Livro

Como observar cromossomos:
Um Guia de Tcnicas em Citogentica Vegetal, Animal e Humana
Como observar cromossomos:

Um Guia de Tcnicas em Citogentica Vegetal, Animal e Humana
Marcelo Guerra Departamento de Botnica Universidade Federal de Pernambuco e Maria Jos de Souza Departamento de Gentica Universidade Federal de Pernambuco
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) (Cmara Brasileira do Livro, SP, Brasil)
Guerra, Marcelo Como observar cromossomos : um guia de tcnicas em citgentica vegetal, animal, e humana / Marcelo Guerra, Maria Jos de Souzas. -Ribeiro Preto, SP : Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto, 2002. Bibliografias. 1. Citogentica 2. Cromossomos I. Souza, Maria Jos. II. Ttulo. ISBN: 85-87528-38-6 02-3218 CDD-572.8072
ndices para catlogo sistemtico: 1. Citogentica : Tcnicas de laboratrio : Cincias da vida 572.8072 Todos os direitos desta edio reservados Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto.
Editor Chefe: Prof. Dr. Francisco A. Moura Duarte Editor Associado: Prof. Dr. David De Jong Supervisora de Produo: Eneida Oliveira Banks Engenheiro de Sistemas: Domingos Yamada Computao Grfica: Jos Meneghetti Jnior Revisora Tcnica: Margareth P Monteiro de Barros . Coordenador de Produo Grfica: Edmundo Cruz Canado Supervisora de Editorao Grfica: Fabiana Pereira da Silva Capa: Fabiana Pereira da Silva
FUNPEC - Editora
Rua Hudson, 655 / Jardim Canad 14024-000 Ribeiro Preto, SP Tel./Fax: (16) 620-1251 e-mail: funpecrp@uol.com.br www.funpecrp.com.br
2002, Impresso no Brasil
APRESENTAO
Este livro comeou como um roteiro para aulas prticas ministradas independentemente por ambos os autores. Ao longo de muitos anos, o texto foi modificado, ajustando-se melhor s tcnicas j bem estabelecidas e incorporando-se novas, servindo tambm de referncia para a rotina dos estagirios e ps-graduandos dos nossos laboratrios. Finalmente, foi reorganizado como um guia prtico de tcnicas em citogentica. Desde o incio at a sua forma final, os procedimentos tcnicos foram sempre testados, criticados e aperfeioados por nossos alunos, aos quais somos imensamente gratos pelas inmeras sugestes, principalmente queles que trabalharam intensamente conosco na fase final de redao deste texto, contribuindo, inclusive, com muitas das fotos apresentadas. Na parte relativa Citogentica Vegetal, o autor gostaria de destacar a colaborao fundamental de Ana Emlia Barros e Silva, que como amiga e tcnica do laboratrio, checou e discutiu todos os protocolos, preparo de solues, etc, alm de revisar o texto final vrias vezes, e de Reginaldo de Carvalho, que gentilmente preparou todas as pranchas dessa rea. Na Citogentica Animal, a autora particularmente grata s colegas Tania T. Rieger, pela leitura e contribuies sugeridas, e Rita de Cssia de Moura, pela elaborao de alguns desenhos, bem como s tcnicas Francisca Tavares Lira e Cirlene Maria da Silva pelo constante apoio nas diferentes fases deste trabalho. Gostaramos ainda de agradecer doutoranda Ana Christina Brasileiro pela reviso do portugus de todo o livro.
PREFCIO
A anlise cromossmica sempre foi um dos campos mais excitantes da Citologia e da Gentica, tanto quando relacionada a estudos taxonmicos e evolutivos, quanto a estudos estruturais, no melhoramento gentico, na caracterizao de germoplasmas ou na anlise clnica. Apesar da revoluo provocada pela Gentica Molecular, a anlise cromossmica continua sendo a nica maneira de observar todo o genoma de um eucariota na forma de blocos individualizados de material gentico, passveis de serem mensurados, diferenciados em sub-unidades e manipulados de diversas maneiras. Em nenhuma outra instncia, o material gentico to claramente observado. Com a introduo das tcnicas moleculares, os chamados corpos corados da Citologia, esto cada vez mais brilhantemente corados, em cores e pseudo-cores as mais variadas. A obteno de bons resultados, depende basicamente do perfeito domnio de diferentes tcnicas de colorao. Com isso, a Citogentica alia a informao obtida sobre o material gentico, estampada em uma simples foto, a uma esttica prpria da rea, capaz de impressionar iniciantes e profissionais experientes. O fascnio da Citogentica evidente at nos trabalhos rotineiros. Em aulas prticas, por exemplo, mesmo professores mais experientes no conseguem ser muito objetivos na anlise de uma lmina bem preparada de mitose em cebola. So sempre possudos pelo desejo de olhar mais e mais, uma e outra clula. Uma metfase bonita, bem espalhada e corada com hematoxilina, Giemsa ou DAPI uma paisagem difcil de tirar da memria por horas ou mesmo dias. Durante o processo evolutivo das espcies, os caritipos se transformaram seguindo regras prprias, muitas das quais ainda desconhecidas, gerando uma imensa diversidade cromossmica em nmero, forma, tamanho, capacidade de pareamento meitico, contedo de heterocromatina, etc. Os vrios exemplos apresentados no texto, ilustram no apenas o efeito final de determinadas tcnicas de colorao como tambm fornecem uma amostra da diversidade revelada com essas tcnicas. As fotos foram quase sempre tiradas de trabalhos nossos j publicados, mostrando assim o que possvel produzir com essas tcnicas. O estudo da variabilidade cariotpica e do seu significado tem sido nosso tema de pesquisa h cerca de 30 anos. Este livro o resultado dessa experincia em pesquisa, em aulas prticas e na orientao de alunos nos mais diversos ramos da citogentica. Os protocolos apresentados tm sido utilizados em aulas prticas de diferentes cursos de graduao e psgraduao ministrados pelos autores na Universidade Federal de Pernambuco e em outras Universidades. A citogentica humana foi restrita, neste texto,
s tcnicas bsicas, tanto por no ser a rea de pesquisa dos autores, quanto por ser uma rea j to especializada que possui guias particulares nos quais tem sido bastante exploradas. O texto est dividido em duas partes praticamente independentes: a citogentica vegetal e a citogentica animal e humana. Cada uma dessas partes de autoria exclusiva de apenas um dos autores e por isso tem estilo de apresentao prprio, apesar da intensa troca de idias e sugestes. Os captulos finais da parte de citogentica vegetal, sobre o preparo de solues, revelao de filmes e sugestes gerais para o dia-a-dia do laboratrio, se aplicam igualmente bem na citogentica animal e so recomendados a qualquer pesquisador iniciante. O texto foi escrito para servir de guia prtico para aqueles interessados em desenvolver essas tcnicas em seus laboratrios. Por essa razo, so descritas no apenas as etapas de cada tcnica mas tambm os detalhes de como fazer cada uma delas e os cuidados que devem ser tomados. Para os iniciados na rea, uma leitura atenta atravs das tcnicas e recomendaes provavelmente revelar algumas observaes importantes. O livro certamente incompleto, uma vez que apresentamos apenas aquelas tcnicas utilizadas rotineiramente em nossos laboratrios. Em caso contrrio, faramos um texto muito volumoso e sem muita experincia. O leitor interessado em outras tcnicas deve consultar outras obras, algumas das quais recomendamos no captulo final. Das tcnicas atuais, a grande ausente a de hibridizao in situ, na qual a nossa experincia no to extensa que nos permita tratar vontade as vrias etapas envolvidas e por isso preferimos apenas recomendar livros recentes de autores com vasta experincia na rea. Esperamos que as tcnicas apresentadas possam ajudar estudantes e pesquisadores iniciantes a descobrir mais sobre esse fantstico mundo guardado dentro das clulas.
MARCELO GUERRA
MARIA JOS
DE
SOUZA
NDICE
Parte I - Citogentica Vegetal
1 1.1 1.2 1.3 1.4 2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.4 2.4.1 2.4.2 3 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 Como coletar material para anlise citogentica Obteno de tecido com atividade mittica intensa Pr-tratamento com antimitticos Fixao das clulas Estocagem do material Como analisar cromossomos mitticos A escolha da tcnica e do corante adequados Tcnicas de esmagamento seguido de colorao Colorao com Giemsa Controle da colorao Giemsa Colorao com hematoxilina a 1% Tcnicas de colorao seguida de esmagamento Colorao com hematoxilina actica a 1% Colorao com orcena actica a 2% Preparao de lminas permanentes com corantes acticos Colorao Feulgen Representao do caritipo na forma de cariograma ou idiograma Construo de um cariograma Construo de um idiograma Como analisar cromossomos meiticos Observaes gerais para a preparao das lminas Tcnicas de colorao seguida de esmagamento Colorao com carmim actico a 2% Colorao com hematoxilina actica a 1% Tcnicas de esmagamento seguido de colorao Colorao com Giemsa Colorao com hematoxilina actica a 1% Anlise de clulas do tapete e da mitose polnica Como corar diferencialmente algumas regies cromossmicas Preparao de lminas com digesto enzimtica Bandeamento C Observao da heterocromatina constitutiva Dupla-colorao com os fluorocromos CMA e DAPI Tripla-colorao CMA/DA/DAPI Colorao sequencial CMA-DAPI com contracorantes (CMA/DA-DAPI/AMD) Colorao com Hoechst 33258, quinacrina ou iodeto de propdeo
15
17 17 19 20 20 23 23 25 25 28 29 31 31 32 33 33 36 36 37 39 39 41 41 43 44 44 45 46
49 49 50 52 55 56 56
4.7 4.8 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25 5.26 5.27
Colorao com nitrato de prata: observao de nuclolos e RONs Descolorao de lminas coradas com prata Como preparar as solues mais utilizadas na citogentica vegetal Fixador Carnoy 3:1 - 20 ml Colchicina a 0,1% ou 0,5% - 50 ml 8-Hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M - 300 ml HCl 1N e 5N - 300 ml Carmim actico a 2% - 100 ml Hematoxilina actica 1% - 100 ml Orcena actica a 2% - 100 ml Soluo corante de Giemsa (soluo estoque) - 66 ml Giemsa a 2% (soluo de uso) - 100 ml Reativo de Schiff - 400 ml gua sulfurada - 300 ml Tampo fosfato pH 6,8 (tampo de Sorensen) - 2 litros de soluo estoque Tampo McIlvaine pH 7,0 - 2 litros de solues estoque Tampo McIlvaine pH 5,5 - 20 ml Tampo citrato-fosfato pH 4,8 - 1 litro 20xSSC - 1 litro 2xSSC - 100 ml Soluo de celulase 2% - pectinase 20% - 20 ml Soluo saturada de hidrxido de brio - 120 ml DAPI (4- 6diamidino - 2 - fenilindol) 2 g/ml - 10 ml de soluo estoque CMA (Cromomicina A3) 0,5 mg/ml - 10 ml AMD (Actinomicina D) 0,2 mg/ml - 5 ml DA (Distamicina A) 0,1 mg/ml - 10ml Hoechst 0,5 g/ml - 2 ml de soluo estoque Quinacrina 0,5% - 10 ml Iodeto de propdeo 1 g/ml - 10 ml de soluo estoque Meio de montagem Glicerol:/McIlvaine 1:1 (para fluorocromos) - 50 ml Como revelar os filmes fotogrficos Reveladores e fixadores mais comuns Revelador Dektol - 1 litro de soluo estoque Revelador Microdol - 1 litro de soluo estoque Revelador HC-110 (para filme de ASA 400) Fixador universal - 1 litro Cuidados com os reveladores e fixadores Revelao dos filmes mais comumente utilizados Filme Copex Pan Agfa ou Imagelink Kodak (ASA 25)
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61 61 61 61 62 62 62 62 63 63 63 64 64 65 65 65 65 66 66 66 66 67 67 67 67 68 68 68 69 69 69 70 70 70 71 71 71
6 6.1 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.2 6.3 6.3.1
6.3.2 6.3.3 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12
Filme T-Max ou Tri-X Pan Kodak (ASA 400) Filme Panatomic X ou T-Max Kodak (ASA 100) Como organizar melhor seu laboratrio e apresentar seus resultados Cuidados gerais com os protocolos Preparao da bancada Anotaes gerais no laboratrio Reutilizao de lminas e lamnulas Descarte de cidos e substncias txicas Conservao de corantes e lminas coradas Observao de uma clula em diferentes microscpios Cuidados com a fotografia A escolha dos filmes Organizao da documentao fotogrfica Seleo de fotos para publicao Montagem de fotos em uma prancha
71 72
73 73 74 74 75 75 75 76 76 77 77 78 78
Parte II - Citogentica animal e humana

8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 Como observar cromossomos mitticos em insetos Manuteno de gafanhotos em cativeiro Obteno de embries Preparao de lmina a partir de embrio total Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de parede de ovarolos Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de cecos gstricos (suspenso celular) Como observar cromossomos mitticos humanos e de pequenos mamferos Cultivo de linfcitos humanos Macrotcnica para cultivo de linfcitos Microtcnica para cultivo de linfcitos Cultivo de fibroblastos em pequenos mamferos Obteno de bipsias Implantao do cultivo Tripsinizao Preparao do material para anlise cromossmica Congelamento de clulas Descongelamento de clulas Observao de cromossomos mitticos em clulas de medula ssea e de bao de pequenos mamferos Utilizando clulas de medula ssea Utilizando clulas de bao Anlise do caritipo mittico
81
83 83 85 86 87 87
9 9.1 9.1.1 9.1.2 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.2.4 9.2.5 9.2.6 9.3 9.3.1 9.3.2 9.4
89 89 89 90 91 92 93 94 94 95 96 96 96 97 98
9.4.1 9.4.2 10 10.1 10.1.1 10.1.2 10.2 10.3 10.4 10.4.1 10.4.2 10.4.3
Construindo um cariograma: o exemplo do cariograma humano A montagem do cariograma
98 99
Como observar cromossomos meiticos e complexos sinaptonmicos 101 Disseco de gafanhotos 101 Preparao de lminas por esmagamento de folculos testiculares de gafanhotos 102 Preparao de lminas por suspenso de clulas testiculares de gafanhotos 103 A meiose em pequenos mamferos (roedores, morcegos e marsupiais) 103 Anlise da freqncia e distribuio de quiasmas em gafanhotos 104 Anlise de complexo sinaptonmico em insetos e pequenos mamferos 105 Anlise do complexo sinaptonmico em pequenos mamferos (tcnica de disperso ou spreading) 106 Anlise de complexo sinaptonmico de pequenos mamferos (tcnica de suspenso celular) 107 Anlise de complexo sinaptonmico em gafanhotos 107 (tcnica de disperso ou spreading) Como corar diferencialmente cromossomos mitticos, meiticos, politnicos e a cromatina sexual 111 Bandeamento C (para vertebrados e invertebrados, especialnente insetos) 112 Bandeamento C (colorao com acridina orange) 112 Anlise da heterocromatina constitutiva atravs da colorao com os fluorocromos CMA3/DA/DAPI (trplice colorao) 115 A colorao DA/DAPI em cromossomos humanos 116 Colorao seqencial AgNO3/CMA3 118 Observao de nuclolos, RONs, cores e cinetcoros de insetos 119 Anlise das RONs em vertebrados 119 Bandeamento G e bandeamento R em humano e outros mamferos 120 Bandeamento G para humano e outros mamferos 120 Bandeamento R por incorporao de 5-bromodesoxiuridina (5-BrdU) 121 Anlise de cromossomos politnicos de drosfila e da cromatina sexual humana 122 Coleta de drosfila na natureza 122 Preparao de lminas para obteno de cromossomos politnicos 122
11 11.1 11.1.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.7.1 11.7.2 11.8 11.8.1 11.8.2
11.8.3 Localizando a cromatina sexual humana 12 Como preparar as solues e meios de cultura usados na citogentica animal 12.1 Soluo de Ringer (soluo fisiolgica de insetos) - 1000 ml 12.2 Soluo de Hanks (soluo salina balanceada) - 500 ml 12.3 Soluo desinfetante de merfene - 75 ml 12.4 Orcena actica a 2% -100 ml 12.5 Orcena lcto actica a 1% - 100 ml 12.6 Soluo de fermento - 25 ml 12.7 Soluo coloidal de gelatina - 50 ml 12.8 Meio de cultura para drosfila 12.9 Meio de cultura para linfcitos - 120 ml 12.10 Meio de cultura para fibroblastos - 120 ml
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125 125 125 125 125 125 126 126 126 127 127
Referncias Bibliogrficas
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PARTE I
CITOGENTICA VEGETAL
1 - Como coletar material para anlise citogentica

Na anlise cromossmica, tanto com tcnicas de colorao simples quanto com as mais sofisticadas, uma coleta e preparao do material muito bem feitas so fundamentais para a obteno de bons resultados. Os procedimentos descritos abaixo tm sido aplicados com xito na anlise citogentica de vegetais dos mais diversos grupos e constituem um resumo dos mtodos mais comumente utilizados para observao de cromossomos em plantas. Antes de se aplicar qualquer das tcnicas de colorao so necessrios alguns cuidados especiais na obteno de tecidos em atividade intensa de diviso, bem como no pr-tratamento, fixao e estocagem desse material. 1.1 - Obteno de tecidos em atividade mittica intensa Em plantas, a maior quantidade de clulas em divises mitticas se encontra no tecido meristemtico. Esse tecido pode ser encontrado em diferentes rgos das plantas e se caracteriza por no apresentar clulas diferenciadas. Para anlise cromossmica mittica o melhor meristema o de razes, devido principalmente ao maior volume celular e ao crescimento muito rpido. Alm disso, as pontas de razes absorvem mais facilmente solues onde so mergulhadas, o que muito importante no uso de antimitticos. A obteno de razes para a anlise cromossmica pode ser feita a partir de diferentes fontes. As mais comuns so sementes, bulbos e caules. Abaixo descrevemos como proceder para obter razes adequadas a partir de diferentes partes da planta. a) Sementes. Coloque sementes limpas para germinar em placas de Petri com papel de filtro umedecido. A raiz deve ser coletada preferencialmente quando o seu tamanho for aproximadamente igual ao do eixo maior da semente. Quando as razes forem muito grossas, prefervel esperar que cresam um pouco mais e se tornem mais finas. Observe que o papel de filtro deve ser mantido apenas mido. A maioria das espcies germina rapidamente e dispensa maiores cuidados. Entretanto, em alguns casos, prefervel esterilizar externamente a semente para evitar o desenvolvimento de fungos e bactrias que afetem a sua viabilidade ou diminuam o seu ndice mittico. Nesses casos, antes de colocar as sementes na placa de Petri, elas devem ser esterilizadas em etanol 70% ou em hipoclorito de sdio (gua sanitria) a 4%, em um recipiente sob agitao intensa por 15 a 20 segundos, e lavadas rapidamente em gua destilada ou esterilizada. Sementes com tegumentos muito duros podem precisar de algum tratamento que facilite a absoro da gua pelo embrio. Para isso, pode-se lixar as sementes em um ponto da superfcie ou mergulh-las cuidadosamente em cido sulfrico concentrado para escarificar o tegumento. O tempo de escarificao depende do material, podendo ser testado, inicialmente,
Um guia de tcnicas em citogentica vegetal, animal e humana
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tempos bem curtos (2 a 5 minutos) at tempos mais longos (30 minutos ou mais). Geralmente possvel observar o efeito corrosivo do tratamento sobre o tegumento a olho nu ou na lupa. b) Bulbos. No caso de plantas com bulbos, como a cebola, ou com estruturas similares, deixe apenas a base do bulbo em contato com a gua dentro de um frasco. As capas mais externas e as razes envelhecidas ou secas do bulbo devem ser retiradas para evitar apodrecimento da gua. Se necessrio, mude a gua freqentemente. No caso de cebola, as razes para coleta devem ter 1 a 2 centmetros de comprimento. c) Caule. Muitas plantas enrazam facilmente quando colocadas na gua e produzem um excelente meristema. o caso da maioria das monocotiledneas, como as arceas (comigo-ningum-pode, imb, etc), comelinceas e gramneas, e de muitas dicotiledneas, como os maracujs e as espirradeiras. Nesse caso, deve-se mergulhar na gua a parte inferior do ramo ou caule, para que emita razes adventcias. Sempre que possvel, deve-se retirar as folhas submersas para evitar que apodream e afetem a qualidade da gua. Em plantas como a mandioca ou as arceas em geral, pode-se obter melhores resultados enterrando-se o caule em um jarro com cubos de xaxim, de coco ou bolinhas de cermica, garantindo assim um excelente nvel de umidade e aerao - duas condies fundamentais para um bom desenvolvimento das razes. d) Plantas cultivadas em jarro. No caso de plantas cultivadas em jarro, pode-se inverter o jarro por inteiro apoiando a terra em volta da planta na palma da mo e, com pancadas cuidadosas no fundo do vaso, deslocar para fora todo o seu contedo sem desmanchar o bloco de terra. As razes jovens, que geralmente se situam no fundo do vaso ou junto s paredes, podem ser facilmente coletadas sem danificar o restante do raizame. No caso de plantas pequenas, o ideal deix-las crescendo em jarros pequenos enterrados no cho ou em um jarro bem maior. Assim, os vasos pequenos no ressecam facilmente e as plantas so manipuladas sem dificuldades. e) Plantas inteiras coletadas diretamente no campo. Especialmente em poca chuvosa, muitas plantas fornecem excelentes razes quando extradas cuidadosamente do solo. Se no h razes jovens, pode-se coletar a planta, retirar todas ou a maioria das razes e deixar crescer novas em um vaso com gua. No caso de gramneas, ciperceas e outras plantas que formam pequenas touceiras, deve-se retirar todas as razes e mergulhar a base da touceira na gua. f) Outros meristemas. Na falta de razes adequadas, diversos outros meristemas podem tambm ser utilizados, como, por exemplo, a parte mais jovem e central dos brotos foliares em crescimento, anteras e parede de ovrio dos menores botes florais e vrios outros rgos em crescimento ativo (gavinhas, ptalas, embries, etc). Nesses meristemas, embora o tamanho das clulas seja geralmente menor que o observado em razes, a
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Como observar cromossomos
quantidade de clulas em diviso maior e por isso eles so especialmente recomendados. Em plantas que tm sementes muito pequenas ou razes muito finas, como muitas cactceas, orquidceas, veloziceas, etc, esses outros meristemas so quase sempre muito melhores que as pontas de razes . Uma desvantagem que nesses tecidos os antimitticos freqentemente no penetram to facilmente quanto nas razes. Isso pode ser contornado cortando o material em fatias relativamente finas. Por outro lado, em espcies com cromossomos muito pequenos, como bromlias, cactos e outros, esses meristemas podem apresentar bons resultados mesmo sem o uso de antimitticos. 1.2 - Pr-tratamento com antimitticos Sempre que o objetivo for analisar o nmero e a morfologia cromossmica ser necessrio pr-tratar o material com agentes antimitticos. Esses agentes tm as seguintes vantagens: a) bloqueiam o ciclo mittico em metfase, acarretando um acmulo de clulas nesse estgio; b) provocam maior contrao cromossmica, permitindo visualizar melhor as constries primrias e secundrias, definindo melhor a morfologia cromossmica; c) produzem um maior espalhamento cromossmico, devido destruio ou inibio das fibras do fuso acromtico. Os agentes mais comumente utilizados so: colchicina 0,01 a 0,5%, 8hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M e solues saturadas de paradiclorobenzeno (PDB) ou -bromonaftaleno. O tempo ideal de tratamento com essas drogas pode variar de uma espcie para outra, dependendo, principalmente, da temperatura e da concentrao utilizadas. A maioria das espcies reage bem com um tratamento de 8HQ 4-5 horas a 18 C ou 20-24 horas a 6-8 C. Temperaturas acima de 18 C, especialmente no caso da 8HQ, devem ser evitadas porque podem causar aderncias entre cromossomos. Espcies com cromossomos grandes, acima de 6 m, freqentemente reagem melhor com colchicina que com outros antimitticos. Isso deve-se ao fato de que a colchicina promove uma condensao cromossmica mais intensa, permitindo um melhor espalhamento e definio da morfologia cromossmica. Na citogentica humana e animal, em geral, utiliza-se a colchicina ou um composto sinttico similar denominado Colcemid. Em algumas espcies, como trigo, aveia e centeio, um tratamento com choque de frio pode causar efeito idntico aos antimitticos qumicos, produzindo excelentes metfases. Nesse caso, as razes so colocadas em um pequeno recipiente com gua, o qual colocado em uma caixa de isopor contendo gua e cubos de gelo. O conjunto mantido na geladeira por 6 a 24 horas. A temperatura da gua deve ficar em torno de 0-2 C. A maioria dos autores que trabalham atualmente com essas gramneas prefere esse tipo de pr-tratamento. Todos os meristemas destacados da planta e mantidos em ambiente mido, continuam seus ciclos nucleares normalmente durante horas ou mesmo dias, dependendo do rgo de onde provm. Para permitir uma melhor absoro do antimittico, prefervel pr-tratar pontas de razes, ou outros meristemas, de tamanho relativamente pequeno.
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O pr-tratamento do meristema deve ser realizado preferencialmente de manh, por volta das 10:00 h. Nesse horrio, a maioria das espcies apresenta uma proporo mais alta de clulas em prfase, resultando em um maior acmulo de metfases bloqueadas ao final do tratamento. Certifique-se de que todo o material em contato com o antimittico e com as razes (pina, frasco para pr-tratamento, etc) est rigorosamente limpo. Por outro lado, a fixao das clulas poder ser feita a qualquer hora do dia, dependendo do pr-tratamento utilizado. 1.3 - Fixao das clulas A fixao uma etapa extremamente crtica para a obteno de bons resultados, especialmente na anlise meitica e em tcnicas de bandeamento cromossmico. O fixador mais utilizado o de Carnoy 3:1 (trs partes de lcool etlico P.A. para uma de cido actico glacial). Pode-se tambm utilizar o lcool metlico em substituio ao etlico, embora o metlico seja desaconselhado por ser mais txico. A soluo fixadora deve ser preparada imediatamente antes de ser utilizada. Antes de colocar as razes no fixador, agite bem a mistura fixadora. Essas substncias no se misturam to facilmente quanto se pode imaginar. Aps mergulhar o material no fixador, especialmente no caso de botes florais, agite novamente o frasco (se possvel, agite algumas vezes durante o tempo de fixao). O volume do fixador deve ser, de preferncia, 10 vezes maior que o volume do material a ser fixado. A fixao sempre feita temperatura ambiente, salvo indicao em contrrio na tcnica. Razes muito grossas, botes florais e brotos foliares devem sempre ser seccionados com uma lmina (nova, de preferncia) antes de serem fixados. Observe que a fixao no ocorre facilmente atravs de paredes grossas ou em tecidos duros. Geralmente deixa-se o material no fixador de um dia para o outro. Contudo, aps as primeiras 2 horas o material j est fixado e j pode ser estocado. Um tempo de fixao maior que 24 horas pode prejudicar o material. No caso de materiais mais sensveis, prefervel fazer uma fixao inicial por 10 a 15 minutos e, em seguida, substituir o fixador por um novo por mais 1 a 2 horas. 1.4 - Estocagem do material O material fixado pode ser imediatamente utilizado para colorao ou estocado para ser usado dias ou anos aps. A estocagem pode ser feita simplesmente guardando o material fixado no freezer, no prprio fixador, ou, ento, transferindo o material para etanol 70% e guardando na geladeira. Em qualquer caso, certifique-se de que os frascos estejam hermeticamente fechados. Use de preferncia frascos com batoque de presso e tampa de rosca. Todas as fixaes devem estar devidamente etiquetadas. As etiquetas devem ser feitas no prprio laboratrio, em papel branco e de tamanho adequado para fcil visualizao atravs do vidro. As anotaes na
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etiqueta so sempre feitas a lpis. A etiqueta sempre mantida dentro do frasco de fixao, junto com o material, com a face anotada para fora. Nunca anote nos dois lados da etiqueta. Na etiqueta deve constar sempre um nmero ou cdigo de referncia do material, a data da fixao e, eventualmente, alguma outra anotao que ajude a reconhecer o material (por exemplo, o tempo de fixao, quando este for intencional ou acidentalmente diferente do normal). Cada pesquisador deve ter suas fixaes reunidas em caixas plsticas prprias, para facilitar a localizao no freezer. Nos projetos que demandam grande quantidade de fixaes importante utilizar tambm uma pequena etiqueta autocolante no lado de fora do frasco para permitir uma identificao mais fcil das fixaes.
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2 - Como analisar cromossomos mitticos

A observao de cromossomos mitticos, tanto para anlise do ciclo mittico quanto para estudo do caritipo, geralmente feita pelas tcnicas de colorao convencional. Essas tcnicas coram os cromossomos por igual, isto , indistintamente, sem nenhuma preferncia por determinado tipo de cromatina, composio do DNA ou de protenas. So chamadas de convencionais para serem distinguidas das tcnicas de colorao diferencial, desenvolvidas a partir do final dos anos 60. Nessas ltimas, so includas as tcnicas de bandeamento cromossmico que coram principalmente, ou exclusivamente, um determinado tipo de cromatina (captulo seguinte). As tcnicas convencionais so as mais utilizadas na citogentica vegetal e tm a vantagem de permitir uma colorao rpida e bem definida dos cromossomos. Alm disso, a repetibilidade dos resultados obtidos com essas tcnicas praticamente de 100%. Por outro lado, as tcnicas de colorao diferencial, por envolverem um nmero maior de etapas experimentais, so mais laboriosas e a repetibilidade dos resultados sempre inferior, ou seja, nem sempre a execuo da tcnica produz os resultados esperados. Essas desvantagens so compensadas pelo fato de permitirem observar detalhes que no seriam visveis com a colorao convencional. Os resultados obtidos com qualquer dessas tcnicas podem ser apresentados na forma de cariograma ou idiograma, os quais permitem uma melhor organizao e visualizao das principais caractersticas cariotpicas. Ao final do captulo, so apresentados os procedimentos para construo de cariogramas e idiogramas. Atualmente, existem no comrcio diversos programas para anlise de imagem que ajudam bastante, ou automatizam completamente, a construo de cariogramas e idiogramas. Contudo, os programas especficos para essa finalidade so muito caros e s valem a pena ser adquiridos se houver uma rotina intensa de trabalho com essas tcnicas. 2.1 A escolha da tcnica e do corante adequados Existem muitas maneiras de preparar e corar lminas para anlise cromossmica em plantas. Neste trabalho sero enfatizadas as tcnicas mais utilizadas em nosso laboratrio, embora diversas outras possam ser igualmente eficientes. A escolha da tcnica mais adequada pode depender dos objetivos desejados e dos recursos disponveis no laboratrio. As tcnicas mais simples, que utilizam drogas mais baratas e dispensam nitrognio lquido (ou gelo-seco), so mais recomendadas para aula prtica. Nesses casos, as clulas devem ser primeiramente coradas e depois esmagadas entre lmina e lamnula, podendo ser analisadas logo em seguida. Essas tcnicas de colorao seguida de esmagamento utilizam geralmente os chamados corantes acticos (carmim actico, orcena actica ou hematoxilina actica) ou o reativo de Schiff. Uma outra opo primeiramente esmagar as clulas numa lmina em cido actico a 45%, retirar a lamnula por congela-
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mento em nitrognio lquido e depois cor-las (tcnicas de esmagamento seguido de colorao). A grande vantagem desse ltimo procedimento que, ao retirar a lamnula por congelamento, as clulas permanecem presas lmina e podem ser submetidas aos mais diversos tratamentos antes de serem coradas. Uma outra vantagem que o material aderido lmina, sem a proteo da lamnula, seca e se achata, permitindo a observao de todos os cromossomos de uma metfase em um nico plano focal o que fundamental para a documentao fotogrfica. Alm disso, as lminas feitas com essas tcnicas so normalmente montadas de forma permanente, enquanto nas tcnicas de colorao seguida de esmagamento a montagem permanente exige um procedimento parte. A escolha do corante tambm depender do objetivo e do material que est sendo analisado. Alguns corantes permitem visualizar simultaneamente os cromossomos e os nuclelos, enquanto outros coram apenas os cromossomos, porm com maior nitidez e contraste. Quando os cromossomos so grandes, a colorao com hematoxilina, orcena ou Feulgen pode ser mais adequada, por ser mais simples e permitir uma observao rpida e direta dos cromossomos. Quando os cromossomos so muito pequenos, deve ser utilizado o corante de Giemsa ou a hematoxilina, que garantem uma colorao mais intensa e melhor contrastada. Em algumas espcies o citoplasma pode reagir um pouco com o corante, diminuindo o contraste da preparao. O mesmo pode ocorrer devido qualidade da fixao fixaes antigas ou feitas em excurses, freqentemente coram tambm o citoplasma. Nesses casos, importante tentar diferentes corantes, at se conseguir um que produza um melhor contraste. A tcnica de colorao Feulgen, descrita inicialmente por Feulgen e Rossenbeck, em 1924, utiliza uma soluo corante chamada reativo de Schiff. uma tcnica clssica que oferece bons resultados e dispensa a retirada da lamnula. A intensidade da colorao, nesse caso, depende muito das condies de fixao e hidrlise. Quando essas condies so bem controladas, a intensidade de colorao dos ncleos diretamente proporcional quantidade de DNA que eles apresentam. Por isso, essa colorao utilizada para medir a quantidade de DNA nuclear (veja mais detalhes sobre essa colorao em Mello e Vidal, 1978). Alm do reativo de Schiff, alguns fluorocromos coram tambm de forma estequiomtrica (isto , proporcional quantidade de DNA presente no ncleo) e podem ser utilizados para determinar a quantidade de DNA. A seguir so descritas algumas das tcnicas de colorao cromossmica mais comumente utilizadas na citogentica vegetal. Cada uma delas apresenta inmeras variaes de procedimentos descritas na literatura especializada. Essas variantes, geralmente, refletem apenas a experincia prtica de diferentes autores e muito raramente constituem melhorias objetivas na tcnica. Nas tcnicas onde necessrio um pr-tratamento, feita a recomendao de um procedimento geral com 8-hidroxiquinolena, como utilizado em nosso laboratrio, embora outros tipos de pr-tratamento possam ser utilizados (item 1.2). A orcena actica, o carmim actico e o reativo de Schiff so classicamente os corantes mais utilizados para vegetais. Por outro lado, o corante de Giemsa (uma mistura de corantes estabelecida por
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Gustav Giemsa) o mais utilizado na citogentica humana e animal (principalmente para vertebrados). Posteriormente, o uso desse corante foi aplicado tambm a vegetais e, em nossa experincia com a citogentica de plantas, a colorao com Giemsa, ou com hematoxilina, produz os melhores resultados, tanto para mitose quanto para meiose (veja mais detalhes sobre essas tcnicas em Guerra, 1983, 1999). O material ideal para treinar qualquer das tcnicas descritas abaixo, relacionadas anlise de cromossomos mitticos, a cebola. Isso por numerosas razes: um material universal, disponvel durante todo o ano, enraza facilmente, as razes so macias e com meristema abundante, apresenta clulas e cromossomos grandes, alm de ter cromossomos pouco numerosos e extensamente estudados na literatura. 2.2 - Tcnicas de esmagamento seguido de colorao Essas tcnicas so recomendadas para anlise convencional de caritipos de plantas em geral. A tcnica de Feulgen (item 2.3.4), tambm recomendada para a anlise de caritipos. Contudo, se os cromossomos forem muito pequenos prefervel utilizar as tcnicas abaixo, que coram os cromossomos mais fortemente. 2.2.1 - Colorao com Giemsa
a) Pr-tratamento. Colete pontas de razes em crescimento ativo e mergulhe-as em um recipiente aberto contendo uma pequena quantidade de 8HQ por 20-24 horas na geladeira a cerca de 10 C. b) Fixao. Mergulhe as razes em Carnoy 3:1 por 2 a 20 horas temperatura ambiente. c) Estocagem. Caso no queira trabalhar com o material imediatamente, estoque as razes no prprio fixador no freezer ou em etanol na geladeira (veja item 1.4). d) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua destilada (5 minutos cada). e) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos. No caso de espcies com razes muito duras, como as de gramneas, prefervel primeiro digerir a parede celular com celulase-pectinase antes de fazer a hidrlise (veja como faz a digesto da parede no item 4.1.c). Nesse caso, faa uma digesto menos intensa (metade do tempo indicado para a digesto normal) para facilitar o manuseio posterior das razes. f) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Enxugue cuidadosamente a raiz com papel filtro e acrescente uma gota de cido actico a 45%. Com o auxlio de um estereomicroscpio, retire a
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coifa e as capas mais externas da raiz procurando deixar apenas o meristema. Corte ou fragmente o meristema em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente, com uma agulha de ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos do meristema at que cada um deles se transforme numa pequena mancha de clulas espalhadas. Verifique no microscpio comum, com o diafragma do condensador parcialmente fechado ou com o condensador do microscpio deslocado para baixo, se as clulas esto bem espalhadas. Se o espalhamento no estiver bom, bata novamente com cuidado, at obter um espalhamento satisfatrio. Nesse ponto, esmague o material colocando o conjunto lminalamnula em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina. Ateno: Para esmagar o material, utilize de preferncia 3 folhinhas de papel filtro cortadas em tamanho 35 x 90 mm e dobradas ao meio. A lmina e a lamnula devem ser ajustadas no canto das folhinhas e ento pressionadas firmemente. Isso evita que a lamnula deslize sobre a lmina e enrole as clulas. Observe que as batidas tm apenas a funo de espalhar as clulas, enquanto o esmagamento propriamente tem a funo de espalhar melhor os cromossomos. importante que cada lmina contenha uma quantidade no muito grande de tecido, permitindo um bom espalhamento das clulas. A preparao deve conter o mximo de tecido meristemtico e o mnimo de outros tecidos, de forma a aumentar a concentrao de clulas em diviso na lmina. Se surgirem bolhas de ar na preparao, acrescente uma gota de cido actico a 45% ao lado da lamnula e retire o excesso com papel filtro. g) Retirada da lamnula. Congele o conjunto lmina-lamnula no nitrognio lquido ou gelo-seco por alguns minutos e com o auxlio de uma gilete ou de um bisturi retire rapidamente a lamnula. Deixe a lmina secar ao ar. Ateno: A reteno das clulas exclusivamente na lmina se deve ao fato de que elas aderem superfcie mais gelada. Como a lmina mais espessa, conserva mais o frio que a lamnula e por isso retm as clulas. Se a retirada da lamnula no for rpida, a temperatura se eleva rapidamente nas duas superfcies e as clulas podem ser retidas em parte na lamnula e em parte na lmina, causando geralmente deformaes tanto nas clulas quanto nos cromossomos. Caso no disponha de nitrognio lquido, gelo-seco ou CO 2 comprimido, coloque a lmina em uma superfcie gelada dentro do freezer, por pelo menos 20 minutos, e rapidamente abra o freezer e retire a lamnula. Nesse caso, pode-se perder uma certa proporo de clulas, mas o que fica suficiente para trabalhar.
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h) Colorao com Giemsa. Coloque as lminas em uma cubeta e acrescente a soluo de Giemsa a 2%. Controle cuidadosamente a intensidade da colorao (veja item seguinte). Para retirar as lminas da soluo, acrescente lentamente gua de torneira at que os cristais sobrenadantes transbordem. Em seguida, retire o restante da soluo corante e lave rapidamente as lminas com gua destilada ou tampo fosfato. i) Montagem da lmina. Seque as lminas com uma bomba de ar, acrescente uma gota de meio de montagem e cubra com uma lamnula limpa. A Figura 1 ilustra a colorao com Giemsa em clulas pr-tratadas de diferentes organismos. Em 1a observa-se um par de cromossomos satelitados, em uma metfase de Costus pulverulentus (zingibercea), onde apenas um deles mostra a constrio secundria distendida e corada.
Figura 1 Cromossomos mitticos corados com Giemsa. a, Metfase de Costus pulverulentus (2n=18). b, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). Setas em a e b apontam constries secundrias. Asteriscos em b mostram a regio onde deve existir uma constrio secundria distendida e no-corada. c, Prometfase de Sesbania tetraptera. Os nmeros indicam os pares cromossmicos com o mesmo padro de condensao profsica. d, Metfase de um brifito, Notothylas vitalii (2n=10). Tringulos vazios apontam microcromossomos. Fotos: a, Guerra, 1988a; b, Guerra, 1988b; c, Forni-Martins e Guerra, 1999; d, original.
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Em 1b , as constries secundrias em uma metfase de Eleutherine bulbosa (iridcea) aparecem distendidas e completamente nocoradas, parecendo tratar-se de dois cromossomos extras. Satlites com a constrio secundria no-corada, como em 1b , tm freqentemente levado a erro na contagem dos cromossomos. Observe nessa figura, a ocorrncia de uma inverso pericntrica no par maior, resultando em um cromossomo acrocntrico e um outro metacntrico. Como a inverso envolveu parte do satlite, os satlites tm tambm tamanhos diferentes. A Figura 1c mostra uma prometfase de Sesbania tetraptera (leguminosa) com alguns braos cromossmicos parcialmente descondensados, gerando um padro de condensao cromossmica caracterstico para cada par cromossmico. Em 1d observa-se o complemento cromossmico diplide de uma espcie de brifito do grupo dos antceros, destacando-se a presena de microcromossomos (o par menor nesta metfase), comuns em brifitos. 2.2.2 - Controle da colorao Giemsa A colorao Giemsa utilizada tanto na anlise cromossmica convencional quanto em outras tcnicas, principalmente o bandeamento C e N. Entretanto, vrios fatores interferem na reao de colorao, entre eles as condies de fixao, a natureza do material e a qualidade do corante (diferentes remessas de um mesmo fabricante podem apresentar reaes significativamente diferentes). Por essa razo, importante controlar cuidadosamente a intensidade de colorao. O tempo de colorao varia de acordo com o tamanho dos cromossomos e com a concentrao e qualidade do corante. Espcies com cromossomos muito pequenos, como a maioria dos brifitos, podem precisar de 20 minutos ou mais, enquanto outras com cromossomos grandes, como cebola ou trigo, coram bem com 5 minutos ou menos. Quando no se conhece o tempo exato de colorao do material com um determinado estoque de corante, deve-se verificar a intensidade de colorao a partir dos primeiros um ou dois minutos. Para isso, retire a lmina do corante, enxugue rapidamente o verso da lmina e confira no microscpio com a objetiva de 10x. Se a colorao no for suficiente, devolva a lmina para o corante, agitando-a um pouco ao mergulh-la na soluo, de forma a evitar os cristais sobrenadantes. Caso o tempo de colorao tenha sido excessivo, possvel retirar o excesso de corante dos cromossomos e do citoplasma, at obter um melhor contraste. Para isso, deve-se: a) Localizar no microscpio uma clula que esteja excessivamente corada para tomar como controle. b) Mergulhar a lmina em um borel contendo gua destilada ligeiramente acidificada (2 a 3 gotas de cido actico a 45% em 80 ml de gua) e mov-la firmemente na horizontal umas 6 ou 8 vezes.
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c) Retirar a lmina do borel, lavar rapidamente com um jato de gua destilada, enxugar o verso da lmina e verificar ao microscpio o efeito na intensidade de colorao. Caso no tenha sido suficiente, repita a operao at obter um contraste ideal. Ao final, lave a lmina em gua destilada, seque e monte como no procedimento normal. Lminas recm-montadas que ficaram mal coradas podem tambm ser recoradas seguindo-se as etapas abaixo: i) Se o meio de montagem no endureceu ainda, pode-se destacar a lamnula, com a ajuda de uma gilete, e mergulhar a lmina em um borel com xilol (na capela) at que o meio de montagem seja completamente dissolvido. Esse processo, que dura uma hora ou mais, pode ser acelerado agitando-se a lmina no borel. Se o meio de montagem estiver endurecido, mergulhe o conjunto lmina e lamnula em xilol e aguarde que o meio se dissolva e a lamnula caia. Em seguida, passe ligeiramente a lmina em um segundo borel com xilol, para permitir uma completa retirada do meio de montagem, e seque-a com uma bomba de ar. ii) Com a lmina apoiada horizontalmente, coloque algumas gotas de cido actico 45% sobre as clulas por 10-15 minutos, ou mais, at obter uma completa descolorao. Em seguida, retire o cido actico com um jato de gua destilada, lavando bem a lmina. iii) Seque bem a lmina e recore com uma soluo mais concentrada de Giemsa (3-4%), controlando cuidadosamente o tempo de colorao. 2.2.3 - Colorao com hematoxilina a 1% a) Preparao da lmina. Todo o procedimento de preparao da lmina nessa tcnica idntico ao anterior (itens 2.2.1.a a g), diferindo apenas a partir da colorao. b) Colorao com hematoxilina. Coloque uma gota de hematoxilina a 1% em cima da mancha de clulas espalhadas na lmina e cubra com uma lamnula. A colorao instantnea e a lmina pode ser examinada imediatamente. c) Montagem de lmina permanente. Para tornar a lmina permanente, retire a lamnula com um jato de gua destilada, seque-a completamente, acrescente uma gota de meio de montagem e cubra-a com uma lamnula limpa. Ateno: A colorao com hematoxilina pode facilmente ser descorada e recorada com Giemsa ou vice-versa. A hematoxilina prontamente descorada retirando-se a lamnula e acrescentando-se algumas gotas de HCl 5N em cima da regio corada. Em seguida, a lmina deve ser
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lavada com um jato de gua destilada, seca e corada normalmente com Giemsa. No caso inverso, para descorar o Giemsa, usa-se o cido actico a 45% (item 2.2.2.ii). Depois de seca, a lmina deve ser corada normalmente com hematoxilina, como no item b. A Figura 2a mostra uma metfase e ncleos interfsicos de uma espcie de orqudea corados com a tcnica acima. Observe que o citoplasma
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Figura 2 Colorao com hematoxilina (a, b) e com orcena (c). a, Metfase e ncleos interfsicos de Pelexia cf viridis (2n=46). b, c, Clulas sem pr-tratamento de cebola (b) e Nothoscordum pulchellum (c), mostrando diversas fases da mitose. P, prfase; M, metfase; A, anfase, Ti, telfase inicial; Tf, telfase final. Fotos: a, Leonardo Felix; b, Guerra, 1999; c, original.
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das clulas no visvel, enquanto os cromossomos so fortemente corados. A presena de um par cromossmico acrocntrico bem maior que os demais caracteriza esse caritipo como bimodal. 2.3 - Tcnicas de colorao seguida de esmagamento Essas tcnicas so mais recomendadas quando no se dispe de nitrognio lquido, gelo-seco ou similar. So recomendadas, principalmente, para observar o ciclo mittico e meitico em aulas prticas, por serem mais simples e rpidas. Contudo, tanto os ciclos nucleares quanto os cromossomos pr-tratados podem ser observados com qualquer das tcnicas descritas a seguir. 2.3.1 - Colorao com hematoxilina actica a 1% a) Obteno de razes. Para anlise do ciclo mittico, coloque um bulbo de cebola em um recipiente com gua de torneira, de maneira que o bulbo fique suspenso na borda do recipiente e apenas sua base entre em contato com a gua. Antes disso, retire com uma gilete as razes secas, cortando inclusive parte do eixo da base da cebola (veja item 1.1b). b) Fixao. Quando as razes estiverem com um ou dois centmetros de comprimento, retire-as com uma pina e coloque-as em um frasquinho de vidro com fixador de Carnoy 3:1 por 2 a no mximo 20 horas temperatura ambiente. Se necessrio, estoque as razes no fixador ou em etanol (item 1.4). c) Lavagem. Retire as razes do fixador e mergulhe-as duas vezes em um recipiente com gua destilada (5 minutos cada). d) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos. e) Lavagem. Lave as razes novamente, como no item c, sendo dessa vez trs lavagens de 5 minutos cada, para retirar completamente o HCl. f) Colorao. Enxugue ligeiramente as razes em um papel filtro e as transfira para um recipiente pequeno e com tampa, como um tubo de Eppendorf ou, de preferncia, uma caixinha de guardar lentes de contato com tampa de rosca. Logo em seguida, acrescente duas ou trs gotas de hematoxilina a 1% e mantenha o recipiente fechado por 30 minutos temperatura ambiente. g) Preparao da lmina. Transfira uma raiz para a lmina e acrescente uma gota de cido actico a 45%. Retire a coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas o meristema. Corte o tecido restante em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente com uma agulha de ponta rombuda diretamente sobre os
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fragmentos de meristema. Verifique ao microscpio se as clulas esto realmente bem espalhadas. Se o espalhamento estiver bom, esmague o material colocando o conjunto lmina-lamnula em um papel filtro dobrado, pressionando com cuidado para no permitir que a lamnula deslize. h) Controle da lmina. Verifique no microscpio a qualidade final da lmina. Lute as melhores lminas passando esmalte de unha na borda da lamnula e as analise em seguida. A colorao pode se manter em bom estado por um ou dois dias, se estiver bem lutada. Ateno: H vrios aspectos muito importantes na hidrlise e na preparao da lmina que so comuns a outras tcnicas e se encontram descritos com mais detalhes nos itens 2.2.1.e e f.. Confira esses itens. A Figura 2b mostra clulas de cebola, sem pr-tratamento, coradas com a tcnica acima. Observe que os ncleos e os cromossomos esto fortemente corados enquanto o citoplasma quase imperceptvel. 2.3.2 - Colorao com orcena actica a 2% a) Obteno e fixao das razes. Proceda como nos itens a e b da tcnica anterior para obter e fixar razes. b) Colorao. Retire as razes do fixador, enxugue-as ligeiramente em papel de filtro e coloque-as em um tubo de ensaio com orcena actica a 2%. Acrescente uma gota de HCl 1N para cada nove de orcena (ou cerca de 10% do volume de corante) e agite. Aquea o tubo (aberto) na chama de uma lamparina a lcool at que o corante comece a borbulhar. Retire o tubo rapidamente da chama e deixe o material esfriar no corante por 20-30 minutos, mantendo o tubo fechado. Ateno: Observe que nessa tcnica no h necessidade de lavar as razes antes de corar. Use apenas uma quantidade de orcena suficiente para cobrir todas as razes. Quando aquecido na chama, o corante pode ferver bruscamente e expulsar violentamente todo o contedo do tubo. Por essa razo, durante o aquecimento, deve-se manter a boca do tubo voltada para a parede, de preferncia azulejada. c) Preparao da lmina. Coloque uma raiz numa lmina limpa, seccione a poro apical da raiz e elimine o restante do material. Tente deixar apenas o meristema da raiz, eliminando as capas de tecidos mais externos. Com a ajuda de agulhas, fragmente o meristema em pedaos menores, tendo cuidado para o tecido no ressecar na lmina enquanto o manuseia. Acrescente uma gota de corante no aquecido e cubra com uma
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lamnula limpa. Bata levemente com uma agulha de ponta rombuda por cima da lamnula, diretamente sobre o material, at espalhar bem as clulas de cada fragmento. Controle ao microscpio o espalhamento das clulas. Pressione a lamnula contra a lmina, dentro de uma folha dobrada de papel filtro (veja mais detalhes no item 2.2.1.f). Observe ao microscpio e lute com esmalte de unha, se necessrio. A Figura 2c ilustra essa colorao em clulas de Nothoscordum pulchellum (alicea), sem pr-tratamento. Observe que o citoplasma, embora fracamente corado, mais visvel que nas tcnicas anteriores. A foto ilustra tambm as vrias etapas do ciclo mittico. 2.3.3 - Preparao de lminas permanentes com corantes acticos a) Congele a lmina-lamnula no gelo-seco ou nitrognio lquido por alguns minutos e, com o auxlio de uma gilete ou um bisturi, retire rapidamente a lamnula. b) Transfira a lmina para um borel com etanol absoluto por cerca de 1 minuto. c) Transfira para outro borel com etanol absoluto, pelo mesmo tempo. d) Mergulhe a lmina rapidamente em um borel com xilol puro. Observe que todo trabalho com xilol deve ser feito em uma capela. e) Com a lmina ainda molhada de xilol coloque uma gota de Entellan, ou outro meio de montagem, e cubra com uma lamnula limpa. Mantenha a lmina deitada at o meio secar (cerca de 24 h). Ateno: No caso de preparaes para meiose, a retirada da lamnula em nitrognio lquido freqentemente provoca rachaduras nas clulas e por essa razo prefervel analisar e fotografar as clulas antes. Caso no disponha de nitrognio lquido ou gelo seco, mergulhe a lmina corada num borel com cido actico 20% at a lamnula cair. Se tiver ficado muito material na lamnula, faa com a lamnula uma segunda lmina permanente. Em geral, as preparaes com corantes acticos (carmim, hematoxilina, orcena) apresentam melhor contraste antes de serem tornadas permanentes. A colorao da lmina fresca pode se manter estvel por poucos dias. Se as lamnulas forem bem lutadas e mantidas na geladeira, podem ser conservadas por uma semana ou mais, embora o contraste seja inferior ao dos primeiros dias. 2.3.4 - Colorao Feulgen a) Pr-tratamento. Colete e pr-trate as razes como no item 2.2.1.a.
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b) Fixao. Transfira as razes para o fixador de Carnoy 3:1 por 2 a 20 horas temperatura ambiente. c) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua destilada (5 minutos cada). d) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos. No caso de espcies com razes muito duras, como as de gramneas, prefervel fazer primeiro uma digesto enzimtica (veja item 4.1) e em seguida a hidrlise. e) Colorao. Mergulhe as pontas de razes no reativo de Schiff em um vidro tampado e protegido da luz por 1 a 2 horas (at ficarem bem coradas). Aps a colorao, transfira as razes para um vidro com gua sulfurada por 10 minutos e repita essa operao mais duas vezes. Ao final, transfira as razes para a gua destilada enquanto prepara as lminas. Ateno: Observe que a ponta da raiz fica mais corada que o lado cortado. Isso se deve ao menor volume do citoplasma das clulas do meristema, aumentando, assim, a densidade de ncleos corados nessa regio. f) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Retire o excesso de gua com papel filtro e acrescente uma gota de cido actico a 45%. Com o auxlio de agulhas e de um estereomicroscpio, retire a coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas o meristema. Corte o tecido em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente, com uma agulha de ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos do meristema at que cada um deles se transforme numa pequena mancha de clulas espalhadas. Em seguida, esmague o material colocando o conjunto lmina-lamnula em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina. A lmina pode ser analisada imediatamente ou lutada e conservada na geladeira por um ou dois dias. Ateno: Durante a preparao, a gota de cido actico 45% colocada no incio dessa etapa, utilizada para facilitar o espalhamento das clulas, pode ser substituda por uma gota de carmim ou orcena actica. Esse procedimento amplamente empregado (exceto quando o objetivo medir a quantidade de DNA) por intensificar a colorao cromossmica, corando apenas levemente o citoplasma. Em clulas com cromossomos grandes, como na Figura 3a, esse reforo na colorao dispensvel. g) Montagem de lmina permanente. Congele a lmina-lamnula
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Figura 3 Representao do caritipo atravs de cariograma (a, b) e idiograma (c). a, b Metfase e cariograma de Alstroemeria sp. c, Idiograma de Emilia fosbergii, com a localizao das bandas C. Fotos em a e b foram digitalizadas e o cariograma montado pelo programa Qwin da Leica. Fotos: a, b, Leonardo Felix e Natoniel Melo; c, Guerra e Nogueira, 1990.
no nitrognio lquido ou gelo-seco por alguns minutos e com o auxlio de uma gilete ou de um bisturi, retire rapidamente a lamnula e deixe a lmina secar ao ar. Em seguida, acrescente uma gota de meio de montagem e cubra com uma lamnula. Veja mais detalhes sobre a preparao e montagem da lmina nos itens 2.2.1.f e g.
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Ateno: Para medio da quantidade de DNA, o procedimento para colorao Feulgen exige alguns cuidados a mais, principalmente na fixao, que pode ser realizada em Carnoy 3:1 ou formaldedo, dependendo do material (veja detalhes em Greilhuber, 1988; Greilhubert e Ebert, 1994). 2.4 Representao do caritipo na forma de cariograma ou idiograma 2.4.1 Construo de um cariograma a) Selecione a melhor foto do material, considerando os seguintes parmetros: 1) clula completa, bem focada e contrastada; 2) cromossomos sem superposio ou com o menor nmero possvel delas; 3) constries primrias (centrmeros) e secundrias visveis; 4) cromossomos sem distores mecnicas causadas pelo esmagamento. b) Se a clula tiver uma diferenciao na morfologia e tamanho cromossmicos bastante evidente e no apresentar superposio de cromossomos, basta uma cpia fotogrfica para recortar e montar o cariograma. c) Pelo contrrio, se a clula contiver cromossomos bem espalhados e diferenciados mas com superposies, sero necessrias ao menos duas cpias fotogrficas, de maneira a permitir recortar cada um dos cromossomos superpostos de uma cpia diferente. d) Para clulas que apresentem muitos cromossomos, prefervel ter ao menos duas cpias. Uma delas servir para identificar e anotar (em cima da prpria foto, com tinta removvel) os provveis pares cromossmicos, comeando pelos mais evidentes. A segunda cpia ser utilizada para recortar os cromossomos e montar o cariograma. A tentativa de identificar os pares cromossmicos na clula, antes de comear a recort-los, ajuda na identificao correta dos pares por permitir uma melhor comparao de cada cromossomo com todos os demais do complemento. Ainda assim, alguns pares precisaro ser reordenados na montagem do cariograma. e) Para a montagem do cariograma os cromossomos podero ser organizados de diferentes maneiras. Mais freqentemente, os pares so alinhados pelos centrmeros, dispondo-se os braos curtos para cima e numerando-se os pares cromossmicos por ordem decrescente do maior para o menor brao curto. Dessa maneira, a silhueta superior do cariograma apresenta-se como uma escada decrescente, facilitando a visualizao da variao na morfologia cromossmica. f) importante apresentar uma escala (barra com equivalncia em micrmetros) para que se possa estimar o tamanho real dos cromossomos.
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Uma cpia da metfase inteira pode tambm ser apresentada junto com o cariograma, comprovando que os cromossomos pertencem a uma nica clula (Figuras 3a, e b). 2.4.2 Construo de um idiograma a) Selecione e fotografe cinco a dez metfases completas, sem distores mecnicas, e que permitam visualizar bem os centrmeros e as extremidades dos cromossomos. b) Coloque o filme negativo de cada uma das metfases em uma ampliadora fotogrfica (ou um projetor de eslaides), projete a imagem em uma folha de papel branco e desenhe os contornos de cada cromossomo. Desenhe todas as clulas na mesma ampliao. c) Retire o negativo da metfase e coloque o negativo de uma escala micromtrica fotografada na mesma ampliao que os cromossomos. Desenhe no mesmo papel, uma linha reta entre dois intervalos consecutivos da escala. A escala deve indicar a quantos micrmetros corresponde um milmetro na figura ampliada, sendo vlida para todos os desenhos. d) Aps desenhar todas as clulas na mesma ampliao, mea o comprimento de cada brao cromossmico e dos satlites, utilizando uma rgua milimetrada comum. Numere todos os cromossomos arbitrariamente, de maneira a lhe permitir identificar cada um deles. e) Em uma outra folha de papel , construa uma tabela com quatro colunas, como exemplificado a seguir. A primeira, apresenta os nmeros de 1 ao equivalente ao nmero 2n daquela espcie. A segunda, apresenta os tamanhos do brao curto, brao longo e comprimento total para cada um dos cromossomos. Nessa coluna, o cromossomo que aparece na nona linha, por exemplo, correspondente na coluna anterior ao nmero 9 e contm os dados do cromossomo anotado no seu desenho como 9, embora no necessariamente seja o nono maior cromossomo. A terceira coluna apresenta os mesmos valores da segunda, porm ordenados em pares pela similaridade de tamanho e morfologia cromossmica. Nessa coluna, o maior cromossomo ser colocado na linha 1, o segundo maior na linha 2, etc. direita desses valores, coloque, entre parnteses, o nmero que cada cromossomo apresentava na coluna anterior, de maneira a permitir o reconhecimento daquele cromossomo no desenho a qualquer momento. A quarta coluna apresenta os tamanhos mdios desses pares para o brao curto, o brao longo e o comprimento total. f) Cromossomos com satlites tm o tamanho do satlite medido e apresentado separadamente, como um terceiro segmento cromossmico. Contudo, na determinao do tamanho do brao cromossmico ao qual o satlite se encontra ligado, o tamanho do satlite acrescido ao do restante do brao. Na representao esquemtica final do idiograma, o satlite
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deve aparecer separado do restante do brao cromossmico por uma constrio ou um pequeno intervalo.
Nmero do cromossomo no desenho 1 2 3 4 5 6 Brao curto + brao longo = total Cromossomos ordenados do maior para o menor Mdia dos pares de cromossomos
( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
g) Aps construir uma tabela para cada metfase, rena em uma outra tabela os valores mdios dos pares cromossmicos, como mostrado abaixo.
Tamanhos mdios Pares Metfase 1 Metfase 2, Valores mdios (convertidos para etc cromossmicos em milmetros micrmetros) 1 2 3
h) Na ltima coluna da tabela acima, converta os tamanhos ampliados de cada par cromossmico, de milmetros para valores reais em micrmetros. Para isso, compare o tamanho da escala micromtrica com o tamanho dos braos cromossmicos, utilizando uma regra de trs. i) Os valores mdios para cada par cromossmico podem tambm ser seguidos do desvio padro de cada mdia, indicando a variao das medidas obtidas. j) Os valores em milmetros podem ser utilizados para construir uma representao esquemtica desses dados. A Figura 3c mostra uma das maneiras possveis de apresentar um idiograma. Nesse caso, alm da representao esquemtica do complemento haplide, os valores obtidos para tamanho (S) e proporo entre braos (AR), para cada cromossomo dessa espcie (Emilia fosbergii), esto claramente indicados (veja uma clula metafsica correspondente a esse idiograma na Figura 8b). Havendo heteromorfismo cromossmico para esses parmetros, em todos os indivduos analisados, as duas formas encontradas devem ser apresentadas no idiograma. Os cromossomos na Figura 3c esto ordenados pelo tamanho do brao curto, do maior para o menor.
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3 - Como analisar cromossomos meiticos

A anlise convencional de cromossomos meiticos feita praticamente da mesma maneira que a anlise mittica. A colorao classicamente mais utilizada a colorao com carmim actico seguida de esmagamento, embora para cromossomos pequenos, as tcnicas de esmagamento seguido de colorao permitam melhor espalhamento e contraste e sejam, por isso, mais recomendadas. As tcnicas utilizadas para anlise meitica permitem tambm observar a primeira diviso mittica dos gros-de-plen. Nesse ltimo caso, deve-se utilizar preferencialmente a colorao com hematoxilina ou com carmim. A colorao com Giemsa no muito recomendada para esse fim porque cora a exina do plen, necessitando, portanto, estourar os gros de plen. A anlise das fases da meiose, e especialmente a interpretao dos bivalentes, no muito fcil em espcies com cromossomos pequenos. Por isso, fortemente recomendado adquirir alguma experincia inicial com espcies que apresentem cromossomos grandes e pouco numerosos. Entre essas espcies, destacamos o centeio com n=7, as espcies de Allium (cebola, alho) com n=8 e as espcies diplides de Nothoscordum (alho de cheiro) com n=5. O milho (n=10), o maracuj (n=9), o tomate e a jurubeba (Solanum), com n=12, embora tenham cromossomos bem menores, so materiais fceis de coletar e tambm permitem uma anlise satisfatria das fases da meiose. Da mesma maneira que na anlise mittica, as tcnicas de anlise meitica podem ser divididas em dois grupos. As tcnicas de colorao seguida de esmagamento so mais simples e rpidas, enquanto as de esmagamento seguido de colorao so um pouco mais demoradas, mas resultam em lminas permanentes, cromossomos sempre em um mesmo plano focal e colorao, geralmente, mais contrastada, sendo por isso mais recomendadas para a rotina de pesquisa. Ambas as tcnicas possuem uma srie de detalhes comuns na coleta, fixao e seleo dos botes, descritos no item abaixo. 3.1 - Observaes gerais para a preparao das lminas a) Coleta de material. Colete botes florais com tamanhos prximos metade do tamanho do boto na antese. Se possvel, antes de iniciar a fixao, retire uma das anteras de um desses botes, coloque em uma lmina com uma gota de cido actico a 45%, dilacere a antera, cubra com uma lamnula e verifique no microscpio, com o condensador abaixado, se j tem gros de plen. Em caso positivo, elimine os botes maiores que esse. Para estabelecer um tamanho mnimo a ser coletado, localize, da mesma maneira, um boto bem menor que esse que no apresente plen nem meicitos. Definidos os limites, procure fixar o maior nmero possvel de botes. b) Fixao. Fixe os botes em lcool-cido actico 3:1 por 2 a 20
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horas e estoque no freezer ou transfira o material para etanol 70% e estoque na geladeira. Ateno: Uma boa fixao dos meicitos fundamental para a posterior anlise dos cromossomos e exige bastante ateno. A fixao dos meicitos dificultada pela presena de spalas e ptalas que protegem as anteras e formam uma barreira penetrao do fixador no seu interior. No caso de Nothoscordum e de algumas outras plantas, quando as anteras esto em meiose, as ptalas ou tpalas so ainda muito mal desenvolvidas e as anteras ficam bastante expostas, facilitando a fixao. Nesse caso, basta remover as brcteas e outras estruturas que protegem a inflorescncia, retirar os botes mais velhos e mergulhar a inflorescncia no fixador. Na maioria das espcies, no entanto, necessrio remover ou afastar as spalas e ptalas, de forma a permitir uma fixao rpida e eficiente dos meicitos. Em algumas espcies, como em ciperceas e orqudeas, prefervel remover as anteras e fix-las em um pequeno frasco ou tubo de Eppendorf. Esses procedimentos precisam ser feitos na lupa, demandando mais tempo, mas sempre produzem resultados de mais alta qualidade. Quando no houver condies de proceder a uma disseco cuidadosa, deve-se ao menos fazer um corte longitudinal no boto, com uma gilete, partindo da base para o pice. Uma pequena compresso do eixo maior de cada metade do boto ajuda a relaxar um pouco a estrutura interna do boto, facilitando a penetrao do fixador. Lembre-se de colocar cinco a dez vezes mais fixador que material a ser fixado em cada frasco. Enquanto est colocando os botes ou anteras no fixador, agite regularmente o frasco com fixador para garantir que os lquidos dos tecidos sejam realmente substitudos pelo fixador. Em casos mais crticos, mude o fixador aps os primeiros 10 a 15 minutos. Caso demore mais de 20 minutos dissecando ou cortando os botes, feche o frasco com os botes j fixados, faa um novo fixador e continue a fixao. c) Seleo do boto floral adequado e preparao da lmina. Coloque em uma lmina cinco ou seis botes, alinhados por ordem de tamanho, mantendo todos bem umedecidos. Afaste um dos botes e, com a ajuda de uma lupa, retire uma das anteras. Coloque a antera em outra lmina com uma gota de cido actico a 45%. Com uma agulha de seringa, corte a antera transversalmente e bata em cima das duas metades de forma que os meicitos sejam liberados da antera. Verifique no microscpio o estgio exato do boto floral. Para isso, abaixe o condensador do microscpio e utilize a objetiva de 5x ou de 10x (certifique-se de que a objetiva no tem possibilidade de encostar no material). Se a meiose j tiver sido concluda, os gros de plen aparecero soltos e em grande nmero na lmina. Isso pode ser visto ao microscpio com a objetiva de menor aumento, ainda antes de cobrir o material com a lamnula. Nesse caso, limpe a lmina e tente a antera de outro boto mais jovem. Anteras em
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estgios pr-meiticos no liberam imediatamente o seu contedo e podem tambm ser facilmente reconhecidas. Anteras em meiose so prontamente reconhecidas pelo grande nmero de meicitos, que so clulas maiores que as demais (em algumas espcies as clulas do tapete podem ser ainda maiores), arredondadas e envoltas por uma capa refringente, formada pela parede de calose (ausente nas clulas do tapete). Em caso de dvida, ou caso haja meicitos em estgio apropriado, retire os restos de parede da antera deixando apenas os meicitos, cubra com uma lamnula e analise ao microscpio. Ao final, esmague cuidadosamente a preparao com a ajuda de folhas de papel de filtro e analise novamente. Ateno: Dentro de uma antera, o desenvolvimento meitico geralmente sincrnico, mesmo em espcies com anteras grandes. As anteras de um mesmo boto tm tambm desenvolvimento mais ou menos sincrnico, podendo conter fases distintas da meiose. Entretanto, se ocorrer plen, ou estgios pr-meiticos, ser impossvel encontrar clulas em meiose no mesmo boto, exceto em botes com grande nmero de estames (cactceas, p. ex.) e em espcies com flores heterodnamas (flores com dois ou mais conjuntos de estames de tamanhos diferentes, ex. Crotalaria). A localizao da antera no estgio correto pode exigir muitas tentativas e por isso necessrio organizar essa etapa de forma a permitir analisar um grande nmero de botes num mnimo de tempo. Com prtica em uma determinada espcie, no entanto, possvel reconhecer o boto adequado pelo seu tamanho ou pelo aspecto geral das anteras. A Figura 4a mostra uma meiose sincrnica, em uma espcie de orqudea. A Figura 4b mostra meicitos de uma nica antera de Psittacanthus sp (lorantcea), com diferentes fases do ciclo meitico. Observe que as clulas aparecem sempre envoltas na capa de calose. Essas clulas foram apenas hidrolisadas com HCl 5N, mas no foram coradas nem esmagadas, deixando os cromossomos mais contrastados e a parede de calose inteira. Observe a presena de uma ponte anafsica em uma clula em final de anfase II. 3.2 - Tcnicas de colorao seguida de esmagamento 3.2.1 - Colorao com carmim actico a 2% a) Coleta e fixao de botes. Como descrito nos itens 3.1.a e b. b) Seleo de botes, colorao e preparao das lminas. A seleo dos botes deve ser feita como no item 3.1.c. Quando transferir uma antera para outra lmina, coloque uma gota de carmim a 2%, ao invs do cido actico a 45%. O restante do procedimento igual, apenas a anlise ao microscpio no precisa ser feita com o condensador abaixado, uma vez que o material j deve estar corado.
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Figura 04 Observao da meiose. a, Clulas de Oncidium varicosum (n=56), todas em metfase I, exceto uma nica clula (AI) que iniciou a anfase I. Colorao com hematoxilina. b, Meicitos de Psittacanthus sp sem corante, apenas hidrolisados com HCl 5N e observados ao microscpio com o condensador abaixado. c, Metfase I de uma pteridfita, Acrostichum aureum (n=30), corada com carmim. Fotos: a, Leonardo Felix; b, original; c, Adriana Marcon.
Ateno: Alguns autores recomendam o uso de agulhas de ferro nessa etapa da tcnica, ao invs de agulhas inoxidveis. Nesse caso, enquanto os meicitos estiverem no corante, a agulha de ferro ajuda a oxidar mais o corante e intensificar a colorao dos cromossomos. Bons resultados
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podem tambm ser obtidos aquecendo-se inicialmente os botes fixados em um tubo de ensaio com o carmim, como na tcnica descrita anteriormente para colorao de mitose de raiz com orcena. Se o citoplasma estiver muito corado, aquea levemente a lmina numa chama at clarear o citoplasma. Esse aquecimento ajudar tambm na dilatao da clula e no espalhamento dos cromossomos. c) Conservao da lmina. A lmina corada com carmim deve ser lutada e analisada dentro de um ou poucos dias. Caso queira torn-la permanente, siga o roteiro descrito no item 2.3.3. A Figura 4c mostra uma metfase I de uma pteridfita (Acrostichum aureum), fotografada em uma lmina recm-preparada. Observe que o citoplasma claramente observado, o que no ocorre na Figura 4a. 3.2.2 - Colorao com hematoxilina actica a 1% a) Coleta e fixao de botes. Como descrito nos itens 3.1.a e b. b) Lavagem. Lave os botes mergulhando-os duas vezes em gua destilada (5 minutos cada). c) Hidrlise. Retire os botes da gua, enxugue-os rapidamente em papel-filtro e mergulhe-os em HCl 5N temperatura ambiente por apenas 5 a 10 minutos. d) Lavagem. Lave novamente os botes em gua destilada (duas vezes, 5 minutos cada), com cuidado para no perder o material (se a hidrlise for excessiva, o material pode ficar demasiadamente macio e frgil). e) Colorao. Transfira o material para um pequeno recipiente (placas de Petri bem pequenas, ou mesmo um vidro de relgio), acrescente uma ou mais gotas de hematoxilina actica a 1%, de forma que todos os botes fiquem imersos, e cubra para no evaporar. Mantenha o material no corante por 30 minutos temperatura ambiente. f) Preparao da lmina. Transfira um dos botes para uma lmina, acrescente uma gota do corante e destaque uma das anteras. Transfira essa antera para outra lmina com uma gota de corante, corte-a transversalmente e procure liberar o contedo da antera. Retire os restos de parede de antera, cubra com uma lamnula e observe ao microscpio. Se houver meicitos, esmague cuidadosamente a preparao. Maiores detalhes so descritos no item 3.1.c. g) Conservao da lmina. Se a lmina estiver boa, ela poder ser lutada com esmalte de unha, para anlise dentro de um ou dois dias, ou tornada permanente. Nesse ltimo caso, siga exatamente o procedimento descrito no item 2.3.3.
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A Figura 5a mostra uma clula de Nothoscordum cf pulchellum em final de diplteno, corada com essa tcnica. Nesse caso, o tempo de hidrlise foi encurtado para permitir a visualizao do nuclolo (associado a uma constrio secundria terminal).
Figura 05 Observao da meiose. a, Final de diplteno de Nothoscordum pulchellum (n=5) corado com hematoxilina. b, Metfase I de Vigna unguiculata (n=11) corada com Giemsa. c, Metfase I de Rhoeo spathacea (n=6), corada com Giemsa, mostrando uma cadeia de 7 e outra de 5 cromossomos. d, Metfase I e ncleos interfsicos de uma alga vermelha, Laurencia sp. (n=29), corados com hematoxilina actica a 4%. Cabeas de setas em a e d apontam nuclolo; seta em d indica a regio de conexo com a clula vizinha. Fotos: a, Guerra, 1999; b, Reginaldo de Carvalho; c, original; d, Fujii e Guerra, 1998.
3.3 - Tcnica de esmagamento seguido de colorao 3.3.1 - Colorao com Giemsa a) Coleta, fixao, lavagem, hidrlise, seleo do boto e
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preparao da lmina. Como descrito na tcnica anterior (veja tambm os itens 3.1.a, b e c). A nica diferena que na colorao com Giemsa no h necessidade de uma lavagem aps a hidrlise, como indicado na tcnica anterior. Nesse caso, aps a hidrlise transfira os botes para um recipiente com gua destilada e inicie o procedimento de seleo do boto adequado.
b) Colorao com Giemsa. Aps a preparao da lmina, a lamnula deve ser retirada em nitrognio lquido e secada ao ar. A colorao com Giemsa a 2% pode ser feita mergulhando a lmina na soluo corante, como descrita na tcnica 2.2.1.h para clulas de raiz. O tempo de colorao depende do material analisado, variando em geral de 5 a 20 minutos. Aps a colorao, deixe a lmina secar completamente e monte em Entellan ou similar. Ateno: Se a colorao com Giemsa resultar excessiva, descore um pouco a lmina mergulhando-a em gua acidificada (veja item 2.2.2). Devido principalmente a problemas na fixao, o citoplasma dos meicitos pode corar com o Giemsa. Se a colorao do citoplasma no for muito intensa, a descolorao indicada acima suficiente para resolver o problema. Entretanto, se o citoplasma corar fortemente (geralmente em fixaes feitas em campo) prefervel descorar a lmina e corar novamente com hematoxilina ou carmim, que reagem menos com o citoplasma. A retirada da lamnula no nitrognio lquido, devido ao congelamento excessivo, freqentemente racha os meicitos estragando a preparao. Por essa razo, recomendado ao invs de mergulhar a lmina diretamente no nitrognio lquido, mant-la suspensa na cmara fria acima da superfcie do nitrognio, ou usar gelo seco, que menos frio. As Figuras 5b e c mostram metfases I com cromossomos pequenos (b) e grandes (c) corados com Giemsa. Os cromossomos da comelincea Rhoeo spathacea (5c) apresentam um complexo de translocao, formando geralmente um anel de 12 cromossomos. Nessa clula, no entanto, dois quiasmas no se formaram, resultando em uma cadeia de sete cromossomos e uma menor com cinco. 3.3.2 - Colorao com hematoxilina actica a 1% a) Coleta, fixao, lavagem, hidrlise e preparao da lmina como descrito na tcnica anterior. b) Colorao com hematoxilina. Aps retirar a lamnula no nitrognio lquido e deixar a lmina secar, coloque uma gota de hematoxilina actica a 1% em cima das clulas na lmina, cubra com uma lamnula e analise ao microscpio. Para tornar a lmina permanente, retire a lamnula com um jato de gua, seque a lmina e monte em Entellan ou similar.
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Ateno: Se houver interesse em observar o nuclolo, a etapa da hidrlise deve ser excluda ou realizada em HCl 1N por cerca de 3 a 5 minutos. Nesse caso, entretanto, o citoplasma poder ficar um pouco mais corado. A colorao com hematoxilina pode facilmente ser descorada e recorada com Giemsa ou vice-versa (item 2.2.3). Para anlise da mitose ps-meitica, prefervel analisar os micrsporos antes de tornar a lmina permanente. Nessa tcnica possvel corar com carmim actico ao invs de hematoxilina, principalmente se os cromossomos no forem pequenos. A colorao com carmim, no entanto, menos intensa. A Figura 4a, mostra clulas de Oncidium varicosum, em meiose I, coradas com hematoxilina a 1%. Na Figura 5d, observa-se uma metfase I de uma alga vermelha, do gnero Laurencia, na qual o nuclolo persiste durante todo o ciclo meitico. Para revelar o nuclolo e evidenciar melhor os pequenos cromossomos, a clula foi corada com hematoxilina a 4%. O disco escuro, bem corado, abaixo dos cromossomos, corresponde a uma estrutura da parede celular dessas algas que liga clulas vizinhas. 3.4 - Anlise de clulas do tapete e da mitose polnica Quando se analisa a meiose na antera, possvel observar dois outros tipos de clulas da antera em diviso: as clulas do tapete e a mitose polnica. O tapete formado por uma camada de clulas grandes, com paredes celulares geralmente finas, que envolve a massa de meicitos. Em alguns casos, como na maioria das arceas, a parede das clulas do tapete desaparece, formando uma nica grande massa de citoplasma e ncleos. As clulas do tapete so geralmente binucleadas (raramente mononucleadas ou multinucleadas) , ficando os ncleos bem prximos um do outro, ou mesmo parcialmente fusionados (Figura 6a). No estgio de zigteno a paquteno, freqente se observar essas clulas em prfase ou prometfase. Nesse estgio, cada ncleo do tapete diplide, mas posteriormente todos se tornam poliplides (Figura 6b ) devido ocorrncia de ciclos endomitticos. Em alguns grupos de plantas, como em vrias espcies do gnero Vigna , ao invs de formarem ncleos poliplides, esses ciclos resultam na formao de ncleos politnicos (Figura 6c). O tapete tem a funo de nutrir o meicito e ajudar na formao do gro de plen, degenerando logo aps a formao desse. Essas clulas so facilmente visveis com qualquer tcnica de colorao cromossmica. Logo aps a dissoluo da ttrade e a formao da exina, o gro de plen apresenta uma primeira diviso mittica (Figuras 7a, e b), originando o ncleo reprodutivo e o generativo (na realidade, duas clulas distintas). A observao dessa primeira mitose ps-meitica pode ser feita mais facilmente com as tcnicas de colorao com carmim ou hematoxilina, descritas nos itens 3.2.1 e 3.2.2, uma vez que esses corantes no reagem com a exina, como ocorre com o Giemsa. As tcnicas de esmagamento seguido
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c
Figura 06 Clulas do tapete. a, Uma clula binucleada e duas outras trinucleadas ao lado de clulas zigotnicas em Psittacanthus sp, sem colorao b, Clula octoplide do tapete de Passiflora racemosa, que normalmente apresenta 2n=18, corada com DAPI. Acima observa-se alguns ncleos diplides. c, Clula politnica ao lado de um ncleo diplide em Vigna unguiculata (2n=22), corados com Giemsa. Cabeas de seta apontam a constrio primria distendida em alguns cromossomos. Fotos: a, b, originais; c, Gianna Carvalheira.
de colorao no so aconselhadas, nesse caso, porque freqentemente se perdem muitos gros de plen durante ou aps a retirada da lamnula. Igualmente, quando as lminas coradas com carmim ou hematoxilina so tornadas permanentes, os gros de plen podem ser perdidos, sofrer distores e ter a colorao do citoplasma intensificada.
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c
Figura 07 Primeira mitose polnica, corada com hematoxilina (a, b) ou com Giemsa (c). a, b, Metfase (a) e anfase (b) em Nothoscordum pulchellum (n=5), com dois cromossomos acrocntricos e trs metacntricos. Observe o contorno da exina e o crculo formado pelos centrmeros nos dois polos da anfase. c, Metfases em Rhynchospora tenuis (n=2) mostrando a exina ligeiramente corada. Fotos: a, Guerra, 1999; b, original; c, Andr Vanzela.
Alguns grupos de plantas apresentam um comportamento diferenciado dos demais no final da microsporognese (aps o estgio de ttrade) ou no incio da microgametognese (primeira diviso do plen), dificultando a interpretao dos resultados para um citologista no familiarizado com essas variantes. Algumas leguminosas mimosodes, por exemplo, ao invs de produzirem gros de plen isolados, produzem polades (agregados de quatro, oito ou mais micrsporos), enquanto muitas orqudeas produzem mssulas (agrupamentos irregulares com nmeros variados de micrsporos). Nas ciperceas, as quatro clulas resultantes da meiose permanecem reunidas, formando um nico gro de plen. Todas as quatro clulas iniciam a primeira diviso mittica. Entretanto, trs delas, deslocadas para uma posio perifrica, alcanam no mximo a fase de metfase, degenerando em seguida. A Figura 7c ilustra essa particularidade das ciperceas em Rhynchospora tenuis (n=2). Nessa figura, aquilo que parece ser uma s clula, na realidade, so quatro micrsporos unidos, cada um com apenas dois cromossomos. Trs conjuntos desses so visivelmente menores (provavelmente porque no passaram por uma fase S antes dessa mitose) e apenas a clula maior e central continua o seu desenvolvimento, formando o microgametfito.
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4 - Como corar diferencialmente algumas regies cromossmicas

Muitos cromossomos possuem um ou mais segmentos, com constituio ou organizao molecular diferente, os quais podem ser corados de forma diferencial. Esses segmentos diferenciais podem estar restritos a uma determinada regio do cromossomo, formando as chamadas bandas, ou podem envolver todo o cromossomo. A presena de bandas permite caracterizar melhor alguns cromossomos, identificar homlogos e auxiliar na anlise da evoluo cromossmica comparada. A preparao de lminas para todas as tcnicas de colorao diferencial, inclusive a hibridizao in situ, segue o mesmo protocolo inicial de digesto enzimtica. Os procedimentos anteriores preparao das lminas, como por exemplo, o tipo de antimittico utilizado ou o tempo de prtratamento, so iguais aos das tcnicas convencionais. As tcnicas para colorao diferencial, especialmente para o bandeamento C, podem ser realizadas de maneiras muito diferentes. Os procedimentos apresentados aqui so os mais freqentemente referidos na literatura e funcionam bem em uma grande diversidade de organismos. O roteiro para bandeamento C est baseado na tcnica proposta por Schwarzacher et al. (1980), a colorao com CMA e DAPI est baseada na tcnica de Schweizer (1976), descrita com mais detalhes por Deumling e Greilhuber (1982), e a colorao com nitrato de prata est baseada em Stack et al. (1991). Uma caracterstica comum a todas essas tcnicas que a obteno de bons resultados no ocorre todas as vezes. No caso do bandeamento C, freqente que em algumas tentativas apenas os satlites corem diferencialmente, enquanto as demais bandas corem fracamente ou no corem. Portanto, muito importante repetir o procedimento algumas vezes para se certificar de que os resultados estejam corretos. 4.1 - Preparao de lminas com digesto enzimtica a) Pr-tratamento e fixao como descrito nas tcnicas anteriores b) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua destilada ou tampo citrato (5 minutos cada). c) Digesto enzimtica. Enxugue ligeiramente as razes em papel filtro, coloque-as em uma lmina e acrescente uma gota da soluo enzimtica, contendo 2% de celulase e 20% de pectinase. Mantenha a lmina em cmara mida a 37 C at as razes ficarem macias. Aps a primeira 1/2 hora, verifique a cada 1/2 hora quando as razes esto suficientemente macias. Esse tempo varia muito entre espcies. Por exemplo, cebola e feijo so digeridos mais rapidamente (60-90 minutos), enquanto gramneas podem necessitar de 2 a 3 horas. Se a atividade das enzimas estiver muito forte, aps o tempo ideal de digesto as razes devem ser transferidas para um recipiente com gua destilada para evitar que se dissolvam.
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Ateno: A concentrao das enzimas pode ser modificada dependendo da atividade que apresentem (a celulase menos crtica e geralmente mantida em 2%, enquanto a pectinase pode variar entre 4 e 20%). O importante que as razes fiquem bastante macias, sem que se dissolvam ao toque. Em algumas espcies, aps a digesto, a regio terminal da ponta da raiz se desprende facilmente. Nesse caso, prefervel fazer a digesto na prpria lmina onde ser realizado o esmagamento. No caso da preparao de lminas para meiose, a digesto enzimtica deve ser feita num tempo muito mais curto (em torno de 20 minutos). As demais etapas seguem essencialmente iguais. d) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Enxugue cuidadosamente a raiz com papel filtro e acrescente uma gota de cido actico a 45%. Com o auxlio de um estereomicroscpio, retire a coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas o meristema. Utilizando estiletes bem finos ou agulhas de seringas, fragmente o tecido em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente com uma agulha de ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos de meristema, at que cada um deles se transforme numa pequena mancha de tecido espalhado. Verifique ao microscpio com o condensador abaixado, se as clulas esto bem espalhadas. Nesse caso, esmague as clulas colocando o conjunto lmina-lamnula em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina. e) Retirada da lamnula. Congele a lmina-lamnula no gelo-seco ou no nitrognio lquido por alguns minutos e, com o auxlio de uma gilete ou um bisturi, retire rapidamente a lamnula. Deixe a lmina secar ao ar. f) Estocagem das lminas. Em algumas tcnicas, a lmina recmpreparada pode ser utilizada imediatamente. Em outras, como no bandeamento C, a lmina precisa ser envelhecida (isto , guardada temperatura ambiente por um ou mais dias). O efeito ao nvel molecular do envelhecimento no conhecido, mas sabe-se que tem um papel fundamental no funcionamento dessas tcnicas. Em qualquer caso, as lminas recm-preparadas e secas devem ser mantidas em caixa protegida de poeira, de preferncia em jarros de Coplin tampados. Ateno: Essas lminas podem ser conservadas por vrios meses, como se fossem frescas, se forem mantidas secas no freezer, em recipiente vedado. 4.2 - Bandeamento C - Observao da heterocromatina constitutiva a) Preparao e envelhecimento de lminas. Prepare as lminas com digesto enzimtica e guarde-as por 2 dias temperatura ambiente. O
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tempo de envelhecimento pode ser posteriormente ajustado para 1 a 3 dias ou mais, dependendo do material. b) Hidrlise. Mergulhe as lminas em cido actico a 45% em banho-maria pr-aquecido a 60 C durante 10 minutos. Aps esse perodo, verta o cido actico a 45% em um outro recipiente essa mesma soluo ser reutilizada mais adiante temperatura ambiente. Ateno: Os recipientes contendo o cido actico 45% e o 2xSSC (item f) devem ser colocados no banho-maria, para pr-aquecimento, ao menos 20 minutos antes de utilizar essas solues. A temperatura deve ser controlada diretamente na soluo e o nvel desta deve ser igual ou inferior ao da gua do banho-maria. O jarro de Coplin no suporta grande variao de temperatura entre seus lados interno e externo. Por isso, antes de colocar uma soluo no jarro em banho-maria, deve-se primeiro aquecer a soluo em um bquer ou Erlenmeyer do tipo pyrex, depois transferir a soluo para o jarro e mergulh-lo imediatamente no banho-maria. c) Lavagem. Lave as lminas em gua de torneira corrente por cerca de 1 minuto e em seguida seque-as com uma bomba de ar. d) Desnaturao. Mergulhe as lminas cuidadosamente em um jarro de Coplin contendo uma soluo saturada de hidrxido de brio temperatura ambiente, durante 10 minutos. Alternativamente, pode ser tentada a mesma soluo a 50-60 C pelo mesmo tempo. e) Lavagem. Acrescente gua de torneira na cubeta cuidadosamente, at que os cristais sobrenadantes transbordem junto com a gua. Em seguida, retire a gua do jarro e adicione a soluo de actico a 45% utilizada no item b. Imediatamente depois, devolva o cido actico para o recipiente onde estava. Essa rpida lavagem em cido actico visa apenas eliminar o hidrxido de brio das lminas. Lave as lminas em gua corrente no jarro de Coplin por 2 minutos. Enxge com gua destilada. Ateno: No descarte o cido actico a 45% na pia. Estoque em depsito apropriado para cidos usados (veja captulo 7). f) Renaturao e extrao diferencial de DNA. Seque as lminas, transfira-as para um jarro de Coplin e acrescente uma soluo de 2xSSC pr-aquecida a 60 C. Imediatamente em seguida, coloque o jarro em banho-maria durante 80 minutos. Ateno: Nessa etapa, prefervel no trabalhar com o jarro cheio de lminas e sim com a metade da capacidade de lminas do jarro.
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O tempo de renaturao pode ser ajustado para cada espcie. Se ao final do procedimento, toda a preparao ficar descorada demais, pode ser devido extrao excessiva de DNA no 2xSSC. g) Lavagem, colorao e montagem. Lave as lminas rapidamente em gua destilada, seque com uma bomba de ar e core com Giemsa a 2% por 15-30 minutos. Controle a colorao geral das clulas (item 2.2.1.e) e monte a lmina em Entellan ou similar. Observe que no bandeamento C a eucromatina (a maior parte da cromatina total) deve ficar fracamente corada (Figuras 8a e b) e, portanto, a lmina deve parecer menos corada que na tcnica convencional. Os ncleos interfsicos geralmente evidenciam melhor o bandeamento e podem servir como um indicador confivel da colorao. Em caso de dvida, coloque uma gota de gua destilada e monte com uma lamnula para checar melhor a colorao. Em seguida, retire a lamnula com um jato de gua destilada, seque a lmina novamente e monte em Entellan, ou devolva a lmina para o Giemsa. Ateno: Aps o procedimento para bandeamento C, a colorao geralmente utilizada a de Giemsa, mas outras coloraes, como o Hoechst e o DAPI, podem tambm ser utilizadas. As Figuras 8c e d mostram uma metfase de centeio, tratada com a tcnica de bandeamento C, corada com Hoechst (8c), descorada e corada com Giemsa (8d). Nesse tipo de colorao, em geral, as bandas coradas com o Hoechst so idnticas s coradas com Giemsa. 4.3 - Dupla-colorao com os fluorocromos CMA e DAPI a) Preparao da lmina. Prepare as lminas com digesto enzimtica (item 4.1) e guarde-as em uma cubeta, protegidas da poeira, por 3 dias temperatura ambiente. b) Colorao com CMA . Coloque uma gota de CMA (0,5 mg/ml) em cima das clulas e cubra com uma lamnula. Guarde a lmina em cmara mida, escura, por 1 hora. Retire a lamnula e o excesso de corante com um jato de gua destilada e seque a lmina rapidamente com uma bomba de ar. c) Colorao com DAPI. Coloque uma gota de DAPI (2 g/ml) em cima das clulas e cubra com uma lamnula. Guarde em caixa escura por 30 minutos. Retire a lamnula e o excesso de corante com um jato de gua destilada e seque rapidamente a lmina. d) Montagem da lmina. Coloque uma gota de meio de montagem glicerol/McIlvaine (contendo MgCl2), cubra com uma lamnula e comprima ligeiramente entre duas folhas de papel de filtro para tirar o excesso de meio. Guarde em caixa escura por pelo menos trs dias antes de analisar ao microscpio.
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Figura 08 Bandeamento C. a, Metfase e ncleos interfsicos de cebola. b, Metfase e ncleos interfsicos de Emilia fosbergii (2n=20). c, d, Metfase incompleta de centeio, bandeada e corada com Hoechst (c), descorada e corada com Giemsa (d). Observe a presena de dois cromosssomos B (setas) com blocos de heterocromatina terminais. Clulas em a e b, coradas com Giemsa. Fotos: a, Maria Jos Gomes de Andrade; b, Guerra e Nogueira, 1990; c, d, Ana Christina Brasileiro.
e) Anlise ao microscpio. Para observar a colorao DAPI use filtro de 340 a 380 nm. Para o CMA use filtro de 390 a 490 nm ou outro comprimento dentro dessa faixa.
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f) Fotografia. Ao contrrio da fotografia de microscopia de campo claro (colorao com carmim, Giemsa, etc), a fotografia com luz ultravioleta geralmente feita com o sistema manual de fotomicroscopia. Para isso, precisar fazer inicialmente alguns testes com diferentes tempos de exposio para as coloraes CMA e DAPI (em geral o tempo ideal para CMA muito maior que para DAPI). Tambm possvel fotografar as clulas coradas com DAPI ou outro fluorocromo estvel com exposio automtica, necessitando para isso um ajuste adequado do sistema fotogrfico. No caso de fluorocromos mais instveis, utilize filme de ASA alta (ASA 400 ou mais). As Figuras 9a e b mostram uma mesma metfase de Eleutherine bulbosa fotografada com o filtro para CMA (a) e para DAPI (b). Observe que com essa colorao possvel observar que o maior par cromossmico sofreu uma inverso pericntrica, mudando a posio das bandas e a morfologia dos cromossomos (compare com a Figura 1b). Ateno: Aps a colorao com fluorocromos, possvel descorar a lmina e corar com outras tcnicas. As Figuras 9c e d mostram uma mesma metfase de uma gimnosperma (Podocarpus macrophyllus) corada com CMA/DAPI (apenas a foto com DAPI apresentada), descorada e corada com Giemsa a 2%. Observe uma banda terminal DAPI+ em quase todos os cromossomos e um par de cromossomos com uma banda DAPIcorrespondente regio da constrio secundria em 9d. Dependendo dos objetivos, pode ser usada ao invs da dupla-colorao CMA/DAPI apenas CMA ou apenas DAPI. Nesses casos, o procedimento o mesmo, dispensando apenas o item b ou c, respectivamente. Alguns autores preferem utilizar a chamada colorao seqencial CMA-DAPI. Nesse caso, feita primeiro a colorao DAPI, com montagem, anlise da lmina e fotografia. Em seguida, a lmina descorada e recorada com CMA, como descrito acima, e refotografada. Para descorar a lmina, retire a lamnula com um jato de gua destilada e mergulhe a lmina em um borel com fixador Carnoy 3:1 recmpreparado, por 30 minutos. Em seguida, transfira a lmina para um borel com etanol 100% por pelo menos 2 horas (de preferncia deixe de um dia para o outro na geladeira). Todos os corantes diminuem sua colorao com a exposio demasiada luz, porm os fluorocromos so particularmente sensveis. Por essa razo, durante toda a preparao da lmina, evite exposio intensa ou prolongada luz. Mantenha as solues de fluorocromos sempre em frascos escuros e envoltos em papel alumnio. Muitos fluorocromos so mutagnicos, devendo ser evitado contato com a pele. Pela mesma razo, no devem ser jogados diretamente na pia. recomendvel ter um depsito de boca larga para fazer a retirada da lamnula e do excesso de fluorocromo (itens b e c anteriores). Quando o depsito estiver com metade da sua capacidade preenchida, seu contedo deve ser eliminado em local de difcil acesso rede fluvial (veja item 6.5).
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Figura 09 Dupla colorao CMA/DAPI e colorao seqencial com hematoxilina. a, b, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12) corada simultaneamente com CMA (a) e DAPI (b). c, d, Metfase e ncleo interfsico de uma gimnosperma, Podocarpus macrophyllus (2n=38), corados com CMA/DAPI (foto, em c, mostra apenas a colorao com DAPI), descorados e corados com Giemsa (d). Setas em c apontam as constries secundrias. Fotos: a, b, Guerra, 1998b; c, d, originais.
4.4 - Tripla colorao CMA/DA/DAPI a) Preparao da lmina e colorao com CMA. Prepare e core a lmina como descrito nos itens 4.3.a e b da tcnica anterior. b) Contracolorao com Distamicina A (DA). Acrescente uma gota de distamicina A (0,1mg/ml) em cima das clulas e cubra com uma lamnula.
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Guarde em caixa escura por 30 minutos. Retire a lamnula e o excesso de corante com um jato de gua destilada e seque rapidamente a lmina com uma bomba de ar. c) Colorao com DAPI, montagem da lmina, anlise e fotografia. Como descrito nos itens 4.3.c, d, e e f da tcnica para dupla-colorao com CMA/DAPI. 4.5 - Colorao seqencial CMA-DAPI com contracorantes (CMA/DADAPI/AMD) a) Preparao da lmina, colorao com CMA e contracolorao com Distamicina A. Como descrito no itens 4.3.a e b e 4.4.b. b) Montagem, anlise e fotografia do CMA/DA. Como descrito nos itens 4.3.d, e e f. c) Retirada dos corantes CMA/DA. Retire a lamnula com um jato de gua, seque a lmina e a mantenha em Carnoy 3:1 por 12 a 24 horas na geladeira, mudando o fixador aps os primeiros 30 minutos e pelo menos mais duas vezes durante esse perodo. Em seguida, seque a lmina e a transfira para etanol (P.A.) por 1 a 2 horas temperatura ambiente ou 24 horas na geladeira. d) Colorao com DAPI. Como descrito no item 4.3.c. e) Contracolorao com Actinomicina D (AMD). Acrescente uma gota de AMD (0,2 mg/ml) na lmina e cubra com uma lamnula. Guarde em caixa escura por 30 minutos. Retire a lamnula e seque a lmina. f) Retirada dos corantes DAPI/AMD. Como descrito no item 4.3.c. g) Montagem da lmina, anlise e fotografia. Como descrito nos itens 4.3.d, e e f. Ateno: Em algumas espcies podem ser obtidos melhores resultados combinando a tcnica de bandeamento C com a de CMA/DAPI. Para isso, realize todo o procedimento para o bandeamento C seguido da colorao com os fluorocromos. Muito cuidado deve ser tomado com o fato de que, utilizando a combinao dessas duas tcnicas, as bandas brilhantes com DAPI ou CMA podem no ser especificamente ricas em AT ou GC, como as observadas na colorao direta. Em geral, todas as bandas C aparecem positivas se coradas apenas com DAPI, inclusive aquelas ricas em GC, como a heterocromatina associada RON. 4.6 Colorao com Hoechst 33258, quinacrina ou iodeto de propdeo
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a) Preparao da lmina. Para qualquer colorao com fluorocromos, trate as razes com digesto enzimtica e prepare as lminas como descrito no item 4.1. b) Colorao com Hoechst. Coloque uma gota de Hoechst (0,5 g/ ml) em cima das clulas, cubra com uma lamnula e guarde em caixa escura por 30 minutos. Em seguida, retire a lamnula com um jato de gua, seque e monte em glicerol/tampo McIlvaine (item 4.3.d). c) Colorao com quinacrina. Siga o mesmo procedimento do item anterior, utilizando uma soluo de quinacrina a 0,5% e um tempo de colorao de 10 minutos. d) Colorao com iodeto de propdeo. Siga o mesmo procedimento do item b, utilizando uma concentrao de iodeto de propdeo de 1 g/ml e um tempo de 10 minutos. Ateno: O corante Hoechst, semelhana do DAPI, pode tambm ser utilizado em combinao com o CMA ou aps o bandeamento C (Figura 8c e d). 4.7 - Colorao com nitrato de prata: observao de nuclolos e RONs a) Prepare as lminas com digesto enzimtica (item 4.1). As lminas, nesse caso, no precisam ser envelhecidas, embora tambm seja possvel trabalhar com lminas feitas alguns dias antes. b) Acrescente uma pequena gota (para isso, utilize uma pipeta Pasteur de ponta bem fina) de nitrato de prata a 50% (0,5 g de nitrato de prata em 1 ml de gua destilada) em cima da mancha de clulas na lmina e cubra com uma tela de nilon, de poros bem estreitos, cortada em tamanho e formato de uma lamnula. Tambm pode ser utilizada lamnula comum, embora a tela produza freqentemente uma colorao mais uniforme. c) Coloque a lmina em uma cmara mida (placa de Petri fechada contendo papel de filtro molhado e dois suportes para a lmina) na estufa a 60 C. d) Aps os primeiros 15 minutos, verifique periodicamente se a mancha de clulas na lmina assume uma colorao marrom ou dourada. Verifique ao microscpio, com a lente de menor aumento, a intensidade de colorao dos nuclolos. e) Quando os nuclolos apresentarem colorao escura (marrom a preto), a colorao deve ser interrompida com um jato de gua ao lado da tela de nilon, expulsando a tela e o excesso de nitrato. f) Caso seja necessrio evidenciar melhor os cromossomos, possvel contracorar com carmim (no caso de meiose), orcena, hematoxilina
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ou Giemsa. Nos dois primeiros casos, basta colocar um gota do corante e cobrir com uma lamnula. No caso da colorao com hematoxilina ou Giemsa, a lmina ficar mais limpa se for primeiramente hidrolisada com HCl 5N por 10 minutos, depois lavada em gua destilada e ento corada. Em qualquer caso, as estruturas coradas com prata no so alteradas pela segunda colorao. g) Seque a lmina com uma bomba de ar e monte-a com Entellan ou similar. Ateno: A colorao dos nuclolos facilmente observada, entretanto a obteno de RONs bem marcadas geralmente exige vrias tentativas. A soluo de nitrato de prata deve ser preparada de preferncia na quantidade mnima necessria para o uso imediato. 4.8 - Descolorao de lminas coradas com prata a) Descolorao. Coloque 1-2 gotas de hexacianoferrato de potssio (K3[Fe(NC)6]) a 1%, recm-preparado e resfriado a aproximadamente 0 C, em cima da mancha de clulas na lmina e cubra com uma lamnula. Deixe descorando por 15 a 60 segundos. b) Limpeza da lmina. Retire a lamnula e a soluo descorante com um jato de gua destilada. Mergulhe a lmina em tiossulfato de sdio penta-hidratado a 20% por cerca de 15 segundos. Lave em gua destilada e deixe secar ao ar. Ateno: Esta tcnica utilizada para colorao seqencial prata-banda C, prata-convencional, etc. Em qualquer caso, prefervel fazer primeiro a colorao com nitrato de prata, para evitar precipitao excessiva da prata. A Figura 10a mostra uma metfase de Eleutherine bulbosa com as constries secundrias e a heterocromatina adjacente marcadas com nitrato de prata. O caritipo apresenta uma constrio secundria maior no cromossomo metacntrico e uma outra menor no cromossomo acrocntrico (compare com o da Figura 1b). A Figura 10b mostra ncleos interfsicos de Emilia sonchifolia (serralheira) com um nico nuclolo bem corado e uma prfase com as constries secundrias associadas ao nuclolo. Observe os satlites, bem corados, ao lado do nuclolo.
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Figura 10 Colorao com nitrato de prata. a, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). b, Ncleos interfsicos e prfase de Emilia fosbergii mostrando o nuclolo e os cromossomos associados ao nuclolo. Setas em a apontam RONs. Fotos: a, Guerra, 1991; b, Guerra e Nogueira, 1990.
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5 - Como preparar as solues mais utilizadas em citogentica vegetal

Ao preparar as solues abaixo, certifique-se de que toda a vidraria a ser utilizada esteja rigorosamente limpa. Todos os depsitos de solues devem estar etiquetados, com as anotaes feitas a grafite ou com tinta insolvel em gua, nunca com caneta esferogrfica comum. A etiqueta deve indicar claramente o nome do produto, a concentrao e a data de preparao. Para cada soluo foi sugerido um volume que consideramos mais prtico, os quais devem ser ajustados s necessidade de cada laboratrio. Como regra, prepare apenas os volumes mnimos necessrios, para evitar que as solues percam ou diminuam suas atividades antes de serem utilizadas. Os fluorocromos, em geral, so substncias caras e vendidas geralmente em p e em pequenas quantidades. Quando a quantidade muito pequena, como no caso da cromomicina A, aconselhvel primeiramente injetar um pouco de solvente (uma mistura de tampo com gua) no frasco, dissolver completamente o fluorocromo, retirar a soluo e completar com o solvente para o volume indicado. Todas as solues de fluorocromos devem ser divididas em alquotas, para evitar o aquecimento desnecessrio de todo o estoque a cada vez que vai ser usado. As alquotas podem ser acondicionadas em tubos de Eppendorf de 1 a 2 ml, todos etiquetados e numerados, de forma a permitir o uso de apenas uma alquota de cada vez. 5.1 - Fixador Carnoy 3:1 - 20 ml a) Misture 15 ml de etanol com 5 ml de cido actico glacial. b) Agite bastante a soluo antes e depois de acrescentar o material a ser fixado. Ateno: A soluo deve ser preparada imediatamente antes de ser usada. O volume de fixador deve ser aproximadamente 10 vezes o volume do material a ser fixado. 5.2 - Colchicina a 0,1% ou 0,5% - 50 ml a) Dissolva 0,05 g ou 0,025 g de colchicina em 50 ml de gua destilada. b) A soluo deve ser dividida em alquotas e mantidas no congelador. Apenas uma delas deve ser mantida na geladeira (por at 6 meses), se estiver em uso frequente. 5.3 - 8-Hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M - 300 ml
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a) Dissolva 0,087 g de 8HQ em 300 ml de gua destilada temperatura ambiente. Para isso, utilize um agitador magntico em uma capela (exala gases txicos). b) Guarde a soluo em frasco bem fechado na geladeira. Ateno: prefervel no estocar a soluo por mais de 6 meses na geladeira. Evite expor a soluo luz. Se com o tempo a colorao da soluo esmaecer pode indicar perda da atividade. 5.4 - HCl 1N e 5N - 300 ml a) HCl 1N: Coloque primeiramente 275,16 ml de gua destilada em uma proveta e acrescente 24,84 ml de HCl. b) HCl 5N: Coloque primeiramente 175,8 ml de gua destilada em uma proveta e acrescente 124,2 ml de HCl. c) Guarde em recipiente bem fechado. 5.5 - Carmim actico a 2% - 100 ml a) Dissolva 2 g de carmim em uma soluo contendo 55 ml de gua destilada e 45 ml de cido actico glacial. b) Deixe fervendo em um condensador de refluxo por 2 a 3 horas. c) Deixe esfriar, filtre e guarde a soluo em recipiente fechado. 5.6 - Hematoxilina actica a 1% - 100 ml a) Dissolva com um basto de vidro 1 g de hematoxilina e 0,25 g de almem frrico em 100 ml de cido actico a 45%. b) Coloque a mistura em um vidro escuro tampado com uma chumao de algodo, em ambiente aberto para evitar os gases. Aps uma semana, filtre a soluo e conserve em vidro escuro fechado. 5.7 - Orcena actica a 2% - 100 ml a) Dissolva 2 g de carmim em uma soluo contendo 55 ml de gua destilada e 45 ml de cido actico glacial. b) Deixe fervendo (de preferncia em um condensador de refluxo) por 2 a 3 horas. c) Deixe esfriar, filtre e guarde a soluo em recipiente fechado.
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5.8 - Soluo corante de Giemsa (soluo estoque) - 66 ml a) Dissolva 0,5 g do corante de Giemsa em p em 33 ml de glicerina a 60 C em banho-maria por 2 horas. b) Depois que a soluo esfriar, adicione 33 ml de lcool metlico, guarde em vidro escuro bem fechado por uma semana e, em seguida, filtre e mantenha em vidro escuro. 5.9 - Giemsa a 2% (soluo de uso) - 100 ml - Misture 2 ml da soluo estoque de Giemsa (ou da soluo comprada pronta) e 98 ml de tampo fosfato pH 6,8. Para uso rotineiro, a diluio pode ser feita em gua destilada. 5.10 - Reativo de Schiff - 400 ml Na literatura h diversas maneiras diferentes de preparar o reativo de Schiff, utilizando os mesmos componentes. Aqui so apresentados dois protocolos diferentes. Dependendo da qualidade dos produtos utilizados, um dos dois pode apresentar colorao cromossmica mais intensa. Protocolo 1 (baseado em Greilhuber e Ebert, 1994) a) Dissolva 2 g de fucsina bsica em 60 ml de HCl 1N. b) Dissolva 7,6 g de metabissulfito de sdio (Na2S2O5) em 340 ml de gua destilada. c) Misture as duas solues em um Erlenmeyer, com agitador magntico por no mnimo 3 1/2 horas. d) Adicione aproximadamente 1 g de carvo vegetal soluo. Agite bastante e filtre com a ajuda de uma bomba de vcuo. e) Repita a etapa anterior duas vezes ou mais, sempre adicionando mais carvo, at o filtrado ficar perfeitamente incolor e cristalino. f) Verifique o pH, que deve estar entre 1,9 e 2,2. Ajuste com HCl ou NaOH. g) Guarde na geladeira em frasco escuro ou coberto com papel alumnio. Protocolo 2 (baseado em Garcia, 1990) a) Coloque 400 ml de gua destilada em um Erlenmeyer e aquea ao ponto de ebulio.
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b) Acrescente 0,8 g de fucsina bsica e 0,8 ml de cido clordrico concentrado. Tampe o Erlenmeyer com uma placa de vidro e coloque a soluo no agitador magntico durante 20 minutos. c) Acrescente 16 g de metabissulfito de sdio soluo e agite por mais 30 minutos. d) Acrescente 3,2 g de carvo ativado e agite por mais 45 minutos. e) Deixe o carvo decantar por 1 a 2 horas e filtre. f) Verifique se o pH est entre 1,9 e 2,2. Ajuste com HCl ou NaOH. g) Guarde na geladeira em frasco escuro ou coberto com papel alumnio. Ateno: O metabissulfito de sdio pode ser substitudo por 8,9 g de metabissulfito de potssio (K2S2O5) para o mesmo volume de soluo. O metabissulfito de sdio ou potssio voltil e muito txico. Por essa razo, o preparo do reativo de Schiff deve ser inteiramente realizado em capela. Se a soluo apresentar colorao rsea ou outra qualquer, deve ser eliminada. Para usar o corante, retire-o do frasco de preferncia por meio de uma pipeta bem limpa e seca, ao invs de verter o frasco. 5.11 - gua sulfurada - 300 ml - Dilua 18 ml de uma soluo 1% de metabissulfito de sdio (1 g de Na2S2O5 dissolvido em 100 ml de gua destilada) em 300 ml de gua destilada e acrescente 15 ml de HCl 1N. 5.12 - Tampo fosfato pH 6,8 (tampo de Sorensen) - 2 litros de solues estoque a) Solues estoque: - Soluo A. Dissolva 9,079 g de fosfato de potssio (KH2PO4) em cerca de 500 ml de gua destilada e complete posteriormente para um litro. Guarde na geladeira. - Soluo B. Dissolva 11,876 g de fosfato de sdio bi-hidratado Na2HPO4.2H2O em cerca de 500 ml de gua destilada e complete posteriormente para um litro. Guarde na geladeira. b) Soluo de uso (100 ml): - Misture 50,9 ml da soluo A com 49,1 ml da soluo B. Ateno: Os tampes em geral, principalmente as solues de uso, no po-
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dem ser estocadas por muitos meses, porque facilmente fungam. Verifique sempre se aparecem pequenos flocos brancos na soluo (nesse caso, deve ser substituda por uma nova soluo). A soluo de uso de todos os tampes deve ter o pH indicado no protocolo. Contudo, importante checar o pH dessas solues e, se necessrio, ajustar com HCl ou NaOH. 5.13 - Tampo McIlvaine pH 7,0 - 2 litros de solues estoque a) Solues estoque: - Soluo A: Dissolva 21,14 g de cido ctrico mono-hidratado (C6H8O7.H2O) em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete para um litro (0,1M). - Soluo B: Dissolva 28,39 g de fosfato de sdio (Na2HPO4) ou 71,63 g de Na2HPO4.12H2O em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete para um litro (0,2M). b) Soluo de uso (100 ml): - Misture 17,6 ml de A com 82,4 ml de B. 5.14 - Tampo McIlvaine pH 5,5 - 20 ml a) Esse tampo utilizado no preparo do Hoechst e constitudo das mesmas solues do tampo McIlvaine pH 7,0, mudando apenas as propores. b) Misture 9 ml de cido ctrico 0,1M (soluo A do item anterior) com 11 ml de fosfato de sdio 0,2M (soluo B). 5.15 - Tampo citrato-fosfato pH 4,8 - l litro - Dissolva 10,5 g de cido ctrico monohidratado (C6H8O7. H2O) e 32,25 g de fosfato de sdio dibsico doze vezes hidratado [Na2HPO4. 12(H2O)] em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete para um litro. O ltimo composto pode ser substitudo por 12,76 g de fosfato de sdio dibsico anidro (Na2HPO4). 5.16 - 20xSSC - 1 litro a) Dissolva em um bquer, no agitador magntico, 175,6 g de cloreto de sdio (NaCl) e mais 88,2 g de citrato de sdio bihidratado (C6H5Na3O7 .2H2O) em cerca de meio litro de gua destilada. b) Complete com gua destilada at um litro e agite at a completa dissoluo. c) Guarde na geladeira. Verifique sempre se no surgem fungos na soluo.
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5.17 - 2xSSC - 100 ml a) Dilua 10 ml de 20xSSC em 90 ml de gua destilada. b) Agite antes de utilizar. 5.18 - Soluo de celulase 2% - pectinase 20% - 20 ml a) Dissolva 0,4 g de celulase em 4 ml de pectinase. b) Complete para 20 ml com tampo citrato-fosfato pH 4,8. c) Divida os 20 ml em 10 tubos de Eppendorf de 2 ml cada e mantenha-os no congelador. Ateno: Essas concentraes indicadas se referem celulase de Aspergillus (100.000 unidades da Calbiochem 21947) e pectinase da Sigma (j fornecida diluda em glicerol 40%). Enzimas de outras marcas, com atividade diferente, devem ser testadas em diferentes propores e concentraes at produzirem um efeito semelhante. 5.19 - Soluo saturada de hidrxido de brio - 120 ml a) Aquea 120 ml de gua destilada at a ebulio e adicione rapidamente 5 g de hidrxido de brio. b) Agite com o auxlio de um basto de vidro e deixe esfriar. Ateno: Esta soluo deve ser preparada em uma capela. Quando em contato com a gua quente, o brio pode efervescer rapidamente, transbordar e causar um acidente. 5.20 - DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) 2 g/ml - 10 ml de soluo estoque a) Soluo estoque (100x): - Dissolva 2 mg de DAPI em 10 ml de gua destilada. Divida em alquotas e conserve no freezer. b) Soluo de uso (2g/ml): - Dilua 100 l da soluo estoque em 10 ml de tampo McIlvaine pH 7,0. Divida em alquotas e guarde no freezer. Ateno: Dependendo do material, concentraes mais diludas (1 ou 0,5 g/ ml) podem dar melhor resultado.
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Tanto a soluo estoque quanto a de uso devem ser mantidas no freezer. A soluo estoque deve ser dividida em pequenas alquotas, em tubos de Eppendorf de 1 a 2 l cada, mantidas no freezer e utilizadas at o final, uma a uma. 5.21 - CMA (Cromomicina A3) 0,5 mg/ml - 10 ml a) Dissolva 5 mg de CMA em 10 ml de uma mistura 1:1 de tampo McIlvaine pH 7,0 e gua destilada. b) Acrescente 10 l de MgCl2 5M ou utilize um tampo contendo 10 mM de MgCl2 (0,2033 g de MgCl2.6H2O em 100 ml de tampo). c) Prepare essa soluo pelo menos uma semana antes de ser utilizada e guarde na geladeira. 5.22 - AMD (Actinomicina D) 0,2 mg/ml - 5 ml a) Dissolva 1 mg de AMD em 5 ml de tampo McIlvaine pH 7,0. b) Acrescente 1 mM de EDTA, agite, divida em alquotas e guarde no freezer. 5.23 - DA (Distamicina A) 0,1 mg/ml - 10 ml a) Dissolva 1 mg de distamicina A em 10 ml de tampo McIlvaine pH 7,0. b) Divida em alquotas de 2 ml e conserve no freezer. 5.24 - Hoechst 0,5 g/ml - 2 ml de soluo estoque a) Soluo estoque (50 g/ml): - Dissolva 100 g de Hoechst 33258 em 2 ml de gua destilada. Conserve no freezer b) Soluo de uso (0,5 g/ml): - Dilua 0,1 ml da soluo estoque em 9,9 ml de tampo McIlvaine pH 7,0. - Divida os 10 ml da soluo de uso em alquotas e guarde no freezer. Ateno: Como a concentrao de Hoechst utilizada muito baixa, fica difcil pesar com preciso os poucos microgramas. Nesse caso, mais prtico pesar o mnimo possvel do Hoechst em p, conferir o peso exato e, a partir dessa quantia, preparar o volume correspondente de soluo estoque na proporo de 50 g/ml. Alguns autores usam concentraes duas a cem vezes mais altas
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que o sugerido aqui. Entretanto, solues entre 0,5 e 2 mg parecem adequadas para corar bem qualquer tipo de cromossomo. 5.25 - Quinacrina 0,5% - 10 ml a) Dissolva 0,05 g de quinacrina di-hidroclordrica em 10 ml de gua destilada b) Divida em alquotas e conserve na geladeira 5.26 - Iodeto de propdeo 1 g/ml - 10 ml de soluo estoque a) Soluo estoque (100 g/ml): - Dissolva 1 mg de iodeto de propdeo em 10 ml de gua destilada. Divida em alquotas e conserve no freezer. b) Soluo de uso (1 g/ml): - Dilua 10 l da soluo estoque em 1 ml de gua destilada. Conserve no freezer. 5.27 - Meio de montagem glicerol/McIlvaine 1:1 (para fluorocromos) - 50 ml a) Misture 25 ml de tampo McIlvaine pH 7,0 em 25 ml de glicerol para fluorescncia (ou glicerol comum). b) Guarde na geladeira. Ateno: Quando esse meio de montagem for usado para lminas coradas com CMA ele deve conter 2,5 mM de cloreto de magnsio. Para isso, acrescente 0,1017 g de MgCl2.6H2O em 100 ml de tampo. Agite bastante e guarde na geladeira. Esse meio pode ser usado para qualquer fluorocromo, embora apenas para as lminas coradas com CMA seja importante a presena de cloreto de magnsio. Todas as solues de fluorocromos, assim como o meio de montagem, devem ser usados temperatura ambiente.
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6 Como revelar os filmes fotogrficos

Em citogentica, a documentao fotogrfica muito importante para a anlise comparada dos resultados e principalmente para a apresentao dos dados. A revelao e cpia dos filmes preto-e-branco bastante simples e deve ser feita pelo prprio pesquisador ou por pessoal especializado nesse tipo de fotografia. A qualidade do filme depende fundamentalmente do tamanho mdio dos gros de prata, que definem sua sensibilidade indicada por uma unidade padro denominada ASA ou ISO. Como as marcas de filmes fotogrficos disponveis no comrcio mudam com o lugar ou o tempo, mais importante considerar a sensibilidade do filme adequado para cada situao. Filmes com gros muito finos (ASA 25, por exemplo) apresentam baixa sensibilidade luz e exigem um tempo de exposio fotogrfica relativamente longo. Esses filmes apresentam um alto contraste e so indicados para a microscopia de campo claro em geral. Por outro lado, filmes com gros mais grossos (ASA 400, por exemplo) possuem maior sensibilidade luz e necessitam um tempo de exposio menor para sensibilizar (queimar) adequadamente todos seus gros. Estes filmes apresentam um menor contraste e podem produzir imagens granuladas. Apesar dessas desvantagens, so muito recomendados para fotografar cromossomos corados com determinados fluorocromos, como o CMA ou o FITC, que perdem o brilho rapidamente quando expostos luz ultravioleta. Fluorocromos que no perdem o brilho com a exposio, como o DAPI em uma colorao cromossmica direta, podem ser fotografados com filmes de baixa sensibilidade. A sensibilidade da maioria dos filmes pode ser um pouco alterada, modificando-se o tempo de exposio e o processo de revelao. Alm disso, alguns filmes, como o Kodak Technical Pan, possuem sensibilidade varivel, podendo ser utilizados para alto e baixo contraste, dependendo da revelao utilizada. Assim, possvel utilizar esse filme tanto para ASA 25 quanto para ASA 400. Os papis fotogrficos tambm podem apresentar alto ou baixo contraste. Em geral, utiliza-se papis de alto contraste, mas papis de baixo contraste tambm so muito teis para amenizar o contraste excessivo de determinados filmes negativos. Alguns papis podem ter seu contraste ajustado mediante o uso de filtros acoplados ampliadora fotogrfica. Abaixo esto indicados alguns tipos de reveladores, fixadores e filmes comumente utilizados para fotografia em preto-e-branco. Outros filmes, com idntica sensibilidade, podero ser utilizados e revelados de maneira similar. 6.1 - Reveladores e fixadores mais comuns 6.1.1 - Revelador Dektol - 1 litro de soluo estoque a) Prepare um litro de soluo estoque de revelador Dektol (Kodak) segundo instrues na embalagem.
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b) Prepare um litro de soluo de uso diluindo a soluo-estoque em gua de torneira na proporo de 1 de revelador para 2 de gua. c) Mantenha ambas as solues na geladeira. Ateno: O volume a ser utilizado depende das dimenses do tanque de revelao. Em geral, 300 ml so suficientes para mergulhar completamente o filme no revelador. Essa soluo deve ser preparada na quantidade necessria para uso e guardada em recipiente separado para ser reutilizada. 6.1.2 - Revelador Microdol 1 litro de soluo estoque a) Prepare um litro de soluo estoque do revelador Microdol (Kodak) segundo instrues na embalagem e mantenha na geladeira. b) Prepare a soluo de uso diluindo o estoque na proporo 1:3 (75 ml da soluo estoque + 225 ml de gua). 6.1.3 - Revelador HC-110 (para filme de ASA 400) a) Soluo estoque: - Dissolva a soluo de HC-110 (Kodak) em gua de torneira na proporo de 1:3 (100 ml de revelador em 300 ml de gua). b) Soluo para uso: - Dissolva a soluo estoque na proporo de 1:7 em gua. 6.1.4 - Fixador universal - 1 litro a) Dissolva 200 g de hipossulfito de sdio e 20 g de metabissulfito de potssio em cerca de 800 ml de gua de torneira em um bquer de 1 litro. Agite com um basto de vidro ou em um agitador magntico. b) Aps completa dissoluo dos cristais acrescente mais gua, at completar 1 litro. Ateno: Esse fixador dito universal por ser utilizado para qualquer tipo de filme ou papel fotogrfico. Como o produto relativamente barato, na maioria dos laboratrios esse fixador comprado pronto e dissolvido conforme indicaes na embalagem. Para a fixao de filmes, o fixador deve ser usado apenas uma vez. Esse mesmo fixador poder ser estocado em garrafa apropriada e reutilizado vrias vezes na fixao de papel fotogrfico at apresentar turbidez ou colorao mais escura.
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6.2 - Cuidados com os reveladores e fixadores a) Reveladores e fixadores devem ser guardados na geladeira e substitudos quando apresentarem colorao amarelo-escura, turbidez ou precipitao. b) Certifique-se de que os frascos onde armazena essas solues fiquem sempre bem fechados. O contato com o ar oxida mais rapidamente essas solues diminuindo sua vida til. c) O revelador Dektol, utilizado na revelao de filme Copex ou Imagelink, pode ser reutilizado vrias vezes, desde que no apresente alterao visvel. Para revelao de papel fotogrfico, pode-se usar um revelador j utilizado para filme, uma vez que na revelao do papel o tempo de revelao controlado visualmente. Em todo caso, o revelador deve ser substitudo sempre que o tempo de revelao do papel se tornar mais longo que o usual. d) recomendvel dispor ao menos das seguintes solues de uso em garrafas etiquetadas: 1) Revelador para filme de ASA 25; 2) Revelador para filme de ASA 400; 3) Revelador Dektol para papel; 4) Fixador para filme; 5) Fixador para papel. 6.3 - Revelao dos filmes mais comumente utilizados 6.3.1 - Filme Copex Pan Agfa ou Imagelink Kodak (ASA 25) a) Revele em Dektol por 5 a 6 minutos (testar) temperatura de 18 C, virando o tanque a cada minuto ou agitando freqentemente o tanque de revelao. Devolva o revelador para a garrafa de revelador usado. b) Encha o tanque com gua de torneira, agite bastante e elimine a gua. c) Fixe por 15 minutos e lave por 1 hora em gua corrente. Ateno: Esses filmes no so especficos para ASA 25, mas produzem bons resultados quando revelados nas condies indicadas acima. A tonalidade desse filme, como de qualquer outro, pode ser intensificada modificando-se cuidadosamente o tempo ou a temperatura de revelao. Pode tambm ser usado o revelador HC-110 da Kodak, diludo em gua de torneira na proporo de 1:50 (v/v). O tempo de revelao de 12 minutos a 20 C, agitando a intervalos regulares. Esse revelador deve ser usado uma s vez e jogado fora. 6.3.2 - Filme T-Max ou Tri-X Pan Kodak (ASA 400)
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a) Revele o filme no Microdol a 24 C, virando o tanque a cada minuto ou agitando freqentemente o tanque de revelao durante 14 a 16 minutos (testar). Pode tambm utilizar o HC-110 a 21 oC por 7 minutos e meio. Aps o uso, descarte o revelador, encha o tanque de revelao com gua de torneira e agite fortemente. b) Retire a gua e acrescente o fixador universal por 15 minutos temperatura ambiente. c) Remova o fixador e lave por 1 hora em gua corrente. 6.3.3 - Filme Panatonic X ou T-Max Kodak (ASA 100) - Procedimento igual ao indicado para filmes de ASA 400, apenas o tempo de revelao deve ser alterado, passando a ser de 6 minutos a 20 C.
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7 - Como organizar melhor seu laboratrio e apresentar seus resultados

Antes de encerrar essa primeira parte, deixamos algumas sugestes de ordem prtica, visando a auxiliar na rotina do laboratrio e na organizao e apresentao dos dados obtidos. Diferentes laboratrios tm encontrado as mais diversas solues para trabalhar com maior eficincia, evitando desperdcio de material e contornando pequenos problemas. O pesquisador no deve sentir-se desconfortvel por precisar improvisar para contornar a falta de determinados equipamentos ou vidrarias apropriadas, desde que isso no comprometa a qualidade e fidelidade dos resultados obtidos. Em muitos dos laboratrios mais produtivos so freqentes o improviso e as medidas para diminuir os gastos. Uma ateno especial deve ser dada ao registro fotogrfico, que na citogentica atual muito importante e nem sempre os iniciantes se apercebem dos cuidados que precisam tomar. Freqentemente, s se percebe os cuidados que devem ser tomados com o registro fotogrfico no momento da publicao ou anos depois, quando se precisa de uma foto original para ilustrar determinado tema. Abaixo esto indicadas algumas solues encontradas na rotina do nosso laboratrio que podero ser teis para aqueles que esto se iniciando na pesquisa em citogentica vegetal ou animal. 7.1 - Cuidados gerais com os protocolos A maioria das tcnicas bem estabelecidas, como as coloraes convencionais, funcionam muito bem em praticamente qualquer material e em qualquer laboratrio, enquanto tcnicas como o bandeamento C podem exigir algum ajuste. Em princpio, deve-se sempre seguir fielmente o protocolo e no considerar que a tcnica no funciona para determinado material antes de repet-la ao menos trs vezes ou com algum com experincia nessa tcnica. Lembre-se que a maioria das tcnicas exige um mnimo de prtica e vrias no tm 100% de repetibilidade. Caso necessite fazer ajustes, altere apenas uma etapa de cada vez (por exemplo, apenas o tempo de envelhecimento da lmina, no bandeamento C). Alguns autores descrevem, na metodologia empregada, infindveis detalhes, como numerosas lavagens, fraes de tempo e temperatura muito precisas, produtos de marca e estoques especficos, etc, parecendo assim extremamente meticulosos. Essas variantes tcnicas muito minuciosas raramente foram definidas com base em experimentos adequadamente controlados e repetidos, e s muito raramente tm alguma importncia para a repetio da tcnica por outro pesquisador. Assim, para a rotina do laboratrio, procure sempre as alternativas de protocolo mais simples, tornando sua rotina mais gil e produtiva. Por exemplo, a soluo de Giemsa normalmente pode ser preparada com gua destilada, evitando, nesse caso, ter que preparar tampo fosfato. Entretanto, se ao tentar dessa forma uma tcnica j conhecida, no obtiver bons resulta-
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dos, volte ao protocolo com o mximo de rigor, procurando inclusive utilizar solues qumicas novas e de qualidade comprovada. 7.2 - Preparao da bancada Antes de iniciar o trabalho, verifique se tudo o que vai precisar (banhomaria a 60 C, soluo de uso do tampo, nitrognio lquido, corante, etc) est disponvel, em quantidade suficiente e em bom estado de uso. Cada pesquisador deve possuir seu prprio estojo com o kit bsico para preparar lminas contendo ao menos agulhas (seringas de insulina so muito boas) ou estiletes, pina fina, bloco de papel filtro, placa escura (muito til para preparar lminas sem colorao), caneta para retroprojetor, etc. Limpe com lcool todas as lminas e lamnulas que vai utilizar e equipe a bancada ou o seu espao de trabalho com tudo o que vai precisar. Uma tbua de madeira, com aproximadamente um centmetro de espessura, por oito de largura e 15 de comprimento, contendo ranhuras inclinadas, fundas e paralelas, muito til para apoiar convenientemente as lminas e lamnulas limpas e para secar ao ar as preparaes aps a retirada da lamnula. 7.3 - Anotaes gerais no laboratrio muito importante ter ao menos trs cadernetas no laboratrio: uma para tcnicas, outra para resultados e uma terceira para anotar coordenadas do microscpio. Na caderneta de tcnicas, deve ser anotado exatamente como as tcnicas foram feitas (h sempre uns detalhes no previstos nos protocolos e umas modificaes sugeridas por diferentes autores). Essa caderneta deve ainda conter informaes sobre os produtos e equipamentos utilizados (marca, modelo, capacidade, frmula qumica, etc). Essas informaes podero ser muito teis meses ou anos depois. A caderneta de resultados deve conter todas as observaes dirias da pesquisa. aconselhvel colocar data em tudo o que fizer (nas cadernetas, nas etiquetas de fixao, nos vidros de solues, nas lminas, nos filmes, etc). Alm de indicar quando foi realizado cada procedimento, essa rede de datas pode ajudar a reconstituir situaes e evitar pequenas falhas de anotaes. Uma regra fundamental no laboratrio nunca delegar prpria memria a funo de guardar quaisquer dados. A caderneta de coordenadas contm apenas as coordenadas das clulas analisadas, com indicaes ao lado ajudando a reconhecer a clula ou chamando a ateno para algum detalhe. Observe que as coordenadas de um charriot (as duas rguas atrs e ao lado da lmina no microscpio) s valem para aquele microscpio. Portanto, necessrio anotar tambm em qual microscpio foram feitas as coordenadas. Para aqueles trabalhos que incluem coletas de plantas no campo, muito importante ter ainda uma caderneta de registro de plantas, contendo todos os dados relativos planta e local de coleta, alm da data e nome do coletor (raramente o autor do trabalho o coletor de todas as plantas que analisa). Cada espcie ou populao diferente deve receber um nmero diferente. Indivduos diferentes da mesma populao devem ter o mes-
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mo nmero seguido do numeral 1, 2, etc, separados por barra ou trao. Esse nmero deve ser o mesmo contido na etiqueta de fixao e deve constar nas lminas que forem preparadas desse material. 7.4 - Reutilizao de lminas e lamnulas Lminas e lamnulas podem ser reutilizadas diversas vezes, exceto se contiverem falhas ou arranhes. Cada pesquisador deve ter seu prprio frasco para lamnulas usadas, assim cada um controla melhor a qualidade de seus materiais. As lminas usadas podem ser mantidas em lcool em um depsito etiquetado de uso comum do laboratrio. Isso se aplica principalmente a lminas que no foram montadas em meio rgido, como o blsamo do Canad ou similares. Embora esses meios possam ser removidos em xilol, o trabalho e a qualidade da lmina resultante nem sempre compensam. Para tcnicas que envolvem muitas etapas e/ou no apresentam repetibilidade de resultados elevada, como o bandeamento C, por exemplo, recomendado o uso de lminas e lamnulas novas, exceto se essas tcnicas j forem bem dominadas pelo pesquisador. 7.5 - Descarte de cidos e substncias txicas As solues cidas mais freqentemente utilizadas na citogentica vegetal (cido actico a 45%, fixador Carnoy, HCl 5N e 1N) no devem ser descartadas na pia, mas sim estocadas em garrafas de vidro de 1 litro, bem fechadas, e posteriormente descartadas em local de difcil acesso rede fluvial. Antes de ser descartada, essa mistura de cidos pode ser utilizada na limpeza de vidrarias e na inativao de substncias txicas. Toda a vidraria em contato com corantes, hidrxido de brio e outras substncias que aderem ao vidro, pode ser mais facilmente limpa se passada primeiramente em uma soluo cida. Igualmente, substncias muito txicas, como a 8hidroxiquinolena e os fluorocromos, no devem ser descartadas diretamente na pia, mas primeiramente misturados com cidos, para perderem a atividade, e depois descartados longe da rede fluvial. Alm dessas garrafas, importante ter tambm no balco um ou dois recipientes de vidro de boca larga, com tampa e capacidade para cerca de 2 a 3 litros. Esses depsitos so teis na retirada das lamnulas com fluorocromos ou com hematoxilina, utilizando um jato de gua, como por exemplo nos procedimentos 3.3.2 e 4.3. prefervel ter um depsito de descarte s para fluorocromos em geral. Antes que esse depsito chegue na metade de sua capacidade deve ser acrescido de igual volume da mistura cida e posteriormente descartado. As lamnulas acumuladas no fundo desse depsito no devem ser reutilizadas, exceto se extensamente lavadas em gua corrente. 7.6 - Conservao de corantes e lminas coradas Todos os corantes devem ser guardados em vidro escuro. As lminas coradas tambm devem ser guardadas em caixas apropriadas, igualmente
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protegidas da luz. A exposio luz contribui fortemente para descorar os pigmentos em geral, ligados aos cromossomos ou a qualquer outra estrutura. O meio de montagem e a temperatura elevada tambm contribuem para descorar o Giemsa (corantes acticos so muito menos sensveis). Alguns meios de montagem, como o Entellan, descoram menos o Giemsa. As lminas que se deseja guardar por muito tempo, podem ser melhor conservadas em uma caixa de lminas na geladeira. 7.7 - Observao de uma clula em diferentes microscpios Para localizar em um microscpio as clulas observadas em outro microscpio, necessrio usar uma lmina acessria com a posio da clula marcada, uma vez que as coordenadas do charriot so diferentes para cada microscpio. Para isso, deve-se utilizar uma lmina branca ou similar. A lmina branca uma lmina comum de microscopia com uma fita de papel branco colada em cima. Para marcar a posio de uma clula na lmina branca localize primeiro a clula no microscpio, substitua essa lmina pela lmina branca, feche o diafragma do condensador (localizado logo abaixo da lmina) deixando apenas um ponto de luz no papel e, com um grafite, faa um ponto no centro da rea iluminada. Volte novamente para a preparao e certifiquese de que aquele ponto est corretamente marcado e que no houve deslocamento do charriot. Leve a lmina branca para outro microscpio, feche o diafragma e coloque o ponto preto no centro da rea iluminada no papel da lmina. Certifique-se, com a objetiva de menor aumento, de que o ponto preto esteja exatamente no centro do campo. Nesse caso, substitua a lmina branca pela preparao com a clula, abra o diafragma do condensador e localize a clula. Em todo esse procedimento, fundamental que a lmina tenha sido sempre colocada bem encostada no charriot, caso contrrio ser difcil reencontrar a clula. Cada lmina branca pode conter vrios pontos, identificados por letras ou nmeros. Alternativamente, pode-se utilizar uma lmina especial, denominada England finder, contendo uma gravao no vidro com uma srie de letras e nmeros muito pequenos. Substituindo-se a lmina da preparao pela England finder possvel fazer uma descrio segura da posio da clula na lmina, a qual poder ser localizada em qualquer outro microscpio. Essa lmina tem como nica desvantagem o preo elevado. As lminas brancas podem ser preparadas utilizando lminas que no servem mais para ser reutilizadas. 7.8 - Cuidados com a fotografia Para fotografar em cores, principalmente clulas coradas com Giemsa, prefervel fazer a foto no mesmo dia da colorao. Aps poucos dias as cores podem ficar menos vivas ou mesmo descoradas. Fotos coloridas devem ser feitas com filtro neutro, azul-claro. Nunca use filtro verde ou de outra cor para fotos coloridas. Fotos em preto e branco ficam geralmente melhor contrastadas com filtro verde, especialmente quando os cromosso-
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mos esto corados em vermelho ou uma cor prxima a esta. Se os cromossomos tiverem colorao azulada, o contraste com o filtro verde poder ser inferior ao esperado. Nesse caso, o contraste dos cromossomos poder ser melhorado utilizando um filtro amarelo ou alaranjado. Como o filme tem sensibilidade diferente a cores diferentes, o tempo ideal de exposio do filme dever ser testado, ajustando a mquina fotogrfica para diferentes valores de ASA, at obter o mesmo tom de preto e branco que obtinha nas demais fotos. importante lembrar que o que aparece bem contrastado para a nossa vista no necessariamente o que produz melhor contraste no filme fotogrfico. 7.9 - A escolha dos filmes Filmes de baixa sensibilidade (ASA 25 ou 32) produzem, em geral, fotos mais contrastadas com qualquer tipo de colorao. Entretanto, trabalhando com fluorocromos que perdem o brilho rapidamente quando expostos luz ultravioleta, como por exemplo a cromomicina A, deve-se utilizar de preferncia filmes com gros de prata mais grossos e mais sensveis (ASA 400 ou mais), que exigem um tempo muito menor de exposio. A imagem obtida com esses filmes pode ser um pouco granulada, mas o resultado quase sempre melhor do que com filmes de baixa sensibilidade. O tempo de exposio ideal, para fotografia em ultravioleta, depende do tipo de fluorocromo usado, da intensidade da colorao e do tamanho dos cromossomos. Portanto, esse tempo geralmente tem que ser determinado experimentalmente, usando o controle manual do sistema fotogrfico. Com a prtica, se adquire uma noo do tempo aproximado para cada situao. Os filmes coloridos, negativos (para impresso em papel) ou positivos (para eslaides), mais comumente usados so os de ASA 100 e 400, para microscopia de campo claro e fluorescncia, respectivamente. O tempo ideal de exposio para uma determinada clula o mesmo com filme preto-e-branco ou colorido, desde que a ASA seja a mesma. 7.10 - Organizao da documentao fotogrfica fundamental que os resultados obtidos durante a pesquisa sejam constantemente organizados para permitir uma anlise final dos dados de maneira fcil e correta. Para isso, certifique-se de que os filmes negativos estejam adequadamente guardados e identificados, protegidos de umidade e poeira. Faa uma cpia pequena de cada negativo, cole as fotos numa folha de papel branco (de preferncia papel 40 kg) e anote todos os dados importantes do material, ao lado ou em cima de cada foto, destacando as particularidades enfocadas (satlites, regies heteropicnticas, bandas, etc). mais rpido e mais econmico fazer uma cpia de todos os negativos de um filme em uma nica folha de papel fotogrfico. Para isso, os negativos devem ser organizados em cima de uma folha de papel fotogrfico, coberto com um vidro limpo e sem arranhes e exposto luz da ampliadora por um tempo previamente testado em um dos negativos. Essa cpia lhe dar uma boa idia de suas fotos, embora uma ou outra foto deva ser ampliada para visualizao de algum detalhe.
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No acumule filmes que no foram revelados e/ou copiados. Observe nas cpias se h alguma sujeira nas lentes do microscpio que deva ser removida. Verifique nas fotos que tm grande chance de virem a ser publicadas, se h alguma falha que possa ser evitada ou se seria possvel melhorar o contraste ou a centralizao da clula. Algumas semanas aps, poder ser impossvel refazer as fotos para corrigir pequenas falhas. 7.11- Seleo de fotos para publicao Selecionar fotos para uma publicao pode parecer uma tarefa simples mas exige bastante ateno, uma vez que alm do contedo tcnico as fotos devem apresentar tambm uma esttica prpria da citogentica. A seleo de fotos deve se basear nos seguintes princpios: a) as fotos devem ilustrar claramente os resultados relatados; b) os cromossomos devem ter o mnimo de superposio e permitir visualizar bem as constries; c) os cromossomos devem prioritariamente estar bem focados, ntidos e bem contrastados contra um fundo branco ou gelo (fotos de fluorescncia devem ter um fundo preto uniforme, mas o mais importante que os cromossomos e as bandas estejam bem visveis e contrastados); d) fotos que apresentem algum tipo de sujeira (cromossomos de outra clula, poeira nas lentes do microscpio, bolhas de ar, etc) devem ser sistematicamente evitadas. Fotos com cromossomos desfocados ou fundo muito escuro, embora possam ser devidas s condies tcnicas de que se dispe, desvalorizam muito o trabalho e so geralmente interpretadas como desleixo e impercia do autor. 7.12 - Montagem de fotos em uma prancha A montagem de uma prancha pode demorar horas e exige um certo planejamento. Antes de cortar as fotos para a prancha considere as seguintes sugestes: a) desenhe numa folha de papel branco um retngulo da prancha nas dimenses desejadas ou permitidas pelo veculo de publicao; b) divida a prancha no nmero de retngulos correspondentes s fotos que pretende incluir, sempre que possvel, em espaos regulares, procurando preencher toda a prancha; c) use uma ampliao suficiente para mostrar bem seus resultados. Ampliaes excessivas, alm de freqentemente diminurem a nitidez das fotos, no so bem vistas pelos editores (a reproduo fotoltica a parte mais cara da publicao); d) procure apresentar todas as fotos numa mesma ampliao, mesmo quando a revista no impe essa restrio; e) evite cortar as fotos muito prximo aos cromossomos. Isso atrapalha a individualizao de cada foto dentro da prancha e causa a sensao de que o autor procurou retirar no corte outros cromossomos ou imperfeies ao lado da clula; f) ao colocar a foto na prancha, escolha a melhor posio da foto, certificando-se de que o canto onde aparecer a letra ou nmero da foto esteja limpo, garantindo sua perfeita visualizao; g) sempre que possvel, utilize uma nica barra de escala para toda a prancha. A barra de escala deve ter um tamanho prximo ao dos cromossomos apresentados; h) letras, setas e outros acrscimos na foto
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devem ter um tamanho discreto, que no chame mais a ateno para si do que para os cromossomos. Evidentemente, nem sempre se consegue preencher todos esses requisitos. Alguns peridicos solicitam que as fotos sejam enviadas soltas e no montadas em pranchas. Mesmo assim, prefervel simular a montagem completa das fotos e enviar as fotos soltas, cortadas no tamanho certo e numeradas no verso. Um bom truque para cortar as fotos, corretamente enquadradas e nos tamanhos certos, utilizar como referncia a prpria folha de papel com as divises em retngulos (itens a e b anteriores). Para isso, fixe a folha com os retngulos no vidro de uma janela bem iluminada ou em um megatoscpio (caixa com lmpadas fluorescentes coberta com uma tampa de vidro fosco) e sobreponha a foto que deseja cortar em cima do retngulo correspondente, ficando o verso da fotografia voltado para o observador. O retngulo de papel e a imagem dos cromossomos devem ficar simultaneamente visveis, permitindo enquadrar corretamente a foto no retngulo. Agora, com o auxlio de pequenas etiquetas autocolantes ou fita adesiva, fixe a foto em cima do papel, na posio ideal. Com a juda de uma rgua ou esquadro, desenhe o retngulo no verso da foto. Leve a foto para a guilhotina e recorte-a com cuidado. Para produzir um corte absolutamente seguro com a guilhotina, coloque a foto com as marcas do retngulo para baixo e, com um espelho debaixo do local de corte da guilhotina, ajuste as marcas da foto precisamente em cima da linha de corte. Nas fotos de fluorescncia, com fundo preto, impossvel visualizar as linhas do retngulo. Nesse caso, prefervel sobrepor o retngulo em cima da foto e marcar os quatro cantos do retngulo furando com uma agulha. A partir desses furos, possvel reconstruir o retngulo e cortar corretamente.
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PARTE II
CITOGENTICA ANIMAL E HUMANA
8 - Como observar cromossomos mitticos em insetos

Estudos citogenticos em insetos tm contribudo de forma significativa para o entendimento de diferentes aspectos envolvendo caractersticas numricas, morfolgicas, estruturais, diferenciao e movimento cromossmico durante os processos de mitose e meiose, alm de esclarecer eventos cromossmico-evolutivos nesse grupo de organismos. Entre os insetos, os gafanhotos oferecem um dos melhores materiais para estudo de mitose e especialmente da meiose. Esses animais de fcil obteno, so encontrados em qualquer rea com gramneas ou campos abertos. So de fcil coleta, podendo ser capturados com redes entomolgicas ou mesmo manualmente. Seus cromossomos so grandes e a maioria das espcies possui cromossomos acrocntricos e nmeros diplides de 2n=23 X0, nos machos, e 2n=24 XX nas fmeas. Alm disso, so portadores de diferentes tipos de rearranjos cromossmicos e muitas espcies apresentam grande variabilidade de heterocromatina constitutiva. As tcnicas usadas para obteno de cromossomos meiticos de gafanhotos podem ser tambm utilizadas em outros grupos de insetos, como colepteros e hempteros. A anlise de cromossomos mitticos de diferentes grupos de insetos e de gafanhotos, em particular, pode ser feita a partir de clulas de embries (material de melhor qualidade), clulas de cecos gstricos de adultos, clulas de parede de ovarolos e tambm clulas espermatogoniais. No caso de gafanhotos, para obteno de embries, fmeas e machos adultos devem ser coletados e mantidos em cativeiro. 8.1 - Manuteno de gafanhotos em cativeiro Para manuteno dos animais, use caixa modelo de madeira (Figura 11a), onde se coloca um recipiente contendo areia ou vermiculita (material de origem mineral micceo) para que a postura seja feita (Figura 11a-b). Na seleo dos indivduos, exemplares machos podero ser reconhecidos com auxlio de lupa, pela ausncia do ovopositor (modificao especial dos trs ltimos somitos abdominais usados para a postura) (Figura 12a), existente na fmea. conveniente deixar fmeas e machos adultos juntos para que possam continuar cruzando (pode-se colocar um macho para cada duas fmeas) e, assim, facilitar a realizao de posturas (= ootecas). Devem ser mantidos, em cada compartimento da caixa modelo (45 x 40 x 13 cm), um mximo de 8 indivduos. Em geral, as posturas (envolvidas por uma camada de material espumoso) so feitas dentro do recipiente contendo vermiculita, localizado no piso da caixa (Figura 11a). Eventualmente, em cativeiro, as fmeas podem fazer a ovoposio nas paredes ou piso da caixa e tambm na vegetao (folhas de couve, gramneas, etc), colocada como alimento. Os ovos assim depositados tambm so usados para obteno de embries. As caixas, devem ser colocadas em local arejado e ensolarado pelo menos por 3 a 5 horas por dia. Alm disso, devem ser
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c
Figura 11 Caixa modelo (a) usada para manuteno de gafanhotos em cativeiro; (b e c) esquema representativo da postura de fmea e diferentes formas de ootecas, respectivamente; Nota: medidas da caixa modelo (42x40x13cm).
observadas diariamente, tanto para a realizao da limpeza, como para a retirada e incubao dos ovos. Na maioria das espcies de acriddeos, os ovos tm forma alongada e cor esbranquiada ou amarelo claro. O conhecimento prvio da biologia reprodutiva da espcie escolhida para a obteno de embries extremamente importante. Espcies cujos perodos de incubao dos ovos so muito longos (mais de 60 dias) so de difcil manejo, especialmente por proliferao de fungos e caros que atacam os ovos, afetando o desenvolvimento embrionrio. Para incubar os ovos, use uma placa de Petri de tamanho mdio (10 cm de dimetro), contendo preferencialmente vermiculita. Os ovos devem ficar cobertos pela vermiculita levemente umedecida e a placa de Petri colocada na estufa a 30 C. Experimentos realizados com espcies dos gneros Rhammatocerus, Schistocerca e Abracris mostraram que ovos incubados numa temperatura de 30 oC, aps um perodo de 10 a 13 dias fornecem embries (Figura 12c) em bom estgio de desenvolvimento, sendo adequados para a realizao das preparaes citolgicas.
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c
Figura 12 Exemplo esquemtico da extremidade abdominal em gafanhotos fmeas e machos (a) permitindo a distino do sexo. (b) Corte abdominal para a retirada do testculo ou ovrio. (c) Representao esquemtica em diferentes estgios de desenvolvimento de embries de gafanhoto. Os estgios 3 e 4 so mais adequados para fazer as preparaes citolgicas (td=tubo digestivo; te=testculo ou ovrio)
8.2 - Obteno de embries As ootecas devem ser coletadas da vermiculita e transferidas imediatamente para uma placa de Petri. A vermiculita deve ser umedecida. Depois de incubados por 10 a 13 dias a 30 C, transfira os ovos, em lotes de 5, para uma pequena placa de Petri com 5 cm de dimetro. Use um pincel pequeno de plos finos e delicados para retirar cuidadosamente os resduos de vermiculita dos ovos. Depois de limpos (Figura 11c) os ovos so transferidos para outra pequena placa contendo 5 ml de soluo de Ringer. Use uma pina de ponta bem fina para prender cada ovo por uma das extremidades e faa um pequeno corte com uma tesoura de ponta fina na extremidade
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oposta. Uma leve presso com a pina expulsar o embrio de dentro do ovo, o qual ser facilmente reconhecido pela morfologia e cor esbranquiada, diferente do vitelo de cor amarelada. Repita esse procedimento para obter os demais embries. Retire toda a soluo de Ringer usando uma pipeta Pasteur. Retire tambm as cascas vazias dos ovos. Adicione 3 ml de colchicina (0,01%) diluda em soluo salina para insetos. Deixe por 45 minutos temperatura ambiente. Retire a soluo de colchicina com uma pipeta Pasteur. Adicione 3 ml de gua de torneira para fazer a hipotonizao. Deixe por 5 minutos. Retire a gua de torneira usando pipeta Pasteur. Adicione 3 ml de fixador (etanol-cido actico 3:1). Aps 15 minutos de fixao os embries ficam mais rgidos, o que facilita a manipulao. Transfira os embries, em lotes de 10, para um pequeno tubo Eppendorf contendo 2 ml de fixador novo. Nessa condio, podem ser estocados em freezer por um perodo longo de tempo e utilizados para preparaes citolgicas sempre que necessrio. 8.3 - Preparao de lmina a partir de embrio total a) Coloque um nico embrio em uma lmina contendo duas gotas de orcena actica a 2% (para a colorao convencional) ou duas gotas de cido actico a 45% (caso a lmina se destine a algum tipo de colorao diferencial - bandas C, colorao com nitrato de prata, etc). b) Cubra o embrio com uma lamnula e bata levemente com a ponta de um estilete. Verifique a qualidade da preparao no microscpio e, se tiver clulas bem espalhadas, esmague cuidadosamente a preparao entre lmina e lamnula envoltas em papel de filtro. c) Se a lmina j estiver corada, pode ser diretamente analisada. As melhores clulas podem ser desenhadas ou fotografadas. As lminas assim coradas podem ser mantidas em caixas fechadas, colocadas no freezer por um perodo de at 60 dias sem perder a qualidade de colorao. d) Se a lmina for preparada com cido actico a 45%, a lamnula deve ser retirada no nitrognio lquido, gelo-seco ou no freezer. A lmina deve secar ao ar para ser utilizada posteriomente em diferentes tcnicas de colorao diferencial. Ateno: Caso as lminas se destinem a coloraes especiais (bandas C, colorao com nitrato de prata, fluorocromos, etc.) devem ser mantidas em estufa a 30 C por um perodo de 5 a 8 dias. Entretanto, lminas recentemente preparadas (24 a 48 horas) podem ser usadas para essas coloraes. Esses procedimentos tambm so vlidos para as preparaes citolgicas obtidas de acordo com os itens 8.4 e 8.5. Quando necessrio, os ovos podem permanecer incubados at que ocorra a ecloso e o surgimento das ninfas de primeiro estgio. Estas ninfas podem ser mantidas em cativeiro at atingirem a fase adulta.
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8.4 - Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de parede de ovarolos a) Para essa preparao injete colchicina nos animais (soluo a 0,1% na proporo de 0,2 ml para cada 5 g de peso, por 6 horas). b) Anestesie, com ter ou clorofrmio, fmeas adultas ou jovens, previamente colchicinizadas, para fazer as preparaes citolgicas. c) Disseque a fmea, sob a lupa, fazendo um corte longitudinal na regio dorsal (Figura 12b) do abdome, retirando os ovrios. No caso de machos, os testculos se encontram na mesma posio. Esse procedimento deve ser realizado com o animal colocado numa placa de Petri de tamanho mdio (10 cm de dimetro), cujo fundo deve ser coberto com uma camada de cortia. O animal deve estar preso com alfinetes e submerso em soluo de Ringer. d) Transfira os ovrios para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de gua de torneira, para induzir a hipotonizao durante 5 minutos. e) Transfira os ovrios para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de fixador (etanol-cido actico 3:1) durante 15 minutos. Para ovrios muito volumosos, conveniente lavar em novo fixador antes de estocar no freezer. Isso ir melhorar as condies de fixao do material. f) Transfira os ovrios para um pequeno frasco com tampa contendo 3 ml de fixador fresco e estoque no freezer. g) Para preparar uma lmina use dois ovarolos. Descarte os ovcitos mais desenvolvidos de cada ovarolo, visto que prejudicam a qualidade da preparao pela presena do vitelo. Faa o esmagamento entre lmina e lamnula, contendo duas gotas de orcena actica a 2%, caso a lmina se destine colorao convencional, ou duas gotas de cido actico a 45%, quando a lmina se destinar colorao cromossmica diferencial. Ateno: As lminas coradas com orcena podem ser mantidas em caixas fechadas, colocadas dentro do freezer por um perodo de at 60 dias, sem perder a qualidade de colorao. Esse procedimento tambm vlido para as preparaes meiticas obtidas a partir de clulas de folculos testiculares. 8.5 - Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de cecos gstricos (suspenso celular) a) Disseque fmeas ou machos previamente colchicinizados (soluo de colchicina a 0,1% por 6 horas), sob a lupa, mantendo o animal
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submerso em soluo de Ringer, de acordo com o item 8.4. a-c. Faa a retirada dos cecos gstricos (Figura 13), transferindo-os para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 3 ml de soluo de Ringer.
a b
Figura 13 Diagrama do sistema digestivo de um inseto. Nota: b=boca; cg=cecos gstricos; tm=tbulos de Malpighi; a=nus.
b) Limpe os cecos com auxlio de estilete e pina, e os transfira para outra placa de Petri contendo 1 ml de Ringer. Corte os cecos em pequenos fragmentos e macere com um basto de vidro at conseguir uma boa suspenso de clulas. c) Transfira a suspenso de clulas obtida, para um tubo de centrfuga contendo 3 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). Deixe hipotonizar por 15 minutos. d) Centrifugue o material a 900 rpm durante 5 minutos. Jogue fora o sobrenadante e adicione 3 ml de fixador fresco. Centrifugue, jogue fora o sobrenadante. Repita o processo de fixao por mais duas vezes. e) Ressuspenda o material em 0,5 ml de fixador fresco. Coloque 2 gotas da suspenso sobre cada lmina limpa e seca. f) Para a anlise convencional, core a lmina com Giemsa a 5%, durante 5 minutos. Seque a lmina e monte em blsamo do Canad ou Euparal.
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9 - Como observar cromossomos mitticos humanos e de pequenos mamferos

Em material humano e de outros mamferos como roedores, morcegos e marsupiais, os cromossomos metafsicos mitticos so adequados para anlise cariotpica, principalmente pelo seu alto grau de condensao e espalhamento em metfase. Isso facilita a contagem do nmero diplide, a definio de morfologia e a identificao dos cromossomos sexuais (no caso de heteromorfismo do par sexual). Cromossomos mitticos, obtidos por diferentes tcnicas de preparao citolgica, podem ser utilizados tanto para anlise convencional como para as identificaes cromossmicas especiais. 9.1 - Cultivo de linfcitos humanos A tcnica mais usada para estudo de caritipo humano o cultivo de linfcitos de sangue circulante perifrico. Essa tcnica tem a vantagem de oferecer grande nmero de metfases em apenas trs dias e de eliminar a necessidade de bipsias, como no cultivo de fibroblastos. No cultivo de linfcitos empregue um agente mitognico, a fitohemaglutinina, que estimula a atividade mittica e tem ao aglutinante sobre as hemcias. Nesse cultivo, use apenas 1 ml de plasma. Para evitar contaminao do material, todo o processo, desde a obteno do sangue at o tratamento com colchicina, deve ser feito sob a mais completa condio de assepsia. Toda a manipulao com o meio de cultura, o soro bovino fetal e o sangue, deve ser feita em fluxo laminar. No caso de cultivo de linfcitos de pequenos mamferos, a diferena consiste apenas no tempo de cultivo (de 72 a 96 horas) devendo esse tempo ser testado para cada espcie. Existem basicamente duas tcnicas para cultivo de linfcitos humanos: a macrotcnica e a microtcnica. A diferena entre elas, que na primeira coleta-se um volume maior de sangue (5 ml) e as hemcias so excludas por sedimentao, enquanto na segunda o volume de sangue menor (0,2 ml) e trabalha-se com o sangue total. A microtcnica pode ser utilizada para anlise cariotpica de recm-nascidos. O cultivo de linfcitos segue a tcnica de Moorhead et al. 1960, com algumas modificaes. 9.1.1 - Macrotcnica para cultivo de linfcitos a) Com uma seringa previamente umedecida de heparina, colete 5 ml de sangue. b) Deixe a seringa em posio vertical com a agulha para cima at que com a sedimentao das hemcias, os linfcitos sejam separados no plasma sobrenadante. c) Transfira 1 ml do plasma, com a prpria seringa, para um frasco de
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cultura contendo 10 ml de meio completo (meio RPMI 1640 da Sigma), contendo 0,2 ml de fitohemaglutinina (preparada conforme indicado pelo fabricante). Esse meio deve estar suplementado com 20% de soro bovino fetal. Adicione os antibiticos Penicilina (10.000U/ml), Estreptomicina (10 mg/ ml) e, tambm, a Glutamina-A (29 mg/ml). Feche bem o frasco, coloque etiqueta de identificao e deixe na estufa a 37 C, por 72 horas. d) Aps 71 horas de cultivo, adicione 3 gotas de colchicina 0,0016% e deixe por 1 hora. e) Ao completar 72 horas de cultivo, transfira o material para um tubo de centrfuga e centrifugue a 900 rpm durante 5 minutos. Elimine o sobrenadante sem agitar o sedimento celular. f) Coloque 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize e deixe na estufa a 37 C por 10 minutos. g) Centrifugue o material por 5 minutos a 900 rpm, elimine o sobrenadante, coloque 5 ml de fixador (metanol-cido actico, 3:1) e homogeneize. Repita este procedimento duas vezes. h) Ressuspenda o sedimento em 0,5 a 1 ml de fixador fresco e pingue duas gotas da suspenso em cada lmina. Para obter uma lmina de melhor qualidade, o material deve ser pingado, em lmina extremamente limpa e inclinada, a uma distncia de mais ou menos 30 cm. Deixe secar a lmina. i) Identifique cada lmina com lpis diamante ou caneta para retroprojetor. j) Core cada lmina com Giemsa a 5%, durante 5 minutos, caso a lmina se destine a anlise convencional. A Figura 14 e mostra uma metfase mittica humana. 9.1.2 - Microtcnica para cultivo de linfcitos a) Colete 0,2 ml de sangue capilar, atravs de puno na ponta do dedo da mo ou na planta do p utilizando uma seringa de 3 ml heparinizada. Previamente, faa uma assepsia da rea com lcool 70%. b) Em condies de assepsia, transfira o sangue total colhido para o frasco de cultura contendo 5 ml de meio de cultura completo. Misture o sangue ao meio, agitando levemente. c) Incube na estufa a 37 oC por 72 horas. d) Decorridas 71 horas, adicione 3 gotas de colchicina na concentrao de 0,0016% e deixe por 1 hora.
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Figura 14 Colorao convencional em clulas meiticas do gafanhoto Xyleus angulatus (a=diplteno; b-c=anfase I e II, respectivamente) e mitticas do morcego Artibeus lituratus (d) e humano (e). Fotos do autor.
e) A partir da, prossiga de acordo com a tcnica anteriormente descrita, a partir do item e para cultivo de linfcitos. 9.2 - Cultivo de fibroblastos em pequenos mamferos O cultivo de fibroblastos uma tcnica bastante utilizada para obteno de cromossomos mitticos em mamferos. O procedimento para obteno de cromossomos mitticos pelo cultivo de fibroblastos consiste nas seguintes etapas: obteno das bipsias, implantao do cultivo, tripsinizao e preparo do material para estudo cromossmico. Tambm
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sero descritos procedimentos para manuteno, congelamento e descongelamento de clulas. Para o cultivo de fibroblastos, pode ser utilizado o meio DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) da Gibco (preparado conforme indicado pelo fabricante). O meio deve ser enriquecido com 20% de soro bovino fetal, com os antibiticos Neomicina (50 mg/ml) e Gentamicina (4 mg/ml) e com soluo de Fungizon (= anfotericina A) (0,01 mg/ml). Em pequenos mamferos, o material comumente usado para cultivo de fibroblastos retirado da orelha ou da cauda. Entretanto, tecido muscular tambm bastante utilizado para este tipo de cultivo. Para o cultivo de fibroblastos foram seguidos os procedimentos tcnicos descritos por Freshney (1986) com modificaes. 9.2.1 - Obteno de bipsias a) Depois de anestesiar o animal com ter, faa a assepsia da regio escolhida, procedendo a limpeza com algodo embebido, na seguinte seqncia: gua, detergente neutro a 5% (Extran ou similar), gua, etanol 70%, ter e soluo de merfene. Repita esse procedimento vrias vezes at que a regio escolhida fique completamente limpa. b) No caso de bipsia de orelha, corte na extremidade cerca de 0,3 ou 0,5 cm. No caso de cauda, conveniente garrotear acima do local do corte para evitar sangramento. Seccione transversalmente a extremidade da cauda e retire cerca de 0,5 a 0,8 cm. Use tesouras e pinas esterilizadas. c) Imediatamente, transfira o material cortado para uma placa de Petri estril contendo 3 ml de meio completo. Retire e despreze a pele, no caso da cauda. Coloque o material em um pequeno frasco (capacidade para 5 ml) estril, contendo 3 ml de meio completo. Mantenha na geladeira a 4 C por 24 horas. Esse tempo permite um acompanhamento do material para deteco de possveis contaminaes. Mudana de colorao ou aparncia trbida do meio de cultura pode ser indicativo de contaminao. Nesse caso, o material deve ser desprezado. Ateno: O cultivo de fibroblastos tambm pode ser feito a partir de material de embrio obtido de fmea prenhe em pequenos mamferos. Nesse caso, as fmeas so sacrificadas e o tero inteiro retirado e colocado numa pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo soluo de Hanks estril, com Neomicina (50 mg/ml). No fluxo laminar, proceda como segue: Retire o embrio ou embries de dentro do tero, usando tesoura e pinas estreis. Transfira para outra placa de Petri contendo 3 ml soluo de Hanks com Neomicina (50 mg/ml). Corte orelha, cauda ou membrana de asa (caso de morcegos) e transfira os fragmentos para pequenos frascos estreis contendo 3 ml de meio de cultura completo. Deixe na geladeira a 4 C por 24 horas, como no caso do item 9.2.1 c.
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9.2.2 - Implantao do cultivo a) Corte o material obtido pela bipsia (cauda, orelha ou embrio) em fragmentos de, no mximo 1 mm3 em placa de Petri pequena, estril, contendo 3 ml de meio de cultura completo. No caso de embries, pode-se escolher fragmentos de cauda, orelha, tecido muscular ou rgos internos. Para fragmentar esse material, use pinas e tesouras esterilizadas e trabalhe no fluxo laminar. b) Para implantao do cultivo, use frascos de plstico (marca Corning, Costar ou similar), com capacidade para 25 cm2. Umedea a face interna do frasco, na qual ser feito o implante, com soro bovino fetal (Figura 15a).
b
Figura 15 Frasco modelo usado para o cultivo de fibroblastos (a). Em destaque (-) a distribuio dos fragmentos de tecido de cauda de morcego. Em (b) crescimento tpico de clulas fibroblsticas.
c) Use pipeta Pasteur para transferir os fragmentos de tecido para o frasco de cultura, colocando-os sobre a parede j umedecida com soro bovino fetal. Depois de distribuir os fragmentos no frasco, coloque no fundo do mesmo 2 ml de meio de cultura completo, deixe o frasco em posio vertical e em repouso durante 30 minutos na estufa a 37 C.
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d) Vire o frasco com cuidado para que os fragmentos de tecido entrem em contato com o meio de cultura e no se destaquem da parede do frasco. Deixe na estufa a 37 C durante 3 dias. e) Quando as clulas iniciarem a proliferao, adicione 3 ml de meio de cultura completo. f) A partir desse momento, necessrio observar diariamente o desenvolvimento do cultivo. importante manter o pH do meio de cultura entre 7,2 e 7,6. Caso o meio apresente uma colorao amarelada (indicativo de acidez), adicione algumas gotas de bicarbonato de sdio a 2,8%. Caso o meio se apresente avermelhado (indicativo de alcalinidade), use algumas gotas de HEPES (N-2-hidroxi-etil-perazina-N-2-cido etanossulfnico) a 2,5% (todas as solues devem ser estreis). Com a proliferao celular (Figura 15b), o meio de cultura deve ser trocado diariamente ou, no mximo, a cada dois dias, para retirada de produtos txicos e reposio de novos nutrientes. Quando cerca de 90% da superfcie do frasco de cultura ficar coberta por uma monocamada de clulas, necessrio fazer a tripsinizao para repicagem das clulas. Esse procedimento visa evitar a interrupo do processo de diviso celular decorrente do grande nmero de clulas confluentes no frasco. 9.2.3 -Tripsinizao a) Retire os frascos da estufa, despreze o meio de cultivo e adicione 2 ml de soluo de Hanks sem clcio e sem magnsio. Deixe o frasco em repouso por 3 minutos e, em seguida, despreze a soluo de Hanks. b) Adicione ao frasco de cultivo 2 ml de soluo de tripsina/EDTA (Etileno Diamino cido Tetractico) (0,005 g de tripsina mais 0,002 g de EDTA em 10 ml de soluo de Hanks). Observe ao microscpio invertido o destacamento das clulas que se caracteriza pelo arredondamento destas. Nesse momento, retire com pipeta Pasteur a soluo de Hanks com tripsina e EDTA. c) Adicione 3 ml de meio completo e bata nas paredes do frasco para desprender as clulas da superfcie do frasco. Acompanhe ao microscpio invertido. d) Divida o contedo do frasco para dois novos frascos de cultivo e acrescente 3 ml de meio completo em cada um deles. e) Coloque os frascos na estufa a 37 oC. Acompanhe o novo crescimento e proliferao celular diariamente, como descrito no item 9.2.2 e, f. 9.2.4 - Preparao do material para anlise cromossmica a) Nas ltimas 24 horas antes da colheita do material, o meio de cultura deve ser trocado por um meio novo, para acelerar o processo de diviso celular.
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b) Adicione 2 gotas de soluo de colchicina a 0,01% no frasco de cultivo. Aps 40 minutos transfira o contedo do frasco para um tubo de centrfuga e reserve. Acrescente ao frasco de cultivo 2 ml de soluo de Hanks sem clcio e sem magnsio, deixe na estufa a 37 C por 5 minutos e, em seguida, faa a transferncia para o mesmo tubo de centrfuga anterior. A partir desta etapa at o item d, todo material celular e respectivos sobrenadantes devem ser colocados em um mesmo tubo de centrfuga para evitar maior perda de clulas. c) Coloque 2 ml de soluo de tripsina / EDTA, conforme o item 9.2.3 b, no frasco de cultivo. Observe ao microscpio invertido para acompanhar o arredondamento das clulas. d) Transfira a soluo de tripsina mais EDTA para o tubo de centrfuga. Coloque 2 ml de Hanks sem clcio e sem magnsio e solte as clulas com batidas nas paredes do frasco. Transfira todo o material para o tubo de centrfuga e, por ltima vez, adicione 2 ml de meio completo para fazer uma retirada completa das clulas do frasco de cultura. Transfira esse meio para o tubo de centrfuga. e) Centrifugue o material a 1200 rpm durante 10 minutos. Despreze o sobrenadante f) Adicione 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize e coloque a 37 C por 10 minutos. g) Centrifugue, despreze o sobrenadante, adicione vagarosamente 5 ml de fixador (metanol- cido actico, 3:1) e homogeneize. h) Centrifugue a 1200 rpm por 10 minutos. Repita o processo de fixao mais duas vezes. i) Ressuspenda o material em 1 ml de fixador e pingue 2 gotas sobre cada lmina que deve estar rigorosamente limpa. j) Seque, core com soluo de Giemsa a 5% diluda em tampo fosfato pH 6.8 durante 5 minutos. Lave em gua destilada, seque e monte em blsamo do Canad ou Euparal. 9.2.5 - Congelamento de clulas a) Para iniciar o procedimento de congelamento de clulas proceda inicialmente como nos itens a e b, da tripsinizao (item 9.2.3). b) Coloque no frasco de cultivo 2 ml de meio de cultura completo adicionando 1 ml de DMSO (dimetil-sulfxido) a 10%. c) Bata nas paredes do frasco de cultivo para soltar as clulas. Adicione 2 ml de DMSO a 10%.
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d) Transfira o material para frascos criognicos (por exemplo, da marca Nalgene) com capacidade para 1,8 ou 2,0 ml. Esses frascos devem ser mantidos em cuba com gelo antes de receber o material. e) Os frascos criognicos, depois de receberem o material, devem ser submetidos a um congelamento progressivo na geladeira a 4 C (2 horas), no freezer a -20 C (5 horas), no gelo seco a -60 C (5 horas) e, finalmente, no botijo de nitrognio lquido (temperatura de -196 oC), onde podero ser mantidos por muito tempo. 9.2.6 - Descongelamento de clulas a) Os frascos criognicos so retirados do botijo de nitrognio lquido e colocados em banho- maria a 37 oC. Espere o descongelamento completo (cerca de 5 minutos). b) Leve os frascos criognicos ao fluxo laminar e antes de abr-los, passe um algodo, embebido de lcool 70%, sobre os mesmos. Transfira o material para um tubo de centrfuga estril contendo 5 ml de meio de cultura completo. Feche o tubo e centrifugue a 800 rpm por 10 minutos. Jogue fora o sobrenadante. c) Ressuspenda o material em 2 ml de meio de cultura completo e transfira-o para um frasco de cultura, adicionando mais 3 ml de meio. d) Mantenha o frasco na estufa a 37 C e acompanhe o desenvolvimento da cultura, como descrito no item 9.2.2 e, f. 9.3 - Observao de cromossomos mitticos em clulas de medula ssea e de bao de pequenos mamferos As duas tcnicas a seguir podem ser facilmente empregadas para obteno de cromossomos mitticos de pequenos mamferos (roedores, morcegos e marsupiais), sem necessidade de fazer cultivo de clulas. A intensa atividade hematopoitica, tanto da medula ssea como do bao, permite uma maior riqueza na quantidade de clulas em diviso mittica nesses rgos. Para a preparao citolgica de medula ssea foi seguido o mtodo de Ford e Hamerton (1956) e para bao Yonenaga (1972) com modificaes. 9.3.1 - Utilizando clulas de medula ssea a) Selecione o animal a ser estudado, bloqueie a diviso das clulas em metfase com injeo subcutnea de colchicina a 0,2%, na proporo de 1 ml para cada 100 g de peso do indivduo. Aps um perodo de 1 a 2 horas anestesie o animal com ter ou clorofrmio e disseque em seguida. b) Retire os fmures e meros. Corte as epfeses e retire a medula
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com lavagens repetidas do canal sseo, em 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), obtendo uma suspenso de clulas (use placa de Petri pequena, 5 cm de dimetro). c) Transfira a suspenso de clulas para um tubo de centrfuga e leve para a estufa a 37 C por 10 minutos. d) Centrifugue a suspenso celular a 800 rpm durante 5 minutos e jogue fora o sobrenadante. e) Ressuspenda o material em fixador (metanol-cido actico, 3:1). Centrifugue e elimine o sobrenadante. Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes. f) Ressuspenda o material em fixador fresco e pingue duas gotas em lmina limpa, conservada na geladeira. Passe a lmina rapidamente na chama para evaporar o fixador ou deixe secar temperatura ambiente. g) Core o material com uma soluo de Giemsa a 5%, durante 5 minutos. Lave em gua corrente. Se o clima do Laboratrio for seco, deixe secar ao ambiente. Caso seja muito mido, seque a lmina imediatamente com secador eltrico. Passe em xilol e monte em blsamo do Canad ou Euparal. A Figura 14d, mostra uma metfase mittica do morcego Artibeus lituratus. 9.3.2 - Utilizando clulas de bao a) Depois de selecionar o animal, injete subcutneamente uma soluo de colchicina a 0,2% na proporo de 1 ml para cada 100 g de peso do indivduo. Sacrifique o animal aps um perodo de 1 a 2 horas, utilizando ter ou clorofrmio. b) Retire o bao e coloque numa placa de Petri pequena (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). c) Use uma seringa de 10 ml para injetar vrias vezes no rgo a soluo hipotnica. Esse procedimento deve ser repetido at o rgo ficar transparente e se obter uma suspenso celular a partir das clulas desprendidas. d) Siga o procedimento descrito para a preparao de medula ssea a partir do item 9.3.1 e. Ateno: Melhores resultados da anlise cromossmica so obtidos medida em que se tem preparaes mais ricas em metfases. O ndice mittico pode ser aumentado, em pequenos mamferos e mesmo em alguns outros vertebrados, com o pr-tratamento dos animais, com uma solu-
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o de fermento biolgico Fleischmam, ou similar, por um perodo de 18 a 24 horas. Esse procedimento acarreta o aumento da atividade hematopoitica da medula ssea e do bao, desencadeando um aumento na freqncia de mitoses nesses rgos. Nos animais mais resistentes, que suportam um perodo mais longo de pr-tratamento com fermento biolgico, por exemplo, 48 horas, o tempo de tratamento com colchicina pode ser reduzido para 1 hora. Esse procedimento permitir um acmulo de metfases mitticas, com cromossomos menos condensados, que sero mais adequados para diferentes tipos de anlises citogenticas. Isto vlido tanto para as preparaes citolgicas de medula ssea como de bao. 9.4 - Anlise do caritipo mittico 9.4.1 - Construindo um cariograma: o exemplo do cariograma humano Os cromossomos humanos e de outros mamferos podem ser melhor analisados a partir de montagem de seus caritipos. Para isto, pode-se usar fotomicrografias de metfases de diferentes espcies. Para analisar o caritipo humano, esses cromossomos so alinhados de acordo com o tamanho e a morfologia (posio do centrmero) em sete grupos designados pelas letras A at G. Os autossomos so numerados de 1 a 22 pela ordem decrescente de tamanho e os cromossomos sexuais representados pelas letras X e Y, conforme descrito abaixo: GRUPO A - os trs maiores pares cromossmicos. O par 1 e 3 so metacntricos, enquanto o par 2 submetacntrico. GRUPO B - pares 4 e 5, submetacntricos. O tamanho de seus braos curtos equivale a 1/3 de seus braos longos. GRUPO C - pares 6 a 12. O cromossomo X includo neste grupo, ficando representado por apenas um cromossomo no caso do homem. impossvel a identificao individual dos cromossomos deste grupo pela anlise morfolgica. Devem ser pareados em ordem decrescente de tamanho. GRUPO D - pares 13, 14 e 15. So acrocntricos de tamanho mdio, com satlites nem sempre visveis nos braos curtos. No so distinguveis entre si pela anlise morfolgica. GRUPO E - pares 16, 17 e 18. O par 16 metacntrico e os pares 17 e 18 so submetacntricos. O par 17 tem os braos curtos ligeiramente maiores que os do par 18. GRUPO F - pares 19 e 20. So os menores metacntricos e no so distinguveis pela anlise morfolgica. GRUPO G - pares 21 e 22 na mulher, e mais o cromossomo Y, no homem. Os pares 21 e 22 apresentam satlites nos braos curtos, nem sempre visveis. No possvel a distino individual desses dois pares. O Y identificvel em muitos casos pela posio paralela dos braos longos, pela ausncia de satlites e localizao preferencial na periferia da metfase.
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9.4.2 - A montagem do cariograma a) Conte o nmero de cromossomos da metfase antes de iniciar o trabalho. No caso de material humano, numere na foto, os pares de cromossomos, de acordo com a classificao descrita acima (grupos A at G mais os cromossomos sexuais). No caso de material de outros mamferos, numere os pares cromossmicos em ordem decrescente de tamanho. b) Depois de identificados na foto, recorte cada cromossomo e agrupe os pares segundo os critrios destacados acima. A Figura 16 mostra uma metfase humana com seus cromossomos antes e depois do pareamento.
Figura 16
Caritipo humano masculino normal (2n=46, XY). Foto do autor.
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c) Para material de outros mamferos, a montagem de caritipo pode obedecer ordem decrescente de tamanho dos cromossomos. Estes, por sua vez, podem tambm ser agrupados por ordem de tamanho, porm levando em conta as caractersticas morfolgicas, por exemplo, metacntricos, submetacntricos, acrocntricos, etc. Ateno: caritipo humano e de outros mamferos, pode tambm ser representado esquematicamente por um idiograma. Para isso, pode-se utilizar valores mdios da posio do centrmero e tamanho de cada cromossomo. Alm disso, o idiograma pode mostrar a representao de diferentes padres de bandeamento cromossmico. Na Figura 17 esto apresentados os idiogramas humanos, a partir da colorao convencional acima e, tambm, a partir do padro de bandas G abaixo visto em cromossomos metafsicos.
Figura 17 Esquemas representativos de idiogramas humanos. Colorao convencional e bandeamento G. Nota: idiogramas do sexo masculino.
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10 - Como observar cromossomos meiticos e complexos sinaptonmicos

A meiose se caracteriza por apresentar duas divises sucessivas do material hereditrio (diviso I e diviso II) precedidas de um nico perodo de sntese de DNA (fase S). A prfase da primeira diviso meitica bastante ampla, podendo durar desde dias (em machos) at anos (geralmente em fmeas de mamferos). Nos machos, o resultado final do processo a formao, por parte de cada uma das clulas que entraram na prfase I, de quatro clulas haplides, que so as espermtides. Em seguida, por um processo denominado espermiognese que se caracteriza por uma srie de mudanas tanto citoplasmticas como nucleares, as espermtides se transformam em espermatozides. Nas fmeas, ocorre eliminao de ncleos e a meiose termina com um nico gameta. Nas tcnicas a seguir, so apresentados diferentes procedimentos para obteno e anlise de cromossomos meiticos em insetos e pequenos mamferos. O procedimento muito mais simples para anlise da meiose masculina, por isso o estudo da meiose feito quase sempre nos machos. Por fim, so descritas tambm algumas tcnicas para anlise de quiasmas e do complexo sinaptonmico, que ocorre durante incio da prfase I da meiose. H pelo menos duas tcnicas principais na preparao de lminas para anlise meitica: por esmagamento e por suspenso de clulas testiculares. Essas duas tcnicas podem ser usadas tanto em insetos (gafanhotos, colepteros, hempteros, etc.) como em pequenos mamferos. Entretanto, a tcnica de esmagamento comumente usada em insetos e a tcnica de suspenso celular em mamferos. A Figura 14a-c apresenta fases da meiose do gafanhoto Xyleus angulatus. Para a obteno de cromossomos meiticos e mitticos em gafanhotos foram seguidas a tcnicas clssicas de esmagamento e a de suspenso celular descrita por Souza (1991). Preparao meitica de pequenos mamferos foi segundo Eicher (1966) e a obteno de complexos sinaptonmicos segundo Pathak e Hsu (1979), Pathak et al. (1979) e Albani e Jones (1984) com modificaes. 10.1 - Disseco de gafanhotos a) Anestesie o animal usando um chumao de algodo embebido com ter ou clorofrmio. Isso pode ser feito dentro de um pequeno recipiente de vidro com tampa. b) Disseque o animal, sob lupa, fazendo um corte longitudinal na parte dorsal do abdome, expondo assim os testculos. Ao dissecar o animal, importante evitar rompimento da extremidade do abdome (parte externa da genitlia), uma vez que esta estrutura importante no caso da identificao taxonmica da espcie. Separe os testculos (Figura 12b) em soluo de
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Ringer para no secar os rgos durante a disseco. Use placa de Petri pequena (5 cm de dimetro). c) Limpe bastante os testculos. Retire a membrana peritoneal e transfira os rgos para uma pequena placa de Petri, contendo 3 ml de fixador (etanol-cido actico, 3:1). Deixe fixando durante 10 minutos. O material assim fixado pode ser estocado no freezer por um perodo de 2 ou mais anos. 10.1.1 - Preparao de lminas por esmagamento de folculos testiculares de gafanhotos a) Prepare cada lmina colocando 1 ou 2 folculos testiculares sobre uma lmina limpa e seca. Adicione uma gota de cido actico 45%. Fragmente os folculos usando estilete ou pina de ponta fina, para facilitar o espalhamento das clulas sobre a lmina. Coloque uma lamnula sobre o material e deixe por 1 minuto. b) Faa o esmagamento, entre lmina e lamnula envoltas em papel de filtro, pressionando o dedo polegar firmemente sobre o papel. Deve-se ter cuidado ao esmagar para no deslocar a lamnula e estragar o material. c) Retire a lamnula no gelo seco ou nitrognio lquido. Coloque a lmina para secar na estufa a 37 C. Ateno: As lminas assim preparadas podem ser usadas para diferentes tcnicas de identificao cromossmica, tais como bandeamento C, colorao com nitrato de prata e colorao com fluorocromos. Se as lminas se destinarem a anlise convencional, no item 10.1.1 a. o cido actico deve ser substitudo pela orcena lcto actica a 2%. Prosseguindo, coloque uma lamnula sobre o material e deixe corando por 2 minutos. A colorao deve ser acompanhada ao microscpio. Quando os cromossomos j estiverem corados, faa o esmagamento. Lutar a lmina usando esmalte de unha para fixar a lamnula sobre a lmina e impedir o ressecamento do corante. Lminas assim coradas podem ser mantidas em caixa fechada e colocadas no freezer ou congelador da geladeira. Nessa condio, as lminas mantm um bom estado de colorao, durante pelo menos 2 meses. Para fazer uma preparao permanente (no caso de colorao convencional com orcena) proceda a retirada da lamnula, em gelo seco, nitrognio lquido ou mesmo no freezer . Passe a lmina rapidamente no lcool 70%. Em seguida, seque e faa a montagem em blsamo do Canad ou Euparal. Alternativamente, a lmina seca preparada como descrito acima, pode ser corada diretamente com hematoxilina a 1%. Nesse caso, coloque uma gota de hematoxilina na lmina, cubra com uma lamnula e analise ao microscpio. Para tornar a lmina permanente, retire a
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lamnula com um jato de gua, seque a lmina e monte em blsamo do Canad ou Euparal. 10.1.2 - Preparao de lminas por suspenso de clulas testiculares de gafanhotos a) Anestesie o animal usando ter ou clorofrmio, como na tcnica anterior. b) Disseque o animal, separe os testculos usando uma soluo de Ringer em placa de Petri pequena (5 cm de dimetro), para a retirada da membrana peritoneal e limpe os testculos. c) Transfira o material para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 1 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). Use um pequeno basto de vidro para macerar o material at que as clulas sejam liberadas dos folculos. d) Acrescente 3 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize com pipeta Pasteur e deixe por 20 minutos temperatura ambiente. e) Centrifugue a 900 rpm durante 5 minutos e elimine o sobrenadante. f) Ressuspenda o material em 3 ml de fixador (etanol-cido actico, 3:1). Centrifugue e elimine o sobrenadante. Repita esse procedimento mais duas vezes. g) Ressuspenda o material em 0,5 a 1,0 ml de fixador e pingue duas gotas por lmina. O material deve ser pingado na lmina a uma distncia de 30 cm. Isso permite um melhor espalhamento das clulas. h) Seque a lmina em estufa a 37 C. Core com orcena lcto-actica a 2%, por 3 minutos ou com Giemsa a 5%, por 5 minutos. Lave com gua destilada, seque e monte com blsamo do Canad ou Euparal. 10.2 - A meiose em pequenos mamferos (roedores, morcegos e marsupiais) a) Anestesie o animal e faa a retirada dos testculos, colocando-os numa placa de Petri pequena (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de soluo de Hanks. b) Retire a tnica albugnea que envolve os testculos fazendo um corte com o auxlio de uma lmina de bisturi para liberar os tbulos seminferos. c) Transfira o material para outra placa de Petri contendo 3 ml de soluo de Hanks. Corte os tbulos seminferos repetidas vezes para liberar as clulas. Um basto de vidro pode tambm ser usado para macerar o materi-
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al e aumentar a quantidade de clulas ou, ainda, o material pode ser passado em seringa (sem agulha) repetidas vezes. d) Transfira o material para um tubo de centrfuga e adicione 5 ml de soluo de Hanks. Centrifugue a 1200 rpm por 10 minutos. e) Despreze o sobrenadante e adicione 8 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). Deixe em banho-maria a 37 oC por 10 minutos. f) A partir da, prossiga conforme o item 9.3.1.d, da tcnica de preparao cromossmica a partir de medula ssea. Ateno: Tanto testculos de indivduos jovens quanto de adultos, desses mamferos podem fornecer material qualitativa e quantitativamente bons para anlise da meiose. 10.3 - Anlise da freqncia e distribuio de quiasmas em gafanhotos O estgio de diplteno se caracteriza pela aparncia dupla dos cromossomos e pela melhor visualizao dos quiasmas. Embora apaream no diplteno, os quiasmas so formados no final do zigteno ou no paquteno, quando as cromtides esto emparelhadas. Nos bivalentes meiticos os quiasmas podem se localizar em posio proximal (P), intersticial (I) ou distal (D), em relao ao centrmero. Assim, a freqncia mdia de quiasmas por clula e a posio (P, I, D) dos mesmos podem ser determinadas em clulas diplotnicas. Essa anlise pode revelar variao na taxa de recombinao meitica, que pode ser provocada por cromossomos B, heterocromatina supernumerria, etc. Apesar dos quiasmas serem visualizados com a colorao convencional, eles so melhor identificados quando as lminas so preparadas pela tcnica de bandeamento C. Isto decorre do fato de que a heterocromatina constitutiva freqentemente tem uma posio centromrica, servindo como um marcador para delimitar essa regio e facilitar a localizao precisa do quiasma. Para esta anlise, podem ser usados tanto desenhos quanto fotos. Para facilitar a organizao dos seus dados considere os seguintes aspectos: a) Use o espao direita do Quadro 1 para fazer o desenho ou para colar a foto representativa da fase meitica em diplteno. b) Numere, na foto ou no desenho, cada bivalente em ordem decrescente de tamanho, por exemplo, de 1 a 11, mais o cromossomo X univalente (para as espcies com 2n=23,XO), que representa a maioria dos acridodeos. c) Analise 10 clulas usando o modelo do Quadro 1 para cada clula. Os resultados obtidos permitiro calcular a freqncia mdia de quiasmas por clula e por posio no cromossomo.
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QUADRO 1 - Modelo para anlise da freqncia e distribuio de quiasmas. (P) proximal; (I) intersticial; (D) distal Bivalente Quiasmas P 1 2 3 4 X I D Total
Totais
) (
) (
10.4 - Anlise de complexo sinaptonmico em insetos e pequenos mamferos O complexo sinaptonmico (CS) uma estrutura nuclear caracterstica dos bivalentes cromossmicos em estgio de zigteno-paquteno organizando-se e desorganizando-se durante a primeira diviso meitica. Essa estrutura tripartida e formada por dois elementos laterais e um elemento central. Sua composio fundamentalmente protica, e forma um eixo no bivalente, que vai de telmero a telmero, passando pela regio centromrica. A zona compreendida entre o elemento central e os elementos laterais menos densa e est constituda por filamentos finos denominados fibrilas, sendo associados com os ndulos de recombinao. Nos procedimentos a seguir, so mostradas duas diferentes tcnicas usadas para anlise de complexos sinaptonmicos de pequenos mamferos: a tcnica de espalhamento (spreading) e a tcnica de suspenso celular de espermatcitos. Ambas as tcnicas usam colorao com nitrato de prata para visualizar os CS. A diferena principal entre as mesmas que a primeira usa o detergente Lipsol ou similar como soluo hipotnica e paraformaldedo como fixador, enquanto que a segunda tcnica usa citrato de sdio e etanol-cido actico, 3:1, respectivamente, como soluo hipotnica e fixador. As duas tcnicas, por sua vez, permitem analisar o CS identificando-o em toda a sua extenso, individualizando cada bivalente e localizando, por exemplo, centrmeros e RONs. Alm disso, so bastante teis para analisar o comportamento citogentico associado s anomalias cromossmicas estruturais como duplicaes, inverses, translocaes, alm do par XY dentro da vescula sexual, no caso de mamferos.
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10.4.1 - Anlise do complexo sinaptonmico em pequenos mamferos (tcnica de disperso ou spreading) a) Anestesie o animal, retire os testculos e coloque numa pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 3 ml de soluo salina de Hanks. Com auxlio de uma lmina de bisturi, retire a membrana albugnea que envolve os tbulos seminferos. b) Transfira os testculos para outra placa de Petri contendo 1 ml de soluo de Hanks. Corte os tbulos vrias vezes e macere com a ponta de um basto de vidro para liberar as clulas. A suspenso testicular deve ser bastante concentrada. c) Transfira o material para um pequeno tubo de centrfuga. Mantenha o tubo num becker com gelo. d) Numa lmina limpa e seca, coloque 3 gotas do detergente Lipsol (Lip. Ltd. Shipley, England) a 1% e, sobre estas, 1 gota da suspenso de material testicular. Misture e observe ao microscpio em contraste de fase ou abaixe o condensador do microscpio comum, para acompanhar o rompimento dos ncleos. Isto ocorre em 1 ou 2 minutos, em material de morcego ou roedor. e) Adicione 4 gotas de uma soluo de paraformaldedo a 4% ao redor do material em lmina. f) Passe um basto de vidro sobre a suspenso, sem tocar na lmina, como se fosse um rolo, permitindo espalhar a suspenso pela superfcie da lmina. g) Coloque a lmina numa caixa fechada para secar durante 18-24 horas. h) Lave as lminas com gua destilada em jarro de Coplin e seque-as ao ar. i) Hidrolise as lminas em HCl 1N a 60 C durante 20 minutos. Lave com gua destilada e seque as lminas. j) Coloque sobre cada lmina 2 gotas de soluo coloidal de gelatina e 3 gotas de soluo de nitrato de prata a 50%. Com movimentos suaves misture as duas solues sobre a lmina. k) Cubra com lamnula e coloque em cmara mida a 70 C durante 5 minutos. Esse tempo deve ser determinado individualmente, checando a lmina ao microscpio. Lave com gua destilada e seque. l) Monte em blsamo do Canad ou Euparal.
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10.4.2 - Anlise de complexo sinaptonmico de pequenos mamferos (tcnica de suspenso celular) a) Anestesie o animal, retire os testculos e coloque numa placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 10 ml de soluo hipotnica de citrato de sdio a 0,7%. b) Separe os tbulos seminferos com auxlio de uma pina e despreze a tnica albugnea. Macere bastante os tbulos para liberao das clulas e obteno da suspenso celular. c) Coloque a suspenso celular na estufa a 37 C durante 30-40 minutos. d) Aspire lentamente o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e coloque-o em um tubo de centrfuga. e) Centrifugue o sobrenadante aspirado a 1200 rpm durante 7 minutos. Jogue fora o sobrenadante. f) Ressuspenda o material em metanol e cido-actico 3:1 (fixador). Centrifugue e elimine o sobrenadante. Repita essa operao trs vezes. g) Ressuspenda o material em fixador fresco e pingue 2 gotas em lmina limpa e seca. h) Siga o procedimento usado para corar as RONs (item 11.6) em vertebrados, do item a at e. A Figura 18 a-b mostra complexos sinaptonmicos do roedor Thrichomys apereoides. Ateno: Outra maneira de corar as lminas pingando, em cada uma, 4 gotas de uma soluo de nitrato de prata (diludo em gua destilada) a 50% e cobrindo com uma lamnula. Incube na estufa a 70 oC, em cmara mida de 2 a 4 horas. Esse tempo de incubao pode ser reduzido para 45 minutos, colocando-se na soluo de nitrato de prata (2 ml) 1 gota de formol a 3%. 10.4.3 - Anlise de complexo sinaptonmico em gafanhotos (tcnica de disperso ou spreading) a) Anestesie o animal, disseque e limpe os testculos pelo mtodo de rotina usando Ringer, como descrito no item 10.1 a-b. b) Transfira os testculos para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro), contendo cerca de 1,5 ml de Ringer.
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Figura 18 Complexo sinaptonmico no roedor Thrichomys apereoides. (a) zigteno e (b) paquteno. As setas indicam a vescula sexual. Fotos do autor.
c) Separe um folculo testicular, esmague em orcena actica e verifique a qualidade do material. Caso o material esteja rico em paqutenos, separe um dos testculos para anlise normal, fixando-o como de rotina. Use apenas um testculo para a preparao de complexo sinaptonmico. d) Macere bastante o material, em 2 ml de soluo de Ringer, at conseguir uma boa suspenso de clulas. e) Limpe lminas de boa qualidade com lcool 70% e seque-as. f) Coloque na lmina 4 gotas de detergente Lipsol (Lip. Ltd. Shipley, England) a 1% e em seguida 1 gota da suspenso de clulas de testculos. Misture bem e acompanhe ao microscpio para observar o aumento de tamanho dos ncleos. Quando os ncleos comearem a romper, coloque 5 gotas de fixador (4 gramas de paraformaldedo em 100 ml de gua destilada a 70 C, mais 3.4 g de sacarose. Evite os vapores), para interromper a ao do detergente. Depois de adicionar o fixador, mexa a lmina para misturar o material e, em seguida, passe um basto de vidro para fazer um filme sobre a lmina. g) Coloque as lminas numa caixa fechada, para evitar poeira, de 12 a 18 horas. h) Lave as lminas com gua destilada, colocando-as dentro de uma cuba de vidro. Deixe secar ao ar.
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i) Core a lmina com uma soluo de nitrato de prata a 50%. Cubra com lamnula e deixe por 30-50 minutos em estufa a 70 oC. A colorao deve ser acompanhada ao microscpio para controlar o tempo. j) Lave as lminas em jarro de Coplin com gua destilada, seque e analise. A Figura 19 c-d apresenta complexos sinaptonmicos do gafanhoto Xyleus angulatus e do morcego Sturnira lilium, respectivamente. Ateno: Para obter uma melhor colorao pode-se substituir a lamnula do item i por retalho de tecido de nylon, de tamanho idntico lamnula e que contenha poros estreitos. Esta tcnica tambm pode ser utilizada em outros grupos de insetos, por exemplo colepteros, heterpteros, etc.
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Figura 19 Colorao com nitrato de prata em clulas meiticas de gafanhoto e morcego. Em a diplteno com marcao das RONs. Em b metfase I com marcao de cores e cinetcoros. Em c e d complexos sinaptonmicos. Em e espermtides com centrolos adjuntos (CA) marcados. Em a, b, c e e so mostradas clulas do gafanhoto X. angulatus. Em d clula do morcego Sturnira lilium. Setas em a mostram remanescentes nucleolares dos cromossomos com RONs e em d a vescula sexual. Fotos do autor.
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11 - Como corar diferencialmente cromossomos mitticos, meiticos, politnicos e cromatina sexual

A colorao convencional dos cromossomos permite apenas uma identificao grosseira do caritipo, no levando a uma caracterizao mais precisa do mesmo. Tcnicas de identificao cromossmica, como bandeamento G e R, fornecem uma diferenciao longitudinal dos cromossomos, o que permite identificar individualmente os mesmos. Rearranjos estruturais e numricos tambm podem ser identificados usando essas tcnicas. Outras tcnicas como bandeamento C e colorao com nitrato de prata, permitem identificar, respectivamente, regies de heterocromatina constitutiva e regies organizadoras de nuclolos (RONs). O bandeamento C a tcnica mais amplamente utilizada para estudo da heterocromatina constitutiva em animais e plantas, desde o incio da dcada de setenta. Os fluorocromos cromomicina A 3 (CMA3) e 4'-6diamidino-2-fenilindol (DAPI) tambm tm sido utilizados com o objetivo de obter informaes sobre a natureza da heterocromatina constitutiva com respeito sua composio de bases. Esses corantes coram preferencialmente seqncias de DNA ricas em pares de bases GC e AT, respectivamente. Embora o bandeamento G seja o principal mtodo usado para evidenciar as bandas eucromticas em vertebrados, o bandeamento R (bandeamento reverso ao padro de bandas G) ainda bastante utilizado. Existe um nmero de diferentes tcnicas para a produo de bandas R. Essas tcnicas podem ser divididas em duas classes principais: aquelas que usam o Giemsa como corante e as que usam fluorocromos, por exemplo, a acridina orange. Em geral, o bandeamento R tem sido aplicado em material de cultivo de linfcitos ou fibroblastos onde se usa incorporao com 5-BrdU (5-bromodeoxiuridina). O 5-BrdU incorporado s reas cromossmicas que esto replicando, bloqueia o ciclo celular na fase S. A incorporao de 5-BrdU nos cromossomos induz padro de bandeamento que depende do momento da fase S durante o qual esse nucleotdeo anlogo da timina foi incorporado ao DNA. Ento, essas bandas so denominadas bandas de replicao, indicando o padro de replicao cromossmica. J o uso da colorao com nitrato de prata, em geral, possibilita identificar nuclolos e regies organizadoras de nuclolos (RONs) em clulas mitticas de vertebrados. Em cromossomos meiticos, especialmente em gafanhotos, a prata permite detectar, alm de nuclolos (ou remanescente nucleolar) (Figura 19a), outras estruturas de cromossomos, como cinetcoros e core (Figura 19b) e o centrolo adjunto (CA) das espermtides (Figura 19e). Vale destacar que em vrias espcies de insetos, gafanhotos em particular, o nuclolo (remanescente nucleolar) desintegra no incio (paquteno/diplteno) da prfase I da meiose. Tambm, nesses organismos, as RONs dificilmente so detectadas em cromossomos mitticos.
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Para as diferentes tcnicas de colorao especiais apresentadas nesse captulo foram seguidos os procedimentos descritos por Sumner (1990) e Verma e Babu (1995) com algumas modificaes, adaptadas para cada grupo de organismos. 11.1 - Bandeamento C (para vertebrados e invertebrados, especialmente insetos) a) Lminas envelhecidas durante 3 ou 4 dias produzem bons resultados, entretanto, possvel usar lminas recentemente preparadas. Nesse caso, basta que depois de preparadas fiquem na estufa a 40 C, por um perodo de 3 horas. b) Mergulhe a lmina em uma soluo de cido clordrico 0,1N por 30 minutos temperatura ambiente. c) Lave com gua destilada. d) Mergulhe a lmina em soluo de hidrxido de brio 5% a 60 C de 10 segundos a 3 minutos, dependendo da idade da lmina. Lmina mais velha (a partir de 5 dias) requer maior tempo de tratamento com brio. e) Lave em banhos rpidos (2 minutos em cada um) de HCl 0,2N e gua destilada. f) Mergulhe em soluo de 2 x SSC a 60 C por 45 minutos. g) Lave com gua destilada. h) Core com uma soluo de Giemsa a 2% em tampo fosfato pH 6,8 por 10 minutos. Acompanhe ao microscpio. Caso a colorao no fique adequada, submeta a lmina novamente ao corante, por mais 5-10 minutos. i) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte com blsamo do Canad ou Euparal. j) Analise ao microscpio. Observe na (Figura 20 a-b) padres de bandeamento C em clulas do gafanhoto X. angulatus e do roedor Clyomys laticeps laticeps, respectivamente. 11.1.1 - Bandeamento C (colorao com acridina orange) a) Para fazer essa colorao siga o pr-tratamento que foi descrito para o bandeamento C (item 11.1 a-g). b) Core a lmina com uma soluo de acridina orange na concentrao de 0,01%. Coloque sobre a lmina 5 gotas desta soluo e deixe por 1 minuto (esse tempo deve ser testado para cada material).
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Figura 20 Bandeamento C (a, b) em meiose (diplteno) de gafanhoto X. angulatus e mitose (metfase) de roedor Clyomys laticeps laticeps , respectivamente. Em c e d marcaes das RONs coradas com nitrato de prata no roedor Thrichomys apereoides e no marsupial Marmosa sp, respectivamente. Fotos do autor.
c) Lave a lmina com gua destilada e, em seguida, coloque duas gotas de gua destilada e cubra com uma lamnula. d) Analise ao microscpio de fluorescncia e fotografe as melhores fases (mitticas ou meiticas). e) Depois de fotografadas as fases a lamnula, pode ser retirada com uma lavagem rpida com gua destilada e, a seguir, corada com Giemsa. Proceda como foi descrito no item 11.1 h-j. Os mesmos pontos (fases) fotografados aps a colorao com acridina orange podem ser tambm foto-
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grafados aps a colorao com Giemsa e, assim, tm-se as mesmas clulas analisadas com as duas coloraes. A (Figura 21 a-b) apresenta uma mesma metfase I do gafanhoto Phaeoparia megacephala pr-tratada para o bandeamento C e corada com acridina orange e em seguida com Giemsa.
Figura 21 Metfase I de macho do gafanhoto Phaeoparia megacephala mostrando o padro de bandas C corado com acridina orange (a) e em (b) a mesma clula corada com Giemsa. Em c e d padro de bandas G no morcego A.lituratus e em humano, respectivamente. Fotos do autor.
Ateno: Em geral, existe uma correspondncia entre os padres de distribuio da heterocromatina constitutiva (bandas C) quando as lminas so pr-tratadas para o bandeamento C, coradas com acridina orange e a seguir, com Giemsa. Entretanto, uma das vantagens de usar as duas coloraes que, quando os blocos de heterocromatina do complemento so muito pequenos, eles aparecem com maior definio na colorao com acridina orange.
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11.2 - Anlise da heterocromatina constitutiva atravs da colorao com os fluorocromos CMA3/DA/DAPI (trplice colorao). a) Coloque duas gotas da soluo de CMA3 (0,5 mg/ml) sobre a lmina, cubra com lamnula e incube, no escuro e em caixa fechada. Deixe por 40 minutos (esse tempo deve ser ajustado para cada espcie). b) Para retirada de lamnulas e excesso do corante lave as lminas com gua destilada e seque temperatura ambiente. c) Coloque duas gotas da soluo de Distamicina A (0,1 mg/ml) e cubra com lamnula. Deixe corar por 30 minutos (o tempo deve ser ajustado para cada espcie) temperatura ambiente. Manter em caixa fechada. d) Lave com gua destilada e seque. e) Coloque duas gotas da soluo de DAPI (0,5 mg/ml) e cubra com lamnula. Deixe corar por 30 minutos (adequar o tempo para cada espcie) temperatura ambiente. Manter em caixa fechada. f) Lave com gua destilada e seque ao ar. g) Monte a lmina com meio de montagem com glicerol/tampo MacIlvaine/MgCl2. h) Examine em microscpio de fluorescncia e fotografe as melhores fases. A (Figura 22 a-b) apresenta fases da meiose do gafanhoto Schistocerca pallens e a (Figura 23 a-b) mitose do morcego Carollia perspicillata marcadas pela trplice colorao CMA3/DA/DAPI. Ateno: Para cromossomos humanos, de pequenos mamferos e de insetos esses fluorocromos podem ainda ser usados para fazer coloraes duplas, em lminas diferentes, da seguinte maneira: CMA3 + Distamicina A (CMA3/DA) ou DAPI + Distamicina A (DA/DAPI). O DAPI tambm pode ser contracorado com actinomicina D (DAPI/AMD). CMA3 e DAPI podem igualmente, ser usados em lminas prtratadas para o bandeamento C. Nesse caso, em vez de serem coradas com Giemsa, so coradas com esses fluorocromos. Aps serem fotografadas, as lminas so descoradas (colocadas no fixador etanol-cido actico, 3:1 no caso de insetos, e metanol-cido actico 3:1, no caso de vertebrados, durante 18 horas) para a retirada do fluorocromo e, em seguida, coradas com Giemsa. Desta maneira, obtm-se uma colorao seqencial CMA3/DA/DAPI/bandas C na mesma preparao. Em vertebrados, particularmente em mamferos, a colorao com os fluorocromos DAPI e CMA3 (trplice colorao CMA3/DA/DAPI) pode induzir padres de bandeamento da eucromatina. Assim, a colorao
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c
Figura 22 Trplice colorao CMA 3/DA/DAPI em clula meitica do gafanhoto Schistocerca pallens (a, b) e colorao DA/DAPI em metfase mittica humana (c). Notar as regies CMA3 + em a e a marcao dos cromossomos 1,9,16 e Y em c. Fotos do autor.
com DAPI mostra padro de bandas G (bandas de replicao tardia e ricas em AT). Por sua vez, a colorao com CMA3 mostra padro de bandas R (bandas de replicao precoce e ricas em GC). 11.3 - A colorao DA/DAPI em cromossomos humanos a) Use lminas com envelhecimento de 3 a 5 dias b) Coloque 3 gotas da soluo de Distamicina A (DA) (0,5 mg/ml) sobre a lmina. Cubra com lamnula e incube, no escuro e em caixa fechada. Deixe por 15 minutos na temperatura ambiente. c) Lave a lmina em gua destilada e seque temperatura ambiente.
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Figura 23 Trplice colorao CMA3DA/DAPI em metfase mittica do morcego Carollia perspicillata (a, b) e colorao sequencial AgNO3/CMA3 no morcego Artibeus lituratus (c, d). Notar em a os blocos CMA3+ e o padro de bandas R (rico em GC ) e em b o padro de bandas G (rico em AT). Em c est destacada a colorao CMA+ das RONs e em d a marcao das mesmas com nitrato de prata (Fotos: Santos e Souza, 1998a, 1998b).
d) Coloque 3 gotas da soluo de DAPI (0,5 mg/ml) e cubra com lamnula. Core no escuro durante 30 minutos temperatura ambiente. e) Lave com gua destilada e seque temperatura ambiente. f) Faa a montagem da lmina e retire o excesso do meio de montagem. g) Guarde a lmina no escuro em caixa fechada por um perodo de 24 a 72 horas, para estabilizar a colorao, antes de analisar no microscpio de fluorescncia. A (Figura 22c) , mostra a colorao DA/ DAPI em humano.
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Ateno: Cromossomos humanos corados com DA/DAPI mostram fluorescncia brilhante nas regies pericentromricas dos cromossomos 1, 9 e 16. Adicionalmente, a regio proximal do brao curto do 15 e distal do brao longo do Y tambm so marcadas. 11.4 - Colorao seqencial AgNO3/CMA3 a) Coloque sobre a lmina 4 gotas da soluo coloidal de gelatina, juntamente com 4 gotas da soluo de nitrato de prata a 50% e cubra com lamnula. b) Coloque a lmina em cmara mida e, em seguida, no forno temperatura de 70 C por 3 a 5 minutos. c) Lave com gua destilada e monte a lmina usando 2 ou 3 gotas de gua destilada. d) Analise ao microscpio e fotografe as melhores clulas com RONs marcadas. e) Retire a lamnula com um leve jato de gua destilada. f) Descore a lmina usando algumas gotas da soluo de hexacianoferrato de potssio (K3[Fe(NC)6]) a 1% recm-preparado e resfriado a 1 C. Cubra com lamnula e deixe descorar por 20-60 segundos. Retire a lamnula lavando com gua destilada. g) Mergulhe a lmina numa soluo de tiossulfato de sdio pentahidratado a 20%, por 20 segundos. Lave a lmina e deixe secar temperatura ambiente e em repouso por dois dias. h) Faa a colorao CMA3 /DA/DAPI conforme descrito no item 11.2 a-h. i) Analise a lmina ao microscpio de fluorescncia e fotografe as mesmas clulas (metfases, por exemplo) marcadas pelo nitrato de prata e anteriormente fotografadas. A Figura 23 c-d mostra colorao seqencial AgNO3/CMA3 no morcego Artibeus lituratus. Ateno: A colorao seqencial AgNO3/CMA3 pode tambm ser feita iniciando pela colorao com CMA3 conforme o item 11.2 a-h. Depois de fotografar as fases, descore a lmina mergulhando-a em fixador metanol actico, 3:1 por um perodo de 18 horas. A partir da, proceda a colorao com AgNO3 de acordo com o item 11.4 a-d, fotografando as mesmas clulas j fotografadas com a colorao CMA3. Em alguns materiais, com esse procedimento, possvel diminuir o grau de precipitao do nitrato de prata sobre a lmina.
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11.5 - Observao de nuclolos , RONs, cores e cinetcoros de insetos a) Prepare as lminas por esmagamento (item 10.1.1) ou suspenso (item 10.1.2) de folculos testiculares. Para essa colorao, as lminas no precisam envelhecer, mas aps serem preparadas devem ficar por 3 horas na estufa a 40 C. b) Passe as lminas na soluo de 2 x SSC aquecido a 60 C, durante 10 minutos. c) Lave com gua destilada. d) Prepare uma cmara mida (uma placa de Petri forrada com papel de filtro e umedecida com gua destilada). Deve-se colocar alguns bastes de vidro para servir como suporte para as lminas e colocar na estufa at atingir de 70 a 80 C. e) Coloque uma gota da soluo de nitrato de prata sobre cada lmina. Cubra com lamnula e coloque em cmara mida previamente aquecida. f) Aps 2 minutos, acompanhe ao microscpio at o material se apresentar corado. g) Lave a lmina retirando a lamnula. h) Seque, monte em blsamo do Canad ou Euparal. Analise e fotografe as RONs, cores, cinetcoros e centrolos adjuntos (CA). Ateno: A soluo de nitrato de prata AgNO3, nesse caso, deve ser preparada da seguinte maneira: Em 100 ml de gua destilada coloque uma gota de cido frmico. Deve ser atingido o pH 3,0 a 3,5. Dissolva o nitrato de prata na soluo acima, na proporo de 0,5 grama de AgNO3 para 1 ml de gua com cido frmico. Os centrolos adjuntos (CA) corados pelo nitrato de prata podem ser indicadores do nvel de ploidia das espermtides. As espermtides normais (n) tem somente 1 CA e aquelas anormais (2n, 3n, etc) mostram 2 CA, 3 CA, respectivamente. Esse padro tem sido usado para analisar anormalidades relacionadas com baixos nveis de fertilidade em algumas espcies de gafanhotos, portadores de cromossomos B. 11.6 - Anlise das RONs em vertebrados a) Coloque na lmina 4 gotas da soluo coloidal de gelatina, juntamente com 4 gotas da soluo de nitrato de prata (2 g de AgNO3 em 4 ml de
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gua destilada). Misture as duas solues movimentando a lmina delicadamente. Cubra com lamnula. b) Coloque as lminas numa cmara mida, conforme item 11.5 d. c) Coloque em banho-maria a 70 C ou em forno na mesma temperatura, por 3 a 5 minutos. Acompanhe a colorao ao microscpio. d) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte em blsamo do Canad ou Euparal. e) Analise ao microscpio. A Figura 20 c-d mostra colorao AgNO3 no roedor Thrichomys apereoides e no marsupial Marmosa sp, respectivamente. Ateno: Lminas recentemente preparadas geralmente do bons resultados. Nesse caso, depois de preparadas, as lminas devem ficar na estufa a 40 C por pelo menos 2 horas antes do momento da colorao. 11.7 - Bandeamento G e bandeamento R em humano e outros mamferos 11.7.1 - Bandeamento G para humano e outros mamferos a) conveniente usar lminas com envelhecimento de 4 dias a 1 semana. Bons resultados, entretanto, podem ser obtidos com lminas recentemente preparadas. Nesse caso, coloque-as na estufa a 40 C por 24 horas e reduza o tempo de tratamento com tripsina. b) Dissolva 0,25 g de tripsina em 50 ml da soluo de cloreto de sdio a 0,85%. A tripsina tambm pode ser diluda em tampo fosfato pH 6,8 ou em Hanks. c) Faa um filme da soluo de tripsina sobre a lmina e deixe de 10 segundos a 1 minuto dependendo da idade da lmina. Em lminas mais velhas aumente o tempo de tratamento. d) Lave com gua destilada. e) Core com uma soluo de Giemsa a 5%, diluda em tampo fosfato pH 6.8, durante 7 minutos. f) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte em blsamo do Canad ou Euparal. g) Analise ao microscpio e fotografe as melhores clulas. Observe na Figura 19 c-d padres de bandeamento G no morcego Artibeus lituratus e em humano, respectivamente.
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Ateno: Em mamferos, preparaes citolgicas provenientes de diferentes tecidos respondem diferentemente quando tratadas com tripsina. Cromossomos obtidos a partir de fibroblastos, linfcitos e medula ssea reagem com aumento de sensitividade, nessa ordem, podendo, portanto, ser tratados com diferentes tempos de tripsina. 11.7.2 - Bandeamento R por incorporao de 5-Bromodesoxiuridina (5-BrdU) a) Tanto para material a ser obtido por cultivo de fibroblastos como de linfcitos, nas ltimas 6-12 horas, do cultivo celular, adicione 5-BrdU numa concentrao final de 25 mg/ml. Envolva o frasco de cultura com papel de alumnio e deixe-o na estufa a 37 C. b) Aproximadamente 45 minutos antes da colheita do material, adicione 1 gota da soluo de colchicina (0,01%) para cada 5 ml de meio de cultura contido no frasco. Devolva o frasco estufa a 37 C, durante 1 hora. Prepare as lminas de acordo com o que foi descrito anteriormente para o cultivo de fibroblastos (9.2.4. e-i) ou para cultivo de linfcitos (9.1.1 f-i). c) Para iniciar o processo de colorao, mergulhe as lminas na soluo de Hoechst 33258 na concentrao final de 10 mg/ml, em jarro de Coplin envolto com papel de alumnio, por 20 minutos. Lave em gua destilada. d) Passe as lminas rapidamente na soluo de 2 x SSC temperatura ambiente. Coloque 3 gotas de 2 x SSC sobre cada lmina e cubra com lamnula. e) Monte uma cmara mida com 2 x SSC, numa placa de Petri grande (10 cm de dimetro) forrada com papel de filtro. Disponha as lminas sobre bastes de vidro (suporte) e cubra a placa com filme de PVC transparente (Plastic film). Coloque sob luz negra por duas horas. As lminas devem ficar a uma distncia de aproximadamente 30 cm da lmpada. Como luz negra pode ser utilizado a lmpada UVK 125-2 C4 da Phillips ou similar. f) Lave as lminas em gua destilada e deixe por 15 minutos em soluo de 2 x SSC a 60 C. g) Lave as lminas em gua destilada e core com uma soluo de Giemsa a 5%, diludo em tampo fosfato pH 6,8 por 5-8 minutos. h) Lave as lminas em gua destilada, seque e monte com blsamo do Canad ou Euparal. Analise em microscopia de luz visvel. Ateno: O padro de bandas R (bandas reversas ao padro de bandas G)
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tambm pode ser obtido corando a lmina com uma soluo de acridina orange. Inicie com a soluo me de 1mg/ml e dilua na proporo de 2,5 ml desta soluo em 50 ml de tampo fosfato pH 6,8. Core as lminas por 20 minutos. Lave com tampo fosfato pH 6,8. Monte cada lmina colocando 2 gotas de tampo fosfato pH 6,8 e cubra com lamnula. Analise e fotografe usando microscpio de fluorescncia. Usando as tcnicas de bandas R, tanto com a colorao com Giemsa como com acridina orange possvel identificar o cromossomo X de replicao tardia em fmeas de mamferos, diferenciando-o do X de replicao precoce. Uma grande vantagem do uso da tcnica de bandas R que ela cora fortemente regies telomricas de vrios cromossomos do complemento cujas marcaes so negativas pela tcnica de bandas G. 11.8 - Anlise de cromossomos politnicos de drosfila e da cromatina sexual humana 11.8.1 - Coleta de drosfila na natureza As drosfilas so um grupo de insetos (dpteros) bastante usadas para estudos de cromossomos politnicos. Os cromossomos politnicos podem ser vistos principalmente em clulas das glndulas salivares, bem como em clulas de ceco gstrico e tbulos de Malpighi das larvas. Diferentes espcies de drosfila podem ser obtidas usando-se iscas de bananas, contidas em frascos de boca larga, colocadas em diferentes locais (jardins, pomares, etc). As moscas faro a postura nas iscas permitindo, assim, a posterior obteno de larvas. Tambm pode ser usado o prprio meio de cultura. Existem diferentes protocolos para preparao de meio de cultura para drosfila. Um dos aspectos mais importantes em experimentos e manuteno destas culturas o cuidado com o material (frascos, tampas) usado na preparao do meio de cultura, que dever ser limpo e esterilizado. Durante o seu ciclo vital, a drosfila passa pelas fases de ovo, larva, pupa e mago (animal emergido da pupa). A durao do ciclo vital varia de acordo com a temperatura e com a espcie. Na temperatura de 25 C, o ciclo de Drosophila melanogaster ocorre com a seguinte cronologia: ovo-larva (3 dias), larva-pupa (5 dias) e pupa-mago (7 dias). Existem diferentes procedimentos para preparao de meio de cultura, obteno de cromossomos politnicos, e tambm diferentes manejos para esse grupo de dpteros. 11.8.2 - Preparao de lminas para obteno de cromossomos politnicos a) Selecione as larvas maiores. Coloque cada larva em uma lmina limpa e seca, acrescente uma gota de soluo de Ringer. b) Com o auxlio de uma pina, segure a poro posterior do corpo da
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larva (Figura 24a) e, com um estilete, firme a cabea de encontro com a lmina. Um movimento firme dever romper a parte anterior do corpo e expor as glndulas salivares. c) As glndulas salivares devero ser transportadas para uma pequena cuba de vidro, onde sero mergulhadas no fixador (etanol-cido actico 3:1) durante 10 minutos. d) As glndulas devem ser transferidas para uma lmina contendo uma gota de cido actico 45%, por 2 minutos. Retire o excesso de cido actico, usando uma tira de papel de filtro para absoro do mesmo. e) Coloque uma gota de orcena actica a 2% e ponha uma lamnula sobre o material. O tempo de colorao deve ser acompanhado ao microscpio. f) Faa o esmagamento entre lmina e lamnula. As lminas ricas em clulas politnicas devem ser lutadas para evitar a evaporao do corante. Maiores informaes sobre tcnicas bsicas e mais avanadas para Drosophila podero ser obtidas nos trabalhos de Shorrocks (1972) e Sullivan et al.(2000). A Figura 24 a - b apresenta um esquema para disseco de larvas e um conjunto de cromossomos politnicos de Drosophila. 11.8.3 - Localizando a cromatina sexual humana a) Usando uma esptula raspe a face interna da bochecha. Despreze o primeiro raspado e raspe novamente. Faa um esfregao do material sobre uma lmina limpa e seca. b) Mergulhe a lmina no fixador (ter-etanol a 95%, 1:1) por 10 minutos. c) Mergulhe a lmina no etanol 79% e 50%, 2 minutos em cada. d) Coloque duas gotas de orcena actica a 2% sobre a lmina, cubra com lamnula e acompanhe a colorao ao microscpio. e) Quando o material estiver corado faa o esmagamento, colocando a lmina envolta no papel de filtro pressionando com o polegar. f) Analise ao microscpio. Selecione os ncleos mais ntegros e identifique o corpsculo de cromatina sexual. g) A orcena actica pode ser substituda pelo reativo de Schiff. Para isso, as lminas so mergulhadas em um borel contendo o reativo, por um
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b
Figura 24 Em a esquema usado para disseco de larva de Drosophila, visando obteno da glndula salivar. (b) cromossomos politnicos de Drosophila malerkotiliana. gs=glndula salivar; gc=gnglio cerebral; td=tubo digestivo (Foto: Tania T. Rieger/UFPE).
perodo de, pelo menos, 2 horas. A colorao feita no escuro (envolver o borel com papel de alumnio). Essa colorao define o corpsculo de cromatina com mais nitidez. Ateno: A cromatina sexual (corpsculo de Barr) representa um corpsculo heteropicntico positivo observvel em ncleos interfsicos de clulas somticas de fmeas de mamferos e que desaparece na mitose. Esse corpsculo tem relao com o sexo do indivduo em cujas clulas ele aparece. Existe uma relao entre os corpsculos e os cromossomos X: o nmero de corpsculos de Barr observado igual ao nmero de cromossomos X menos um. Portanto, no aparecem nas clulas somticas do homem normal (XY) e nas clulas somticas de mulheres normais (XX), aparece apenas um.
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12 - Como preparar as solues e meios de cultura usados na citogentica animal.

12.1 - Soluo de Ringer (soluo fisiolgica de insetos) - 1000 ml a) Use um bquer de 1500 ml e coloque 500 ml de gua destilada estril. Dissolva 6,5 g de NaCl em seguida 0,25 g de KCl e nessa ordem, 0,20 g de NaHCO3 e 0,30 g de CaCl2. Para dissolver essas substncias use o agitador magntico. b) Complete para 1000 ml de gua destilada e deixe no agitador por mais 5 minutos. Ateno: Dissolva as substncias na ordem descrita acima. Cada substncia s deve ser colocada quando a precedente estiver completamente dissolvida. Manter a soluo na geladeira. 12.2 - Soluo de Hanks (soluo salina balanceada) - 500 ml a) Use um bquer de 1000 ml e coloque 250 ml de gua destilada estril. Dissolva 4,0 g de NaCl, em seguida 0,2 g de KCl e, nessa ordem, 0,024 g de Na2HPO4; 0,5 g de C6H12O6 e 0,17 g de NaHCO3. Dissolva essas substncias usando agitador magntico. b) Por ltimo, coloque 0,5 g de vermelho fenol. c) Complete para 500 ml com gua destilada estril. Agite at completa dissoluo. Mantenha na geladeira. 12.3 - Soluo desinfetante de merfene - 75 ml a) Use um bquer de 250 ml e coloque 25 ml de gua destilada estril. Dissolva 0,025 g de borato de fenilmercrio. Adicione 25 ml de etanol 95%. b) Complete para 75 ml com gua destilada e mantenha na geladeira. 12.4 - Orcena actica a 2% -100 ml a) Use um bquer de 250 ml e coloque 100 ml de cido actico 45% b) Coloque o bquer no agitador magntico e adicione 2,0 g de orcena. Deixe agitando por 10 minutos. c) Filtre e guarde em frasco fechado, na temperatura ambiente. 12.5 - Orcena lcto actica a 1% - 100 ml
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a) Dissolva 1,0 g de orcena em 25 ml de gua destilada estril. Adicione 25 ml de cido actico glacial. Ferva, acrescente 25 ml de cido ltico a 85% e deixe ferver. b) Acrescente 25 ml de gua destilada e ferva novamente por 3 minutos. Deixe esfriar. c) Filtre e conserve na temperatura ambiente. 12.6 - Soluo de fermento - 25 ml a) Dissolva de 2,0 a 3,0 g de fermento Fleischam biolgico seco em 25 ml de gua destilada aquecida (temperatura de 37 C). b) Adicione de 2,0 a 6,0 g de dextrose. Misture com um basto de vidro e deixe em repouso por 5 minutos. c) Para injetar nos animais, use sempre soluo fresca, feita no momento do uso. 12.7 - Soluo coloidal de gelatina - 50 ml a) Dissolva 1,0 g de gelatina p. a. em 50 ml de gua destilada aquecida (temperatura de 30 C). Use agitador magntico. b) Depois de dissolver a gelatina, acrescente 0,5 ml de cido frmico. Mantenha na geladeira por at 3 semanas. 12.8 - Meio de cultura para drosfila gar gua Fub Mel de abelha Fermento biolgico Fleischmann, fresco Soluo de Nipagin a 10% 9g 630 ml 65 g 65 ml 25 g 5 ml
Para preparar o meio, dissolva o gar em 500 ml de gua fria, agite e leve ao fogo. Adicione o mel de abelha mexa e deixe ferver. Em outro recipiente misture o fub e o fermento nos 130 ml de gua restantes. Adicione esse contedo ao recipiente contendo mel e gar e ferva, mexendo, durante 10 a 15 minutos, para que o meio adquira uma boa consistncia. Retire do fogo e deixe esfriar um pouco. Adicione 5 ml da soluo de Nipagin a 10%. Em cada frasco com capacidade para 200 ml distribuir uma camada de meio com cerca de 2 cm de espessura. Tampe os frascos com tampa de gase com recheio de algodo. Antes dos frascos serem usados deve-se colocar uma tira dupla de papel de filtro embebida da soluo de Nipagin a 10%. Esse papel absorver o excesso de umidade do meio e servir como suporte para as moscas e pupas. Para preparar a soluo de Nipagin a 10% dissolva 10 gramas de Nipagin em 100 ml de etanol a 96%.
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12.9 - Meio de cultura para linfcitos - 120 ml a) Prepare o meio RPMI 1640 conforme instruo do fabricante e em condies estreis. Para preparar o meio use vidraria (bquer, pipeta, etc.) estril e realize todo procedimento dentro do fluxo laminar. Em geral, prepara-se 1 litro de meio (soluo estoque). Filtre o meio, usando filtro Millipore ou similar. Esse meio deve ser dividido em alquotas de 100 ml, e guardado no freezer. b) Preparo de meio para uso: em 100 ml de meio estril adicione 20 ml de soro bovino fetal; 1,3 ml de Penicilina (10.000 U/ml); 1,3 ml de Estreptomicina (10 mg/ml) e 1,3 ml de Glutamina-A (29 mg/ml). Ateno: O meio de cultura RPMI 1640 pode ser substitudo por outros meios, como, por exemplo, TC199, McCoy 5 A ou RPMI 1630 (preparar segundo instruo do fabricante); A fitohemaglutinina liofilizada deve ser dissolvida numa quantidade apropriada de gua destilada estril (conforme sugesto do fabricante). A soluo de uso pode ser estocada no freezer por algumas semanas. A forma liofilizada pode ser estocada numa temperatura de 2 a 5 C por vrios meses; Cada frasco de cultivo deve conter 10 ml de meio completo. A fitohemaglutinina (0,2 ml/10 ml do meio), entretanto, deve ser adicionada no momento de iniciar o cultivo de linfcitos; Todo preparo do meio completo ou de seus componentes particulares deve ser realizado em condies estreis e dentro do fluxo laminar. 12.10 - Meio de cultura para fibroblastos - 120 ml a) Prepare o meio de cultura Dulbeccos, conforme instruo do fabricante, e em condies estreis. Em geral, prepara-se 1 litro (soluo estoque) de meio. Esse meio deve ser filtrado, dividido em alquotas de 100 ml e mantido no freezer. Para preparar o meio completo para uso, descongele cada alquota de 100 ml. b) Em 100 ml de meio (estril/filtrado) adicione 20 ml de soro bovino fetal; 0,6 ml de Neomicina (50 mg/ml); 0,0012 mg de Fungizon (=Anfotericina A - 0,01 mg/ml) e 0,5 ml de Gentamicina A (4 mg/ml). Ateno: Para preparar a Neomicina, pese 0,5 mg da substncia e dissolva em 10 ml da soluo de Hanks estril (concentrao final 50 mg/ml); coloque 0,6 ml dessa soluo em 120 ml de meio completo. Para usar a Fungizon, pese 0,0012 mg desta substncia, coloque em 100 ml de meio e filtre antes de colocar o soro bovino fetal.
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Referncias bibliogrficas
Literatura citada Albani, S.M. e Jones, G.H. (1984). Synaptonemal complex-associated centromeres and meiocytes prepared by an improved surface-spreading technique. Exp. Cell Res. 155: 588-592. Deumling, B. e Greilhuber, J. (1982). Characterization of heterochromatin in different species of the Scilla siberica group (Liliaceae) by in situ hybridization of satellite DNAs and fluorochrome banding. Chromosoma 84: 535-555. Eicher, E. (1966). An improved air-drying techique for recovery of all stages of meiosis in the mammalian testis. Mammal. Chrom. Newsl. 20:74. Ford, C.E. e Hamerton, J.L. (1956). A colchicine hypotonic citrate squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technol. 3:247-251. Forni-Martins, E. e Guerra, M. (1999). Longitudinal differentiation in chromosomes of Sesbania Scop. (Fabaceae) species. Caryologia 52: 97-103. Freshney, R.I. (1986). Animal Cell Culture - A Practical Approach. Oxford, Washington. 247 pp Fujii, M. e Guerra, M. (1998). Improved haematoxylin staining to algae cytogenetics. Biotech. and Histochem. 73: 132-136. Garcia, A. (1990). Manual de Tcnicas Citogenticas . Colgio de Psgraduados, Chapingo, Mxico, 196 pp. Greilhuber, J. (1988). Self-tanning - a new and important source of stoichiometric error in cytophotometric determination of nuclear DNA content in plants. Plant Syst. Evol. 158: 97-96. Greilhuber, J. e Ebert, I. (1994). Genome size variation in Pisum sativum. Genome 37: 646-655. Guerra, M. (1983). High amount of heterochromatin in a tropical tree species: Genipa americana L. (Rubiaceae).Cytologia 58: 427-432. Guerra, M. (1988a). Characterization of different types of condensed chromatin in Costus (Zingiberaceae). Plant Syst. Evol. 158 : 107-115. Guerra, M. (1988b). Mitotic and meiotic analysis of a pericentric inversion associated with a duplication in Eleutherine bulbosa (Iridaceae). Chromosoma 97: 80-87. Guerra, M. (1991). Cis-acting regulation of NOR cistrons in Eleutherine bulbosa (Iridaceae). Genetica 83: 235-241. Guerra, M. (1999). Hematoxylin: a simple, multiple-use dye for chromosome analysis. Genet. Mol. Biol. 22: 77-80. Guerra, M. e Nogueira, M.T.M. (1990). The cytotaxonomy of Emilia (Asteraceae: Senecioneae) species occurring in Brazil. Plant Syst. Evol. 170: 229-236. Melo, M. L. S. e Vidal, B. de C. (1978). A reao de Feulgen. Ci. e Cult. 30: 665-676. Moorhead, P. S., Nowell, P.C., Mellinan, W. J., Battips, D.M e Hungerford, D.A (1960). Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res. 20: 613-616.
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Apresenta o protocolo para hibridizao in situ em vegetais, utilizado pelos autores em numerosos trabalhos, alm de alguns outros procedimentos complementares. Cada etapa do protocolo precedida de uma introduo clara e objetiva sobre a teoria relacionada quela etapa. O captulo final discute os principais tipos de falhas tcnicas e indica sugestes de como corrigi-las. Schwarzacher, T. e Heslop-Harrison, P. (2000). Pratical In Situ Hybridization. Springer-Verlag, New York, 203 pp. Trata-se de um manual prtico, com um roteiro semelhante ao de Leitch et al. (1994), dividindo o procedimento em suas vrias etapas, com uma pequena introduo terica para cada. Ao final, os autores discutem as falhas mais comuns da tcnica e sugerem alternativas para solucion-las, indicam uma relao dos principais fornecedores de reagentes e equipamentos e uma extensa lista de referncias bibliogrficas. Escrito em uma linguagem simples, apresenta ainda bons esquemas e diversas fotos estimulantes. Sullivan, W., Ashburner, M e Hawley, R. S. (2000). Drosophila Protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 728 pp. O livro apresenta diferentes protocolos relativos a estudos de biologia clssica e molecular em Drosophila. Os diferentes captulos incluem uma introduo terica, alm de excelentes ilustraes, figuras e tabelas. Sharma, A.K. e Sharma, A. (1999). Plant Chromosomes - Analysis, Manipulation and Engineering . Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 371 pp. Uma reviso extensa sobre praticamente todas as principais tcnicas tradicionais e modernas em citogentica vegetal. O texto inclui alm das tcnicas tradicionais da citogentica, diversos protocolos sobre manipulao de cromossomos e clulas, microscopia eletrnica e confocal, mapeamento e seqenciamento de fragmentos de DNA, cultura de clulas, transformao gnica, etc. Os mesmos autores publicaram alguns outros livros anteriores mais extensos sobre tcnicas em citogentica vegetal, as mais importantes das quais foram includas neste volume. Sumner, A.T. (1990). Chromosome Banding. London, Unwin Hyman, 434 pp. Um excelente livro, contendo um conjunto de tcnicas usuais de identificao cromossmica e de regies especficas, alm de um contedo terico para cada tcnica em particular. Muitas das diferentes tcnicas apresentadas podem ser utilizadas em diferentes grupos de organismos, desde invertebrados at vertebrados. Uma extensa reviso bibliogrfica tambm consta do contedo do livro. Verma, R.A e Babu, A. (1995). Human Chromosomes: Principles and Techniques. Sec. Edition, McGraw-Hill, Inc. 419 pp. Este livro apresenta uma relao de tcnicas clssicas e principalmente avanadas para o estudo de cromossomos humanos. Estas tcnicas abrangem desde procedimentos para obteno de preparaes citolgicas de cromossomos humanos, at os diferentes protocolos para identificao cromossmica.
131
Este livro foi impresso pela Paym Grfica e Editora Ltda. para FUNPEC-Editora em Outubro de 2002. A fonte utilizada no texto foi Benguiat no corpo 10/12 e o papel do miolo Alta Print 90 g/m2 fornecido pela Cia. Suzano de Papel e Celulose.

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2002, Impresso no Brasil

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