Medios de cultivo

Leche tornasolada Indicador de pH: Tornasol cido: Color rojo (pH = 4.5) Alcalino: Color azul (pH = 8.3) Medio no inoculado: Azul purpreo (pH = 6.8) Fundamento Permite diferenciar organismos sobre la base de sus mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo como: fermentacin de lactosa, caselisis, y coagulacin de la casena. El tornasol incorporado a la leche es un indicador de pH y de oxidacin-reduccin que hace que el medio pueda indicar diversas funciones metablicas. La leche contiene lactosa, casena, lactalbmina y lactoglobulina, por lo tanto, un organismo puede mostrar una o varias propiedades metablicas en la leche tornasolada ayudando as a la identificacin bacteriana: 1. Fermentacin de lactosa Cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa, produce principalmente cido lctico, con una condicin cida indicada por el cambio de color del medio que se vuelve rojo rosado. A veces el cido butrico es el producto final. Ciertas bacterias que forman lcalis no fermentan lactosa, pero actan sobre las sustancias nitrogenadas que se encuentran en la leche liberando amoniaco, y dando en consecuencia un pH alcalino que se manifiesta por un color prpura azulado. Lactosa glucosa + galactosa cido lctico cido butrico CO2 + H2

Glucosa

cido pirvico

2. Reduccin del tornasol El tornasol es un indicador de pH y un indicador de oxidacin reduccin; algunos organismos son capaces de reducir el tornasol a una leucobase. 3. Formacin de cogulo Las enzimas proteolticas provocan la hidrlisis de las protenas de la leche lo que da como resultado su coagulacin. La principal enzima responsable de la formacin de cogulo es la renina. La formacin del cogulo es causada por la precipitacin de la casena, por la formacin de cidos o por la conversin de la casena en paracasena por la enzima renina. La casena es una fosfoprotena compleja y es la protena ms importante de la leche. Formacin de un cogulo cido La precipitacin de la casena provocada por los cidos orgnicos a partir de lactosa en condiciones cidas produce un cogulo firme y gelatinoso que no se separa de las paredes del tubo. Lactosa cido lctico Caseinasa c. Lctico + casenato de Ca

caseingeno (pp)

Formacin del cogulo Otra forma de cogulo es el cuajo, o sea el proceso de cuajado de la leche por la conversin de la casena en paracasena por las enzimas renina, pepsina o quimiotripsina contenidas en la leche. La renina provoca el cuajado de la leche convirtiendo la sal de casena soluble en una paracasena insoluble que es el cuajo o requesn. Renina Casena Ca2+

paracasena (pp.)

4. Peptonizacin (digestin) La hidrlisis de la casena por la actividad enzimtica produce una conversin final del precipitado caseingeno en un lquido claro; el proceso se denomina peptonizacin y se manifiesta por una aclaracin acuosa del medio causado por una digestin del precipitado (cogulo) y las protenas de la leche por las enzimas proteolticas de las bacterias. Sin embargo, solo se produce una peptonizacin cuando la bacteria que se desarrolla en la leche tornasolada contiene la enzima proteoltica caseinasa. 5. Formacin de gas Los gases CO2 y H2 se forman como resultado final de la fermentacin de la lactosa. Caldo Bsico Rojo de Fenol (Durham) Indicador de pH: Rojo de fenol cido: Color amarillo (pH = 6.8) Alcalino: Color rojo (pH = 8.4) Medio no inoculado: Rojo (pH = 7.4) Fundamento La fermentacin es un proceso metablico de oxido-reduccin que ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxgeno, un sustrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriolgicos, este proceso se detecta observando cambios de color en indicadores de pH a medida que se forman productos cidos. Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos. Utilizando un indicador de pH con un determinado hidrato de carbono puede determinarse si una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, observando un cambio de color visible en el medio. Citrato de Simmons Indicador de pH: Azul de bromotimol (pH= 6) Alcalino: color azul de Prusia intenso (pH = 7.6) Medio no inoculado: Color verde (pH = 6.9) Fundamento Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimtico sin la intervencin de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o citrato desmolasa.

Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio: pH bsico:

pH cido:

Reduccin del azul de metileno en leche Azul de metileno Incoloro: Estado reducido Azul: Estado oxidado; medio no inoculado (pH=6.4) Fundamento Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir el azul de metileno en un medio con leche. El sistema citocromo oxidasa activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular que a su vez acta como un aceptor de electrones en el periodo terminal del sistema de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones aerbicas el oxgeno es el aceptor final del hidrgeno, produciendo agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico. Los sustratos artificiales como el azul de metileno, pueden sustituir a los aceptores de electrones naturales en cualquier lugar de la cadena de transporte de electrones, donde actan como reductores del sistema citocromo. Cuando se agrega el colorante sinttico reducible, azul de metileno a un medio que contenga organismos metabolizantes, los electrones producidos por un sustrato oxidable son desplazados de su ciclo normal, si se produce reductasa y son utilizados para reducir el colorante.

Azul de metileno oxidado (azul) Voges Proskauer

Azul de metileno reducido (incoloro)

Fundamento Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetona a partir de la fermentacin de glucosa. La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. sta es metabolizada en cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona (precursor de la produccin de 2,3-butanediol) que es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La formacin de acetona y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de metilo. Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP positivas y RM negativas, y viceversa. El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el catalizador alfa-naftol porque ste acta como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin prdida de su especificidad. El segundo reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP contribuye a la absorcin de CO2. No debe excederse de un volumen exacto. El KOH reaccionar con la peptona dando un color rosado salmn y con el agregado posterior de alfa naftol no habr alteracin del color.

Rojo de Metilo Indicador: rojo de metilo pH inicial = 6.9, medio no inoculado, color rojo. cido: rojo (pH = 4.4) Alcalino: amarillo (pH = 6) Fundamento Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias que principalmente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos a menudo producen suficiente cido para mantener un pH menor de 4.4. La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentracin de iones hidrgeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos estables manteniendo una alta concentracin de iones hidrgeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces cesa toda actividad. Los organismos RM negativo tambin producen cidos pero tienen una menor concentracin de iones hidrgeno porque hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en carbonatos. La validez de la prueba de RM depende de un tiempo de incubacin suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa. Los organismos en estudio se incubarn por lo menos 2 das, lo que permite que todos los organismos con baja proporcin gaseosa muestren su lmite en la concentracin de iones hidrgeno. Reduccin de nitratos Fundamento Determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrgeno libre. La reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales un organismo obtiene su oxgeno del nitrato. El oxgeno sirve como un aceptor de hidrgeno. Reduccin del nitrato en nitrito NO3 + 2 e- + 2 H+ NO2 + H2O

Nitrato en nitrgeno molecular 2 NO3 + 10 e- + 12 H+

N2 + 6 H2O

La reduccin de nitrato en nitrito est indicada por la aparicin de color cuando el nitrito reacciona con los dos reactivos. La reaccin de color resultante se debe a la formacin de un compuesto diazoico, p-sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina.

Prueba de Sulfuro Indol Movilidad (SIM) Fundamento Determinar si un organismo es mvil o inmvil, si es capaz de liberar cido sulfhdrico por accin enzimtica de los aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin visible de color negro y por ltimo la capacidad de desdoblar el indol de la molcula triptfano, adems que la consistencia del medio permite la observacin de la movilidad de algunas bacterias.

1. Prueba de cido sulfhdrico La protelisis de las protenas en aminocidos (aa.) individuales, algunas especies bacterianas son capaces de liberar azufre enzimticamente de los diferentes aa. que las contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico (H2S). La peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o aa. Que contienen azufre para producir H2S. La enzima responsable de sta actividad es la cisteinasa. Primera etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidacin de los sustratos orgnicos. El Tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una fuente de azufre para el organismo. Segunda etapa: El gas incoloro H2S reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso.

2. Prueba de la produccin de indol El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolactico. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin del indol. El principal intermediario en la degradacin del triptfano es el cido indolpirvico. La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran produccin de energa. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica. La prueba de indol se bas en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de pdimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs). La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentacin de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la glucosa la inhibe.

Agar Lisina Hierro (LIA) Indicador de pH: Prpura de bromocresol cido: color amarillo (pH = 5.2) Alcalino: color prpura (pH = 6.8) Medio no inoculado: color prpura intenso brillante (pH = 6.0) Fundamento Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo dando una amina o una di-amina y anhdrido carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el fosfato de piridoxal.

El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar cadaverina y CO 2 por accin de la enzima especfica lisinadescarboxilasa. Descarboxilacin

Descarboxilacin de lisina

Caldo Triptona Fundamento La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran produccin de energa. El NH 3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica. La prueba de indol se bas en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de pdimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs).

Agar Kligler Indicador de pH: Rojo de fenol

cido: Color amarillo (pH = 6.8) Alcalino: Color rojo (pH = 8.4) Medio no inoculado: Rojo (pH = 7.4)

Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy til, ya que demuestra varias caractersticas enzimticas de la bacteria. Est compuesto principalmente por dos azcares en distinta proporcin (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %), tiosulfato sdico, citrato frrico y rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, la siembra en este medio de cultivo se realizar tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de este (anaerobiosis). 1. Fermentacin de glucosa La utilizacin de la glucosa por va fermentativa da como producto cido piruvico, el cual disminuye el pH del medio, y dado que la fermentacin es un proceso anaerbico, el vire en el color del indicador se observara en el fondo del tubo, el cual ser de rojo a amarillo, dando as una prueba positiva para la fermentacin de glucosa. Puede existir una fermentacin de la glucosa pero sin observar un color amarillo en el tubo, en lugar de este se observa una coloracin entre rojo y violeta, esto sucede cuando el cultivo es incubado por un lapso prolongado de tiempo, ya que al terminar de fermentar la glucosa el microorganismo empezara a utilizar las peptonas del medio provocando una descarboxilacin oxidativa en las mismas con la liberacin de aminas que elevaran el pH del medio provocando un nuevo vire en el color del indicador, y dado que este proceso se lleva a cabo en medio acido se infiere que la fermentacin de la glucosa es positiva.

2.

Fermentacin de la lactosa

La utilizacin de la lactosa en el medio quedara de manifiesto con el vire del indicador a amarillo debido a la acidificacin del medio, provocada por la liberacin de acido lctico como producto de la fermentacin de la lactosa.

3. Produccin de H2S La liberacin al medio de azufre se da por la ruptura del enlace di sulfuro de los aminocidos presentes en el medio tales como la cistena o metionina, o bien por el sulfato ferroso que se encuentra dentro de la composicin del medio produciendo H2S, un gas incoloro que al combinarse con sales pesadas, citrato de amonio, forma un precipitado color negro insoluble. Catalasa Fundamento Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo.

Oxidasa Fundamento Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La prueba se basa en comprobar la existencia de protenas citocromo c que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones propias del metabolismo respirador, en donde el oxigeno molecular acta como el aceptor final de electrones produciendo agua o perxido de hidrogeno, segn la especie bacteriana. La presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamina de oxidarse al ceder electrones al citocromo c, apareciendo una coloracin azul (forma oxidada). Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica.