You are on page 1of 51

1

EVALUACION.

1. TRABAJO DE LABORATORIO.

50

Material para trabajar. (bata, gafas, guantes, cinta adhesiva, marcadores) Trabajo en equipo Prerequisitos Discusin en equipo Conclusiones en equipo Limpieza de are de trabajo 20 30 % %

2. PRUEBA ESCRITA 3. BITACORA

PRCTICA No. 1 EXPLICACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO OBJETIVO Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentacin aplicable a tcnicas de experimentacin en el rea bioqumica. PRERREQUISITOS 1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas. 2.- Definicin de cido, base y amortiguador. 3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro. 4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v INTRODUCCION Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen tcnicas bsicas de experimentacin tales como: - Tcnicas de medicin de lquidos. - Tcnicas de pesado de slidos. - Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos. Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan algunos datos sobre cada una de estas tcnicas. Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son: pipetas, probetas y matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de hasta 25 ml. En este rango de volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiabilidad. Hay dos tipos generales de pipetas: las serolgicas y las volumtricas. La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en diferentes medidas, por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de mililitro y por lo tanto sirve para la medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0, 2.0, 5.0 y 10.0 ml. Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para medir un solo volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para medir este volumen. Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est midiendo quede una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe dejarse contenida en la pipeta porque de otra manera se introducir un error en la medicin. La manera de reconocer este tipo de pipetas es por las letras TD ( To Deliver ) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras pipetas estn diseadas para liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta, este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC ( To Contain ), en este caso, si no se libera el total del lquido medido se incurre en un error de medicin. Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es controlado por una llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las buretas deben llenarse por arriba de la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco se ajuste a cero. Dentro de los usos 3

indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para medicin de volmenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc. Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta de 50 ml. se pueden medir volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se denotan por marcas que se encuentran entre una graduacin y otra. las probetas ms frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para medir volumen en una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un lquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta est hecho para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduacin. Si se mide el volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un error. Los matraces volumtricos, tambin llamados de adoracin, sirven para medir volmenes exactos y son usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares. Los matraces ms frecuentemente usados son de 50, 100, 500 y 1000 ml. El uso de estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las probetas. Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn expuestos a cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drsticamente la exactitud de la medicin. El diseo de este material de cristalera est hecho para medir volmenes a una temperatura promedio de 25C. Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas en la medicin de reactivos qumicos de textura slida. La granataria tiene una exactitud de aproximadamente una dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades mayores de un gramo y cuando la precisin no sea menor de 0.1 g. La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de 0.1 g. Es uno de los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de miligramo. Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos comunes tales como: limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara especfica de la balanza antes de cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza. Las balanzas de torsin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una herramienta para el buen uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de centrfuga siempre debe hacerse en base al peso y no al volumen del contenido. La centrfuga es un aparato que permite separar slidos de lquidos. Es un instrumento que separa suspensiones a alta velocidad. El material slido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la porcin lquida en la parte superior del recipiente (lquido sobrenadante). Los recipientes utilizados en la centrfuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrfuga siempre debe ser en direcciones opuestas. Mezclado de lquidos y slidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales as como los diferentes tipos de diluciones son las mezclas ms utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de slidos en lquidos o de lquidos en lquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas lquidos en lquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el xito de la experimentacin en el laboratorio. El fotocolormetro permite cuantificar concentracin de sustancias en base al color desarrollado. La concentracin de una sustancia en solucin generalmente es determinada 4

por una reaccin de color, siendo el principio general que a mayor concentracin de la sustancia en la solucin mayor ser la intensidad del desarrollo del color. Los fotocolormetros son instrumentos que nos sirven para hacer estas determinaciones.

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biolgico infeccioso, su manejo y desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM 052. INTRODUCCION Residuos peligrosos biolgicos infecciosos Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos? Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clnicos o de investigacin, bioteros, centros de enseanza e investigacin, principalmente; que por el contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

Cules son considerados los RPBI? De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los siguientes: La sangre La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones celulares. la sangre resultante (hemoderivados). Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos.

Los patolgicos Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn otro tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina y excremento. Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios. Los residuos no anatmicos Son residuos no anatmicos los siguientes: Los recipientes desechables que contengan sangre lquida. Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo-Raqudeo o lquido peritoneal. Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades infecciosas emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatgenos. Los objetos punzocortantes Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

Por qu representan un riesgo a la salud o al ambiente? Por sus caractersticas, ya que pueden contener agentes biolgicos infecciosos que se definen como cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando est presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada).

Existe regulacin para los RPBI? Con la finalidad de prevenir alguna situacin de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la autoridad Ambiental (SEMARNAT) public el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica. Debido a que esta Norma present algunos problemas de interpretacin como en su aplicacin, se gestiono en coordinacin con la Secretara de Salud, su modificacin, derivndose el 1 de noviembre de 2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-087SEMARNAT-SSA1-2000, Proteccin Ambiental - Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003. Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federacin la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de Manejo.

A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002? Con base en el campo de aplicacin de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generacin, aclarando que aquellos que su generacin sea menor a 25 kilogramos al mes, podrn ubicarse como generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI? 8

Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo esta es de carcter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Cul es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI? A partir de la publicacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condicin de que dicha norma establece que los residuos denominados patolgicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el nmero de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han cerrado por no cumplir con los parmetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098-SEMARNAT-2002, Proteccin ambiental-Incineracin de residuos, especificaciones de operacin y lmites de emisin de contaminantes. Actualmente la incineracin es uno de los procesos de tratamiento ms observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas que actualmente cuentan con esta autorizacin son capaces de cumplir con los parmetros establecidos en la NOM-098.

PRCTICA #2 USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO


OBJETIVO: Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para aplicarlo en las caractersticas cido base de las soluciones. INTRODUCCIN: El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de medicin, en la cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin. La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin de protones. En consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH. Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que queremos encontrar el pH. El soporte del electrodo es de vidrio comn y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador. El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo cuando la superficie de la membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia), posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podra cargase electrostticamente. Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus referencias, deben ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso que se utilizan soluciones especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones son: solucin buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo, solucin buffer (borato) de pH 10 color azul.

10

El pHmetro digital porttil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batera cuadrada. Debe mantenerse siempre humedecido. Para su calibracin a un punto: 1. Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON. 2. Introduzca el electrodo en la solucin patrn de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice (aproximadamente 30 seg). 3. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp oC a la temperatura de la solucin patrn (buffer). 4. Ajuste la perilla de calibracin calbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la solucin patrn (buffer). 5. Retire el electrodo de la solucin patrn (buffer) y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta), pero no seque el electrodo. 6. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de la solucin a medir. 7. Introduzca el electrodo en la solucin a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la solucin no est entre 3 unidades de pH de la solucin patrn (7.0 pH), se necesita hacer una calibracin a dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vaya a manejar). 8. Despus de cada medicin, retire el electrodo y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta) Calibracin a dos puntos 1. Siga los pasos de calibracin a un punto hasta el paso 5 2. Sumerja el electrodo en la segunda solucin patrn de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de esta solucin patrn debe ser idntica a la de la primera 3. Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda solucin patrn. 4. Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada medicin.

11

Precauciones El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con respecto al electrodo deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeo recipiente en el que descansa el electrodo.

12

PRCTICA #3 TITULACIN ACIDO-BASE


OBJETIVO Observar una reaccin acido-base fuerte utilizando un indicador de pH y comprobar el pH de la solucin mediante el uso del potencimetro. INTRODUCCION Es una tcnica o mtodo de anlisis cuantitativo muy usada, que permite conocer la concentracin desconocida de una disolucin de una sustancia que pueda actuar como cido o base, neutralizndolo con una base o cido de concentracin conocida.1 Es un tipo de valoracin basada en una reaccin cido-base o reaccin de neutralizacin entre el analito (la sustancia cuya concentracin queremos conocer) y la sustancia valorante. Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan como indicador sustancias qumicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolucin. El cambio de color se debe a un cambio estructural inducido por la protonacin o desprotonacin de la especie. Los indicadores cido-base tienen un intervalo de viraje de unas dos unidades de pH, en la que cambian la disolucin en la que se encuentran de un color a otro, o de una disolucin incolora, a una coloreada. Los ms conocidos son el naranja de metilo, que vira en el intervalo de pH 3,1 - 4,4, de color rojo a naranja, y la fenolftalena, que vira desde un pH 8 hasta un pH 10, transformando disoluciones incoloras en disoluciones con colores rosados / violetas. Los indicadores de pH tienen una constante de protonacin, K, que informa sobre el desplazamiento de la reaccin de protonacin de la forma bsica del indicador.

Se dice que el cambio de color de un indicador es apreciable cuando la concentracin de la forma cida o de la forma bsica es superior o igual a 10 veces la concentracin de la forma bsica o la forma cida respectivamente. MATERIALES 2 buretas 50 mL 2 Matraz erlenmeyer 150 ml HCl 0.1N NaOH 0.1N

Fenolftaleina METODOLOGIA
1. Verter NaOH y HCl en buretas graduadas.

13

2. Tomar 20 mL de HCl y colocarlo en un matraz erlenmeyer. 3. Medir el pH de la solucion un potencimetro 4. Agregar 4 gotas de fenolftalena y mezclar 5. Agregar gota por gota NaOH a los 20 mL de HCl siempre mezclando 6. Observar cambios de coloracin.

7. Una vez obtenido el cambio de coloracin del indicador de pH medir una vez ms el pH de la solucin ahora titulada. RESULTADOS Volumen de NaOH utilizado durante la titulacin de HCl_____________ Concentracin de NaOH y de HCl en la solucin final ______________ Establecer la relacin entre el indicador de pH y el pH obtenido con el potencimetro.

14

PRCTICA No 4 FOTOCOLORIMETRA OBJETIVO: Conocimiento del espectrofotometro, su fundamento y manejo. Determinar los espectros de absorcin de dos sustancias coloridas. PRERREQUISITOS: Definir los siguientes trminos: a) Longitud de onda. b) Espectro de absorcin. c) Absorbancia. d) Transmitancia. e) Espectro electromagntico. f) Que es un Espectrofotometro . g) Ley de Lambert-Beer. h) Patrn de referencia, o solucin estandar INTRODUCCION: La utilizacin de fotocolormetros y espectrofotmetros se basa en la determinacin de un parmetro, esto es, medir la luz absorbida por una sustancia que se encuentra en el seno de un lquido y esto se relaciona directamente con la concentracin de la sustancia en el lquido. Estos instrumentos que sirven para medir la intensidad de la luz transmitida o absorbida por una solucin, consisten prcticamente de una fuente de luz, filtros (fotocolormetros) o un monocromador (espectrofotmetro ), una hendidura de salida de luz seleccionada, un receptculo para la muestra ( celdilla ), fotocelda y galvanmetro ( figura 1 ). Lmpara ------> Filtro ------> Celdilla ---> Fotocelda ------> Galvanmetro ** Figura No. 1.- Diagrama de flujo de luz en un fotocolormetro o espectrofotmetro. La diferencia entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro es a nivel del separador de las diferentes longitudes de onda que componen la luz, siendo ms sensible el monocromador del espectrofotmetro, ya que los lmites son ms estrechos, que los filtros del fotocolormetro en cul los lmites estn ms separados. Las medidas fotocolorimtricas estn basadas en 2 leyes: a) La Ley de Lambert b) La Ley de Beer

15

La Ley de Lambert nos indica que la proporcin de luz incidente absorbida por un medio es independiente de su intensidad, pero no del espesor de la capa lquida ni de las caractersticas del medio. Matemticamente la expresin se puede resumir como sigue: As K l Donde K es un coeficiente de extincin, y la l es igual al grosor de la capa del lquido expresado en centmetros. La Ley de Beer nos indica que la intensidad de la luz que pasa a travs de una solucin a una concentracin c y un grosor l es la misma cuando la concentracin es 2c y el grosor l/2 o cuando la concentracin es c/2 y el grosor 2l, de tal manera que la absorcin de luz es proporcional al nmero de molculas del material absorbente a travs de las cules pasa la luz. As, si la sustancia absorbente est disuelta en un solvente transparente, la absorcin de la solucin es proporcional a la concentracin molar.(1) Matemticamente se expresa como sigue: K E c Donde K es el coeficiente de extincin, E es el coeficiente de extincin molar y c es la concentracin en moles por litro. Por lo tanto combinando las dos leyes tenemos que: As E c l Los materiales que cumplen con la ley de Lambert-Beer, o sea donde hay proporcionalidad entre la Absorbancia (As) y la concentracin dentro de ciertos lmites de concentracin, pueden ser estudiados por este mtodo, trabajando una curva de calibracin que permita la interpolacin dentro del margen de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer o utilizando un estndar. MATERIAL.1.- Solucin de H2SO4 0.5 M. 2.- Solucin de KMnO4 0.0004 M. 3.- Solucin de K2Cr2O7 0.0016 M. 4.- 11 Tubos de ensaye de 15x160 mm 5.- 2 Pipetas de 10 ml. 6.- 2 Pipetas de 5 ml. 7.- 2 Celdillas para Fotocolormetro. 8.- 1 Gradilla. 9.- Fotocolormetro

16

METODOLOGIA.Experimento No. 1 DETERMINACION DE LOS ESPECTROS DE ABSORCION. 1.- Determinar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones tipo, leyendo las absorbancias (As) a cada una de las longitudes de onda (nanmetros, nm) del Fotocolormetro; calibrando a cero con la solucin de H2SO4 0.05 M. 2.- Seleccionar las longitudes de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. Experimento No. 2 PREPARACION DE CURVAS DE CALIBRACION PARA CADA SOLUCION TIPO. 1.- Preparar 4 diluciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16) para cada una de las soluciones tipo, utilizando la solucin de H2SO4 como diluyente. 2.- Leer la absorbancia de cada dilucin a la longitud de onda seleccionada en el inciso anterior. En el reporte incluir las curvas de calibracin para cada una de las soluciones tipo, graficando absorbancia vs. concentracin .

17

REPORTE DE LA PRACTICA No. 4

RESULTADOS: EXPERIMENTO No. 1 1.- Llenar la siguiente tabla: Long. de onda __330__ __360__ __390__ __420_ __450__ __480__ __510__ __540__ __570__ __600__ As K2Cr2O7 ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ As KMnO4 ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________ ________

En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. EXPERIMENTO No. 2 Longitud de onda seleccionada para el K2Cr2O7 = __________ =As1 Longitud de onda seleccionada para el KMnO4 = __________ =As2 Dilucin : K2Cr2O7 Dilucin 1:2 1:4 1:8 1 : 16 Absorbancia Concentracin KMnO4 Absorbancia Concentracin

18

PRACTICA No 5. "REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS". OBJETIVO.Al trmino de esta practica el alumno sera capaz de diferenciar a los aminocidos utilizando tcnicas colorimtricas mas comunes para identificarlos, as cmo, relacionar la estructura de los aminocidos con su reactividad y sus funciones en el organismo. PREREQUISITOS: 1.- Cuales son las diferencias de estructura de los diferentes aminocidos. 2.- Que semejanzas hay entre los aminocidos con otros monmeros como carbohidratos y lpidos. 3.- Identificar las propiedades qumicas acido base de los aminocidos. Mencione 5 diferencias fundamentales tanto qumicas como bioqumicas que permiten diferenciar a los aminocidos de los carbohidratos y de los lpidos. 4. Existe un enorme grupo de aminocidos no estndar, mencione 4 ejemplos e indique por se conocen como no estndar. 5. Esquematice los 20 L- a -aminocidos naturales en una tabla indicando:

INTRODUCCION: Los aminocidos son los monmeros que dan la estructura de los polmeros conocidos como protenas o polipptidos, 20 tipos de aminocidos, son los principales componentes de las protenas, los cuales poseen las siguientes caracteristicas estructurales: H | - C | + NH3

COO-

Contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina) llamado carbono alfa, al cual se le unen cuatro radicales que son: - carboxilo (COO-) - amino (+NH3) - un tomo de hidrgeno (H) y - un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R). Llamado cadena lateral. Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posicin, dentro de la estructura proteca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua tender a esconderse; o en su defecto, si es de caracteristicas polares (hidroflico), tender a interaccionar con el agua. Desde luego, para 19

saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de conocer cual es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H+) o desprotonada, este parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin de Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado; por ejemplo:

H H H | pk1 | pK2 | R - C - COOH -----> R - C - COO- ------> R - C - COO| | l + + NH3 NH3 NH2 pH = cido pH = alcalino

Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH en que se encuentre el aminocido, ya que como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas el aminocido est totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente desprotonado, esto se debe a que los aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto tienen una constante de disociacin por cada grupo o radical capaz de comportarse como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero. Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los cuales se les ha identificado como aminocidos naturales y los no naturales son los que an cuando siendo aminocidos, no forman parte estructural de las protenas (no estn codificados en el cdigo gentico). El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminocidos requeridos para la formacin de todas las protenas y por lo cual partiendo de esta base, los aminocidos se dividen en : esenciales; porque es necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio organismo y por lo tanto no es crtico si el individuo no los consume en su dieta. Cabe hacer notar, que los 20 aminocidos son importantes para el buen desarrollo del organismo. MATERIAL.1.- 15 tubos de ensaye 2.- 1 gradilla 3.- 5 pipetas de 1.0 ml 4.- 4 pipetas Pasteur 5.- 2 pipetas de 5.0 ml 6.- 1 pipeta de 10.0 ml 7.- 1 Bureta

METODOLOGIA.Nota.- A menos que se especifique, todos los volmenes a aadir estn dados en mililtros (ml)

20

Experimento No. 1
REACTIVOS

PRUEBA DE SULLIVAN
BLANCO o (1er Tubo) control PATRON (2 Tubo) PROBLEMA(3 Tubo)

AGUA CISTEINA Sol. Problema NaCN Dejar reposar por NITROPRUSIATO DE SODIO NH4OH Dejar reposar para

0.5 ---------------------------0.5 ML Por 10 minutos 2-3 gotas 2 gotas Desarrollo de color

-----------0.5 -----------0.5 ML 2 3 gotas 2 gotas Por 10 minutos

---------------0.5 0.5 ML

2-3 gotas 2 gotas

Comparar las coloraciones del problema entre el blanco y el patron. Un color rojizo indicara prueba positiva o presencia de Cistina o cisteina Experimento No. 2 Reaccin de identificacin de fenoles para-sustituidos (tirosina) REACTIVOS AGUA TIROSINA PROBLEMA NITROSONAFTOL BLANCO 0.5 ----2-3 gotas PATRON --0.5 --2-3 gotas PROBLEMA ----0.5 2-3 gotas

Nota: Modificacin los volumenes de 1 ml a 0.5 ml para el blanco, problema y patron Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 5 minutos. ACIDO NITRICO 0.5ml. 0.5 ml 0.5 ml

Comparar las coloraciones del problema entre el blanco y el patron. La aparicion de un color rojo fuerte para tirosina y caf rojiso para fen y trip..

21

Experimento No. 3 Reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa aminocidos dando un color azul, morado hasta incoloro . La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo. REACTIVOS AMINOACIDO (prolina) PROBLEMA NINHIDRINA AGUA BLANCO (ML) ----0.5 0.5 PATRON (ML)_ 0.5 --0.5 --PROBLEMA (ML) --0.5 0.5 0.5

Mezclar dejar en reposo por 10 minutos La aparicin de un color azul violceo es positiva con excepcin de la prolina y la hidroxiprolina.

CUESTIONARIO: 1. Cmo se calcula el punto isoelctrico de un aminocido? 2. Que importancia mdica tiene la identificacin de los aminocidos.? 3. Cul es la funcin del cianuro de sodio en la reaccin del nitroprusiato? Nombre del aminoacido Ej. Tirosina (dibujo) Grupo funcional Anillo fenolico Propiedades Polar, neutro,

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

22

PRACTICA No. 6 "REACCIONES DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS". OBJETIVO: Al trmino de esta practica, el alumno deber ser capaz de describir algunas de las tcnicas de deteccin cualitativa de protenas en base a los componentes de su estructura. PRERREQUISITOS: 1.- Definicin de Pptido, Polipptido y Protena. 2.- Clasificacin de las Protenas. 3.- Niveles de complejidad estructural de las Protenas. 4- Defina el trmino Secuenciacin protica.

INTRODUCCION: La palabra Protena proviene del griego preeminente, que significa primero; fu inicialmente propuesta por Berzeluis en 1838 para referirse a unas serie de compuestos orgnicos nitrogenados con cierta complejidad que se encuentran altamente distribuidos en la naturaleza y son la base para actividades tanto estructurales y funcionales de todo organismo vivo. Las protenas estas compuestas por aminocidos naturales ordenados en una secuencia discreta y unidos entre s por enlaces peptdicos que siempre involucran los radicales amino y carboxilo de cada aminocido. La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como: complejidad estructural, residuos aminoacdicos que la forman, propiedades qumicas y fsicas y funciones especficas de cada protena en el organismo que la contiene. Se concluye, por lo tanto, que el anlisis qumico de las protenas en base a sus propiedades es muy amplio y su aplicacin en el campo mdico, clnico y de investigacin es muy importante. Basndose en los anlisis fsicos y qumicos de ellas, se han planteado cuatro niveles estructurales de conformacin, se han postulado las posible formas estructurales , su naturaleza electrosttica , su capacidad de solubilidad as como sus funciones dentro del organismo. MATERIAL.1.- 12 tubos de 20 x 150 mm 2.- 3 pipetas de 1.0 ml. 3.- 1 pipeta de 10.0 ml. 4.- 1 Gradilla 5.- Sol. de albmina 0.1% 6.- Sol. de peptona 0.1% 7.- Sol Gelatina 0.1 % 8.- Sol. Tirosina 0.1 % 9.- Sol. NaOH 10.0 % 10.- Sol. Sulfato de Cu 0.5 % 11.- Ac. ntrico concentrado 12.- Hidrxido de amonio 23

METODOLOGIA.Experimento No. 1 Reaccin de Biuret: Existen diversas tcnicas de deteccin y cuantificacin de protenas algunas ms complicadas que otras y algunas ms confiables que otras. Una de las reacciones ms utilizadas es la de Biuret; en esta reaccin, el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos, ya que el radical carbamilo que se forma en el enlace peptdico es muy afn a los iones de cobre. Se le da el nombre de Biuret porque este es un compuesto que da una reaccin tpicamente positiva con el sulfato de cobre alcalino. La formacin del color violeta es directamente proporcional al nmero de enlaces peptdicos que contenga la protena y no es sensible a pptidos. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: Tubo # Agua destilada Albmina Peptona Gelatina Tirosina Reactivode Biuret 1 1 ml --------1 ml 2 --1 ml ------1 ml 3 ----1 ml ----1 ml 4 ------1 ml --1 ml 5 --------1 ml 1 ml

Agitar y dejar reposar los tubos durante 15 min. Observar la coloracin y su intensidad. Reportar los resultados de la siguiente forma: (++) = violeta intenso, (+) = Ligeramente coloreado, (-) = no formacin de color. Experimento No. 2 Reaccin Xantoproteca: Esta reaccin afecta la integridad estructural de los residuos aminoacdicos de las protenas. En este caso, Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico, forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido Ntrico concentrado. Al aadir una solucin alcalina se forman sales de estos derivados que son de color naranja. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: Tubo # Agua destilada Albmina Peptona Gelatina Tirosina Ac. Ntrico 1 0.5 ml --------0.5 ml 2 --0.5 ml ------0.5 ml 3 ----0.5 ml ----0.5 ml 4 ------0.5 ml --0.5 ml 5 --------0.5 ml 0.5 ml 24

Mezclar y calentar a bao de agua a ebullicin durante 5 min. y enfriar a temperatura ambiente durante 10 min. agregar por estratificacin y SIN MEZCLAR: Hidrxido Amonio de 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

La formacin de un anillo color naranja en la interfase es resultado positivo. Reportar con un signo positivo (+) los tubos donde se haya formado el color naranja REPORTE: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1.- Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el Reactivo de Biuret y los enlaces peptdicos. 2.- Correlacionar los pesos moleculares y los componentes aminoacdicos de la albmina, peptona, gelatina y tirosina. 3.- Explique porque cada protena se comporta de diferente manera en las reacciones de Biuret y Xantoproteica.

25

PRACTICA No. 7 DETERMINACION DE LAS PROPIEDADES QUIMICAS DE LAS PROTEINAS OBJETIVOS: Al trmino de esta practica, el alumno ser capaz de describir y demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las protenas en base a los siguientes aspectos: a.- Solubilidad de las protenas. b.- Las propiedades electroqumicas de las protenas. c.- El efecto cido-basico en la solubilidad de las protenas. PRERREQUISITOS: CUESTIONARIO: 1.-De que factores depende la solubilidad de una protena en el agua. 2.-Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o una base fuerte. 3.-Explique como afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad de una protena. 4.-Qu es el Salting in y que tipo de compuestos pueden promoverlo. 5.-Qu es el Salting out y que tipo de compuestos pueden promoverlo. 6.-Qu relacin existe entre el punto isolelectrico y la solubilidad de una protena. 7.-Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado utilizarse. 8.- Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.

26

INTRODUCCION: Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de aminocidos. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia determinados por el cdigo gentico. Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variacin de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad. Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos: protenas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, para los fines que se persiguen en esta practica se les mencionara en forma general. Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza inica del medio, el pH. la temperatura y la constante dielectrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la protena responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteca de una manera superficial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en nuestro organismo, la variacin de tales factores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la protena. MATERIAL.1.- 13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm 2.- 1 pipeta de 10 ml 3.- 5 pipetas de 5 ml 4.- 1 pipeta de 5 ml 5.- 1 gradilla METODOLOGIA.En esta practica se trata de provocar cambios de solubilidad en protenas que se encuentran en el organismo, mediante la modificacin las propiedades de los solventes, para establecer una relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo. Fundamento Qumico: la adicin de una sal a una solucin proteca modifica la constante dielectrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal, se neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar. Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas electropositivamente. Con la adicin de un cido o una base a una solucin protica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico. 27

Experimento No. 1 Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido. Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4 5.8 Ac. Acetico 0.01N 0.62 1.25 0 0 0 0 0 0 0 0 Ac. Acetico Ac. Acetico Caseinato de 0.1 1.0N Sodio 0.1N 0 0 1.0 0 0 1.0 0.25 0 1.0 0.5 0 1.0 1.0 0 1.0 2.0 0 1.0 4.0 0 1.0 8.0 0 1.0 0 1.6 1.0 0 3.2 1.0

Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad de la casena en cada tubo. Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach. Experimento No. 1 Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH Solubilidad

Cual es el punto isoelctrico de la protena ? _____________________________ ____________________________

28

PRACTICA # 8 ANLISIS ENZIMATICO CUALITATIVO OBJETIVO: Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de definir el efecto fisicoqumico que generan las enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando adems, las propiedades qumicas que permiten que una enzima, catalize la modificacin de un sustrato. PRERREQUISITOS: 1. Definicin de enzima, sustrato, apoenzima, holoenzima, pro-enzima, zimgeno, coenzima, cofactor. 2. Determine lo que significa: especificidad enzimtica y alosterismo. 3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidorreductasa, transferasa, liasa, ligasa e Isomerasa. 4. De acuerdo a la clasificacin enzimtica a que clase pertenecen las enzimas utilizadas(renina y ureasa) y porqu?. 5. Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa. 6. Qu grupos qumicos participan en el sitio activo de las enzimas?. 7. Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan? si, no; porqu? INTRODUCCIN: Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa muy rpidamente, debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamadas enzimas. Al igual que los catalizadores inorgnicos; las enzimas modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se requieren pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas del sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayora de los catalizadores inorgnicos las enzimas son bastante especficas ya que catalizan un nmero comparativamente pequeo e reacciones; en algunos casos, tan solo una reaccin, as mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentracin de sustrato, coenzimas, etc. Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen determinados en este tema. Las enzimas se designan y se clasifican d acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan; los seis grupos principales de enzimas son: Oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas o sintetasas. MATERIAL: 6 tubos de ensaye, 3 pipetas de 1.0 ml., 2 pipetas de 5 ml., 2 pipetas pasteur, 2 gradillas, 6 tapones de algodn. 29

METODOLOGA: Experimento #1 Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas. Actividad de la ureasa. Tubo semilla de vegetal agua(ml) 1 pizca ---2 pizca 5.0 3 pizca 5.0

Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapn de algodn a los tubos 1 y 2 y colquelos en bao a ebullicin durante 20 minutos.(Cuidar que no se acabe el agua del bao.) agua(ml) azul bromotimol (gotas) 5.0 2 -------2 ------2

Aadir cido dbil (gotas) en caso de que la solucin tenga un color azul . Urea (ml) 5.0 5.0 5.0 Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul en cada uno de los tubos. Experimento # 2 Determinacin de la actividad de renina. Tubo Leche(ml) oxalato de amonio(ml) sol. renina(gotas) 1 3.0 -----3 2 3.0 0.5 3 3 3.0 0.5 3

Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos. Calentar el tubo 2 a ebullicin y enfriar. cloruro de calcio(gotas) -----10 10

Mezclar y compara los cambios observados en los tubos 2 y 3 con el 1.

30

PRACTICA No 9 CINETICA ENZIMATICA. EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA SOBRE LA CINETICA ENZIMATICA.

OBJETIVOS: El alumno analizara el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica en una reaccin, Basado en: 1. Discutira el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica al variar el pH de la mezcla de reaccin. 2. Discutira los cambios que se presentan en la cinetica enzimatica al variar la temperatura de reaccin. 3. Determinara las condiciones optimas de reaccin en funcin de estos dos factores (pH y Temperatura). PREREQUISITOS: 1. 2. 3. 4. Describa el efecto del ph sobre la estabilidad y actividad de una enzima. Describa el efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima Describa el sitio activo y sitio de enlace de una enzima Describa los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre la enzima 5. Explique los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin catalizada.

INTRODUCCION.

Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente estn compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma inica apropiada o especifica, de tal manera , que se pueda mantener la conformacin adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin del sustrato y su transformacin hacia los productos. Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma inica especifica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realice la catlisis.

31

Los efectos del pH sobre la estabilidad de una enzima se deben tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catlisis de sustrato. MATERIAL 14 Tubos de ensaye Gradilla Celdas fotocolorimetricas Fotocolorimetro Baos de agua con temperatura controlada Pipetas 1 ml Pipetas de ml

METODOLOGIA. EFECTO DEL PH. TUBO


Sacarosa 0.3M pH 2.5 pH 3.5 pH 4.5 pH 5.5 pH 6.5 pH 7.5 Agua Enzima MEZ CLAR Dinitrosalicilato

1
1.0 ml 0.5 ml

2
1.0 ml 0.5 ml

3
1.0 ml

4
1.0 ml

5
1.0 ml

6
1.0 ml

7
1.0 ml

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml INCUBAR A 37 2.0 ml 2.0 ml 1.0 ml oC 2.0 ml 1.0 ml POR 2.0 ml 1.0 ml 20 2.0 ml 1.0 ml MIN. 2.0 ml

2.0 ml

Mezclar y calentar en bao a ebullicin en agua por 5 min. (Puede ser menos tiempo, deber cuidarse que no se ponga demasiado intenso el color canela que despus no se pueda leer en el colormetro. Se ajusta enfra y se ajusta a cero con el tubo No 7 y se lee a 540 nm.,

32

EFECTO DEL TEMPERATURA TUBO


Sacarosa 0.3M Amortiguador ph = 4.7 Temperatura oC Enzima Agua MEZ CLAR Dinitrosalicilato

1
1.0 ml 0.5 ml 4 1.0 ml ---INCUBAR 2.0 ml

2
1.0 ml 0.5 ml 26 1.0 ml ---A 37 2.0 ml

3
1.0 ml 0.5 ml 37 1.0 ml ---oC 2.0 ml

4
1.0 ml 0.5 ml 45 1.0 ml ----POR 2.0 ml

5
1.0 ml 0.5 ml 60 1.0 ml ---20 2.0 ml

6
1.0 ml 0.5 ml 100 1.0 ml ----MIN. 2.0 ml

7
1.0 ml 0.5 ml 26

1.0 ml 2.0 ml

Mezclar y calentar en bao a ebullicin en agua por 5 min. (Puede ser menos tiempo, deber cuidarse que no se ponga demasiado intenso el color canela que despus no se pueda leer en el colormetro. Se ajusta enfra y se ajusta a cero con el tubo No 7 y se lee a 540 nm.,

REPORTE. 1. Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs ph 2. Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura 3. Indique cuales son los valores de temperatura y ph ptimos

33

PRACTICA # 10 EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA OBJETIVO: Determinar cualitativamente, mediante la observacin de los grados de decoloracin; las relaciones existentes entre la actividad de la deshidrogenasa lctica (LDH) y la presencia de nicotinamida adenin dnucletido (NAD), en funcin de los siguientes aspectos: Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD. Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno Aportar pruebas experimentales que demuestren la coenzima no se modifica estructuralmente durante la actividad de enzima. PRERREQUISITOS: 1.- Definir los trminos: cofactor, coenzima y metaloenzima. 2.- Mencionar las coenzimas que actan en oxidorreducciones. 3.- Explicar como afectan las coenzimas a la cintica enzimtica. 4.- Explique cual es el efecto del oxgeno en la actividad de las oxidasas.

INTRODUCCIN: La mayora de las manifestaciones metablicas de un organismo, se relacionan con cambios de energa, la cual se obtiene por la oxidacin sistemtica de los nutrientes y esto es debido a que en los procesos de oxidorreduccin hay transferencias de energa generadas por diferencias n el potencial electroqumico. Un sistema de potencial elevado, oxida al de ms bajo potencial con la consiguiente liberacin de energa para las necesidades vitales. En todas las reacciones de oxidorreduccin, existe transferencia de electrones. La oxidacin se define como: la prdida de electrones por parte de un compuesto, mientras que la reduccin es la ganancia de dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto, la oxidacin y la reduccin son fenmenos que se realizan en forma simultnea. La oxidacin biolgica implica transferencia de hidrgenos y electrones a travs de una serie de sistemas enzimticos que actan como intermediarios, para llegar al aceptor final que es el oxgeno. El proceso oxidativo se inicia por la oxidacin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con el oxgeno, sino que requiere intermediarios como el NAD, las flavoprotenas y los citocrmos. En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizar la deshidrogenasa lctica de msculo de rata; que slo es activa en estado de anaerobiosis y requiere NAD como intermediario para completar su actividad, la cual se manifiesta en la siguiente reaccin.

34

PIRUVATO---------------- LDH-------------LACTATO NADH+ H+ NAD + Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona normalmente, basndose en la concentracin de NAD y anaerobiosis promoviendo la reduccin del piruvato en presencia de NADH+ H+; entonces, aumentando la concentracin de NAD + podemos revertir la reaccin para oxidar al lactato y generar NADH+ H+ el cual reaccionar con el azul de metileno y provocar su decoloracin. Si esta premisa se cumple se habr demostrado que la concentracin de la coenzima puede regular la direccin de la actividad de una enzima reversible. MATERIAL: 1.- Una rata adulta de 250g de peso( o un conejo) 2.- Cuatro tubos de ensayo de 20 x 150 mm. 3.- Tres pipetas de 5.0 ml. 4.- Una pipeta de 2.0 ml. 5.- Una pipeta de 1.0 ml. 6.- Dos vasos de precipitado de 150 ml. 7.- Un matraz erlenmeyer de 125 ml. 8.- Un mortero con pistilo. 9.- Un estuche de diseccin 10.- Un bao mara ajustado a 37 C 11.- Eter(anestsico para la rata) 12.- Arena lavada(agente triturante) 13.- NaCl al 0.9%( solucin isotnica para resuspenden clulas). 14.- KCN al 0.5%(inhibidor de las deshidrogenasas mitocondriales). 15.- Lactado de sodio al 1%(substrato de la LDH) 16.- Azul de metileno 0.002M(indicador redox que reacciona con NAD). 17.-Aceite mineral (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis). Efecto de la Nicotinamida adenin dinucletido(NAD) en la actividad de la enzima Lactato Deshidrogenasa. a).- Preparacin de la enzima LDH: 1.- Matar una rata con ter, disecarla y obtener de 2 a 3 gramos fragmentos de msculo de las patas. 2.- Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9%(10 ml por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente. 3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos. 4.- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetndolo como LDH.

35

b).- Preparacin de la coenzima NAD: 1.- Obtener otos 3 g de tejido muscular de las patas traseras de la rata. 2.- Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlo en agua a ebullicin por 5 minutos en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporcin de 8ml de agua por gramo de msculo. 3.- Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente. 4.- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como NAD. c).- Deteccin de la actividad enzimtica de LDH: Preparar una serie de cuatro tubos de ensaye como se indica a continuacin: NOTA: se debe tener precaucin al utilizar el KCN ya que es altamente txico. UTILICE BURETA. Tubo KCN al 0.5%(ml) Lactato de sodio al 1% (ml) Azul de metileno 0.002 M (gotas) Agua destilada (ml) Coenzima (NAD) (ml) Enzima (LDH) (ml) 1 1.0 1.0 1 1.0 ----1.0 2 1.0 1.0 1 ----1.0 1.0 3 1.0 ----1 1.0 1.0 1.0 4 1.0 1.0 1 1.0 1.0 -----

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral. Incubar en bao de agua a 37C los tubos MANTENINDOLOS INMOVILES y observar los grados de decoloracin de cada solucin. Hacer estas observaciones en intervalos de 15 minutos durante 45 minutos.

REPORTE: CONCLUSIONES:CUESTIONARIO: 1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos. 2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados. 3.- Explique el fundamento qumico de la reaccin entre el azul de metileno y el NAD. 4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del experimento que pudieran modificar los resultados.

36

PRACTICA # 11 Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimtica (Ensayo sobre la inhibicin competitiva y no competitiva de las enzimas lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa). OBJETIVO: Analizar el efecto inhibitorio de los compuestos qumicos malonato de sodio, sobre la actividad enzimtica de lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa, en base al tipo de inhibicin que generan. PRERREQUISITOS: 1.- Explicar el trmino actividad enzimtica. 2.- Describir el fenmeno de inhibicin competitiva. 3.- Describir el fenmeno de inhibicin no competitiva. 4.- Enumerar al menos cinco inhibidores que acten en cada tipo de inhibicin. 5.- Explicar el comportamiento cintico de una enzima cuando esta bajo el efecto de ambos tipos de inhibicin. 6. Que tipo de inhibicin genera el malonato de sodio INTRODUCCIN: Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad cataltica. Este efecto se utiliza para preparar drogas o insecticidas que inhiben selectivamente ciertas enzimas en la bacteria o insecto infectante y que no afecte al hospedero. La inhibicin es una de las formas ms tiles para regular la actividad de una enzima. Los estudios logrados en base a inhibidores, han contribuido a la informacin actual sobre cintica enzimtica y mecanismos tanto metablicos como clnicos. Los dos tipos principales de inhibicin son: La inhibicin competitiva: donde el compuesto inhibidor interacciona con el sitio cataltico, compitiendo con el sustrato por la unin con dicho sitio. En este caso el grado de inhibicin depende directamente de la concentracin del inhibidor, con respecto al sustrato especfico, por lo tanto, si la concentracin de sustrato es mayor que la del inhibidor, no se presentar el efecto inhibitorio. Ms an, si a una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de sustrato, casi siempre desaparecer el efecto inhibitorio. La mayora de los inhibidores competitivos tienen una estructura qumica semejante a la del sustrato natural por lo tanto son muy especficos. Como el inhibidor competitivo se une al sitio cataltico, la enzima pierde afinidad con el sustrato original y esto modifica la constante de Michaelis(Km). La inhibicin no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la enzima, pero no con el sitio cataltico de manera que la enzima puede unirse al 37

sustrato y al inhibidor simultneamente. La inhibicin ocurre porque al unirse el inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que disminuye su actividad cataltica. El aumento de la concentracin de sustrato no tiene efecto sobre el inhibidor. Los inhibidores no competitivos son inespecficos o sea que un mismo inhibidor puede afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de sodio o muy simples como los iones metlicos plata, cobre, plomo y cianuro. La inhibicin no competitiva no afecta la afinidad de la enzima por el sustrato por los que la Km se mantiene intacta. En este caso, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no se puede disociarse y ocurre una disminucin en la cantidad de enzima activa disponible. MATERIAL: 1.- Catorce tubos de ensayo de 20 x 150 mm. 2.- Cuatro pipetas de 1.0 ml. 3.- Dos pipetas de 2.0 ml. 4.- Dos pipetas Pasteur. 5.- Una gradilla. 6.- Solucin de succinato de sodio 0.1M. 7.- Solucin de malonato de sodio 0.1 M. 8.- Solucin de azul de metileno 0.002M. 9.- Aceite mineral. 10.- Preparacin de la enzima deshidrogenasa succinica (DSC). 11.- Solucin de cloruro de sodio al 0.9%. METODOLOGA: En este experimento se probar el efecto inhibitorio del malonato de sodio mediante un diseo en donde, se aumenta gradualmente la concentracin de inhibidor con respecto al sustrato, manteniendo constante la concentracin de la enzima. La verificacin de la actividad se determinar, en referencia a la actividad de un redox biolgico(azul de metileno) ya que las enzimas que utiliza el diseo son Oxidorreductasas. Preparacin de DSC a partir de msculo cardiaco de rata. 1.- Tomar de 2 a 3 gramos de msculo de corazn de una rata recin disecada y cortarlo en fragmentos pequeos. 2.- -Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en una proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar perfectamente. 3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos. 4.- Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetado como DSC.

38

EXPERIMENTO NO. 1 Efecto del malonato de sodio sobre la actividad de DSC: Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: Tubo Succinato de sodio 0.1M Azul de metileno 0.002 M (gotas) Malonato de sodio 0.1 M Agua destilada Enzima DSC 1 0.5 1 ---1.0 2.0 2 ---1 ----1.5 2.0 3 0.5 1 ----3.0 ---4 0.5 1 1.5 ----2.0 5 0.5 1 0.5 0.5 2.0 6 0.5 1 0.25 0.75 2.0 7 1.0 1 0.25 0.25 2.0

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos los tubos 1.0 ml de aceite mineral. Incubar en bao de agua a 37C y observar los grados de decoloracin que genera cada tubo a los 15, 30, 45 y 60 min. de incubacin.

39

PRACTICA No.12 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS OBJETIVO: Conocer y practicar dos tcnicas de cuantificacin de protenas del suero y analizar los resultados en relacin a posibles anormalidades desde el punto de vista metablico. PRERREQUISITOS: 1.- Analizar el fundamento qumico de la reaccin de Biuret. 2.- Conocer el perfil protenico del suero. 3.- Analizar clnicamente el trmino protenas totales. 4.- Analice la estructura de la albmina y explique como esta protena funciona en el transporte de diferentes tipos de metabolitos por la circulacin sangunea. 5.- Mencione las funciones de las globulinas . INTRODUCCIN: Una de las fracciones orgnicas ms importantes de la sangre es la de las protenas, tanto por su contenido porcentual como por las funciones que realizan. El contenido totoral de protenas del plasma es normalmente del orden de 5.7 a 8.0 g/dl. Las protenas sricas constituyen la mayor parte de los slidos del plasma y son una mezcla compleja de protenas simples y conjugadas como glucoprotenas y lipoprotenas. Las protenas del plasma estn constituidas en tres grupos principales: Albmina, globulinas y fibriingeno. El fibriingeno normalmente constituye del 4 al 6 % de las protenas plasmticas, es producido por el hgado y tiene importancia fundamental para la coagulacin de la sangre. La albmina es la principal protena del suero; se halla tambin en los espacios extravasculares, linfa y otros lquidos biolgicos como el amnitico, bilis, jugo gstrico, etc. Se encuentra en la orina de pacientes con enfermedades renales y es uno de los componentes principales del lquido del edema. Las dos funciones principales de la albmina plasmtica son: El mantenimiento de la presin colidosmtica y el transporte de algunos metabolitos tales como bilirrubinas, aminocidos, cidos grasos, enzimas, medicamentos, etc. La albmina es sintetizada por las clulas hepticas en una cantidad de 12 a 14 g/da. Las globulinas se dividen en tres grupos principales: globulinas alfa, beta y gamma. Las globulinas alfa y beta ejercen diversas funciones en la circulacin tales como transporte de metabolitos y de iones metlicos. Las globulinas gamma actan en la actividad inmunolgica ya que constituyen las inmunoglobulinas que resisten a la infeccin. La mayor parte de las globulinas alfa y beta son de origen heptico pero las gamma se pueden sintetizar en hgado y tejido linftico. El hgado es el centro principal de protenas plasmticas. La formacin de albmina y fibriingeno parece estar limitada al hgado; aproximadamente el 80% de las 40

globulinas se fabrican en el hgado, incluyendo las lipoprotenas. El principal papel del hgado en la sntesis protenica del plasma se refleja en la disminucin notable de albmina y fibriingeno que tiene un lugar en tejido heptico daado, como se observa en pacientes con cirrosis o a consecuencia de una hepatotectoma experimental. Existen una gran cantidad de compuestos qumicos entre los cuales se incluyen a las drogas y los frmacos que afectan la integridad metablica de los hepatocitos. Algunos de ellos afectan la capacidad de sntesis de metabolitos como la albmina y en la mayora de los casos el efecto es tan drstico que puede llegar a ser letal. Dentro de los compuestos que han sido catalogados como hepato-txicos estn el cloroformo, el dinitrofenol, la clorpromazida, el fluoruracilo y la tetraciclina. Esta ltima afecta al hgado de una manera proporcional a la concentracin que se administra. En pacientes desnutridos la tetraciclina es hepatotxica a dosis mayores de 3 g/da y su efecto comienza a las 48 hrs. de administrarse esta dosis. Si la tetraciclina es un antibitico que a dosis mayores de 3 g/da disminuye el metabolismo del hepatocito y la albmina se sintetiza nicamente en el hgado, entonces, es factible encontrar bajos niveles de albmina srica en un individuo que ha sido tratado con altas dosis de este antibitico.

REACTIVOS Reactivo de Biuret Suero no hemolizado Solucin patrn Solucin salina 0.890.9%)

BLANCO 2.5 ml. ------------0.1 ml

PATRON 2.5 ml. ------0.1 ml --------

PROBLEMA 2.5 ml. 0.1 ml -------------

CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES

Agitar los tubos y dejar reposar durante 15 min. Medir la absorbancia del patrn y del problema ajustando a cero con el blanco a 550 nm. Protenas totales = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl Absorbancia del patrn

41

CUANTIFICACION DE ALBMINA REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA

Reactivo verde de 3 ml. 3 ml. 3 ml. bromocresol Suero no hemolizado --------------0.01 ml Solucin patrn ------0.01 ml. --------Solucin salina 0.01 ml -------------El volumen de suero, patrn y blanco depender del pH de la solucin verde de bromocresol. Mezclar y dejar reposar los tubos durante 10 min. a temperatura ambiente. Medir la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el blanco a 640 nm. CALCULOS: ALBMINA = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl Absorbancia del patrn PROTEINAS TOTALES ALBMINA = GLOBULINAS RELACION ALBMINA /GLOBULINAS

42

PRACTICA # 13 REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS OBJETIVO. Conocer las tcnicas de anlisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su utilizacin como herramienta de trabajo en ciertos experimentos. PREREQUISITOS: 1. Definir el termino carbohidrato. 2. Diferenciar los tipos de carbohidratos y menciomar ejemplos. 3. Identificar las propiedades qumicas de los carbohidratos. 4. MENCIONE 3 FUNCIONES FUNDAMENTALES DE LOS CARBOHIDRATOS EN LA CELULA EJEMPLIFICANDO EN CADA UNO DE LOS CASOS. 5. MENCIONE 2 HOMOPOLISACARIDOS Y 3 HETEROPOLISACARIDOS Y SU COMPOSICION. INTRODUCCION Los carbohidratos son derivados aldehidicos o cetnicos de alcoholes superiores polivalentes ( ms de un OH). se clasifican en base al nmero de molculas que los componen. Monosacridos (azcares simples) no se pueden hidrolizar en molculas ms sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas etc. segn el nmero de tomos de carbono que tengan. Las siguientes reaccines permiten identificar de manera cualitativa la presencia de cierto tipo de azucares en una muestra problema y se utilizan en la prctica tanto clnica como vegetal. Muchas de las pruebas que se estudiarn en el laboratorio requieren tiempo para que aparezca un precipitado o se desarrolle un color. La mayara de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de reactivos en cantidades mayores pueden conducir a interpretaciones errneas. MATERIAL : 1.- Bao de agua a ebullicin 3.- 2 Pipetas de 1.0 ml 5.- Gradilla

2.- Tubos de ensaye 4.- Pipeta de 5.0 ml

METODOLOGIA: Se realizarn cuatro experimentos y en cada uno se pondrn a prueba los carbohidratos que indique el profesor, admas debern de identificar el carbohidrato presente en una mezcla problema.

43

EXPERIMENTO # 1 REACCION DE FEHLING ( IDENTIFICACION DE COMPUESTOS REDUCTORES ) Esta reaccion nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azcares en un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxgeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan las reacciones de reduccion que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efecta con una solucin que contenga cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azcar, las sales de amonio tambin interfieren en la reaccin. Si la solucin problema es cida debe neutralizarse antes de efectar la prueba. Fundamento: si calentamos una solucion de Cu(OH)2 en un medio alcalino formamos oxido cuprico (negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu2O de color caf rojizo pardo .

Solucion A contiene sulfato de cobre . Solucion B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidroxido de potasio . METODO MUESTRA SOL. DE FEHLING A SOL. DE FEHLING B 1.0 ml. 0.5 ml 0.5 ml.

MEZCLAR Y CALENTAR A BANO DE EBULLICION 5 MIN. COLOR ROJO ES POSITIVO. EXPERIMENTO # 2 REACCION DE MOLISH-UDRANSKY.- Esta prueba es positiva con aldehidos y algunos cidos como el frmico, oxlico, lctico, citrico, etc. Esta reaccin es muy sensible , dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de 0.0001%. MUESTRA Reactivo de Molish 1.0 ml 3 GOTAS

44

Mezclar y aadir 0.5 ml de cido sulfrico concentrado ( resbalando por la pared del tubo ) NO mezclar. La aparicin en la interfase de un anillo violceo es indicativo de que la prueba result positiva. EXPERIMENTO # 3 REACCION DE SELIWANOFF.- Est reaccin permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en cada uno de los tubos. Una reaccin positiva est dada por la aparicin de un color rojo. Reaccin para diferenciar Cetosas de Aldosas ( Reaccin de Seliwanoff ) MUESTRA 1.0 ml REACTIVO DE SELIWANOFF 5.0 ml Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 1 minuto, anote el resultado. Las cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba dbil y lentamente. EXPERIMENTO # 4 REACCION DEL YODO O LUGOL Esta reaccion identifica los polisacridos como Amilosa, Amilopectina, Glucogeno, Almidon formando un complejo adsortivo entre el Iodo y las cadenas helicoidales del polisacrido (enlaces alfa 1,4 glucosdicos y enlaces alfa 1,6 glucosdicos de por lo menos 8 residuos de glucosas ) . METODO. MUESTRA 1.0 ml. LUGOL 3 GOTAS Mezclar y si es necesario calentar 2 segundos en bao de ebullicin. La aparicin de un color azul o violeta indica la presencia de un polisacarido.

45

PRACTICA No. 14 CUANTIFICACION DE GLUCOSA SERICA. OBJETIVO: Conocer y practicar la tcnica de cuantificacin de glucosa del suero y plasma y analizar los resultados en relacin a posibles anormalidades desde el punto de vista metablico. INTRODUCCIN: La concentracin de Glucosa en plasma de humano o suero, determinado por metodos altamente especificos , se encuentra en el rango de 70 a 105 mg/100 ml. El nivel de glucosa en sangre es mantenido por medio de los almacenes de glucogeno . El organismo contiene la enzima especifica glucosa-6-fosfatasa , necesaria para la conversin de glucosa-6-fosfato a glucosa. Los niveles de glucosa en sangre se incrementan usualmente por absorcin de carbohidratos desde el intestino. La glicolisis es remplazada por la glicogenesis , la cual convierte los excesos de glucosa en sangre a glucogeno muscular. La hormona principal que regula la concetracin de glucosa en sangre es la Insulina. Esta hormona es producida por las celulas beta de las isletas de Langerhans en el pancreas. Esta hormono promueve la Glicogenesis y lipogenesis (formacin de grasa a partir de carbohidratos), con un resultado en la disminucin de los niveles de glucosa en sangre. Otro accin importante de la Insulina es incrementar la permeabilidad de las celulas a la glucosa. Una deficiencia en la produccin de Insulina provoca un problema llamado Diabetes. Los niveles de glucosa tienden a incrementarse (hiperglicemia) y el cuerpo presenta menos habilidad para metaboliza los carbohidratos. Otro problema es cuando se produce un exceso de insulina, rsultando en niveles bajos de sangre (hipoglicemia).

46

CUESTIONARIO. 1. Que importancia clinica tiene la determinacin de glucosa serica. 2. Cuales son los parmetros normales de glucosa serica en perros y bovinos. 3. Que hormona se encarga de regular los niveles de glucosa en sangre y donde es secretada

METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA ( KIT LAB.)

PROCEDIMIENTO. 1. Extraer una muestra de sangre . 2. Centrifugar la sangre por 10 minutos a 3000 rpm. 3. Separe el suero y aplicar el siguiente analisis TUBO Blanco Estandar Suero REACTIVO DE GLUCOSA BLANCO 0.05 ml ------5ml PATRON -----0.5 ml ----5ml PROBLEMA ---------0.5 ml 5ml

Dejar a temperatura ambiente por 10 minutos y leer a 630 nm. Valores Normales: si se encuentra en el rango de 70 a 105 mg/100 ml. Calculos: Mg/100 ml de Glucosa = ( abs. del Problema/Abs. del Patron) (Conc. Patron)

47

PRACTICA # 15 CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO Y HDL COLESTEROL

OBJETIVO: Determinar la concentracin de colesterol srico y analizar las implicaciones clnicas de niveles anormales de colesterol. PREREQUISITOS. 1. 2. 3. 4. Estructura, funcin y tipos de colesterol Relacin metablica entre el colesterol y las lipoprotenas Anlisis de la digestion del colesterol esterificada y no esterificado Relacin de las Lipotrotenas plasmticas con la Aterognesis.

INTRODUCCION. El colesterol es uno de los lpidos que se encuentran en mayor concentracin en la sangre, se puede afirmar que la fraccin lipdica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentracin y sta se localiza principalmente formando parte de las lipoprotenas. Qumicamente el colesterol es un compuesto cclico con estructura bsica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6. El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en muy pequeas cantidades y como colesterol esterificado mediante la unin de un cido graso no saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo de colesterol es el ms frecuente tanto en sangre como en tejidos. La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hgado, sto implica que el colesterol exgeno tenga menor importancia metablica. La sntesis de colesterol endgeno es activada en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que ste funciona como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolmicos que aumentan la sntesis de colesterol o bin disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado. El colesterol exgeno se reduce en el intestino por medio de enzimas bacterianas para dar lugar al colestanol y as entra a la sangre en pequeas concentraciones, otra parte del colesterol exgeno se convierte en un producto de excresin llamado coprostano que se libera con las heces. El colesterol endgeno con frecuencia se cataboliza en el hgado y en otros rganos. El 7-dihidrocolesterol se obtiene por oxidacin del colesterol;

48

ste compuesto predomina en la piel y en presencia de radiacin ultravioleta se convierte en colecalciferol que es una de las formas de vitamina D. Otros productos del catabolismo del colesterol son los cidos biliares que en general se deben a una carboxilacin de la cadena lateral del colesterol y sta reaccin sucede en el hgado. Entre los cidos biliares ms comunes est el cido clico, el cido desoxiclico, cido quenodesoxiclico y el cido litoclico. Por ltimo, otros metabolitos son la progesterona y los esteroides corticales, as como hormonas andrognicas y estrognicas.

DETERMINACION DE COLESTEROL SERICO Y HDL-COLESTEROL METODOLOGIA Cuantificacin de colesterol srico y HDL-colesterol, por la tcnica de Lieberman - Buchard. Fundamento qumico : Esta tcnica se basa en utilizar los derivados polienos del colesterol como elementos cromforos( que dan reaccin de color). En presencia de cido sulfrico concentrado y anhdrido actico ( reactivo de colesterol) se producen diferentes tonalidades de color verde cuya tonalidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Los polienos son estructuras cclicas que resultan de la oxidacin del colesterol. La cuantificacin de HDL colesterol se determina por mtodos de precipitacin en los cuales la formacin de complejos insolubles se debe a interacciones entre los grupos cargados negativamente de los polianiones y los grupos positivos de las subunidades proteicas de las lipoprotenas

TECNICA: preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro. Tomar muestra sanguinea y sin anticuagulante y centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. REACTIVOS TUBO PROBLEM A 0.05 ml. --------------2.0 ml. HDLCOLESTEROL ----------------0.05 ml 2.O ml TUBO TUBO BLANCO PATRON o STANDAR ----------0.05 ml. ----------0.05 ----------2.0 ml. 2.0 ml

SUERO SOL. PATRON AGUA SOBRENADAN TE II REACTIVO DE COLESTEROL

49

Sobrenadante: A 0.5 ml de suero, agregar 0.05 ml de Reactivo precipitante de HDL-COLESTEROL, mezclar, reposar 5 minutos y centrifugar 5 min a 3000 rpm.( sobrenadante II) Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20 minutos a temperatura ambiente y aadir en forma directa sobre la superficie del lquido 0.20 ml. de Acido sulfrico concentrado. Colocar los tubos por separado inmediatamente despues de la adicin del cido sulfrico en un bao de agua a temperatura ambiente y agitar suavemente. Se deben mantener los tubos en bao de agua mnimo 5.0 minutos. Leer la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda de 640nm. CALCULOS: [Colesterol Total] = Abs. problema / Abs. del Patrn X [ conc. patrn mg/dl ] Valor normal hasta 280 mg/dl [ HDL-COLESTEROL ] = Abs problema / abs patrn x [ conc. Patrn]

PERFIL DE LIPIDOS RESULTADOS COLESTEROL TOTAL.____________ Normal Edad 0 - 19 20 a 29 30 a 39 50 a 59 TRIACILGLICERIDOS _____________ Normal Edad TRIACILGLICERIDOS 0 A 29 30 a 39 40 a 49 50 a 59 COLESTEROL DE ALTA DENSIDAD ____________ COLESTEROL DE BAJA DENSIDAD ____________ Colesterol total HDL - VLDL COLESTEROL DE MUY BAJA DENSIDAD __________ Trigliceridos/5 = VLDL FACTOR DE RIESGO CORONARIO = Colesterol total/HDL Hombres Mujeres Promedio 3,43 3.27 50 Colesterol total 120-330 mg/dl 120 a 240 mg/dl 140 a 270 mg/dl 160-330 mg/dl

10 A 140 mg/dl 10 a 150 mg/dl 10 a 160 mg/dl 10 a 190 mg/dl 30 A 75 mg/dl 66 A 178 mg/dl 2 A 36 mg/dl

Promedio 2 Veces el Promedio 3 Veces el promedio

4.97 9.55 23.39

4.44 7.05 11.04

COLESTEROL TOTAL NORMALES 150 - 280 mg/dl 3.9 - 7.2 mmol/lt AUMENTADO DISMINUIDO Hipercolesterolemia familiar Hepatitis Aguda Hipotiroidismo Ocacionalmente Bajo en Hipertiroidismo, infeccion aguda, desnutricion, anemia crnica y deficiencia de apolipoproteinas. Diabetes Mellitus mal controlada Sndrome Nefrtico Hepatitis crnica Cirrosis Biliar Ictericia Obstructiva Hiperproteinemia Lipidemia (idioptica familiar) Embarazo `

CONCLUSIONES

51

You might also like