflon denteada que ficar a 1 mm acima do fundo da forma) que servir como molde para produzir diversas cavidades (poos) no gel. Essas minsculas cavidades no chegam a atravessar o gel e serviro como reservatrios onde as amostras de DNA sero aplicadas. Ao esfriar e polimerizar, a agarose fica com o aspecto turvo e com resistncia diretamente proporcional concentrao de agarose utilizada.

A seguir, a forma contendo o gel colocada no interior da cuba de eletroforese horizontal (Figura 20.1). Na cuba o gel encontra-se entre fios de platina que atuam como ctodo e nodo provocando a passagem de corrente eltrica gerada por uma fonte de eletricidade. Adiciona-se o mesmo tampo usado para fundir a agarose em quantidade suficiente para que o gel fique totalmente imerso tomando-se o cuidado para que o nvel de tampo fique pelo menos 1 mm acima do gel. A seguir retira-se cuidadosamente o pente.
Pente Poo Fonte Gel Tampo

Figura 20.1: Representao esquemtica dos equipamentos necessrios para a realizao da eletroforese em sistema horizontal (cortesia de Adriana Medaglia).

Aplicao das amostras:

Antes da

aplicao, as amostras de

DNA devero ser

misturadas a um tampo de amostra. O tampo de amostra contm corantes e reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Estes ltimos asseguram que a amostra de DNA entre no poo pela fora da gravidade. J os corantes, azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a aplicao da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, j que apresentam velocidade conhecida durante a migrao na matriz em direo ao plo positivo. Por exemplo, o

azul de bromofenol migra juntamente com um fragmento de DNA de aproximadamente com 0,3kb e o xileno cianol com um fragmento de 4 kb em gis de agarose de 0,5 a 1,4% em TAE. H ainda corantes que migram mais rapidamente, como o Amarelo G, que acompanha

fragmentos menores que 100pb. Estes corantes podem ser adicionados simultaneamente no tampo de amostra, ou utilizados individualmente, dependendo da disponibilidade e objetivo do experimento. Para permitir uma estimativa visual do tamanho dos

fragmentos de DNA de uma dada amostra necessrio aplicar em um dos poos o marcador de massa molecular (ladder). O ladder uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentraes conhecidos, gerados a partir da digesto de plasmdeos (tipo de DNA circular presente em bactrias) com enzimas de restrio. Ele permite inferir, por comparao, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada. Existem no mercado diversos tipos de ladders, que variam no tamanho dos fragmentos de DNA presentes na soluo. Dentre os mais utilizados, destacam-se os marcadores Ladder 1kb, que contm 13 fragmentos que vo de 0,3 a aproximadamente 10 kb; e o Ladder 100bp que contm 14 fragmentos que variam de 0,1 a 5 kb, com duas bandas de alta intensidade em 1,5 e 2 kb.

Corrida de eletroforese:

Aps a aplicao das amostras, encaixa-se a tampa da cuba contendo os cabos que permitiro a conexo entre a cuba e a fonte de corrente contnua. Para se determinar a voltagem que ser utilizada deve-se computar a distncia entre os eletrodos e no o comprimento do gel. Geralmente usa-se uma voltagem de 1 a 5 V/cm. Voltagens excessivas ou muito baixas interferem na mobilidade do DNA e causam distores na migrao. Para cubas rotineiramente utilizadas pela maioria dos

laboratrios de pesquisa, a voltagem varia entre 50 e 110 V.

Durante a corrida o DNA sair do poo, penetrar no gel, migrando em direo ao plo positivo. Com isso os fragmentos sero separados de acordo com o tamanho. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os fragmentos maiores, pois eles apresentam maior facilidade de atravessar os poros da matriz de agarose em direo ao plo positivo. Enquanto que fragmentos de mesmo tamanho migram praticamente juntos. No caso da utilizao do azul de bromofenol, quando este atingir do gel a corrente pode ser desligada. Entretanto, h variaes de acordo com o tamanho do fragmento de DNA de interesse. Se o fragmento for muito grande, aguarda-se a separao dos fragmentos maiores na parte superior do gel e no h tanta preocupao com a parte inferior. Neste caso, o corante pode at sair do gel.

Anlise e registro dos resultados:

O mtodo mais usual para se visualizar o DNA em gis de agarose por colorao com brometo de etdeo (EtBr) de frmula C21H2OBrN3. Esse corante se intercala entre as bases dos cidos nuclicos e, na presena de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). Com este mtodo pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescncia emitida proporcional concentrao de DNA presente na amostra. O brometo de etdeo pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampo da amostra a ser aplicada, ou aps a corrida quando o gel submergido em soluo de EtBr. No entanto, no recomendada a incorporao do brometo de etdeo no gel porque esse corante interfere no padro de migrao das diversas conformaes que a molcula de DNA pode assumir. Segundo, e no menos importante, devido contaminao da vidraria, da cuba e demais utenslios usados na preparao do gel.

Corantes fluorescentes atxicos so boas opes alternativas (Yung-Sharp e Kumar, 1989) para visualizar o DNA. Alguns exemplos disponveis no mercado so: o Azul de Metileno (Flores, et al, 1992), que no apresenta potencial mutagnico e no requer luz U.V, embora apresente a desvantagem de ser pouco sensvel; o Sybr Safe, um corante fluorescente que cora o DNA no gel de agarose e no gel de poliacrilamida exibindo a mesma sensibilidade que o brometo de etdeo e visualizado no transiluminador de luz azul; e o GelRed e o GelGreen que pelo fato de serem termoestveis podem ser adicionados antes da homogenizao do gel. Os grupos de molculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do poo e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Aps a visualizao os resultados geralmente so fotodocumentados. No caso de gis corados com brometo de etdio, as fotos devem ser adquiridas sob luz ultravioleta. Para tal, utiliza-se filme Polaroid (branco e preto) ou um software capaz de transformar em imagem a intensidade relativa de fluorescncia emitida pelas bandas de DNA captadas por uma cmera fotogrfica digital. Em alguns laboratrios, a fim de minimizar os potenciais efeitos danosos da luz ultravioleta, o gel corado com brometo de etdio colocado dentro de uma cmara e a luz U.V s ligada com a cmara fechada. Uma cmera acoplada registra a foto do gel.

Fatores que influenciam a migrao do DNA:

A mobilidade eletrofortica do DNA atravs do gel de agarose influenciada por vrios fatores que sero discutidos a seguir.

a- Tamanho e conformao do DNA

O tamanho dos fragmentos de DNA o principal fator que influncia a migrao em gel de agarose. Pode-se dizer que este seria o fator crtico e alvo da anlise. Uma molcula de DNA migra na matriz de agarose com mobilidade inversamente proporcional ao log10 de sua massa molecular, que, por sua vez, funo do tamanho e da forma da molcula. Assim, o tamanho do fragmento do DNA em pares de base, ou seja, sua sequncia linear, o fator que, em princpio, deveria influenciar a migrao no gel. Entretanto, nem sempre o DNA encontra-se linear e descondensado e tais fatores podem alterar a migrao do fragmento no gel, pois interferem na passagem da molcula de DNA pelos poros. As molculas de DNA circular podem assumir formas como: relaxada (com corte, isto , nick) ou superenovelada (supercoiled). Estas formas no migram de acordo com o tamanho do DNA durante a eletroforese, podendo atravessar a malha do gel em velocidades

superiores ou inferiores ao padro. No entanto, quando estas molculas circulares so

linearizadas, ou seja so clivadas em um ponto e assumem uma forma linear, ento a corrida na eletroforese obedece ao tamanho da molcula. Sob algumas condies, a forma circular superenovada migra mais rapidamente que a forma linear; e sob outras condies acontece o inverso. Outro exemplo o DNA genmico, pois sua estrutura condensada e complexa no permite que os fragmentos migrem de acordo com o tamanho em pares de base e sim, fiquem presos nos poros do gel devido sua estrutura densa e irregular que no permite que os fragmentos atravessem. Assim, a mobilidade das formas do DNA no gel no depende somente do tamanho da molcula, mas da densidade, toro do DNA e de outros fatores que sero discutidos a seguir.

b- Concentrao de agarose

A concentrao da agarose desempenha papel importante na separao eletrofortica, pois determina a porosidade do gel, que por sua vez, influencia diretamente na capacidade de migrao das molculas de DNA. Portanto, o tamanho dos poros desta matriz inversamente proporcional concentrao de agarose utilizada e diretamente

proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar. Vale ressaltar que a agarose, apesar de apresentar um custo elevado, pode ser reciclada e reutilizada em eletroforese analtica. Para isso necessrio descontamin-la dos resduos de brometo de etdio, equilibr-la em gua, desidrat-la e transform-la novamente em p (Reiniger et al, 2004).

c- Presena do brometo de etdeo no gel

A mobilidade dos fragmentos de DNA influenciada pela presena do brometo de etdeo. O fato desse agente se intercalar entre os pares de bases provoca mudanas na conformao e na flexibilidade da molcula de DNA. Na ausncia de brometo as molculas circulares superenoveladas (forma I) migram mais rpido do que as molculas lineares (forma III) de mesma massa molecular. J as molculas circulares relaxadas (forma II) migram mais lentamente do que as outras duas isoformas topolgicas. Na presena de EtBr os superenovelamentos negativos

(geralmente encontrados no DNA de procarioto) so gradualmente removidos, causando a diminuio na mobilidade do DNA. Porm, altas concentraes de brometo acarretam na formao de superenovelamento positivo e conseqente aumento da mobilidade das molculas. Alm disso, a corrida da forma linear reduzida em cerca de 15% quando comparada a migrao da mesma molcula na ausncia do agente intercalante.

Assim, dependendo do objetivo do experimento o uso de altas concentraes do brometo de etdeo uma estratgia que permite separar a forma circular superenovelada das formas circular relaxada e linear. d- Voltagem e tipo de tampo de eletroforese aplicada

A corrente eltrica, a composio e a fora inica do tampo influenciam na migrao do DNA. Em uma faixa de baixa voltagem, a taxa de migrao de fragmentos de DNA linear proporcional voltagem aplicada. Entretanto, o aumento de voltagem faz com que a linearidade seja perdida. Desta forma, os grandes fragmentos de DNA migram mais rpido do que os pequenos havendo formao de rastros que refletem a m resoluo dos fragmentos. Em baixa fora inica, a migrao lenta e em alta fora inica h uma super condutividade eltrica que gera calor e pode derreter o gel dentro da cuba alm de desnaturar o DNA. Os tampes mais utilizados em eletroforese de DNA so o TAE (Tris-acetato-EDTA) e o TBE (Tris-borato-EDTA), ambos compostos pelo elemento tamponante, o Tris ou (hidroximetil) aminometano. Ressalta-se que o Acetato (cido actico) ou Borato (cido brico) so utilizados para ajustar o valor de pH da soluo e atuam como eletrlitos para a manuteno da corrente. Enquanto que o EDTA (cido etienodiamino tetractico) presente em ambos os tampes serve como um agente quelante que sequestra ons de magnsio entre outros. Isto

particularmente interessante para proteger o DNA via inibio de nucleases que dependem da presena de magnsio para degradar o DNA. A seleo dos tampes de eletroforese TAE ou TBE depende do objetivo do experimento. O TAE possui a menor capacidade

tamponante, no entanto, apresenta maior poder de resoluo para molculas grandes de DNA quando comparado ao TPE (Tris fosfato EDTA) ou TBE. Por sua vez o tampo TBE preferido para a separao de

molculas pequenas de DNA, menores do que 1 kb, e para longas corridas devido a sua maior capacidade tamponante. No caso do DNA ser

posteriormente recuperado do gel e utilizado, por exemplo, em um experimento de clonagem, prefere-se o uso de TAE, pois o Borato presente no TBE um potente inibidor de vrias enzimas.

Interpretando o resultado de uma eletroforese em gel de agarose no diagnstico da anemia falciforme

Uma das anlises que pode ser feita por eletroforese em gel de agarose o diagnstico da mutao que deu origem Anemia Falciforme. Esta mutao pontual no gene da globina beta da hemoglobina (substituio de uma Adenina por uma Timina na 20 posio da sequncia de nucleotdeos) elimina o ponto de restrio da enzima Dde I. necessrio lembrar que a visualizao do DNA atravs da eletroforese o ltimo passo que realizado para a anlise em questo. Assim as etapas que precedem a eletroforese so: a- Extrao do DNA genmico. b- Amplificao de uma regio de 381 pb do gene da beta globina que contm a regio da mutao. c- Incubao com a enzima de restrio Dde I que reconhece o stio C/TNAG (N = qualquer um dos quatros nucleotdeos).

Como resultado so gerados perfis de fragmentos de DNA que permitem o reconhecimento do gentipo homozigoto normal (A A), do heterozigoto e do homozigoto carregando cpias do alelo mutado (A S e SS). Em outras palavras, o fragmento de DNA contendo 1 stio de restrio resultar em 2 novos fragmentos devido clivagem. J na presena da mutao a enzima no reconhecer o stio de restrio e no cortar o fragmento (Figura 20.2).

No ocorre o corte

Figura 20.2: Uso da enzima de restrio Dde I no diagnstico da Anemia Falciforme. Observar que a substituio da adenina pela timina elimina o stio de clivagem da enzima.

Assim,

indivduo

homozigoto

para

alelo

normal

apresentar duas bandas no gel de agarose, devido clivagem do gene pela enzima Dde I. O indivduo homozigoto para o alelo mutante, por outro lado, apresentar apenas uma banda correspondente ao fragmento no clivado por Dde I devido presena da mutao. Finalmente, o individuo heterozigoto, isto , que carrega um alelo normal e um alelo mutante, apresentar trs bandas no gel: uma correspondente ao alelo mutado no clivado, e duas correspondentes ao alelo normal clivado (Figura 20.3).

Observaes:

- A seta indica a direo da corrida - Por conveno os poos so orientados para cima e os gis interpretados da esquerda para a direita.

Figura 20.3: Anlise de restrio do produto amplificado de 381pb do gene da -globina. Representao esquemtica de um gel de agarose mostrando em (M) marcador de massa molecular; (1) indivduo homozigoto dominante para o alelo normal (presena de dois fragmentos um de 201pb e o outro de 180pb); (2) indivduo heterozigoto (alelo normal = banda de 201pb e 180pb; e o alelo mutado = banda de 381pb); (3) indivduo homozigoto recessivo (ambos os alelos carregam a mutao que elimina o stio de restrio (banda de 381pb).

ANEXO Composio do tampo de eletroforese para DNA (concentrao da soluo estoque por litro). Adaptado de Sambrook e Russel (2001). TAE 50X 242 g de Tris Base 57,1 mL de cido actico glacial 100 mL de 0,5 M EDTA* (pH 8,0). *Ajustar o pH da soluo de EDTA com NaOH Armazenar a temperatura ambiente TBE 10 X 107,8g de Tris base 7,44 g de EDTA (Na2EDTA.2H2O) Aproximadamente 55,0 g de cido brico anidro Adicionar lentamente o cido brico at alcanar o valor de pH igual a 8,3 Armazenar a temperatura ambiente TPE 10X 40 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) 15,5 mL cido fosfrico 85 % 108 g de Tris Base Armazenar a temperatura ambiente

Composio do tampo da amostra para DNA (loading buffer 6X): Adaptado de Sambrook e Russel (2001). Azul de bromofenol 0,25% Xileno cianol FF 0,25% Glicerol 30% Armazenar em aliquotas de 1 mL 4C

Referncias Bibliogrficas

Flores, N. et al. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques, n. 13, p. 203-205, 1992. Reiniger et al. Reciclagem de agarose em laboratrios de biologia molecular. Cincia Rural, v. 34, n.5, set-out, 2004.
SAMBROOK. J.; RUSSEL, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3.ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Yung-Sharp, D; Kumar, R. Protocols for the visualisation of DNA in electrophoretic gels by a safe and inexpensive alternative to ethidium bromide. Technique, v. 1, n 3, p. 183-187, 1989.