MODULO I Ao 2010

Biologa Molecular de la Piel

Carrera de Especializacin en Dermatologa Autor: Dr. Ramiro E. Lorente
Directora: Prof. Dra. Ana Mara Lorenz

FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

Admin Carrera de Especializacin en Dermatologa MODULO I Ao 2010

the minute you let her under

your skin then you begin to make it better Paul McCartney

Ilustracin de tapa: Microfotografa electrnica de una Clula de Langerhans en migracin.

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MODELOS DE ANIMALES TRANSGNICOS.....36 RATONES TRANSGNICOS...................37

CONTENIDO
THE MINUTE YOU LET HER UNDER YOUR SKIN....................2 THEN YOU BEGIN TO MAKE IT BETTER................................2 PAUL MCCARTNEY.....................2 CONTENIDO..............................3 INTRODUCCION.........................4 HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR.............................5 LA PIEL: BIOLOGA MOLECULAR. 9 EPIDERMIS....................................9 LA MEMBRANA BASAL.......................16 UNIONES INTERCELULARES..................18 CLULAS NO KERATINOCTICAS DE LA EPIDERMIS...................................20 DERMIS.....................................23 PROTENAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR...23 COMPONENTES CELULARES DE LA DERMIS. .25 HIPODERMIS.................................26 TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR UTILIZADAS EN DERMATOLOGA......................28 PROCESAMIENTO DEL TEJIDO................28 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA. 29 SECUENCIAMIENTO DE ADN................30 TRANSCRIPCIN - REVERSA PCR (RT-PCR) ..............................................31 WESTERN BLOT.............................32 MICROARRAY................................33 PROTEMICA CON ESPECTROMETRA DE MASA ..............................................35

CONCLUSIONES.......................39 AGRADECIMIENTOS.................40 BIBLIOGRAFA.........................41 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 42

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comenz a llamarse a s mismo bilogo molecular:

INTRODUCCION
El trmino Biologa Molecular fue introducido por Warren Weaver que se desempeaba como Director de la Seccin de Ciencias Naturales de la Fundacin Rockefeller en un reporte de 1938: ...y gradualmente est llegando una nueva rama de la ciencia Biologa Molecular que est comenzando a dejar al descubierto muchos secretos concernientes a la unidad fundamental de la clula viviente.donde tcnicas modernas estn siendo usadas para investigar cada vez mas detalles minsculos de ciertos procesos vivientes1; Tambin podemos citar la opinin que W. Astbury tiene sobre biologa molecular: "...no tanto una tcnica como un enfoque, un enfoque desde el punto de vista de las llamadas ciencias bsica con la idea principal de la bsqueda por debajo de las manifestaciones a gran escala de la biologa clsica para el plan molecular correspondiente. Le preocupan particularmente las formas de las molculas biolgicas y es predominantemente tridimensional y estructural - lo que no significa, sin embargo, que no es ms que un refinamiento de la morfologa - debe indagar al mismo tiempo en la gnesis y funcin2; Una mejor explicacin acerca del origen del trmino, viene de lo que dice Francis Crick sobre porque

me vi forzado a mi mismo a llamarme bilogo molecular porque cuando un clrigo inquisidor me pregunt acerca de lo que haba hecho, me cans de explicarle que era una mezcla de cristalgrafo, biofsico, bioqumico y genetista, una explicacin que en cada caso encontraba muy difcil de entender3. El Human Genome Project da la siguiente definicin de biologa molecular: Es el estudio de la estructura, funcin y composicin de molculas biolgicamente 4 importantes . Este trabajo se ocupar primero del desarrollo de la biologa molecular, y luego en describir la estructura de la piel haciendo nfasis en los componentes moleculares de importancia.

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HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

Al principio del siglo XX el campo de la gentica estaba regulado por las leyes Mendelianas de Segregacin y de Segregacin Independiente5, pero los procesos de reproduccin gnica, mutacin y expresin eran desconocidos. Thomas H. Morgan crea un equipo de investigacin que toma a la mosca de la fruta (Drosophila) como modelo para estudiar la relacin entre los genes y los cromosomas en el proceso hereditario6,7. Un estudiante de Morgan, Hermann J. Mller, reconoce en los genes las bases para la vida, y direcciona su trabajo para investigar su estructura, descubre que los rayos x tenan efectos mutagnicos en la mosca Drosophila y utiliza este fenmeno para estudiar el tamao y naturaleza de los genes. A pesar de los grandes avances de Mller, este reconoce que no puede extender su investigacin al nivel de explicar las propiedades fundamentales de los genes y sus acciones. En un ensayo publicado 1936 dice: El genetista por s mismo es intil para analizar nuevas propiedades (en los genes). Aqu los fsicos, as como los qumicos deben dar un paso adentro. Quin ser voluntario para hacerlo?.8. En la siguiente dcada mucho fsicos famosos mostraron atencin por la biologa, ms especficamente por la herencia biolgica, en 1944 el fsico Erwin Schrdinger publico What

is life? (Qu es la vida?)9, proponiendo de una manera entusiasta como la fsica cuntica podra explicar la estabilidad, incluso la mutabilidad de los genes10, reduca los genes a la fsica especulando con cristales aperidicos involucrados en la codificacin de la herencia. Muchos cientficos jvenes fsicos y bilogos se vieron fuertemente influenciados por este libro, llevndolos a considerar nuevas direcciones en la investigacin, lo que aos ms tarde tendra gran influencia en la Biologa Molecular.

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Otro fsico famoso interesado por la biologa era Max Delbrueck discpulo del fsico cuntico Neil Brh, quien como su maestro buscaban en contraparte con Schdinger no buscaban explicar los procesos biolgicos reducindolos a fenmenos fsicos sino entendiendo como cada disciplina poda complementar a la otra.

Salvador Luria The Phage Group marcando un punto muy importante en el desarrollo de la biologa molecular. En un famoso experimento llevado a cabo por Hershey, A.D. y Marta Chase prueban que los genes no estaban compuestos por protenas sino por cido desoxirribonucleico11. Delbrueck facilitaba la colaboracin entre bilogos y fsicos pero era esquivo a los detalles qumicos que tendan puentes entre las dos disciplinas. Fue Linus Pauling un colega de Delbrueck del Cal Tech quien al contrario de este utiliz sus conocimientos en qumica estructural para estudiar la estructura de las macromolculas. Su trabajo en la terica de los enlaces qumico facilit el entendimiento sobre la estabilidad de grandes macromolculas. Este concepto abarca tanto a las protenas como a los cidos nucleicos y era un requisito para poder estudiar su estructura. Pauling utilizo cristalografa por rayos x y sumado a la construccin de modelos a escala, descubre la estructura alfa helicoidal de las protenas y eventualmente propone un modelo para la estructura del ADN12. James Watson era un estudiante de Luria del Phage Group que reconoci la necesidad de utilizar cristalografa para poder llegar a la estructura del ADN, y Francis Crick un fsico que inspirado por Erwin Schrdinger se volvo hacia la biologa y contribuyo en la teora de la cristalografa por rayos x. Estos dos cientficos coincidieron en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge y trabajaron en conjunto utilizando datos de cristalografa de rayos x de ADN
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Figura 1 Max Delbrueck y Salvador Luria

Delbrueck visit el laboratorio de moscas de Mller, pero considero que la Drosophila era demasiado compleja para descifrar los mecanismos de auto reproduccin (caracterstica nica de los seres vivos) y prefiri utilizar a los bacterifagos (bacteriophages) como objeto de investigacin, creando al inicio de la dcada de 1940 junto con

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aportados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin del King's College de Londres para crear un modelo de la estructura helicoidal doble del ADN que fue finalmente publicada en 195313, lo que trajo aparejado el comienzo del periodo clsico de la Biologa Molecular.

desarrollo de nuevas tcnicas de biologa molecular.

Figura 2 James Watson y Francis Crick

Figura 3 - Csar Milstein

Ya con la estructura del ADN en la mano, los bilogos moleculares centraron su atencin en dilucidar los mecanismos de la funcin y reproduccin gentica. Se puso nfasis en tratar de secuenciar el cdigo gentico. Los primeros pasos fueron secuenciando protenas la primera fue la de Insulina a final de los aos 50, y durante las dos dcadas siguientes se fueron desarrollando y mejorando tcnicas de secuenciacin. Adems de las tcnicas de secuenciacin, hubo aportes importantsimos desde la inmunologa con el desarrollo de anticuerpos monoclonales, (trabajo que le vali el premio Nobel a Csar Milstein en 1984), de inestimable valor para el

Con el desarrollo de la tcnica de la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa en Ingls) hacia 1985 por Kary Mullis14, se dio impulso a un programa desarrollado por el Departamento de Energa y el Instituto Nacional de Salud de los EEUU para secuenciar el genoma humano y estudiar el impacto de la radiacin de las bombas de Hiroshima y Nagasaki sobre el genoma humano. De ste proyecto derivo el ms conocido como El Proyecto Genoma Humano, que se vio envuelto en muchas controversias entre el consorcio internacional de centros de secuenciacin y las compaas privadas avocadas a la misma tarea en una especie de carrera gentica. La secuencia del genoma en bruto fue
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publicada hacia 200115, marcando un antes y un despus en la biologa molecular.

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LA

PIEL: MOLECULAR

BIOLOGA

La piel humana est dividida en dos capas primarias, la epidermis o capa externa y la dermis o capa interna. Estas dos capas estn separadas por una estructura llamada membrana basal. Debajo de la dermis hay una capa de tejido conectivo laxo, llamada hipodermis o tejido celular subcutneo, que se contina en profundidad con la capa de tejido graso. La piel de un adulto promedio cubre aproximadamente un rea de 2 m2. Desde el nacimiento a la madurez, el rea de la piel se extender siete veces. Puede llegar a pesar hasta el 15% del peso total del cuerpo adulto16, es el rgano ms grande, y recibe hasta un tercio de la volemia. La piel constituye una barrera contra el medio ambiente al mismo tiempo contribuye a mantener la homeostasis del medio interno. Es un rgano capaz de autoregenerarse, y puede soportar agresiones mecnicas y qumicas, hasta un cierto lmite. Su espesor puede variar desde 0,5 mm en la membrana timpnica a 0,6 mm en la planta de los pies.

renovacin en un ciclo que dura entre 26 y 45 das, se produce una renovacin total de la epidermis cada aproximadamente 2 meses. La
Figura 4 - Corte Histolgico de piel humana de la zona interescapular Figura 5- Corte Histolgico de piel humana de la Palma de la mano, (se
observa capa crnea ms gruesa y compactada)

epidermis constituye un epitelio escamoso estratificado compuesto por keratinocitos y la dividimos en 5 capas: estrato crneo, lcido, granuloso, espinoso y capa basal o stratum germinatuvm. El estrato crneo El estrato crneo, es la capa superficial y est compuesta de clulas muertas keratinizadas llamadas corneocitos. Est compuesto por clulas muertas dispuestas en capas finas apiladas y estn llenas en un 80% de keratina de ah el nombre de keratinocitos, rodeadas de una matriz extracelular lipdica, y tienen la funcin
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Epidermis
La epidermis es la capa mas externa de la piel, es avascular y deriva del ectodermo embrionario. Es una capa relativamente uniforme en espesor y tiene entre 75 y 150m, excepto en palmas y plantas donde tiene entre 0,4 y 0,6 mm. La capa epidrmica se encuentra en constante

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de barrera de la epidermis. La regulacin de la permeabilidad, descamacin, actividad antimicrobial, exclusin de toxinas y absorcin selectiva, estn a cargo de la matriz extracelular. La resistencia mecnica, hidratacin, promotores de inflamacin mediados por citokinas, y proteccin del dao por radiacin UV, son provistas por los corneocitos. En condiciones normales el estrato crneo est compuesto de keratinocitos completamente diferenciados. Las clulas ms superficiales son descamadas por los traumas mecnicos y qumicos de la vida diaria y en parte debido a la degradacin proteoltica de los desmosomas. La keratina es una fibra dura, insoluble, resistente a cambios de pH y a la digestin enzimtica de tripsina y pepsina. Se han identificado 54 genes funcionales de keratina, que codifican para 34 tipos de keratina epiteliales y 17 pilosas. Mutaciones a nivel de estos genes se traducen en mltiples enfermedades.

El estrato lcido El estrato lcido se encuentra directamente por debajo del estrato crneo. Esta capa puede encontrarse en reas donde la piel es gruesa como en palmas y plantas, y puede estar ausente en piel fina como la de los prpados. Puede tener entre una y cinco clulas de espesor, los lmites celulares son difciles de distinguir en el microscopio de luz. Es una capa transicional donde hay enzimas lisosomales activas que degradan el ncleo y las organellas antes de que las clulas pasen al estrato crneo. El estrato granuloso El estrato granuloso se encuentra por debajo del estrato crneo o del estrato lcido cuando este est presente. Las clulas en sta capa tienen ncleo activo. El nombre deriva de los grnulos de keratohialina contenidos en las clulas de esta capa compuestos principalmente de profilaggrina, filamentos intermedios de keratina, y loricrina. En sta capa comienza a formarse la envoltura de las clulas cornificadas. La

Tabla 1 - Expresin de genes de keratina y enfermedades asociadas

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profilaggrina polimrica se convierte en filaggrina en un proceso dependiente de Ca. Los monmeros de filaggrina agregan keratina para formar macrofilamentos, la filaggrina luego es degradada, quedando macrofilamentos de keratina. La loricrina es una protena rica en cistena que constituye el principal componente de la envoltura cornificada que se une a estructuras desmosomales. Esta protena junto con involucrina, cystatina A, protenas pequeas ricas en prolina (SRP1, SRP2, y cornifina), elafina, envoplakina son subsecuentemente cruzadas en la membrana plasmtica por las transglutaminasas tisulares (TGM1 y TGM3 principalmente) formando la envoltura de los corneocitos.
Figura 6 - Ictiosis Laminar

Mutaciones en los genes que codifican para las diferentes protenas mencionadas producen trastornos en la normal queratinizacin por ejemplo: mutaciones en el gen que codifica TGM1 estn involucradas en casos de Ictiosis Laminar; mutaciones en el gen que codifica filaggrina estn involucradas en casos de Ictiosis Vulgar; mutaciones en el gen que codifica loricrina estn involucradas en casos de Sndrome de Vohwinkel con Ictiosis y pseudoainhum.
Figura 7 - Pseudoainhum

Tambin hay situaciones donde la alteracin no est en la formacin sino en la produccin de autoanticuerpos por ejemplo en la dermatitis herpetiforme existen anticuerpos contra la TGM3. ( Figura 8) .

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Figur a 8 -

Tabla 2 - Enfermedades resultantes de la alteracin de los desmosomas

Dermatitis Herpetiforme

Las clulas de esta capa tambin contienen grnulos pequeos llamados cuerpos de Odland. En realidad ya son numerosos en las clulas de la parte superior del estrado espinoso, y se ubican en la periferia celular a medida que pasan el estrato granuloso. Vierten su contenido lipdico en el medio extracelular, contribuyendo a la funcin de barrera y cohesin celular en la capa crnea.

El estrato espinoso El estrato espinoso es la capa debajo del estrato granuloso. El nombre deriva por la configuracin en espculas que tiene las estructuras citoplasmticas de las clulas de esta capa que constituyen los desmosomas caracterstica sobresaliente de esta capa. Los desmosomas ( Figura 9 Figura 10, Figura 11) ests constituidos por una parte intracelular denominada placa y una parte extracelular denominada core. La placa contiene los polipptidos plakoglobina, desmoplakina 1 y 2, keratocalmina, desmoyokina, y plakofilina y el core contienen glicoprotenas transmembrana que son desmoglena 1 y 3, y desmocolinas 1 y 2 que son parte de la familia de cadherinas que se encargan de la adhesin en la porcin extracelular, y son dependientes de Ca. La importancia del calcio como mediador
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de la adhesin queda demostrada en dos condiciones que exhiben discohesin epidrmica caracterstica, la enfermedad de Darier ( Figura 14) o keratosis folicular y Hailey-Hailey ( Figura 12) o pnfigo crnico benigno familiar. Ambas enfermedades son producidas por mutaciones en lo genes que regulan el transporte de calcio, el SERCA2 (sarco++ endoplasmatic reticulum Ca ATPasa type 2 isoform) en la enfermedad de Darier17 y el ATP2C1 (ATPasa, Ca++ transporting type 2C, member 1) regulador de la concentracin citoplasmtica de calcio en la enfermedad de Hailey-Hailey.
Figura esquema 9 Desmosoma en

nuevo ARNm para stas keratinas, excepto en alteraciones hiperproliferativas.

Figura 10 desmosomales Protenas

Figura 11 - Microfotografa electrnica. Desmosoma

Las clulas en esta capa comienzan a sintetizar grandes cantidades de keratina K1/K10 que se agrega a la K5/K14 que todava est presente de la capa basal, pero no se sintetiza
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En estados hiperproliferativos como psoriasis, keratosis actnicas, y reparacin de heridas la sntesis de keratina K1/K10 as como el ARNm para stas sufren downregulation, y se favorece la sntesis y traduccin del ARNm para keratina K6/K16. El ARNm para K6/K16 est normalmente presente en la epidermis pero solo es traducido cuando hay una estimulacin de la proliferacin. La alteracin de las protenas que componen los
Figura 12 - Hailey-Hailey

enfermedades como se expone en la tabla 2. El estrato basal El estrato basal es la capa interna de la epidermis. Est compuesta de una capa simple de clulas mitticamente activas. Estas clulas responden a varios factores como la matriz extracelular, factores de crecimiento, hormonas, y vitaminas. El metabolismo de la piel est mediado por glucosa, y la utilizacin de esta por parte de la piel es comparable a la del msculo. Una vez q la clula deja la capa basal esta comienza una migracin hacia arriba que dura entre 2 y 3 semanas, le toma aproximadamente 14 das en moverse desde la capa basal al estrato crneo y otros 14 das pasar a la parte superior del estrato crneo y descamar.
Figura 14 - Enfermedad de Darier

desmosomas se traducen en varias

Figura 13 - Keratodermia estriada

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Las clulas pluripotenciales (stemlike cells) epidrmicas comprenden aproximadamente un 10% del total de clulas basales. Estas clulas tienen un ciclo celular muy lento y cuando se dividen las clulas hijas que se diferenciarn a medida que se mueven hacia la capa crnea son llamadas clulas amplificadoras transitorias ( Figura 16), stas constituyen el 50% de la poblacin de keratinocitos basales. Una parte de la poblacin de clulas madre puede ser encontrada en las criptas epidrmicas de las crestas de la dermis y en el bulbo de los folculos pilosos. Las clulas en divisin pasan por el ciclo celular y la fase G1 es acortada en estados como la reparacin de heridas. El ciclo celular normal de un keratinocito es de alrededor de 300 horas pero puede ser tan corto como 36 horas en ciertos estados patolgicos como la psoriasis

Figura 15 - Psoriasis

Las stem cell y las clulas amplificadoras transitorias, tienen ambas capacidad para divisin celular limitada o contina, y son las que tienen ms probabilidad de residir el tiempo suficiente en la piel para sufrir modificaciones genticas que lleven a desarrollar cncer de piel. El uso de clulas madres provenientes de la capa basal de la piel es un rea de creciente investigacin y desarrollo18.

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 Figura 16 Amplificadoras

Esquema.

Clulas

La membrana basal
La zona de membrana basal o unin dermo-epidrmica, constituye la interface entre dermis y epidermis. Est dividida en dos zonas llamadas lmina lcida y lmina densa, segn su densidad en la microscopa electrnica. La principal funcin reside en servir de anclaje entre la dermis y la

Figura 17 - Esquema de la matriz de la membrana basal

epidermis y proveer resistencia ante fuerzas cizalladoras externas. Sirve como soporte de la epidermis, determina la polaridad de crecimiento, dirige la organizacin del citoesqueleto en las clulas basales, provee seales de desarrollo, y acta como barrera semipermeable. La membrana basal est formada por las interacciones especficas entre las protenas, laminina, colgeno tipo IV, nidogen, y perlecam. Tambin
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encontramos fibronectina, y glicosaminoglicanos. Encontramos una menor cantidad de colgeno tipo VII, pero ste juega un papel importante en el anclaje de clulas a la lmina densa. Puede ser dividida en tres redes supramoleculares: el complejo hemidesmosoma-filamento de anclaje, la membrana basal propiamente dicha, y la fibrillas de anclaje. El rol crtico de sta regin de mantener la integridad estructural de la piel, se pone de manifiesto con el gran nmero de mutaciones en los componentes de la unin dermoepidrmica que causan enfermedades ampollosas como por ejemplo el colgeno tipo VII. Estas son agrupadas de acuerdo al grado de escisin dentro de la unin dermoepidrmica, por ejemplo la ms superficial es la epidermlisis bullosa simple donde hay escisin de los keratinocitos basales; epidermlisis bullosa de la unin escisin entre la lmina lcida y la lmina densa y la epidermlisis bullosa distrficas que es la ms profunda donde existe escisin entre la sublmina densa y los filamentos de anclaje.

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Uniones Intercelulares
Adems de los desmosomas ya descriptos, hay otros tipos de uniones intercelulares, que no tan solo contribuyen a la interaccin mecnica, sino que son responsables de la interaccin bioqumica y de seales entre clulas. Estas uniones incluyen Uniones ocluyentes (tight), uniones adherentes (adherens), y uniones GAP. Uniones adherentes Las

clula adyacente. El anclaje principal a citoesqueleto de actina es mediante catenina adems de otros componentes como p120ctn, catenina, plakoglobina, -actinina, vinculina, VASP (vasodilatador stimulated phosphoprotein). No se han identificado dermatosis asociadas a anormalidades primarias en la estructura de los componentes de las uniones adherentes, aunque la plakoglobina, asociada a una mutacin en la enfermedad de Naxos, tambin es componente de los desmosomas.
Figura 18 - Microfotografa electrnica. Uniones gap

uniones

adherentes estn constituidas por estructuras transmembrana, que se asocian con el esqueleto de actina, parte de la red de filamentos de los keratinocitos. Los componentes transmembrana estn constitudos por Ecadherina, que formas interacciones adhesivas hemoflicas calcio dependiente con la E-cadherina de la
Figura 20 - Esquema. Uniones gap

Figura 19 - Ecadherinas. Unin Ca dependiente

Uniones gap Las uniones gap comprenden grupos de canales intercelulares, conocidos como conexones, que directamente forman conexiones entre

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el citoplasma de keratinocitos adyacentes (tambin presentes en otras clulas). Hay descriptas cerca de trece conexinas diferentes en el humano. Los conexones se originan mediante el ensamblaje de seis conexinas dentro del complejo de Golgi que son transportadas a la membrana plasmtica, donde se asocian con otros conexones para formar la unin gap. Las uniones gap pueden ser homotpicas o heterotpicas dependiendo del tipo de conexinas. La formacin y estabilidad de las uniones gap estn reguladas por la quinasa de protena C, Src quinasa, concentracin de Ca, calmodulin, AMPc, y el pH local. Mediante las uniones gap, clulas vecinas comparten metabolitos de bajo peso molecular (<1000 Da) e intercambian iones, esto permite la coordinacin intercelular y uniformidad. Alteracin en genes que codifican para conexinas, estn implicados en varias formas de queratodermias y prdida de la audicin. Hay genodermatosis especficamente asociadas a conexinas, como el sndrome de Vohwinkel, formas autosmicas dominantes y recesivas de eritrokeratodermias, sndrome de Clouston, y sndrome KID (queratitis, ictiosis, deafness [sordera]). Uniones ocluyentes Las uniones ocluyentes intercelulares constituyen los mayores reguladores de la permeabilidad en el epitelio simple y estn presentes en la piel con un rol clave manteniendo la funcin de barrera de la piel. Estn constituidas por protenas transmembrana e intracelulares como

occludina, molcula de unin adhesiva, y caludinas. Adems del control de la permeabilidad, las uniones ocluyentes, contribuyen al mantenimiento de la polaridad celular. Las claudinas tendran la capacidad para regular la permeabilidad epidrmica ya sea con la formacin de uniones oclusivas o mediante la unin directa a ciertos factores de transcripcin. La asociacin con otros factores de transcripcin como Kruppel like factor 4 (Klf4), o enzimas como Transglutaminasa 1, que son conocidos reguladores de la permeabilidad al producir los enlaces cruzados en las protenas de la envoltura de los corneocitos, no est del todo establecida, pero en ratones donde se produce la ablacin gentica de claudina 1, o Klf4 o transglutaminasa 1, muestra patrones similares en la alteracin de la barrera epidrmica. Esto sugiere que para un correcto control de la permeabilidad de la piel, adems de las uniones
Figura 21 - Esquema. Unin ocluyente

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ocluyentes en la capa granulosa se necesita una correcta organizacin de la envoltura de los corneocitos en la capa crnea.
Figura 22 - Esquema. Protenas de unin ocluyente

pesar del color de piel, un melanocito cada 36 clulas basales aproximadamente.

No se han asociado dermatosis con anormalidades primarias en las protenas de las uniones oclusivas, sin embargo, se ha notado expresin anormal de algunos componentes como la ocludina en dermatosis inflamatorias como la psoriasis. ( Figura 15)

Figura 23 Melanocito. Tincin para tirosinasa

Clulas no keratinocticas de la epidermis.

Los melanocitos son clulas dendrticas derivadas de la cresta neural sintetizadoras pigmentos que residen principalmente en la capa basal. Bajo el microscopio de luz, son reconocidas por su citoplasma plido, ncleo ovoide, y el color de melanosomas llenos de pigmento, que son la organella distintiva de estas clulas. Los melanocitos ya pueden ser detectados el piel a los 50 das de gestacin y bajo condiciones normales no se dividen. En la piel normal, el nmero de melanocitos es el mismo a

Las dendritas de los melanocitos son las responsables de distribuir el pigmento a un gran nmero de keratinocitos. La principal diferencia entre la piel clara y oscura es la cantidad y distribucin de los melanosomas y la actividad de los melanocitos. La funcin de los melanocitos se pone de manifiesto en patologas como el vitligo, donde se produce una deplecin de melanocitos por accin autoinmune.

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 Figura 24 - Vitiligo

piel sin pelos de los dedos, labios, cavidad oral, y la hoja externa de los folculos pilosos. Al igual que otras clulas no keratinocticas las clulas de Merkel tienen un citoplasma plido en las tinciones.

Otros desrdenes de la pigmentacin son causados por defectos en la melanognesis, que puede estar en la sntesis de melanina, produccin de melanosomas, y transporte de melanosomas y transferencia a los keratinocitos. La interaccin entre melanocitos y keratinocitos es crtica para la homeostasis y diferenciacin del melanocito, influyendo en la proliferacin, dendricidad y melanizacin. El estudio de los melanocitos ha crecido notablemente sobre todo como parte del estudio de los melanomas, donde se han descubierto nuevos mecanismos de supervivencia tumoral, con prometedoras implicancias 19 teraputicas. Las clulas de Merkel, son mecanoreceptores de adaptacin lenta tipo 1, localizados en sitios de alta sensibilidad tctil. Estn presentes entre los keratinocitos basales en regiones particulares del cuerpo, incluyendo piel cubierta de pelos y en

Figura 25 - Carcinoma de clulas de Merkel. Marcado hinmunohistoqumico mostrando patrn punteado perinuclear caracterstico.

Figura 26 - Carcinoma de clulas de Merkel. Muestra rpido crecimiento. Ndulo violceo en dedo del pie.

Los marcadores inmunohistoqumicos incluyen K8, K18, K19, y K20 pptidos de keratina. K20 est restringido a las clulas de Merkel en la piel as que se considera el marcador ms confiable. Ultraestructuralmente son fcilmente reconocibles por los grnulos densos, limitados por membrana, que se coleccionan en oposicin al aparato de
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Golgi y prximos a una neurita amielinizada. Estos grnulos son similares a los encontrados en neuronas y contienen sustancias similares a neurotransmisores y marcadores de clulas neuroendocrinas, incluyendo metaencefalina, pptido vasoactivo intestinal, enolasa neurona-especfica, y sinaptofisina. Las clulas de Merkel pueden sufrir transformacin originando neoplasias (carcinoma neuroendocrino primario) que son particularmente agresivos y difciles de tratar.

la epidermis. A raz de su funcin estas clulas estn implicadas en mecanismos patolgicos como dermatitis de contacto, leishmaniasis cutnea, e infeccin por HIV. Las clulas de Langerhans estn reducidas en la epidermis de pacientes con ciertas condiciones patolgicas como psoriasis, sarcoidosis, y dermatitis de contacto. Su funcionalidad se ve afectada por la radiacin UV, especialmente la UVB. Por su efectividad como presentadora de antgenos y estimulacin de linfocitos, ests clulas estn siendo estudiadas como vehculos para el tratamiento de tumores y el desarrollo de vacunas anti-tumorales.20,21

Figura 27 - Clula de Langerhans en epidermis.

Las Clulas de Langerhans son clulas dendrticas procesadoras y presentadoras de antgenos de la epidermis. Aunque no son exclusivas de la epidermis representan del 2% al 8% del total de clulas epidrmicas. Se encuentras comnmente en posicin supra basal, pero pueden estar distribuidas por la capa basal, espisona, o granulosa. Se tien plidamente en los preparados histolgicos, y tienen un ncleo complejo. El citoplasma contiene estructuras caractersticas llamadas grnulos de Birbeck. Su funcin principal es tomar muestras y presentar antgenos a las clulas T de

Figura 28 - Microfotografa electrnica de una Clula de Langerhans en epidermis. Flechas

indican Grnulos de Birbeck. En recuadro se puede apreciar la forma en raqueta, las flechas curvas indican la fusin tipo cierre de la parte vesicular. N indica el ncleo

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Dermis
La dermis est constituida por elementos tejido conectivo fibroso, filamentoso, y difuso, que soporta redes vasculares y nerviosas, apndices epidrmicos y muchos tipos de clulas incluyendo fibroblastos, macrfagos, mastocitos, y clulas transitorias del sistema inmune. La dermis forma la mayora de la piel y la provee de flexibilidad, elasticidad, y resistencia a la tensin. Protege el cuerpo de traumatismos mecnicos, retiene agua, colabora en la termorregulacin e incluye receptores para estmulos sensoriales. La dermis interacta con la epidermis en el mantenimiento de ambas capas, colaborando durante el desarrollo y la morfognesis de la unin dermoepidrmica, y los apndices epidrmicos, e interactan en la remodelacin de la piel luego de una injuria. La dermis puede ser dividida en dos regiones principales, la dermis papilar superior, y la dermis reticular inferior. Estas regiones pueden ser identificadas en los cortes histolgicos ya que difieren en la organizacin del tejido, la densidad celular y la distribucin de vasos y nervios. La dermis papilar colinda con la epidermis, moldea su contorno, y tiene usualmente el doble del espesor de la dermis. La dermis reticular forma el grueso de la dermis. Est compuesta principalmente por fibras colgenas gruesas, organizadas in grandes haces de fibras entretejidas, con ramas de fibras elsticas rodeando los haces. En la piel normas, las fibras elsticas y los haces colgenos

aumentan de tamao progresivamente hacia la hipodermis. El plexo subpapilar, es un plano horizontal de vasos, marcando el lmite entre la dermis papilar y la dermis reticular. El lmite inferior de la dermis reticular est definido por la transicin de tejido conectivo fibroso a tejido conectivo adiposo en la hipodermis.
Figura 29 Estructura helicoidal triple del colgeno.

Protenas de la matriz extracelular

Colgeno El colgeno es la principal protena estructural encontrada en la dermis y es secretada por fibroblastos drmicos como procolgeno, que se transforma en colgeno en el medio extracelular por accin de las enzimas ADAMTS-2, 3, y 4 (a desintegrin and a metalloproteinase with thrombospondin repeats)22 actuando como procolageno-N-proteinasa y por BMP1/Tolloid-like family (bone morphogenetic protein 1; Tolloid identifica originalmente la misma enzima en la Drosophila) actuando en el lado C terminal ( Figura 32). Una
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actividad defectuosa en las procolageno-N-proteinasas, se encuentran en el sndrome de EhlersDanlos VIIc ( Figura 30), con una fragilidad extrema de la piel.
Figura 30 - Sndrome de EhlersDanlos

los encontramos asociados a los costados de los formadores de fibras principales como monmeros, extendindose en la matriz circundante asocindose con los proteoglicanos, ayudando a relacionar las fibras colgenas con los dems componentes de la matriz extracelular.
Figura 32 - Ensamblaje de las fibras de colgeno

El principal tipo de colgeno que encontramos en la piel es el colgeno tipo I, uno de los tipos de colgeno formadores de fibras, representa alrededor del 77% al 85% del colgeno presente. El colgeno tipo III, tambin formador de fibras representa casi todo el colgeno restante. Los colgenos tipo V y VI, tambin pueden estar presente en pequea cantidad. Los colgenos tipo IX y XII, no son formadores de fibras por s mismos, y

El colgeno proporciona a la piel su fuerza, para darse una idea, el colgeno es el que le proporciona al cuero de vaca su fuerza y durabilidad. Los aminocidos que forman al colgeno son prolina, glicina, hidroxiprolina, e hidroxiglicina. Elastina

Figura 31 - Comparacin entre la fibra de colgeno y la elastina.

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La elastina es la protena que le proporciona a la piel su elasticidad. Esta previene a la piel de ser permanentemente remodelada. La elastina al igual que el colgeno ( Figura 31), es una protena formadora de fibras y tiene una gran cantidad de glicina y prolina en su composicin pero carece de grandes cantidades de hidroxiprolina. Las fibras de elastina forman estructuras similares a un resorte que permite ser estirada y luego retornar a su forma original. La cantidad de elastina en la piel representa menos del 2% de su peso seco. Alteraciones en los genes que codifica para elastina da lugar a fenotipos de cutis laxa. Proteoglicanos y glicosaminoglicanos Los Proteoglicanos y glicosaminoglicanos (PGs y GAGs), constituyen la sustancia basal, que se encuentra entre las fibras colgenas y elastina. Dentro de estas categora estn incluido el condrotitn sulfato y dermatn sulfato (versican, decorin, biglycan), condrotitn sulfato y dermatn sulfato proteoglicanos (syndecan, perlecan), y condroitn-6sulfato proteoglicanos. Aunque estas protenas solo representan cerca del 0,2% del peso seco de la dermis, estas molculas son muy importantes ya que son capaces de retener 1000 veces su volumen en agua, y tienen un rol muy importante en la hidratacin de la piel determinando su volumen y compresibilidad. Tambin encontramos en la dermis acido hialurnico que es mucho ms abundante en la piel fetal donde facilita

la migracin celular. Este material puede asociar factores de crecimiento y facilita la conexin celular con otros materiales de la matriz extracelular.

Componentes celulares de la dermis

Los componentes celulares de la dermis son fibroblastos, macrfagos, y mastocitos. Son encontrados ms frecuentemente alrededor de la regin papilar y rodeando los vasos del plexo subpapilar. Tambin podemos encontrarlos en la dermis reticular entre las fibras colgenas. Los fibroblastos son clulas mesenquimticas que migran a travs del tejido y son responsables de la sntesis y degradacin de los componentes fibrosos y no fibrosos de la matriz proteica y de algunos factores solubles. Los fibroblastos proveen de un marco estructural a la matriz extracelular a la vez que promocionan la interaccin dermo-epidrmica mediante la sntesis de mediadores solubles. Juegan un rol importante en la reparacin de heridas y cicatrizacin donde aumentan su proliferacin y actividad sinttica.
Figura 33 - Fibroblastos

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Los macrfagos, monocitos y clulas dendrticas drmicas, constituyen el sistema de clulas fagocticas mononucleares en la piel.
Figura 34 - Macrfago fagocitando bacterias (en amarillo)

de activacin pueden volverse hiperproliferativos e hiperplasicos (mastocitosis). Los mastocitos son responsables de la reaccin de hipersensibilidad inmediata en la piel y en el mantenimiento de estados inflamatorios subagudos y crnicos.
Figura 35 - Urticaria

Los macrfagos derivan de precursores en la mdula sea, se diferencian en monocitos circulantes en el torrente sanguneo, luego migran a la piel para diferenciarse en macrfagos. Estas clulas son fagocticas, procesan y presentan antgenos, son microbicidas, tumoricidas, secretan factores de crecimiento, citoquinas y otras molculas inmunomoduladoras, y estn involucradas en la reparacin de heridas y remodelacin de tejidos. Los mastocitos son clulas secretoras especializadas que en la piel estn presentes en gran densidad en la dermis papilar, cerca de la unin dermoepidrmica, y alrededor de vasos sanguneos y nervios del plexo subpailar. Tambin son comunes en la grasa subcutnea. Los mastocitos son identificados histolgicamente por un ncleo oval y redondeado y por abundantes grnulos oscuros citoplasmticos. La superficie de los mastocitos est cubierta con fibronectina que probablemente asegura a la clula a la matriz de tejido conectivo. En determinados estados

Sintetizan y secretan grnulos cargados de histamina, heparina, triptasa, quimasa, carboxipeptidasa, factor quimiottico neutrofilico, y factor quimiotctico eosinoflico anafilctico.

Hipodermis
El tejido de la hipodermis asla al cuerpo, sirve como reserva energtica, amortigua y protege la piel y facilita su movilidad sobre las estructuras subyacentes. Tiene efecto cosmtico moldeando el contorno corporal. El lmite entre la dermis reticular y la hipodermis, es una transicin abrupta del tejido conectivo fibroso de la dermis al tejido adiposo de la hipodermis. A pesar de la separacin anatmica, las dos regiones estn estructuralmente y funcionalmente conectadas por una red de vasos y nervios y la continuidad de apndices epidrmicos. Folculos pilosos en
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crecimiento activo pasan la dermis y se extienden en la grasa subcutnea, y las glndulas sudorparas apcrinas y crinas, estn normalmente confinadas a esta profundidad de la piel. Los adipocitos de la hipodermis estn organizados en lbulos definidos por septos de tejido conectivo, que contienen los vasos, nervios y linfticos.
Figura Subcutneos 36 Adipositos

subcutnea est ausente en reas de lesin seas, o con esclerodermia, donde la grasa subcutnea es reemplazada por tejido conectivo fibroso. Estas regiones tienden a desarrollar lceras crnicas. La piel de pacientes con esclerodermia es tensa y dolorosa.

La sntesis y acumulacin de grasa es continua ya sea mediante la acumulacin de lpidos dentro de los adipocitos, proliferacin de adipositos existentes, o mediante la recluta de nuevas clulas del mesnquima indiferenciado. La hormona leptina, secretada por los adipocitos, provee una seal de retroalimentacin de larga duracin regulando la masa grasa. Los niveles de leptina son ms elevados en los adipositos subcutneos que en los mesentricos, sugiriendo un rol del a leptina en el control de la distribucin de los adipositos. La importancia de la grasa subcutnea se pone de manifiesto en los pacientes con sndrome de Werner (defecto molecular en la enzima RecQ DNA helicasa), donde la grasa
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Tcnicas de biologa molecular utilizadas en dermatologa

Los avances en biologa molecular estn cambiando rpidamente nuestro conocimiento sobre la biologa de la piel y sus enfermedades. El aumento de informacin se traslada en nuevos diagnsticos moleculares que estn transformando la prctica clnica de la dermatologa. Pero hay que usarlos de una manera prudente.

En este captulo, se profundizara sobre las tcnicas de biologa molecular tiles en dermatologa. Como enfermedad modelo utilizaremos el melanoma. Se discutir el rango de tcnicas disponibles por el dermatlogo para elucidar las bases moleculares del melanoma, para luego realizar un tratamiento efectivo. Se estudiara las tcnicas de biologa molecular que permiten analizar ADN, ARN y protenas de las clulas del melanoma. Luego, se analizaran las posibles terapias genticas. Todo esto contribuir con importante informacin para el pronstico, consejo teraputico y screening a futuro del melanoma.

Procesamiento del tejido

Para determinar los cambios moleculares producidos que llevaron a la formacin de un melanoma, primero hay que terminar como se procesara la muestra elegida la obtencin de ADN, ARN o protenas. El melanoma extrado puede ser procesado de cuatro formas diferentes. ( Figura 37) 1. El tejido en fresco puede ser colocado en un medio de cultivo y las clulas del melanoma pueden ser cultivadas en una incubadora. Estas clulas permiten obtener ms clulas que las de la muestra original y exponerlas a distintas condiciones. 2. Procesar el tejido fresco con bferes y reactivos para extraer ADN, ARN y protenas de toda la masa tumoral y en calidad elevada.
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Figura 37 - Procesamiento de una muestra de tejido

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3. El tejido puede ser fijado en formol (para microscopia ptica) o en glutaraldehido (para microscopia electrnica) y luego ser analizado histolgicamente en distintas formas, incluyendo tinciones de rutina, inmunohistoqumica o hibridacin in situ. 4. La muestra puede ser congelada para una extraccin diferida del ADN, ARN o protenas. Tambin nos permite obtener cortes para el estudio histolgico. Otra opcin es usar micro diseccin por captura laser (LCM) para aislar clulas individuales del melanoma para su posterior anlisis a partir de un preparado histolgico visualizado en el microscopio. ( Figura 38) Luego de la extraccin del ADN, ARN o protenas del melanoma, queremos detectar las posibles mutaciones en proto-oncogenes o en genes supresores de tumores responsables de la neoplasia. Por ejemplo, suponiendo que es conocido en el melanoma la mutacin del gen toomuchsun, para obtener solo este

gen del total del ADN, podemos utilizar la tcnica de biologa molecular Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) que nos permitir aislar el gen buscado y amplificar la cantidad del mismo para hacerlo medible. El ADN amplificado por PCR que contiene el gen, puede ser clonado en plsmidos bacteriales para una fcil manipulacin y luego ser secuenciado usando tcnicas de secuenciacin por fluorescencia automatizada (Fig. 4.4). En base a los resultados de la secuenciacin, sobremos si la mutacin se encuentra presente en el gen toomuchsun en el tumor bajo estudio.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Objetivo de la tcnica: amplificar una porcin especfica de ADN

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Requerimientos: se necesita conocer la secuencia especifica del ADN problema (al menos las porciones finales)

Cadenas cortas de ADN llamadas oligonucletidos, son diseadas para hibridarse con una secuencia especifica de ADN.

Conceptos sobresalientes Mtodo La Los cebadores (primers) son Figura 38 - Captura por Microdiseccin Lser doble oligonucletidos diseados para cadena de ADN puede ser separada hibridarse en secuencias especficas en cadenas nicas aumentando la situadas en los extremos del ADN de temperatura (desnaturalizacin); ( inters. Estos cebadores son Figura 40) aumentando la temperatura agregados a una mezcla, junto con los nuevamente, la cadena nica pude desoxinucletidos trifosfato (dATP (A), unirse (hibridar) a secuencias de dTTP (T), dGTP (G) and dCTP (C) ) Figura 39 nucletidos complementariasSecuenciamiento de ADN ADN polimerasa , el ADN problema, por fluorescencia automtico formando una doble cadena Figura 40 - Esquema de la reaccin nuevamente (re naturalizacin). en cadena de la polimerasa (PCR) Durante el proceso de hibridacin, los nucletidos A de una cadena, se termoestable y buffer. unen con los nucletidos T de la La mezcla se coloca en tubos de cadena complementaria, mientras que PCR en un termociclador, que los nucletidos C se unen a los controla la temperatura de la reaccin nucletidos G y viceversa durante varios ciclos Durante cada ciclo se realizan los siguientes pasos: 1. Desnaturalizacin 2. Hibridacin del cebador 3. Elongacin de la cadena de ADN a partir del primer 4. Repeticin del ciclo completo 30 a 40 veces- ( Figura 40)

Secuenciamiento de ADN
Objetivo de la tcnica: Determinar la secuencia u orden de los nucletidos (AGCT). Requerimientos: El ADN a secuenciar puede ser el producto de una PCR o ADN clonado presente en plsmidos. Conceptos sobresalientes El mtodo de terminacin de la cadena o Sanger es el preferido
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La incorporacin de un didesoxinucletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Mediante electroforesis, se separan los diferentes fragmentos de ADN segn su tamao. Mtodo Un cebador se hibrida al ADN a secuenciar y la ADN polimerasa sintetiza una segunda cadena complementaria. La sntesis de la segunda cadena es interrumpida al azar por la incorporacin de nucletidos anlogos marcados con fluorescencia (didesoxinucletido ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Los fragmentos de ADN que presentan este nucletido anlogo en su extremo pueden ser identificados ya que cada uno de los 4 didesoxinucletido est marcado con un fluorocromo distinto. Los distintos fragmentos de ADN son separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida El fluorocromo presente en cada fragmento de ADN es ledo a travs de un detector de fluorescencia e indica el orden de la secuencia de ADN. Una vez determinada la existencia de la mutacin en el gen bajo estudio, se puede determinar si esta influye en el nivel de mRNA y de protenas dentro de la clula. Para el analizar ARN, primero se lo debe convertir en ADN usando la tcnica de Transcripcin Reversa (RT). Luego, el ADN complementario (cADN) puede

ser amplificado mediante PCR. Adems esta tcnica permite monitorear la cantidad de producto formado en cada ciclo de amplificacin, y es conocida tambin como PCR cuantitativa en tiempo real.

Transcripcin - reversa PCR (RT-PCR)

Objetivo de la tcnica: Amplificar ARN mensajero (mARN) por PCR. El ARNm es convertido primero en ADN complementario y luego se amplifica por PCR la regin especifica a niveles detectables. Requerimientos: El material puede ser ARN celular total (incluyendo ARN ribosomal, ARN de transferencia y ARN mensajero) o ARN purificado. Conceptos sobresalientes Para facilitar el estudio del ARN, primero se debe convertir el ARN en ADN complementario por medio de una enzima llamada transcriptasa reversa (es una enzima ADN polimerasa dependiente de ARN). Mtodo La transcripcin reversa puede convertir mARN en cADN a travs de tres mtodos diferentes, dependiendo de los cebadores utilizados para el paso inicial. ( Figura 41) 1. Cebadores hexamericos al azar, que contienen 6 nucletidos (6-mer) que contienen todas las posibles combinaciones de dA, dG, dC y dT. Estos cebadores se hibridaran a la secuencia complementaria correspondiente en el ARN molde.
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2. Cebadores de oligonucletidos que contienen solo dT e hibridan en la cadena complementaria de dA nucletidos presentes en el extremo de las molculas de ARNm (cola poli A) 3. Cebador que solo hibrida en una secuencia especifica de mARN Luego que obtenemos cADN, se agregan los cebadores que se hibridaran a una secuencia especfica que permitir la amplificacin por PCR. Para medir las protenas producto del gen mutado, se utiliza la tcnica de Western Blot (Fig. 4.6), tambin conocida como Imunoblot, ya que utiliza anticuerpos para detectar la protena de inters. Adems esta tcnica nos permite medir el tamao

de la protena y revelar si se presenta en distintas formas.

Western Blot
Objetivo de la tcnica: medir el tamao y la cantidad de protenas presentes en la muestra Requerimientos: anticuerpos especficos para la protena de inters Conceptos sobresalientes Anticuerpos policlonales que reaccionan a varios epitopes de una protena antignica son obtenidos inyectando la protena en un animal y aislando los anticuerpos de la fraccin de las inmunoglobulinas del suero. Anticuerpos monoclonales que reaccionan a un solo epitope de una protena antignica son obtenidos inmunizando a un ratn con el antgeno, luego se unen los linfocitos reactivos del ratn en una lnea celular de un mieloma para crear clulas que producirn anticuerpos indefinidamente. U n
Figura 41 Transcriptasa Inversa

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A- Una transcriptasa inversa puede convertir a cDNA del mRNA de tres maneras diferentes, dependiendo del primer utilizado para la etapa inicial RT: (1) cebadores aleatorios hexamericos, (2) oligo dT primers, y (3) primers especficos del gen. Despus de que el ARNm se ha convertido a cDNA, los primers que se pueden hibridar con secuencias especficas son aadidos y amplificacin por PCR se lleva a cabo. B- PCR en tiempo real es capaz de medir con precisin la cantidad de producto de PCR de forma continua (eje y) despus de cada ciclo (eje x). Cada trazado lnea representa la cantidad de presente del producto de PCR en una muestra diferente. En las muestras que inicialmente contienen transcripciones BIOLOGAde ARNm de genes 32 PCR en tiempo MOLECULAR ms, real demostrar un aumento exponencial de producto de la PCR tempranamente despus de unos pocos ciclos de PCR.

anticuerpo secundario es utilizado para detectar el anticuerpo primario unido a la protena de inters. Los anticuerpos pueden ser visualizados al agregarles fluorescencia o una enzima que produzca luz o color a travs de una reaccin enzimtica.

expresan en forma incorrecta (disminuida o aumentada) comparndolas a clulas normales ( Figura 43) Esta poderosa tcnica, utiliza secuencias de oligonucletidos representando miles de genes que son desarrollados en un chip; luego, el mARN de los melanomas y los de los melanocitos normales es separado y convertido en sondas marcadas que son hibridadas en los chips. El nivel de hibridacin de los oligonucletidos de un gen dado indica cuanto mARN de ese gen est presente. La ventaja de esto es la posibilidad de analizar en forma cuantitativa el nivel de expresin de miles de genes de una sola vez.

Microarray
Objetivos: Analizar la expresin de mARN de miles de genes en un solo experimento
Figura 42 - Western Blot

Requerimientos: mARN

ARN total o

Mtodo Una mezcla de protenas solubilizadas es separada en un gel de poliacrilamida y transferida electroforticamente a una membrana. Esta se coloca en un buffer que contiene el anticuerpo. Los anticuerpos que se unieron son luego detectados a travs de tcnicas cromogenicas o por quimioluminiscencia. ( Figura 42) Para investigar los cambios en la expresin gnica de todos los genes de clulas tumorales como el melanoma, se utiliza la tcnica de Micromatriz o Microarray. Con ella se puede conocer cuales genes se

Conceptos sobresalientes Hibridacin a ADN. Se utiliza el mismo principio de hibridacin que el aplicado en PCR, excepto que muchos genes diferentes son evaluados simultneamente. El ADN es qumicamente sintetizado en la superficie de miles de puntos especficos. ( Figura 43). Si las clulas estn expresando ARNm del gen correspondiente, el ARNc se hibridara en el lugar y generara una seal cuya intensidad ser en relacin al nivel de expresin.
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Mtodo ARN es convertido en cADN mediante transcripcin reversa. La transcripcin in vitro del cADN se realiza con nucletidos marcados con biotina dando como resultado cARN marcado ( Figura 43). Las molculas de cARN marcado son hibridadas a pequeos fragmentos de ADN presentes en un chip. El chip es teido con estreptavidina ficoeritrina; la estreptavidina se une a la biotina del cARN y la ficoeritrina genera una seal fluoresecente. Generalmente, los patrones de expresin gnica de dos muestras

son comparados, normal vs tumor, tratado vs no tratado. Alternativamente, los oligonucletidos del microarray pueden utilizarse. ( Figura 43). Usando esta posibilidad, el ARN es directamente marcado con fluorescena o con nucletidos radioactivos y son hibridados a los oligonucletidos en un portaobjetos o en una membrana. Cuando se usan sondas radioactivas, las muestras son hibridadas en microarrays separados. Si las muestras de mARN a comparar son marcadas con fluorocromos distintos, las 2 muestras pueden ser hibridadas en el mismo array en forma simultnea. Un scanner mide la intensidad de la seal de cada punto y un software determina cuales genes estn sobre o subexpresados en una muestra comparada con la otra. Para realizar el anlisis comparativo de miles de genes diferentes, se utiliza un poderoso software. Este software puede comparar resultados de mltiples experimentos o grupos de resultados de acuerdo a la expresin gnica. Agregado al micromatrices uso de para

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analizar todo el ARNm producido por una clula, se puede estudiar todas las protenas producidas en ellas. El termino Protemica representa a todas las protenas producidas dentro de una clulas en un momento dado. La espectrometra de masa es una tcnica que nos permite el estudio de la Protemica, que provee de mediciones con gran precisin de la masa de protenas
Figura 43 - Arrays de cidos Nucleicos.

protenas mediante la captura y la deteccin especifica de protenas.

Protemica con Espectrometra de Masa

Objetivo de la tcnica: La Protemica representa a todas las protenas celulares que son expresadas en condiciones particulares. Requerimientos: mezcla de protenas celulares o pptidos derivados de esas protenas, son purificados de una poblacin celular definida. Conceptos sobresalientes La espectrometra de masa puede medir con gran precisin el tamao o la masa de protenas, pptidos o fragmentos de pptidos mediante la ionizacin de los mismos con carga positiva y luego ser medir el tiempo que necesitan los iones para moverse a travs de un tubo hacia el detector. (TOF tiempo de vuelo) ( Figura 44) La masa de los pptidos ionizadas se correlaciona con precisin con el tiempo de vuelo, pptidos pequeos se mueven ms rpido (menor TOF) que los pptidos mayores (mayor TOF) Mtodo El primer paso es disminuir la complejidad de la mezcla de protenas o pptidos celulares, previamente a la espectrometra de masa. Los 2 mtodos principales para separar protena/pptidos son mediante
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mediante la ionizacin de las mismas y la medicin de la aceleracin de las partculas a travs de un tubo hacia un detector en el lado opuesto.

Figura 44 - Protemica espectrometra de masa

con

Tambin se puede utilizar matrices de protenas, donde anticuerpos especficos son inmovilizados en un portaobjetos o membrana. Este array puede analizar mezclas complejas de

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electroforesis bidimensional y la cromatografa liquida. En la electroforesis bidimensional, las protenas son primero separadas segn su punto isoelctrico (primera dimensin); luego se las separa aun ms segn su tamao en un gel de poliacrilamida (segunda dimensin), donde las protenas ms pequeas corren ms rpido en el gel que las mayores. Las protenas presentaran un lugar nico en el gel que puede ser fsicamente removido y ser analizado mediante espectrometra de masa. La cromatografa liquida puede usarse tambin para separar protenas mientras transcurren a travs de columnas que contienen distintos tipos de resinas. Las protenas son separadas en funcin de su hidrofobicidad (cromatografa de fase reversa), carga elctrica (cromatografa de intercambio catinico/aninico) y tamao (cromatografa de exclusin molecular). Luego de separar las protenas, se realiza la espectrometra de masa. Primero se ionizan las protenas con carga positiva usando lseres o ionizacin por electrospray y nanospray. Basados en el tiempo de vuelo del ion cargado, la espectrometra de masa puede medir la relacin masa/carga de cada pptido. Con la ayuda de poderosas computadoras y software de

bioinformtica, se puede medir la relacin masa/carga, que permite la identificacin de la secuencia de un pptido y a la protena que contiene a este pptido.

Modelos de animales transgnicos

Luego de haber identificado diferentes genes que se asocian por ejemplo al desarrollo de melanoma, se podrn utilizar modelos animales para probar si causan cncer. Estos estudios nos permitirn investigar los mecanismos de la carcinognesis y demostrar que ese gen mutado es capaz de producir una neoplasia. Los modelos animales ms usados para el estudio del cncer son los ratones transgnicos y los ratones knock-out. Los ratones transgnicos son normales excepto que cada clula contiene el nuevo gen que nos interesa. El gen a ser estudiado, en micro inyectado en un ovulo de ratn fecundado, que se integrara en forma aleatoria en el genoma del ratn y que estar presente en todas las clulas del mismo. ( Figura 45) Aunque el gen se encuentra presente en cada clula, su expresin puede ser limitada a tejidos especficos usando promotores/ estimuladores que solo se expresen en determinados tejidos. Los promotores/ estimuladores son la porcin del
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gen (que usualmente se encuentra en el extremo 5 o upstream de la regin codificante) que inicia o regula el nivel de expresin del ARNm. Los promotores/ estimuladores que aseguraran qu genes son expresados slo en melanocitos incluira los promotores del gen relacionadas a la sntesis de melanina, como la tirosinasa.

Ratones Transgnicos
Objetivo: modelos de ratones transgnicos permiten a los investigadores estudiar los efectos de un transgen (gen de inters) en una clula, en un tejido o en todo el animal. El transgen puede ser expresado en forma selectiva en tipo particular de clula o tejido usando un promotor/estimulador que regula la expresin gnica en ese tipo especfico de clulas. Requerimientos: Un transgen o gen de inters, cuya funcin biolgica se quiera caracterizar en un modelo animal (ej. El gen toomuchsun); Una regin reguladora (promotor/estimulador) que expresara en forma selectiva el transgen en un tejido especfico (ej. Melanocitos) Tecnologa apropiada para crear un ratn transgnico. Conceptos sobresalientes Luego de la inyeccin de un gen en un ovulo fecundado de ratn o en una clula embrionaria, el transgen se integra en el genoma al azar. ( Figura 45). A medida que las clulas embrionarias se dividen y dan lugar al desarrollo de un ratn, el transgen integrado estar presente en todos los tipos de clulas, tejido y rganos del ratn. La expresin de este transgen solo ocurrir donde la regin promotor/estimulador es activa. Cualquier fenotipo que desarrolle el ratn, ayudara a entender los efectos biolgicos del gen bajo estudio. Mtodo Se construye un transgen, definido como el gen ms la regin reguladora (promotor/enhancer) que es preparado para la inyeccin. El transgen en micro inyectado en vulos fertilizados y se integra en el genoma, generalmente en un sitio nico. Estos vulos fecundados son luego implantados en una madre receptora, quien luego parir a

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Figura 45 - Ratones transgnicos

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ratones precursores heterogneos. Se habla de ratn heterogneo porque el gen se encuentra solo en uno de los dos cromosomas pares Los ratones precursores son criados ratones normales no transgnicos. La progenie ser tanto transgnicos y no transgnicos heterocigotos segn las leyes mendelianas. Para obtener solo ratones homocigotos que contengan el transgen en ambos pares de cromosomas, dos ratones heterocigotos son cruzados. Ratones transgnicos homocigotas tendrn el doble de la dosis de transgen que llevara a fenotipos diferentes y a efectos biolgicos distintos que a los ratones heterocigotos.

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Conclusiones
El campo de la biologa molecular crece a pasos agigantados. En la actualidad no hay prcticamente ninguna disciplina biolgica que no se haya visto beneficiada con los nuevos conocimientos que va aportando, a la vez que nos obligan a cambiar nuestro enfoque y llevar nuestro razonamiento hacia el nivel molecular. Es imprescindible que el dermatlogo de hoy tenga incorporados conocimientos bsicos de biologa molecular, ya que de lo contrario no podr estar a la altura no tan slo de las nuevas tcnicas diagnsticas y de investigacin sino de los nuevos tratamientos que se van imponiendo a medida que la biologa molecular descubre los mecanismos moleculares de las enfermedades que vemos da a da. En la prctica mdica diaria y ms an en la dermatologa, donde la observacin constituye la base del proceso diagnstico, cuando estudiamos una lesin macroscpica en un paciente, pensando en las posibles causas, sin darnos cuenta nos trasladamos al nivel molecular teorizando que interacciones moleculares estarn implicadas en lo que observamos y decidimos que tcnicas de biologa molecular podramos aplicar para establecer un diagnstico, implementar un tratamiento, y mejorar el pronstico.

Tal vez el estudio de la biologa molecular pueda ser opcional en otras ramas de la medicina pero para el dermatlogo, debe considerarse como la membrana basal desde donde crece y se diferencia su formacin como especialista.

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Agradecimientos
A Piwi (por aguantarme el mal humor, por darme amor) A Augusto, a Francisco, a Nacho (por darme tres razones para seguir) A mi Madre (sobran razones) A la Prof. Dra. Constanza E. Lorente (por su valioso asesoramiento) A mi Familia (porque es la nica que tengo) A la Prof. Dra. Ana Mara Lrenz (por darme la oportunidad de formarme en dermatologa, por siempre tratar de inspirar a sus alumnos) A la Dra. Mara Elena Ricaud (por la paciencia) A los Sres. Docentes de la carrera (por la falta de mezquindad al compartir sus conocimientos) Al Sr. Jos Luis Carrazana, Secretario de la Ctedra de Dermatologa (por su siempre buena disposicin)

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Bibliografa
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