Identificacin de especies del gnero Tuber La trufa (gnero Tuber) es un hongo ascomicete de la familia Tuberaceae.

Presenta una relacin simbitica micorrcica con rboles, como los castaos, nogales y especialmente los del gnero Quercus como las encinas o los robles. Las trufas han formado parte del la gastronoma y del folklore a lo largo de la historia, pues ha sido recolectada durante incontables generaciones. Los modernos gastrnomos aprecian las trufas por su aroma y sabor trreos. Estn dispuestos a pagar precios exorbitantes por ellas en el mercado (hace poco, la variedad blanca italiana, Tuber magnantum del Piamonte italiano, super los 2200 /kilo). Pero a pesar del constante inters del hombre por las trufas, muchas de sus caractersticas biolgicas han constituido durante tiempo un misterio. Sin embargo, en las dos ltimas dcadas, los anlisis genticos y las observaciones de campo han esclarecido los orgenes y las funciones de esos organismos. Han revelado que desempean funciones crticas en numerosos ecosistemas. Los hallazgos se utilizan para elaborar estrategias de conservacin de algunas especies amenazadas que dependen de esos habitantes del suelo. Las trufas suponen por tanto una importante fuente de ingresos econmicos a la vez que hacen de motor del desarrollo en ciertos medios rurales (ms del treinta por ciento de la produccin nacional de trufa negra (T. melanosporum) procede de Soria y el cinco por ciento de la que se consume en el mundo procede de los montes sorianos). Y como sucede con todo bien escaso, surgen negocios fraudulentos en los que se mezclen ejemplares de alto valor junto con otras variedades de menor calidad gastronmica y precio durante el proceso de comercializacin. Variedades de trufa Precisamente, para evitar errores y detectar fraudes, se han desarrollado numerosos test de identificacin gentica para cada tipo de trufa en el laboratorio mediante la la amplificacin de su ADN y subsiguiente anlisis comparativo con un patrn previamente conocido. Las trufas que fueron analizadas son: Tuber melanosporum: conocida comnmente como trufa negra o de Prigord y es la ms apreciada en Espaa y Francia. Su color es negruzco o gris con tonos violceos. Tiene forma irregular y se parece a un trozo de carbn. La piel es muy fina y est recubierta de verrugas. Su cuerpo es carnoso y compacto, ms blanquecino cerca de la piel y griscea hacia el centro hasta convertirse en un color marrn violceo. Presenta un olor intenso y picante y un sabor agradable, aunque ligeramente amargo. Tuber mesentericum: de ascoma redondeado o irregular, con una amplia cavidad basal. Fuertemente verrucoso, aunque con verrugas ms pequeas que las de T. aestivum. Tamao de 2-3 cm. Cubierta de color negro, con verrugas menos prominentes que las de T. aestivum y T. uncinatum. Interior color marrrn oscuro, ms oscuro que la gleba de T. aestivum. Venas blancas meandriformes y dispuestas radialmente. Tiene un olor muy intenso a fenol, alquitrn o yodo en el momento de la recoleccin pero vara mucho de unas colecciones a otras. Este olor se atena cuando la trufa es sacada de la tierra y se airea, pudiendo llegar a parecerse al de la T. melanosporum. T. mesentericum es una especie muy parecida a T. aestivum y ha sido sinonimizada o considerada una variedad de T. aestivum, pero los anlisis moleculares concluyen que son dos especies diferentes. Tuber aestivum: o trufa de verano. Como indica su denominacin, tiene su poca de crecimiento desde verano hasta principios de otoo. Este hongo tiene forma redondeada con irregularidades. Est recubierta en su totalidad de verrugas angulosas que las diferencia de las dems. Su color es marrn negruzco y su carne compacta. El olor es intenso y aromtico y presenta un sabor peculiar que recuerda a las nueces. La trufa estival se considera de buena calidad y es tambin apta para los mismos usos que las anteriores, pero con la diferencia de que sta se vende fuera de temporada, en

la prctica durante todo el ao, ya sea confitada con algn licor o en su propio jugo de conservacin. Como se puede imaginar, su precio es bastante ms asequible. Tuber malenconii: superficie frgil, color marrn oscuro a negro. Verrugas pequeas, irregularmente poligonales, bastante aplanadas y muy juntas. Interior inicialmente blanquecino y posteriormente gris, oscurecindose segn madura. De consistencia no muy dura, tiene un olor intenso y desagradable. No tiene inters culinario. Comparte hbitat con T. melanosporum. Tuber uncinatum: ascoma fuertemente verrucoso, un poco ms pequeas que las de T. aestivum. Peridio de color marrn a negro, gleba de color marrn oscuro, ms que la de T. aestivum. Consistencia firme y carnosa y olor ms fuerte que el de T. aestivum, de hecho es ms apreciado que este. Tuber indicum: ascoma redondeado, bastante regular, a veces lobulado. Marrn chocolate y verrucoso. Gleba de color blanco cuando es inmadura. Negra a negro-prpura cuando termina de madurar. Venas blancas consistencia algo elstica. Olor y sabor escaso. Textura gomosa. Comestible poco apreciada en su pas de origen (China), se exporta en grandes cantidades a los mercados europeos por su bajo precio y su parecido a la T. melanosporum, aunque carece de su aroma, sabor y textura, que es algo acorchada. Hay una gran confusin taxonmica con las trufas chinas. Los estudios moleculares sugieren que T. indicum, T. sinense y T. pseudohimalayense son la misma especie. T. himalayense sera una trufa distinta, ms escasa y de mejor calidad. Tuber rufum: ascoma globoso, regular o irregular. Superficie finamente verrucosa. Color marrn rojizo. Consistencia dura, coricea. Olor: intenso, ahumado, a veces aliceo. Detectable fcilmente por los perros truferos, el escarabajo de la trufa (Leiodes cinnamomea) y las moscas de la trufa (Suillia spp.) y sabor dbil. Habita los mismos suelos que T. melanosporum y T. aestivum. Tuber magnatum: Son las conocidas como trufas blancas de Italia, zona donde ms abundan, y alcanzan los precios ms elevados en el mercado, entre 4000 y 6000 /kilo, principalmente la primera. Su peso es variable, de unos 40 hasta unos 300g. Tienen formas irregulares, una piel fina y ligeramente aterciopelada, de color ocre plido, blancuzco o amarillento en el interior, y un olor intenso, muy pronunciado. Su poca de crecimiento es muy corta, y depende mucho del clima, entre el final de verano y la entrada del invierno. Tuber brumale: Es llamada comnmente trufa negra. Como su nombre comn indica, es de color negro, muy similar a T. melanosporum pero de inferior calidad y cotizacin. En los bosques espaoles se recolecta junto a la trufa negra. Caracterizacin molecular del gnero Tuber Para poder establecer un protocolo adecuado para determinar especies del gnero Tuber, el procedimiento a seguir fue estudiar las secuencias ITS (espaciadores de transcripcin interna) especficas de RNAr. Las regiones ITS son las regiones del RNA que ms se han secuenciado en los hongos. Han sido por lo general muy tiles para la sistemtica molecular a nivel de especie, e incluso dentro de las especies (por ejemplo, para identificar razas geogrficas). Debido a su mayor grado de variacin que en otras regiones gnicas de DNA recombinante (SSU, subunidad pequea y LSU, subunidad grande), a veces se podrn observar variaciones entre cada RNAr tanto entre secuencias ITS como con las regiones IGS (espaciadores intergnicos). Adems de los primers ITS1 + ITS4 comnmente usados

en la mayora de laboratorios, se han descrito otros primers especficos de taxn que permiten la amplificacin selectiva de secuencias de hongos, por ejemplo ITS1-F e ITS4-B para basidiomicetes.

La tcnica usada para diferenciar especies fue la PCR-RFLP. Se trata de una tcnica que explota las variaciones en las secuencias de DNA homlogas. Se refiere a una diferencia entre las muestras de molculas de ADN homlogas que vienen de diferentes lugares de los sitios de enzima de restriccin. En el anlisis de RFLP, la muestra de DNA se rompe en pedazos (digeridos) por las enzimas de restriccin y los fragmentos de restriccin resultantes son separados de acuerdo a su longitud mediante electroforesis en gel. Aunque en la actualidad no es muy usado debido al aumento de tecnologas de secuenciacin de ADN a bajo coste, el anlisis de RFLP fue la primera tcnica de caracterizacin de ADN lo suficientemente barata como para observar una amplia aplicacin. Adems de las huellas genticas, RFLP es una herramienta importante en la cartografa del genoma, en la localizacin de genes de trastornos genticos, en determinacin de riesgo de enfermedades y en pruebas de paternidad. Protocolo de identificacin Por tanto, el primer paso consisti en la extraccin del DNA de las muestras. Una vez extrado se procedi a la medida de la concentracin y la pureza por medio de tcnicas espectrofotomtricas (NanoDrop). Una vez est el DNA extrado y se han seleccionado los cebadores adecuados, se pone en marcha una PCR que contendr los reactivos necesarios tras haber hecho ensayos previos a distintas concentraciones y variando a su vez la presencia o ausencia de los mismos. En concreto, se llevaron a cabo ensayos de variacin de concentraciones con DMSO y el catin divalente, en este caso Mg2+. El DMSO se utiliza en PCR para inhibir estructuras secundarias en el DNA molde o los cebadores de DNA. Se aade a la Master Mix de PCR antes de comenzar la reaccin, donde interfiere con el fenmeno de auto-complementariedad del DNA, lo que minimiza las reacciones de interferencia. Por otro lado, el Mg2+ (aadido a las reacciones en forma de MgCl2) acta como cofactor enzimtico de la DNA polimerasa, luego es esencial para el correcto funcionamiento de la enzima. Sin embargo, concentraciones por enzima de la ptima pueden ser contraproducentes, pues puede disminuir la astringencia. Una vez determinamos el mejor protocolo a seguir segn nuestras necesidades, pusimos en marcha la PRC. El producto de la reaccin (las regiones ITS amplificadas) fueron entonces digeridas por tres enzimas de restriccin, que cortan en sitios especficos de acuerdo a pequeas secuencias concretas. Los polimorfismos, por tanto, se detectarn en el momento en el que la longitud de los fragmentos generados vare entre individuos. Para localizar los polimorfismos y as identificar especies distintas segn el patrn de digestin obtenido, se somete el producto de la digestin a un gel de agarosa para estimar la longitud de los fragmentos generados. Para comprobar los resultados obtenidos por medio del gel, utilizamos un

bioanalizador. El bioanalizador es una plataforma basada en la tecnologa de microfluidos diseada para la determinacin del tamao, la cuantificacin y el control de calidad de DNA, RNA y protenas en un nico instrumento, mediante electroforesis en pequeos chips. Los resultados se obtienen en un corto espacio de tiempo de forma automatizada, directamente en formato digital. Ofrece una mejor precisin y reproducibilidad de los datos, tiempos de anlisis reducidos, un mnimo consumo de muestra o una mejor automatizacin e integracin de flujos de trabajo complejos. Una vez comprobamos que las bandas obtenidas en el gel de agarosa coinciden con las obtenidas por medio del bioanalizador, seremos capaces de identificar un espcimen del gnero Tuber sometiendo su DNA al mismo proceso antes mencionado, comparando su patrn de bandas con la base de datos elaborada con todas las especies anteriores y seleccionando por similitud la ms parecida a la especie problema.