Analize Si Evaluari Toxicologice

Felicia Loghin Daniela Popa Bela Kiss Rodica Anton
ANALIZE I EVALURI TOXICOLOGICE
Editura Medical Universitar Iuliu Haieganu Cluj-Napoca 2003
EDITURA MEDICAL UNIVERSITAR IULIU HAIEGANU CLU-NAPOCA Felicia LOGHIN, Daniela POPA, Bela KISS, Rodica ANTON
ANALIZE I EVALURI TOXICOLOGICE

ISBN 973 8385 95 4
Toate drepturile asupra acestei ediii sunt rezervate Editurii Medicale Universitare Iuliu Haieganu. Tiprit n Romnia. Nici o parte din aceast lucrare nu poate fi reprodus sub nici o form, prin nici un mijloc mecanic sau electronic, sau stocat ntr-o baz de date fr acordul prealabil, n scris, al editurii.
Copyright 2003 EDITURA MEDICAL UNIVERSITAR IULIU HAIEGANU CLUJ-NAPOCA
Refereni:
Prof. Dr. MARIUS BOJI Conf. Dr. RADU OPREAN
EDITURA MEDICAL UNIVERSITAR IULIU HAIEGANU CLUJ-NAPOCA Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj-Napoca 3400 Cluj-Napoca, 13, Emil Isac str. Tel. + 40-64-197256, Fax: +40-64-196585
Director: Prof. Dr. Liviu Vlad
Tiparul executat la Tipografia Universitii de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj-Napoca, str. Moilor 33, telefon: + 40-64-198701 PRINTED IN ROMNIA
CUPRINS
Capitolul 1 ANALIZE TOXICOLOGICE: CLASIFICARE, ETAPE 1.1. Clasificarea analizelor toxicologice 1.2. Etapele unei analize toxicologice generale Capitolul 2 METODE DE ANALIZ TOXICOLOGIC SISTEMATIC 2.1. Metode de izolare pentru gaze i vapori 2.2. Metode de izolare a substanelor toxice minerale 2.3. Metode de izolare a substanelor toxice organice Capitolul 3 EVALUAREA TOXICOLOGIC A MEDICAMENTELOR Partea experimental Determinarea dozei medii letale a DNOC Testarea mutagenitii substanelor prin testul micronucleilor Capitolul 4 ANALIZA UNOR SUBSTANE TOXICE: FIE DE LUCRU 4.1. Identificarea unor substane toxice prin metode chimice Identificarea alcoolului metilic Identificarea alcoolului etilic Identificarea formaldehidei Identificarea acetonei Identificarea fenolului Identificarea anilinei Identificarea acidului cianhidric Identificarea arsenului Identificarea cadmiului Identificarea mercurului Identificarea plumbului Identificarea dinitro-o-crezolului Identificarea aspirinei din medii biologice Identificarea paracetamolului din medii biologice Identificarea derivailor barbiturici din medii biologice Identificarea benzodiazepinelor din medii biologice Identificarea izoniazidei din medii biologice
1 1 16 32 32 45 51 69 82 82 89 91 91 91 92 93 93 94 95 96 97 98 99 99 100 101 102 102 103 104
Identificarea antideprinului din medii biologice Identificarea fenotiazinelor din medii biologice 4.2. Identificarea unor substane toxice prin cromatografie n strat subire Identificarea alcaloizilor din pulberi ilicite prin CSS Analiza toxicologic calitativ n cazul unei intoxicaii cu substane necunoscute 4.3. Determinarea cantitativ a unor substane toxice din aer i din medii biologice Analiza toxicologic a monoxidului de carbon Determinarea cantitativ din aer prin metoda cu clorur de paladiu Identificarea carboxihemoglobinei prin metoda Wolff Dozarea carboxihemoglobinei prin metoda spectrofotometric Analiza toxicologic a hidrogenului sulfurat Analiza toxicologic a clorului Analiza toxicologic a dioxidului de sulf Analiza toxicologic a oxizilor de azot Analiza toxicologic a alcoolului metilic Analiza toxicologic a alcoolului etilic Determinarea cantitativ a fenolului total din urin Analiza toxicologic a formaldehidei Analiza toxicologic a etilenglicolului Identificarea cristalelor de oxalat de calciu din urin Analiza toxicologic a anilinei Determinarea cantitativ prin formare de azocolorani Determinarea cantitativ din snge prin reacia indofenolului Determinarea cantitativ a p-aminofenolului din urin Determinarea methemoglobinei din snge Analiza toxicologic a acidului cianhidric Determinarea cantitativ din snge prin metoda argentimetric Determinarea cantitativ a tiocianailor Analiza toxicologic a hidrocarburilor aromatice: indicatori ai expunerii Determinarea acidului hipuric prin metoda spectrofotometric n vizibil Determinarea spectrofotometric n UV a acidului hipuric Determinarea sulfat indexului prin metoda nefelometric Analiza toxicologic a metalelor Determinarea cantitativ a mercurului din urin Determinarea cantitativ a cadmiului din urin
104 105 108 108 110 115 115 115 116 117 119 120 121 123 125 126 128 130 131 132 133 134 134 135 138 139 140 142 143 144 146
Determinarea cantitativ a plumbului din urin Determinarea cantitativ a acidului -ALA din urin Analiza toxicologic a derivailor barbiturici Determinarea cantitativ prin metoda spectrofotometric n vizibil Determinarea cantitativ prin spectrofotometrie n UV Analiza toxicologic a aspirinei Analiza toxicologic a paracetamolului Analiza toxicologic a antidepresivelor triciclice Analiza toxicologic a fenotiazinelor Analiza toxicologic a izoniazidei Analiza toxicologic a benzodiazepinelor Determinarea cantitativ sub form de azocolorani Determinarea cantitativ a diazepamului prin spectrofotometrie n UV Analiza toxicologic a morfinei Analiza toxicologic a unor pesticide Determinarea cantitativ a malationului Analiza toxicologic a paraquatului n urin Determinarea cantitativ a DNOC din sngele total Determinarea cantitativ a DNOC din urin Determinarea cantitativ a p-nitrofenolului total din urin Determinarea activitii anticolinesterazice din sngele total Capitolul 5 DIAGNOSTICUL CLINIC AL INTOXICAIILOR: STUDII DE CAZURI CLINICE Capitolul 6 NTREBRI I PROBLEME ANEXA I: Valori limit de expunere profesional pentru agenii chimici ANEXA II: Limite biologice tolerabile ANEXA III: Concentraii terapeutice, toxice sau letale ale unor substane toxice ANEXA IV: Valorile probit corespunztoare procentelor de letalitate ANEXA V: Reactivi speciali Rspunsuri la ntrebri i probleme Bibliografie
147 150 151 152 154 156 157 159 160 161 163 166 167 167 168 170 170 171 173
176 200 206 209 210 213 217 220 229
Capitolul 1 ANALIZE TOXICOLOGICE: CLASIFICARE, ETAPE O analiz toxicologic reprezint ansamblul de procedee analitice prin care se determin prezena unei substane toxice ntr-o prob de analizat. Aceste analize fac obiectul de studiu al unei ramuri a toxicologiei, toxicologia analitic, care cuprinde metodologia fizico-chimic de izolare, identificare i determinare cantitativ a substanelor toxice din aer, ap, sol, alimente, corpuri delicte i produse biologice, n vederea prevenirii sau diagnosticrii intoxicaiilor. 1.1. CLASIFICAREA ANALIZELOR TOXICOLOGICE Analizele toxicologice pot fi clasificate, n funcie de tipul probelor analizate i de scopul analizelor, n: - analize de toxicologie sanitar (industrial i alimentar), care urmresc depistarea prezenei substanelor toxice n mediu i au scop profilactic - analize de toxicologie clinic, care au drept scop diagnosticarea rapid a intoxicaiilor i controlarea eficienei terapiei instituite - analize de toxicologie medico-legal, care urmresc confirmarea sau infirmarea intoxicaiilor letale, pentru informarea justiiei. 1.1.1. Analizele de toxicologie sanitar Probele analizate sunt probe de mediu: aer din mediul comunal sau industrial, ap, sol, alimente, care sunt recoltate de toxicolog sau de alt personal sanitar. Astfel de analize se efectueaz n cadrul laboratoarelor de toxicologie din ntreprinderi sau din Centrele de Medicin Preventiv. n afar de probele de mediu, n aceste laboratoare se mai controleaz periodic i nivelele sanguine sau eliminarea renal a toxicilor la persoanele expuse, precum i modificarea unor markeri biochimici care pot permite depistarea intoxicaiilor n faza de debut. Recoltarea probelor depinde de obiectivele studiului, care pot varia n funcie de tipul de zon studiat. De exemplu: a) zone de mediu nconjurtor (regiuni slbatice, lacuri, ruri) - probele recoltate pot furniza informaii cu privire la concentraia poluanilor, gradul de contaminare.
2 Analize i evaluri toxicologice
b) zonele urbane - probele recoltate pot furniza informaii cu privire la tipurile de poluani la care locuitorii pot fi expui pe cale cutanat, inhalatorie sau oral, ntr-o perioad de timp. c) zonele industriale - pot fi detectate situaiile de risc i sursele de poluare. Principalele probe de mediu analizate sunt cele de aer, sol, ap i esuturi. Probele de aer Majoritatea poluanilor din atmosfer provin din arderea combustibililor, procesele industriale i deversarea reziduurilor solide. Alte surse pot fi: exploziile nucleare, incendiile din pduri, vulcanii, emisia de gaze naturale, arderea culturilor, utilizarea pesticidelor. Aceti poluani se gsesc n atmosfer sub form de gaze, de vapori sau de aerosoli. Probele de sol Atunci cnd poluanii din mediu se depun n zone terestre, comportarea lor ulterioar este complicat de o serie de interaciuni cu componenii organici i anorganici, fazele lichid-gaz prezente i componentele vii sau nu ale solului. Dependent de structura chimic i fizic, poluantul poate rmne ntr-un singur loc pe perioade mai lungi sau mai scurte, poate fi absorbit n esuturile plantelor sau se poate deplasa n sol prin difuziune. Deplasarea poate fi afectat de dizolvarea sau suspendarea n ap a poluanilor, sau de adsorbia pe componentele anorganice sau organice ale solului. Pentru aceste motive, prelevarea probelor de sol pentru determinarea poluanilor poate fi simpl sau foarte complicat. Pentru a obine probe reprezentative, trebuie s fie luate n considerare caracteristicile fizice i chimice ale locului de unde se face recoltarea, posibilele reacii ale poluantului cu componentele din sol, precum i gradul de variabilitate a zonei. Pe baza acestor date, zona poate fi mprit n sectoare omogene i se colecteaz numrul necesar de probe. Exist mai multe dispozitive pentru recoltarea probelor de sol. Unele din ele permit determinarea distribuiei verticale a poluantului i sunt constituite fie din tuburi de oel, cu diametru ntre 2,5 i 7,6 cm i lungimea de 60 pn la 100 cm (acionate manual), sau din tuburi de forare cu diametru mare, de 1200 cm (acionate mecanic). Probele de ap Pentru a obine probe reprezentative de ap, trebuie luai n considerare mai muli factori. Cei mai importani sunt natura poluantului i locul n care acesta a ptruns n mediul acvatic. Poluanii pot proveni din surse agricole, municipale sau altele, cum ar fi scurgeri din epave sau deraieri de trenuri. Ali factori importani sunt: direcia i viteza vntului, viteza de curgere a curentului sau a rului, temperatura, stratificarea termic i a salinitii, compoziia sedimentului. Probele din apele de suprafa sunt adesea colectate cu ajutorul unor dispozitive automate, controlate de diferii senzori. Metoda cea mai simpl const n scufundarea n ap a unui recipient, cltirea, umplerea i nchiderea acestuia.
Analize toxicologice: Clasificare, etape
Pentru obinerea probelor de ap de la adncimi mari se folosesc dispozitive speciale. Pentru a reduce numrul i volumul probelor, se pot utiliza colectoare care sunt prevzute cu membrane cu pori mici (45m) pentru a reine poluanii care conin metale, sau coloane cu rini schimbtoare de ioni sau cu silicagel modificat (C18) pentru a reine poluanii organici; astfel, poluanii din volume de mai muli litri de ap sunt reinui pe coloane sau n mici containere. Recent, a fost dezvoltat o nou tehnic (ce se bazeaz pe folosirea unui filtru ce conine o matrice de Teflon n care sunt ncastrate lanuri de hidrocarburi C18) i care const n concentrarea poluanilor prin trecerea apei prin membran, urmat de reluarea lor cu solveni corespunztori. Dup recoltarea probelor, acestea vor fi ngheate i trimise la laborator. Dac nu se analizeaz imediat, vor fi congelate la temperaturi sub -200C pentru a preveni degradarea. Probele de esuturi Atunci cnd este suspectat poluarea unor zone de mediu, se fac studii pe plante i pe animale. Multe din aceste studii se desfoar n timpul sezoanelor de vntoare i de pescuit i constau n determinarea numrului de animale ucise i ndeprtarea organelor i a altor esuturi pentru analizarea contaminanilor suspectai. Recoltarea probelor se face la ntmplare n zona cercetat; analiza poate permite determinarea concentraiei, a gradului de contaminare pentru o anumit specie i a zonelor contaminate. Muli poluani din mediu se concentreaz n oase, n anumite organe sau esuturi (ex. esut adipos). Aceste organe sunt recoltate n vederea analizei, de la animalele ucise recent. Materialul vegetal recoltat pentru analiz este fie mprit n: rdcini, tulpini, frunze, flori i /sau fructe, fie se analizeaz planta n ntregime. Plantele recoltate dintr-un anumit loc pot fi amestecate i analizate mpreun ca o prob unic. 1.1.2. Analizele de toxicologie clinic Aceste analize se efectueaz n principal pe probe biologice (snge, urin), dar i pe coninut gastric sau produse suspecte. Probele sunt recoltate de personalul sanitar din seciile medicale de urgen sau din clinicile de boli profesionale i sunt analizate n laboratoarele de toxicologie, de ctre un personal calificat. Pentru ca rezultatele analizei s fie utile, este indispensabil ca ntre medic i toxicologul analist s existe o colaborare bun. Este ideal ca aceast colaborare s nceap nainte de recoltarea probelor, pentru a putea fi ndeplinite cerinele legate de tipul de probe necesare. Poate fi util completarea unor formulare de solicitare a unei analize toxicologice care s nsoeasc probele la laborator.
Transportul i conservarea probelor Probele trimise la analiz trebuie s fie etichetate, indicndu-se numele complet al pacientului, data i ora prelevrii, natura probei dac aceasta nu este evident. Acest lucru este foarte important mai ales atunci cnd este vorba de o intoxicare a mai multor pacieni, sau cnd s-au recoltat mai multe probe de la acelai pacient. n laborator se vor nota data i ora recepiei fiecrei probe, care va fi nregistrat, atribuindu-se un numr de identificare unic. Recipientele care conin produse volatile (ex. solveni organici) se vor ambala separat de probele biologice, pentru a evita riscul de contaminare reciproc. Toate probele biologice se vor pstra, dac este posibil, la 40C pn n momentul analizei. Dup efectuarea analizei, probele ar trebui pstrate la 40C nc 3-4 sptmni, n caz c este necesar repetarea analizei. Dac se prevd implicaii medico-legale (de ex. dac nu s-a stabilit modul de administrare a substanei toxice, sau dac pacientul a decedat), toate probele se vor pstra (de preferin la 200C) pn la ncheierea anchetei. Tipuri de probe analizate Sngele (snge total, plasm, ser) Sngele este singurul tip de prob ce permite obinerea unor rezultate cantitative ce pot contribui la estimarea gravitii intoxicaiei. n general, concentraiile substanei toxice n plasm i n ser nu difer semnificativ. Totui, dac o substan nu este prezent ntr-o cantitate suficient de mare n eritrocite, utilizarea de snge total hemolizat va conduce la o diluare considerabil a probei. Alte substane, cum ar fi monoxidul de carbon, cianurile, plumbul, staniul, se gsesc fixate n principal n eritrocite, ceea ce face necesar realizarea determinrilor cantitative pe snge integral. Deoarece coagularea sngelui i separarea serului pot determina pierderi prin antrenare, este preferabil s se rein serul pentru determinrile enzimatice. De aceea, sngele total i plasma sunt probele cele mai reprezentative. Ideal este ca laboratorul s primeasc snge total, necoagulat i nehemolizat. Pentru a mpiedica coagularea se pot folosi heparin sau fluorur de sodiu solid (5mg/ml). Aceasta din urm acioneaz prin sechestrarea calciului, mpiedicnd coagularea, iar n plus este un inhibitor enzimatic, ceea ce contribuie la reducerea procesului de putrefacie. Ulterior, analistul va decide dac va utiliza snge total sau l va centrifuga pentru a separa plasma, care prezint avantajul eliminrii interferenei pigmenilor sngelui i care nu formeaz la fel de uor emulsii cu solvenii organici. La internarea pacienilor se recomand recoltarea a 10 ml snge heparinizat, a 2 ml snge pe fluorur de sodiu i a 10 ml snge fr conservani sau coagulani. Dac se suspecteaz o intoxicaie cu etanol, se recolteaz 5 ml snge ntr-un flacon ce conine NaF (10mg/ml reprezint cantitatea necesar pentru a inhiba
complet degradarea microbian). Flaconul trebuie s fie perfect curat i uscat. Se umple complet cu snge i se nchide cu un dop de plut parafinat. Dezinfectarea pielii se face cu soluie de sublimat, ap cu spun sau ap simpl. Nu se folosesc niciodat alcool, tinctur de iod sau ali solveni cu fraciuni volatile. Dup extracie se efectueaz o dezinfectare corespunztoare. Eantionul de snge trebuie transvazat cu precauie: trecerea rapid a sngelui prin acul de sering poate provoca o hemoliz suficient de important pentru a afecta dozarea fierului sau a potasiului din ser. Dac se bnuiete o intoxicaie cu monoxid de carbon (CO), spaiul liber din flacon trebuie redus la minim. Urina Este o matrice biologic cu care se lucreaz uor, interferenele fiind puine, dar multe xenobiotice se excret greu pe aceast cale, analiza putnd sau nu s fie reprezentativ. Nu necesit adugarea de conservani. Este o prob deosebit de util pentru testele de identificare, deoarece este adesea disponibil n cantitate mare, iar concentraiile sunt n general mai mari dect n snge . Prezena metaboliilor poate fie s faciliteze identificarea, dac se utilizeaz tehnici cromatografice, fie s o complice. Nivelele urinare nu pot fi utilizate pentru a evalua gravitatea intoxicaiei. Prezena sau absena substanei ntr-o prob de urin indic doar faptul c aceasta a fost sau nu administrat sau ingerat. n cazul adulilor se recolteaz n general o prob de 50 ml, ntr-un recipient steril care se nchide ermetic. Recoltarea se face ct mai repede posibil, de preferin nainte de instituirea unui tratament medicamentos. Totui, unele medicamente ca antidepresivele triciclice (amitriptilin, imipramin) produc retenie urinar, astfel nct o prob recoltat precoce poate s conin o cantitate minim de substan toxic. Invers, cantitatea prezent ntr-o prob recoltat dup cteva ore sau zile poate s fie de asemenea foarte redus, chiar dac starea clinic a pacientului este grav, cum ar fi cazul intoxicaiilor acute cu paracetamol. La pacienii n stare de incontient, recoltarea urinei se face de obicei cu ajutorul unui cateter, existnd riscul de contaminare cu lubrifiani sau anestezice locale (lidocain). Dac s-a ncercat provocarea vomei prin administrarea de sirop de ipeca, urina poate conine emetin. Coninutul gastric Prin coninut gastric se neleg vomismentele sau produsele de aspirare sau de spltur gastric. Este important s se recolteze produsul din prima spltur, deoarece urmtoarele pot fi prea diluate. Cantitatea minim necesar pentru mai multe analize este de 20 ml. Nu se adaug conservani. Analiza nu prezint prea multe inconveniente practice i poate fi rapid, deoarece separarea xenobioticului este uoar. n funcie de natura probei, pot fi
necesare operaii suplimentare - ex. omogenizare urmat de filtrare i /sau centrifugare. Dac proba se obine la puin timp dup ingestie, pot fi prezente cantiti importante de substan toxic, n timp ce metaboliii, care complic adesea analiza, sunt n general abseni. Mirosul poate indica prezena unor compui, i uneori pot fi identificate comprimatele sau capsulele prin simpl observare. Dac pentru provocarea vomei s-a administrat sirop de ipeca, n coninutul gastric se poate regsi emetin. Analiza completeaz rezultatele obinute pe probele de urin sau de snge, dar nu permite aprecierea gravitii intoxicaiei, deoarece cuantific substana toxic ce nu a fost absorbit. Spltura gastric poate n unele cazuri s favorizeze absorbia, de exemplu n cazul salicilailor, care trebuie determinai sistematic n aceast prob printr-o reacie de culoare. Produsele suspecte Este important s se pstreze toate flacoanele, recipientele sau materialele suspecte care sunt gsite la pacient sau n apropierea lui, deoarece acestea pot avea legtur cu intoxicaia i sunt analizate dac este necesar. Comprimatele sau alte preparate farmaceutice pot fi identificate cu ajutorul unor baze de date informatizate pe baza culorii, formei, mrimii, greutii, etc. Dei acest lucru nu intr n sarcina principal a laboratorului de toxicologie, n unele cazuri poate contribui la identificarea rapid sau la confirmarea cauzei unei intoxicaii. Detectarea rapid a substanelor responsabile de producerea unei intoxicaii poate fi salvatoare i reprezint primul scop al unei analize de toxicologie clinic. Aceast operaie mai poart denumirea de screening toxicologic i se poate servi de diferite metode de analiz, n funcie de dotarea laboratorului de toxicologie. n tabelul 1.1. sunt prezentate probele biologice analizate pentru identificarea diferitelor substane, precum i metodele aplicate n acest sens. Probele analizate pot fi aruncate la finalul investigaiei. Rezultatele analizei trebuie comunicate telefonic serviciului de urgen, ct mai rapid. Raportul scris poate fi trimis ulterior, ntr-o form relativ concis, coninnd materialele primite spre analiz, metodele utilizate i rezultatele. Interpretarea rezultatelor poate fi util pentru clinician, care nu are timp suficient pentru a cuta ntr-o bibliografie adecvat.
Tabel nr.1.1. Recoltarea probelor pentru screeningul toxicologic Nr Prob 1. Snge integral (anticoagulant, conservant) 2. Ser Volum 2 ml Analiza Alcooli Metode aplicate GC
5-10 ml
Screening medicamente: Digoxin, Litiu
3. 4.
Snge total 2 ml COHb (heparinizat) Urin 20-50 ml Screening medicamente
Extracie Screening GC-MS Met. imunochimice (Digoxin) Flamfotometrie (Li+) Spectrofotometrie Teste de culoare (salicilai) Met. imunochimice (droguri) Extr. + GC/MS (confirmare) Teste culoare (salicilai) Examinare vizual (prezena unor comprimate, capsule) Extracie + GC/MS
5.
Lichid gastric
20-50 ml Screening medicamente
1.1.3. Analizele de toxicologie medico-legal Toxicologia medico-legal se refer la orice aplicaie a tiinei care studiaz substanele toxice, contribuind la elucidarea problemelor care apar n timpul procedurilor judiciare. Analizele de toxicologie medico-legal reprezint un instrument n investigaia unui accident sau a unei crime i trebuie s verifice dac o substan toxic este responsabil de un eveniment sau l-ar fi putut influena. Alte scopuri urmresc clarificarea faptului c o substan a putut fi administrat deliberat sau accidental, sau elucidarea derulrii n timp a evenimentelor.
Analizele de toxicologie medico-legal se efectueaz pe probe reprezentate de corpuri delicte (ap, resturi alimentare, obiecte suspecte) sau pe produse biologice (snge, urin, coninut stomacal, organe). Recoltarea acestor probe se face de persoane autorizate (medic legist sau procuratur), pstrndu-se n acelai timp i duplicate, sau contraprobe, pentru situaia n care rezultatul analizei este contestat i se solicit o contraexpertiz. Probele sunt etichetate corespunztor i sunt nsoite de un raport de necropsie, care conine informaii n legtur cu mprejurrile n care s-a produs intoxicaia i descrierea morfopatologic macroscopic a cazului respectiv. Dup efectuarea analizei, probele rmase neutilizate se vor pstra o perioad relativ lung de timp, care este precizat de autoritile legale din fiecare ar. Lichidele biologice i esuturile se pstreaz congelate. Deoarece toxicologia medico-legal analizeaz n principal cazurile de moarte subit sau neateptat, numrul substanelor toxice cutate este foarte mare. De obicei, analistul nu ncepe examinarea probelor nainte de ncheierea studiilor preliminare, inclusiv a necropsiei i a examinrii microscopice a tuturor esuturilor. Astfel, el poate ncepe analiza cu o ipotez de lucru. Informaiile care ar trebui furnizate n toate cazurile n care exist suspiciunea de intoxicaie sau de dopaj sunt urmtoarele: Date generale Numele victimei Sexul Vrsta Greutatea sau nlimea Naionalitatea Dac a cltorit recent n strintate? Ocupaia (cu detalii cu privire la produsele care se fabric sau se folosesc la locul de munc) Istoricul medical Dac victima sufer de hepatit viral sau alte boli infecioase? Dac victima a suferit recent de o boal sau de o maladie cronic? Care sunt medicamentele care i-au fost prescrise? Dac victima este un alcoolic, un dependent de droguri sau un fumtor? Ce substane toxice sunt suspectate? (Cutiile de medicamente sau seringile gsite la faa locului trebuie de asemenea analizate.) Denumirea medicamentelor sau a substanelor toxice la care victima a avut acces.
Timpi Data i momentul n care victima a fost vzut pentru ultima oar n stare de sntate. Data i momentul mbolnvirii sau a decesului i locul unde victima a fost gsit (ex. la locul de munc, n pat, afar). Dac aceti timpi nu sunt cunoscui, unde a fost gsit victima? Timpul ultimei mese i detalii despre aceasta. Tratamente S-au acordat ngrijiri medicale dup momentul suspectrii unei intoxicaii sau a dopajului? Momentul spitalizrii; data i momentul externrii. Detalii despre tratamentele efectuate (volumul lichidului de spltur stomacal, momentul recoltrii probelor de snge sau urin). Analize efectuate n timpul spitalizrii: realizate /neefectuate /care nu au fost disponibile. Se noteaz dintre urmtoarele simptome cele care au fost observate: diaree, vom, sete, orbire, constipaie, cianoz, icter, pierdere n greutate, frisoane, convulsii, mioz, midriaz, delir, com, transpiraii, insuficien renal. Data autopsiei i cauza posibil a decesului. Orice alte informaii care pot fi utile laboratorului, de exemplu dac victima era nsrcinat, detalii despre suspect (ocupaia i produsele utilizate la locul de munc, comentarii ale victimei, suspectului sau martorilor).
Probe recoltate - Dac victima este n via: vom, aspirat gastric sau lichid de spltur stomacal, snge sau urin. - Dac victima a decedat: coninut stomacal, snge, urin, probe de organe. Deoarece recoltarea altor probe necesit de obicei exhumarea, este foarte important ca acestea s fie recoltate i pstrate corespunztor. De exemplu, sngele trebuie s fie recoltat prin puncie cardiac, niciodat din cavitatea corpului, urina din vezica urinar; bila este colectat intact, ca parte a vezicii biliare ligaturate. Trebuie s se recolteze cantiti suficiente, iar substanele cutate n diferite probe pot fi: - n snge: monoxid de carbon, etanol i ali alcooli, barbiturice, tranchilizante, alte medicamente - urina: este util att pentru analiza substanelor toxice ct i a metaboliilor se extrage ntreg coninutul vezicii urinare - ficatul conine frecvent cantiti mari de substane toxice i / sau metabolii, iar rinichiul este organul cel mai important pentru analiza medico-legal.
Atunci cnd nu exist nici o suspiciune cu privire la natura toxicului, se procedeaz la o analiz toxicologic general i se impune trimiterea spre analiz a urmtoarelor probe biologice: 1. un flacon cu stomacul i coninutul su; 2. un flacon uscat cu snge, n cantitate de 100 ml; 3. un flacon cu urin (cantitatea maxim ce poate fi extras); 4. un flacon cu 100 g ficat i vezic biliar. Este organul cel mai interesant pentru investigarea substanelor toxice organice i metalice. 5. un flacon cu 100 g creier - n special n cazul intoxicaiilor cu solveni organici, anestezice, pesticide organice i produse de curire la rece; 6. un flacon cu 100 g rinichi. Cantitatea trebuie s fie mai mare dac se suspecteaz o intoxicaie cu metale. 7. un recipient cu 100 g plmn. Observaii: 1. Atunci cnd se suspecteaz intoxicaii cu arsen, plumb, beriliu, taliu, stroniu, uraniu, fluor, se vor trimite spre analiz i probe de unghii, pr, oase. 2. Cnd se urmrete investigarea toxicilor gazoi sau volatili este important s se evite ca flacoanele s conin aer; ele trebuie nchise ermetic i pstrate majoritatea timpului n frigider. 3. Nu se adaug ageni conservani (pot contamina sau pot interfera n analiz), dar se menin la temperatur sczut, fr a se congela. Conservanii sunt admii n: - snge, pentru determinarea alcoolemiei (NaF) - esuturi, pentru determinri histologice (formol 10%). 4. Toate flacoanele se eticheteaz, precizndu-se coninutul i proveniena. Toate transferurile se marcheaz pe probe (ora i data) i se semneaz de ambele pri. Trebuie verificat securitatea probelor. Atunci cnd se bnuiete sau se cunoate prezena unei anumite substane toxice, probele cele mai adecvate pentru analiz sunt cele prezentate n tabelul 1.2. n cazul n care este necesar recoltarea de probe de la cadavre exhumate, se ine cont de urmtoarele: - Dac nhumarea a fost recent i se recunosc viscerele, acestea se recolteaz ca la o autopsie. Dac nu, se recolteaz resturile vizibile sau magma existent n zone distincte. - Probele sunt nsoite de cptueala sicriului i de pmnt de sub sicriu, mai ales atunci cnd nhumarea s-a fcut direct n sol. - Toate probele se introduc n flacoane de sticl, iar cele cu pmnt trebuie s conin 100 g pmnt de deasupra sicriului i 100 g pmnt de sub sicriu.
Analize toxicologice: Clasificare, etape 11
Tabelul nr. 1.2. Probele biologice ce se recomand a fi recoltate pentru analiza diferitelor clase de substane toxice
Clasa de substane toxice Droguri Alcool etilic Solveni organici Medicamente Pesticide Metale CO i Gaze Ciuperci Snge X X X X X X X Urin X Coninut Creier stomacal X Ficat RiBil nichi X X X Oase Unghii Pr X Subst. suspect X
X X X X X
X X X X X
X X X X X X X X X X X X X
X X X X X
Probele de pr Primul caz de determinare a unei substane toxice n prul capilar a fost menionat n 1857, cnd arsenul a fost pus n eviden n prul unui cadavru exhumat dup 11 ani. O sut de ani mai trziu, n 1954, a fost detectat pentru prima dat o substan organic n perii din blana de cobai. n 1979, Baumgartner i colaboratorii au publicat o metod radioimunologic de detectare a opiaceelor n prul drogailor, introducnd ideea de depistare i monitorizare a consumului de droguri. Din acest moment, interesul pentru utilizarea n scop medico-legal a acestei matrici biologice a fost n continu cretere, iar mai recent se preconizeaz i folosirea sa n scopul monitorizrii terapeutice a unor medicamente. Acest lucru a devenit posibil ca urmare a evoluiei procedeelor de extracie i a creterii performanelor analitice, mai ales sub aspectul mbuntirii selectivitii i al scderii limitelor de cuantificare. Analiza probelor de pr este tot mai mult utilizat i pentru detectarea expunerii in utero la droguri, a expunerii pasive a copiilor n locuinele n care prinii consum activ droguri, precum i n cazurile criminale, la locurile de munc, n cazurile de custodie i n clinicile de dezintoxicare. De asemenea, aceast prob a fost folosit n unele aciuni juridice care au implicat consumul de anabolizani n timpul Turului ciclistic al Franei din 1998. Substanele toxice pot ajunge n pr pe trei ci: - calea endogen prin captarea n firul de pr a substanelor prezente n circulaia sistemic n timpul procesului de histogenez;
- calea endo-exogen prin transferul n prul cheratinizat a substanelor absorbite i apoi eliminate prin transpiraie, sebum sau excreie transdermic; - calea exogen absorbie prin prul cheratinizat a substanelor din mediul extern. Factorii care favorizeaz ncorporarea substanelor toxice n pr sunt: - Lipofilia compusului: cu ct este mai mare, ncorporarea este mai mare. Acest fapt se explic prin aceea c transferul moleculelor se realizeaz n principal prin difuzie pasiv. - Afinitatea melaninei pentru substana toxic: ncorporarea este mai bun n prul pigmentat; - Bazicitatea compusului: compuii cu caracter bazic sunt mai bine ncorporai dect cei cu caracter acid; totui, datorit concentraiilor n snge mai mari ale substanelor acide, aceast rat de ncorporare mai redus este compensat. Avantajele folosirii probelor de pr n analizele toxicologice sunt urmtoarele: - Analiza furnizeaz informaii asupra utilizrii pe termen lung a substanei, spre deosebire de alte probe biologice, cum ar fi urina, n cazul crora fereastra de detecie este mai redus (Tabel 1.3.). Acest lucru este posibil deoarece creterea prului capilar este relativ constant, fiind n jur de 1 cm / lun i permind acumularea substanelor i a metaboliilor lor, iar perioada de cretere este lung, pn la 4-6 ani. Pot fi obinute i informaii cu privire la modul de utilizare a unor droguri sau la severitatea abuzului. - Testul nu poate fi influenat de o abstinen temporar sau prin falsificarea probei. - Prul poate fi recoltat sub supraveghere strict, fr ca individul s se jeneze. - Se poate recolta o a doua prob, care poate fi comparat cu prima pe baza aspectului, prin examinare microscopic sau procedee de identificare a ADN-ului. - Specimenele de pr sunt stabile chiar i n condiii de mediu nefavorabile i pot fi pstrate timp nedefinit, fr a necesita congelare. Recoltarea probelor de pr se face prin tiere ct mai aproape de scalp, din regiunea vertexului posterior. Cantitatea optim este de 200 mg, iar dac se dorete o analiz secvenial, firele se taie n segmente de 1-1,5 cm, care reprezint creterea aproximativ dintr-o lun. Probele se pstreaz la temperatura camerei, n plicuri de hrtie sau plastic sau n flacoane de sticl. Raportul laboratorului de toxicologie medico-legal trebuie s conin mult mai multe informaii dect n cazul analizelor de toxicologie clinic. Astfel, vor fi descrise probele primite spre analiz, iar toate metodele i etapele analitice, precum i rezultatele obinute, vor fi menionate. Nu toate informaiile chimice pot fi nelese de ctre juriti. De aceea, raportul trebuie s cuprind un rezumat n limbaj
uzual, care s poat fi neles de avocai. Totui, partea analitic a raportului este important, deoarece partea acuzat poate ncerca, ajutat de un consultant tiinific, s obiecteze la concluziile toxicologului; acesta trebuie s i poat susine rezultatele pe baza unei documentaii analitice complete, care nu trebuie neaprat inclus n raport, dar care trebuie pstrat n dosar. Toate experimentele efectuate trebuie consemnate n ordine cronologic n registrul laboratorului. Tipuri de analize toxicologice Strategia utilizat n analizele toxicologice depinde de tipul de intoxicaie. Astfel, exist dou grupe principale de intoxicaii, n funcie de informaiile existente cu privire la natura agentului toxic: 1. Intoxicaii de origine cunoscut Exemple de astfel de intoxicaii sunt: - inhalarea de CO sau HCN n timpul unui incendiu - absorbia unor produse industriale n timpul unui accident - supradozarea unui medicament n cursul unui tratament n aceste cazuri se pot utiliza metode de analiz cantitativ direct, ce nu necesit izolare i purificare, mai ales dac matricile biologice nu sunt complexe. Astfel de metode sunt: testele de culoare, metodele imunochimice, fotometria (CO), flamfotometria (Li+). n marea majoritate a cazurilor sunt ns necesare izolarea din mediu, purificarea probei i uneori concentrarea substanei toxice. Dac se cunoate natura toxicului, se pot alege procedeele de izolare sau purificare cele mai adecvate naturii chimice a compusului, n scopul obinerii unor randamente de extracie ct mai bune. Acest lucru face posibil i utilizarea unor cantiti minime de prob. 2. Intoxicaii de origine necunoscut n aceast categorie se ncadreaz n special intoxicaiile medicamentoase, dintre care multe sunt tentative de sinucidere, iar uneori i intoxicaiile accidentale, dac pacientul este comatos sau se afl n imposibilitatea de a se exprima. n acest caz se efectueaz o analiz toxicologic general. Pentru acest grup de intoxicaii, este recomandabil ca analiza s se realizeze n laboratoare de toxicologie corespunztor echipate, unde este posibil investigarea sistematic a compuilor necunoscui cu ajutorul unor metode ce includ etape de izolare, purificare i concentrare, urmate de aplicarea unor tehnici de analiz cantitativ CSS, HPLC, GC-MS.
Tabelul nr.1.3. Fereastra de detecie pentru diferite matrici alternative sau clasice Matrice Pr Saliv Sudoare Plasm/Ser Fereastra de Utilizare detecie >3 zile luni/ani Concentraia compusului printe dup consum cronic Concentraia 1 h 24 h compusului printe 3 h - 2 zile/1 spt Doar detecia compusului printe Concentraia 3 h 2 zile compusului printe permite evaluarea toxicitii pe termen scurt Doar detecia 6 h 3 zile metaboliilor compusului Observaii Uor de pstrat la temperatura camerei Dispozitive speciale de colectare Pstrare la rece/congelat
Urin
Pstrare la rece/congelat
Orientarea analizei toxicologice n situaia n care intoxicaia este de origine necunoscut, utilizarea unor date orientative permite nu numai reducerea cmpului de studiu i folosirea tehnicilor celor mai potrivite, ci i evitarea testelor de confirmare n cazul n care toxicul identificat corespunde informaiilor primite. Orientarea analizei toxicologice se poate face pe baza a dou grupe de date: 1) informaii generale 2) informaii clinice 1) Informaiile generale cuprind datele de anamnez care ar putea avea legtur cu intoxicaia, cum ar fi: - profesia pacientului i dac manipuleaz substane chimice; - tratamentul medicamentos anterior; - prezena la locul de producere a intoxicaiei a unor produse chimice, medicamente sau ambalaje (este util ca aceste substane s fie trimise la laborator pentru a servi ca martor sau pentru a determina dac compoziia lor corespunde cu cea teoretic); - informaii de la familie, vecini sau nsoitori.
2) Informaiile clinice sunt obinute de la medicul care ngrijete bolnavul sau de la cel care efectueaz necropsia. Acestea cuprind: - informaii cu privire la starea de contien (urgena analizei), tulburrile neurologice, cardiace sau respiratorii; - indici patologici: acidoz metabolic, hiperglicemie, care pot contribui la rezolvarea problemei. Patologiile existente, cum ar fi o afeciune renal sau hepatic, precum i alte situaii paratoxice (cldura sau frigul), pot influena toxicitatea medicamentelor i trebuie luate n considerare. De asemenea, trebuie specificat orice tratament efectuat naintea recoltrii probei: spltur gastric, administrarea unui antidot sau a unui medicament, deoarece acestea ar putea influena toxicocinetica sau toxicodinamica substanei, i deci rezultatul analizei. Examenul fizic al probelor biologice, n principal urin i coninut gastric, dar i al produselor suspecte, poate contribui la orientarea analizei toxicologice. Astfel, anumite medicamente sau metaboliii lor pot da o coloraie caracteristic urinei, dac sunt prezente n cantiti suficient de mari, aa cum se poate observa n tabelul 1.4. Desferalul sau albastrul de metilen, administrate ca antidoturi, pot determina colorarea urinei n rou, respectiv n albastru. Tabel nr. 1.4. Coloraii caracteristice ale urinei, determinate de diferite substane toxice Coloraie Cauze posibile maro sau negru (se intensific n Nitrobenzen, fenoli timp) galben sau portocaliu Fluorescein, fenolftalein, nitrofurantoin rou sau maro Fenotiazine, fenitoin, fenolftalein, chinin, warfarin (hematurie) albastru sau verde Amitriptilin, indometacin, fenoli Substanele toxice cu miros puternic, cum ar fi camforul sau salicilatul de metil, pot fi uneori recunoscute n urin deoarece se elimin parial sub form nemodificat. O urin tulbure poate fi consecina unei patologii asociate (snge, microorganisme, celule epiteliale) sau prezenei carbonailor, fosfailor sau urailor sub form microcristalin sau amorf. Aceste forme nu trebuie ignorate, chiar dac nu sunt ntotdeauna corelate cu o intoxicaie. Tratamentul cronic cu sulfamide poate conduce la formarea de cristale de culoare galben sau brun-verde ntr-o
urin neutr sau alcalin. O supradozare a fenitoinei sau a primidonei poate conduce la apariia de cristale n urin, n timp ce la pH neutru, dup ingestia de etilenglicol, apar n urin cristale incolore caracteristice de oxalat de calciu. n coninutul gastric i n produsele suspecte, unele substane pot fi recunoscute dup mirosul lor puternic. Astfel de toxici sunt prezentai n tabelul 1.5. Alte substane mirositoare sunt cloroformul, salicilatul de metil, paraaldehida, fenelzinul. De asemenea, un pH foarte sczut sau foarte ridicat se poate datora ingerrii unui acid sau a unei baze, n timp ce o coloraie verde /albastr poate indica prezena unor sruri de fier sau cupru. Tabelul nr. 1.5. Mirosuri specifice ale unor substane toxice Miros Migdale amare Fructe Usturoi Pere Benzin Fenol Tutun Crem de pantofi Dulceag Cauze posibile Cianuri Alcooli (inclusiv etanol), esteri Arsen, fosfor Cloral Distilate de petrol (utilizate i ca diluani pentru pesticide) Dezinfectante, fenoli Nicotin Nitrobenzen Cloroform sau alte hidrocarburi halogenate
1.2. ETAPELE UNEI ANALIZE TOXICOLOGICE GENERALE Acestea sunt: 1. Izolarea substanei toxice din proba de analizat Este etapa esenial a unei analize toxicologice, care poate influena decisiv rezultatul acesteia. Metodologia utilizat depinde de natura probei de analizat, dar i de natura substanei toxice, respectiv de proprietile fizico-chimice ale acesteia. Ea este deosebit de important n cazul probelor biologice, a cror analiz este dificil pentru mai multe motive, printre care se pot enumera: - coninutul ridicat de proteine - concentraiile mici
- prezena mai multor compui interfereni, fie endogeni, fie exogeni, care adesea se gsesc n concentraii mai mari dect ale analitului - necesitatea obinerii unor probe lichide pentru prelucrarea ulterioar - riscul de infecie. Datorit importanei deosebite a acestei etape a analizei, ea va fi discutat ntr-un capitol special. 2. Purificarea extractului Aceast etap este indispensabil n cazul analizei probelor biologice i presupune izolarea substanei toxice de ali compui care pot interfera, putndu-se realiza concomitent cu etapa de izolare sau ulterior. Principalii interfereni sunt compui normali din organism, cei mai importani fiind proteinele, dar i lipidele sau lecitinele. Eliminarea proteinelor se poate face prin precipitare cu diferii reactivi sau denaturare cu ajutorul enzimelor proteolitice. Prin denaturare, proteinele i pierd capacitatea de a lega substanele toxice, eliberndu-le n filtrat. Deproteinizarea se poate realiza prin mai multe procedee: - Procedee fizice: denaturarea prin nclzire, ultrafiltrarea, dializa; - Procedee imunologice: precipitarea selectiv a proteinelor se poate efectua cu ajutorul anticorpilor precipitani, formndu-se compleci antigen-anticorpi insolubili; - Deshidratare: cu ajutorul solvenilor organici (metanol, etanol, aceton, acetonitril) sau a srurilor minerale (sulfat de sodiu, sulfat de amoniu); - Precipitare sub form de sruri insolubile: o n mediu neutru cu sulfat de zinc i hidroxid de sodiu sau de bariu are dezavantajul de a conduce la adsorbia pe precipitatul de hidroxid metalic a substanelor neproteice prezente n mediu; o n mediu acid cu acizi: tricloracetic, percloric, tungstic, picric dezavantajul principal const n posibilitatea degradrii substanei toxice la pH-ul sczut. n tabelul 1.6. sunt prezentate principalele avantaje i dezavantaje ale acestor procedee. - Denaturarea cu ajutorul enzimelor proteolitice: tripsin, subtilizin, papain are avantajul de a evita degradarea substanei toxice i este folosit mai ales pentru probele de organe, caz n care faza de purificare preced faza de extracie. 3. Fracionarea extractului n cazul unei expuneri concomitente la mai muli compui, poate fi necesar fracionarea extractului pe grupe de substane: acide, bazice sau neutre. Deoarece
aceast etap se realizeaz concomitent cu extracia sau imediat dup aceasta, ea va fi discutat n capitolul destinat metodelor de extracie. 4. Detecia substanelor toxice Const n depistarea rapid a compuilor n probele analizate i se realizeaz n general prin teste fizice sau chimice. Este mai important n cazul analizei substanelor toxice din aer, cnd nainte de izolare este necesar cunoaterea naturii substanelor din mediu pentru a putea alege condiiile adecvate. n cazul probelor biologice, ea se face n principal prin teste de culoare sau eventual prin metode imunochimice. Tabel nr. 1.6. Eficiena diferitelor metode de deproteinizare Metoda nclzire 5-15 min. la 90C Saturare cu sulfat de amoniu ZnSO4-hidroxid de sodiu Acid metafosforic Acid percloric Eficiena Nu foarte eficient, poate descompune analitul. Eficien moderat; concentraii crescute de sare n supernatant, pH final n jur de 7. Eficien excelent, precipitat fin, pH final n jur de 7, potrivit la temperaturi sczute. Eficien excelent, reactivul trebuie meninut la rece, aciditatea (pH < 3) poate descompune analitul. Eficien excelent; reactivul trebuie pstrat la rece datorit pericolului de explozie. pH-ul final (< 3) poate descompune analitul. Majoritatea compuilor cu caracter bazic pot fi extrai fr probleme. Eficien bun; reactivii trebuie pstrai la rece i pot fi dificil de ndeprtat. Pentru denaturarea complet sunt necesare dou volume de etanol pentru un volum de prob; este potrivit pentru substanele instabile la pH sczut. Pentru denaturare complet sunt necesare 1,5 volume pentru un volum de prob. Precipitatul este puin dens, ceea ce reduce coprecipitarea analitului. Mai bun dect sulfatul de amoniu sau acidul tungstic pentru compuii bazici.
Acid tricloracetic Etanol
Acetonitril
Clorur de aluminiu
5. Identificarea substanelor toxice Identificarea substanelor toxice n extractele purificate, sau uneori chiar n probele ca atare, se poate face prin metode chimice (reacii de culoare sau de precipitare), metode fizico-chimice (cromatografice, spectrofotometrice, spectrometrice) sau metode imunochimice. Metodele chimice, n special teste de culoare, in mai mult de domeniul trecutului, dar pot fi nc ntlnite n laboratoarele cu o dotare mai puin sofisticat i la analiza unor corpuri delicte sau a unor probe biologice mai puin complexe, cum ar fi urina sau coninutul gastric. Astfel, salicilaii pot fi identificai cu reactivul Trinder, fenotiazinele cu reactiv FNP, imipramina prin reacia Forrest, iar compuii triclorurai prin reacia Fujiwara. Deoarece multe din aceste metode au att specificitate ct i sensibilitate redus, ele nu sunt foarte fiabile i pot fi pozitive doar n prezena unor cantiti relativ mari de substan toxic. Metodele cromatografice i n special cromatografia n strat subire, au fost i nc mai sunt mult utilizate n scopul identificrii substanelor toxice, mai ales datorit faptului c permit n acelai timp i o separare a toxicului de eventualii interfereni extrai concomitent din probe, n special cele biologice. n Tabelul 1.7. sunt prezentate principalele condiii cromatografice pentru identificarea prin CSS a multor din substanele toxice frecvent ntlnite. Un progres al aplicrii tehnicii CSS n toxicologia analitic l reprezint kitul TOXI-LAB, care este o trus de cromatografie comercializat n format standard i uor de utilizat n screening-ul toxicologic deoarece reduce variabilele din metoda clasic a cromatografiei n strat subire. Probe utilizate sunt: urina, care este preferat, dar dup modificri adecvate se pot folosi i serul, coninutul gastric sau probe nebiologice. Kitul a fost conceput s detecteze concentraiile toxice ale medicamentelor sau drogurilor frecvent ntlnite, iar uneori detecteaz, pentru anumite substane, i concentraiile terapeutice. Exist dou scheme analitice: - sistemul A cu procedeele de extracie, cromatografie, colorare - pentru detectarea substanelor bazice i neutre - sistemul B pentru substanele acide i neutre. Fabricantul furnizeaz plcile cromatografice (TOXI-GRAM), materialele de extracie (lichid-lichid sau extracie pe faze solide) i reactivii de colorare. Dup developarea plcii cu o faz mobil specific, spoturile sunt vizualizate prin introducerea plcii n reactiv i nu prin pulverizare. Pentru facilitarea identificrii este furnizat i o bibliotec CSS n format Rolodex ce conine Rf-ul i coloraiile medicamentelor i metaboliilor. Faza staionar este fabricat din hrtie din microfibr de sticl impregnat cu silicagel, pe care se pot aplica 6 probe sau
standarde. Pentru a vizualiza frontul solventului, n timpul developrii este folosit un marker colorant. Limitele de detecie sunt n general de 1 g / ml pentru o prob de urin de 4,5 5 ml. Kitul este adecvat pentru determinarea antidepresivelor triciclice (amitriptilin, imipramin, doxepin), a antidepresivelor tetraciclice (maprotilin), a antihistaminicelor (difenhidramin, clorfeniramin), a aminelor simpatomimetice, a analgezicelor neopiacee i a opioidelor sintetice (paracetamol, pentazocin). Determinarea benzoilecgoninei, opiaceelor, benzodiazepinelor, fenciclidinei este problematic, n timp ce salicilaii i ibuprofenul nu se pot detecta. Avantajele acestei truse sunt urmtoarele: - toate materialele i reactivii sunt asigurate de productor ntr-un singur set - standardele sunt pre-aplicate pe placa TOXI-GRAM - se asigur un material documentar detaliat - se asigur o bun documentare asupra substanelor i metaboliilor lor sub aspectul Rf-ului i a culorii spoturilor - sistemul are o specificitate crescut, asemntoare cu cea a gaz cromatografiei Limitele sistemului constau n: - limitele de detecie insuficient de joase pentru anumite medicamente - imposibilitatea depistrii substanelor polare sau a metaboliilor n timpul screening-ului iniial - mascarea unor substane de ctre altele prezente concomitent n prob (ex. fenotiazinele pot fi mascate de opiacee). Rezultatele determinrilor trebuie confirmate pentru a avea certitudinea identificrii, dar sistemul este deosebit de util n toxicologia clinic, atunci cnd viaa intoxicatului depinde de rapiditatea cu care se depisteaz toxicul incriminat. Performanele tehnicilor cromatografice pot fi crescute prin cuplarea acestora cu procedee de detecie bazate pe metode spectrofotometrice sau spectrometrice. Astfel, cromatografia n strat subire poate fi cuplat cu detecia UV prin folosirea unui densitometru, care permite nregistrarea in situ a spectrelor UV ale substanelor separate. Compararea acestor spectre cu cele din bazele de date confer un plus de certitudine identificrii toxicului, realizat anterior pe baza Rfului, prin metoda standardului extern. Cuplarea gaz-cromatografiei cu detecia prin spectrometrie de mas a permis dezvoltarea unei tehnici de identificare i dozare extrem de performante, care a reprezentat o adevrat revoluie n toxicologia analitic, mai ales o dat cu standardizarea tehnicii de ionizare i constituirea unor biblioteci de spectre. Progresele n domeniul informaticii fac posibil identificarea rapid i sigur a compuilor necunoscui prin compararea cu spectrele existente n bibliotecile de spectre.
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) poate fi cuplat cu detectori UV cu ir de diode (DAD), sau chiar cu un detector spectrometru de mas. Detectorul cu ir de diode determin spectrul UV al fiecruia din compuii separai, acesta fiind apoi comparat cu ajutorul unui soft special cu spectrele din biblioteca de spectre. Tehnica lichid cromatografie-spectrometrie de mas (LC-MS) s-a dezvoltat foarte mult n ultima perioad, avnd numeroase aplicaii att n toxicologia medico-legal ct i n cea clinic. Ea combin puterea de separare a HPLC cu sensibilitatea i specificitatea spectrometriei de mas, iar fa de GC-MS are avantajul de a putea fi aplicat i la analiza moleculelor polare, termolabile sau cu mas molecular mare i de a necesita mai puin timp pentru pregtirea probelor, eliminndu-se faza de derivatizare. Electroforeza capilar reprezint o tehnic cromatografic relativ nou, care s-a dezvoltat foarte mult n ultimii ani, avnd numeroase aplicaii i n toxicologia analitic. Avantajele acestei metode sunt: - diversitatea compuilor ce pot fi analizai, de la ioni anorganici, medicamente i droguri, pesticide, molecule aromatice mici, pn la aduci ai ADN-ului; - existena mai multor moduri de separare, cu selectiviti diferite (Ex. electroforeza capilar zonal, electroforeza electrocinetic micelar, electrocromatografia capilar, electroforeza capilar n gel, izotacoforeza capilar) ; - volumele mici de prob necesare pentru analiz, de obicei de ordinul nanolitrilor (dezavantaj: limitarea limitelor de detecie), - necesarul minim de solveni i costul sczut al acestora (sunt soluii tampon), precum i al altor consumabile (capilarele); - posibilitatea de cuplare cu diferii detectori; - robusteea i simplitatea aparaturii de baz. Aparatele de electroforez capilar sunt alctuite dintr-un autosampler, o surs de curent cu tensiune ridicat (10-30 kV), dou rezervoare pentru soluiile tampon, capilara (cu diametru intern ntre 20-100 m i lungime ntre 20-100 cm) i un detector (Fig.1.1). Teoria separrii este simpl. Deoarece capilarele sunt din silice i gruprile silanol sunt dispuse pe suprafaa intern, ele se pot ioniza pe msur ce pH-ul tamponului cu care se face eluarea crete. Ionizarea atrage cationii pe suprafaa silicagelului, iar la aplicarea unui curent aceti cationi vor migra spre catod, antrennd o deplasare a lichidului prin capilar. Fluxul poate fi ajustat prin modificarea triei dielectrice a tamponului, prin modificarea pH-ului, prin ajustarea tensiunii curentului sau prin modificarea vscozitii. n aceste condiii, att cationii ct i anionii sunt separai n timpul unei singure separri, cationii fiind eluai primii. Moleculele neutre (ex. pesticidele) sunt separate prin adugarea n tampon a unui detergent, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu, ceea ce conduce la formarea de micelii, n care moleculele neutre se vor distribui pe baza hidrofobicitii lor.
Deoarece miceliile sunt atrase spre anod, ele se vor deplasa spre catod cu o vitez mai mic dect restul lichidului din capilar, ceea ce permite separarea. Procesul poart denumirea de cromatografie capilar electrocinetic micelar (Fig.1.1.). Majoritatea analizelor se pot efectua n 5-10 minute, sensibilitile fiind situate n domeniul prilor pe bilion (ppb). Detectorul cel mai frecvent utilizat este detectorul UV, dar detectorul de fluorescen indus de laser poate determina o cretere a sensibilitii pn la 10 7-10 12 M. Metodele spectrofotometrice cele mai folosite sunt spectrofotometria UV, spectrofotometria IR i spectrofotometria de absorbie atomic (n flacr sau fr flacr), aceasta din urm fiind utilizat la analiza metalelor. Spectrofotometria IR cu transformant Fourrier are avantajul de a permite n anumite condiii (prin intermediul scderii spectrelor asistate de calculator) identificarea rapid a unor droguri din amestecuri ilicite, fr a fi necesar separarea acestora; se impune ns confirmarea rezultatelor prin spectrometrie de mas.
Figura 1.1. Reprezentarea schematic a unui cromatograf de electroforez capilar i o seciune prin capilar n timpul analizei electrocinetice micelare
Metoda spectrometric cea mai utilizat n analiza toxicologic este spectrometria de mas care, pe baza fragmentrii caracteristice a moleculei, face
posibil identificarea cu certitudine a substanelor. Spectrometrele de mas sunt frecvent cuplate cu metodele cromatografice care asigur separarea componenilor eventual prezeni n probele analizate, iar existena unor vaste librrii de spectre favorizeaz identificarea substanelor necunoscute. Metodele imunochimice sunt metode de analiz ce se bazeaz pe reacia reversibil dintre un antigen (ligand) i un anticorp (receptor), n urma creia se formeaz un complex solubil n ap: Ag + Ac K1 K2 Reacia continu pn la echilibru, cnd o parte din Ac i Ag se gsesc sub form legat, restul existnd sub form liber. Avantajele acestor metode constau n: - sensibilitatea i specificitatea mare - rapiditatea analizelor - prelucrarea unor cantiti mici de probe, fr pregtire anterioar. Metodele imunochimice se pot clasifica n trei grupe, n funcie de fenomenul final observat i msurat: - 1. Metode n care se observ direct rezultatul reaciei antigen-anticorp, cele mai cunoscute fiind metodele de precipitare i de aglutinare; - 2. Metode n care rezultatul reaciei este observat indirect, prin intermediul altui fenomen; este vorba de un fenomen fizico-chimic, corelat cu un marker ataat artificial de antigen sau de anticorp, care permite evidenierea reaciei dintre antigen i anticorp; - 3. Metode n care rezultatul reaciei este observat prin intermediul unui fenomen biologic, n general celular. Metodele folosite n analiza toxicologic fac parte n principal din a doua grup i, n funcie de agentul cu care se face marcarea, se pot distinge: - Radioimunoanaliza (RIA), n care markerii sunt radioizotopi - Analiza imunoenzimatic, ce folosete drept markeri enzime - Analiza imunofluorimetric, n care marcarea se face cu un compus fluorescent - Dozarea imunoluminometric, n care marcarea se realizeaz cu un compus luminiscent - Imunodozarea radicalilor liberi. Aceste metode pot fi la rndul lor n faz heterogen, cnd dozarea se face prin msurarea distribuiei reactivului marcat, fiind necesar separarea fazelor, sau AgAc
n faz omogen, cnd dozarea se bazeaz pe modularea activitii markerului, nefiind necesar separarea fazelor. RADIOIMUNOANALIZA (RIA) Aceast metod presupune marcarea antigenului cu un izotop (14C, 3H, 125I, 131 I). Are loc n sistem heterogen, ceea ce nseamn c este necesar separarea complexului AgAc de fraciunea de Ag liber. Att antigenul marcat Ag*, ct i Ag nemarcat (analitul) se leag de anticorp (Ac), cele 2 specii fiind n competiie pentru aceeai cantitate limitat de Ac. Deoarece ambele specii au teoretic aceeai afinitate, proporia lor n faza legat i n cea liber este aceeai, deci distribuia Ag nemarcat (analit) poate fi caracterizat de distribuia Ag*: Ag + Ag* + Ac AgAc + Ag*Ac
Dac se folosesc cantiti constante de Ac i Ag*, proporia de fraciune liber i fraciune legat va fi determinat de cantitatea de Ag nemarcat. Cu ct crete concentraia de Ag nemarcat, cu att radioactivitatea fraciunii legate scade, deci cantitatea de Ag* legat este invers proporional cu cantitatea de Ag nemarcat (analit). Fraciunea legat se separ de cea liber prin: reinere pe crbune activat, folosind un al doilea anticorp, prin reinere pe faz solid. ANALIZA IMUNORADIOMETRIC ( IRMA) Anticorpul n exces este marcat cu radioizotopi. Se incubeaz cu antigenul din prob, iar excesul de Ac* este ndeprtat din sistem prin adiia unei faze solide pe care se gsete legat o cantitate de antigen, n final determinndu-se radioactivitatea complexului AgAc*. ANALIZA IMUNOENZIMATIC Marcarea antigenului se face cu enzime, care pot fi: fosfataza alcalin, galactozidaza, peroxidaza din hrean, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza, lactamaza, ureaza. Tehnica prezint unele avantaje fa de marcarea cu izotopi radioactivi: - folosete compui marcai enzimatic, ce pot fi determinai prin spectrofotometrie UV-VIS - enzimele sunt mai stabile dect radioizotopii i nu prezint riscuri la manipulare - se poate lucra n sistem omogen, nemaifiind necesar o etap de separare - se poate automatiza. Se poate lucra n sistem heterogen ELISA - sistem omogen EMIT
Tehnica ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) se poate folosi pentru determinarea oricrui antigen. Este o metod competitiv, n care o cantitate corespunztoare de anticorp se leag pe o faz solid. La suportul solid se adaug o soluie care conine o cantitate cunoscut din antigenul marcat enzimatic i antigenul standard sau o prob necunoscut. Amestecul de reacie se incubeaz pentru a permite ca reacia Ag-Ac s ajung la echilibru. Dup splare se adaug substratul, iar activitatea enzimatic se msoar dup o perioad de incubare. Concentraia produsului de reacie este invers proporional cu concentraia standardului sau antigenului din proba necunoscut. Tehnica EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique), sau tehnica imunoanalitic cu enzime multiplicate, este limitat n general pentru determinarea haptenelor cu masa molecular mic. Metoda se bazeaz pe modificarea activitii enzimei atunci cnd haptena marcat enzimatic se leag de anticorp. Conjugatul hapten-enzim este activat enzimatic nainte de legarea de Ac care, datorit impedimentelor sterice, mpiedic accesul spre situsurile active ale enzimei. Haptena din prob se afl n competiie cu conjugatul hapten-enzim pentru o cantitate limitat de anticorp. O concentraie crescut de hapten va determina o legare mai redus a conjugatului hapten-enzim de anticorp, deci o activitate enzimatic crescut (Fig. 1.2.).
Figura 1.2. Mecanismele de modulare enzimatic n metoda EMIT I. Sistemul test n absena analitului. Anticorpii leag antigenul marcat cu o enzim: reacia are drept rezultat inactivarea enzimei, datorit unui impediment steric. II. Sistemul test n prezena unui exces de antigen liber [analit]. Inhibiia enzimatic este contracarat; cu ct analitul se gsete n cantitate mai mare, cu att activitatea enzimatic este mai mare i semnalul este mai intens.
TEHNICA FRAT (free radical assay technique) a fost introdus n 1971 pentru determinarea morfinei. Aceast metod se bazeaz pe analiza spectrului RES al radicalilor liberi. Astfel, un radical liber (ex. nitroxid) aflat n soluie prezint un spectru simplu din trei linii atunci cnd este examinat cu ajutorul unui spectrometru RES. Acest spectru se observ chiar i atunci cnd radicalul este legat de o molecul de medicament. Dac ns complexul medicament-radical se leag de un anticorp, rotaia sa n soluie este ncetinit, iar spectrul se aplatizeaz (Fig.1.3.). n absena antigenului nemarcat, tot complexul medicament-radical este legat de Ac i nu se observ semnal RES ascuit. Dac se adaug antigen nemarcat, complexul este deplasat de pe Ac i semnalul ascuit devine vizibil. Dezavantajul acestei metode const n necesitatea unui spectrometru RES, care este destul de costisitor.
A radical legat de Ac
B radical ce se roteste liber
Figura 1.3. Reprezentarea spectrelor RES observate n determinrile prin tehnica FRAT
1. Determinarea cantitativ a substanelor toxice Se realizeaz prin diferite metode fizico-chimice: poteniometrice, voltametrice, spectrofotometrice, spectrometrice, cromatografice sau imunochimice. n funcie de natura substanei i de concentraia n care aceasta se gsete n prob, se aleg acele metode care ofer cea mai bun specificitate i o sensibilitate care s corespund scopului analizei. 2. Interpretarea rezultatelor analizei Toate rezultatele trebuie nregistrate n fie de laborator, menionndu-se data, numele analistului, numele pacientului i orice alte informaii - n special numrul i natura probelor i analizele efectuate. Este de preferat s se atribuie fiecrei probe un numr de identificare unic n momentul recepiei n laborator, acest numr urmnd a fi utilizat n toate analizele efectuate. Spectrele UV, curbele de etalonare i alte documente obinute n cursul analizei vor fi pstrate un anumit timp dup comunicarea rezultatelor. Dac se menioneaz c o substan nu a fost detectat n plasm, ser sau urin, trebuie s se cunoasc limita de detecie a metodei. Rezultatele analizelor toxicologice sunt interpretate pentru probele de mediu (aer, ap, alimente) fa de concentraiile maxime admise (CMA) sau concentraiile medii prevzute n normele oficiale ale rii respective, iar pentru substanele toxice din mediile biologice, fa de nivelele fiziologice maxime (dac este vorba de un component normal al organismului, ex. fier), fa de nivelele terapeutice maxime (dac este vorba de un medicament) sau fa de nivelele toxice sau letale menionate n literatur i care au fost determinate n cursul unor cazuri de intoxicaii. Variabile care pot influena rezultatele analizelor toxicologice Numeroi factori pot influena rezultatul unei analize toxicologice. Cei mai importani sunt legai de: A. Momentul de recoltare a probei B. Stabilitatea compusului n prob C. Reproductibilitatea metodei analitice D. Interferenele cu metoda analitic A. Momentul de recoltare a probei Cnd o persoan absoarbe o singur doz de substan toxic, concentraia acesteia n snge, urin sau viscere depinde de momentul toxicocinetic n care se recolteaz proba sau se produce decesul (pentru probele recoltate post-mortem). Diferenele sunt mai importante pentru substanele cu timp de njumtire scurt. n cazul unei absorbii cronice, n special atunci cnd ne intereseaz monitorizarea unei intoxicaii, sau n domeniul toxicologiei profesionale, probele au o valoare redus atunci cnd se obin n momente care nu corespund strii staionare, sau de echilibru. Dac probele se recolteaz n faza de absorbie, att
concentraiile substanei ct i valorile parametrilor farmacocinetici calculai vor fi eronate. Starea staionar n absorbia cronic va fi mai bine reflectat de probele de snge recoltate naintea urmtoarei absorbii (administrri). B. Stabilitatea compusului n prob Frecvent, substana sufer modificri n prezena enzimelor plasmatice; acest inconvenient este mai redus n cazul probelor de snge total la care s-a adugat un conservant care mpiedic coagularea, cum ar fi fluorura de sodiu. C. Reproductibilitatea metodei analitice Metodele analitice trebuie s fie foarte sensibile, astfel nct plecnd de la probe de 2 ml s se poat detecta concentraii mai mici de 50-100 g, dar mai important este ca rezultatele s fie reproductibile ori de cte ori se analizeaz aceeai prob. Pentru acest motiv este necesar ca laboratorul s participe la programe de control al calitii, att intra-laborator ct i inter-laboratoare. n general, rezultatul unei analize nu poate fi considerat ca o valoare absolut pentru mai multe motive: A. Este posibil ca laboratorul s nu poat detecta agentul etiologic al unei intoxicaii ca urmare a: a) unor deficiene operatorii cu o recuperare redus a substanei toxice datorit: - unei tehnici extractive greite, unei separri insuficiente din complexele cu proteinele sau a glucuronoconjugailor, etc; - unor pierderi excesive n timpul proceselor de purificare sau datorit descompunerii compusului (prin hidroliz, oxidare, piroliz) nainte sau n timpul operaiilor analitice; - utilizrii unor tehnici de detecie cu sensibilitate redus. b) dispariiei substanei toxice din corpul intoxicatului nainte de prelevarea probei biologice. n mod normal, se crede c individul este recuperat atunci cnd reuete s elimine substana toxic, dar acest lucru nu este ntotdeauna valabil. Astfel, exist substane care declaneaz un proces fiziopatologic care poate continua chiar i dup dispariia agentului cauzator din organism. Un exemplu este cel al distrugerii parenchimului pulmonar la 12 zile dup absorbia paraquatului, care n realitate se elimin n 24 h. B. Se observ numeroase discordane ntre concentraiile substanelor toxice n sngele i urina intoxicatului i simptomatologia clinic. Astfel, tabelele de corelare ntre nivelurile substanelor toxice n lichidele biologice i starea clinic a intoxicatului trebuie considerate doar orientative din urmtoarele motive: a) Multe date nu au un suport statistic suficient: concluziile diferiilor autori se bazeaz pe un numr mic de observaii, iar criteriile clinice utilizate sunt uneori
diferite. Cea mai notabil excepie o reprezint corelarea alcoolemiei cu starea clinic a pacientului. b) Confuzia ntre valorile corespunztoare sngelui total, serului sau plasmei, sau diferenele de concentraie urinar care pot s apar n oligurie fa de diureza provocat. c) Diferene individuale datorate mai multor factori: - diferenele de sensibilitate a receptorilor (motive genetice, toleran dobndit, etc) - capacitate diferit de legare a proteinelor plasmatice - adaptarea metabolic, ce poate induce toleran prin eliminarea mai rapid a unei doze, dar n acelai timp poate determina devierea metabolismului spre alte ci care pot conduce la metabolii mai toxici sau mai puin toxici. n general, n analiza toxicologic se dozeaz produsul iniial i se ignor metaboliii activi sau dimpotriv, n funcie de tehnica folosit, se determin substana toxic i metaboliii mpreun. n mod logic, rezultatele nu vor fi concordante. De exemplu, o aceeai doz de amitriptilin poate produce la indivizi diferii diferene plasmatice de pn la 40 de ori. - aciunea concomitent a mai multor substane cnd, prin potenare sau antagonism, se poate modifica rspunsul normal al individului la dozele individuale din fiecare substan - confuzia ntre substane toxice nrudite chimic, dar diferite sub aspectul metabolismului i excreiei - diferenele de aciune farmacodinamic n funcie de ora din zi sau de anotimp (cronotoxicologie) d) Diferenele de sensibilitate i exactitate a tehnicilor analitice e) Utilizarea unor tehnici (spectrofotometria n UV sau fluorescen, reacii de culoare i CSS) care nu permit diferenierea ntre substanele toxice i metaboliii activi sau inactivi f) Utilizarea unor tehnici analitice avansate cu dizolvarea n ap a produsului. Pot s apar erori deoarece nu se ine cont de: - prezena proteinelor i lipidelor n probele biologice - interferena resturilor organice i a metaboliilor.
Tabel nr. 1.7. Sisteme CSS pentru identificarea unor substane toxice
SISTEM S1
GRUP BARBITURICI
STANDARDE DEVELOPARE a) aliltiobutilbarbituric CHCl3 : acetona (9:1) b) tiopental a) acid salicilic b) fenacetina c) salicilamida d) cafeina Diazepam Meprobamat
S2
DERIVATI FENOLICI SI XANTINICI BENZODIAZEPINE CARBAMATI
S3 S4
S5
FENOTIAZINE SI METABOLITI (SULFOXIZI)
a) clorpromazina b) imipramina
REVELARE a) general: Hg2(NO3)2 1% b) tiobarbiturici: sulfat de cobalt (0,5% n etanol) dietilamin (3%) CHCl3 : etanol (9:1) a, b, c) FeCl3 5% Benzen : acetat de etil : d) iodobismutat acid acetic (85:10:5) e) I2 (1% n etanol) + KI (1% n etanol i HCl) Acetat de etil : metanol : Iodobismutat amoniac (84:10:5) CCl4 : CHCl3 : acid - furfurol n HCl conc. acetic : apa (6:9:10:5) - Vanilin n H2SO4 50% Benzen : metanol : acid - Ditiocarbamai acetic (48:8:4) CuCl2 (1,5 g) + NH4Cl (3g) + NH3 (3ml) + ap (50 ml). nainte de utilizare se amestec 1:1 cu hidroxilamina (20% n ap) sau b) de la S1 Metanol : amoniac FNP (100:1,5) a) o-Tolidina b) i a) H2O2
S6 S7
ALCALOIZI SI DIFERITE AMINE AMFETAMINE
a) stricnina b) morfina c) sulpirid Amfetamina
Metanol : amoniac (100:1,5) n-butanol : acid formic: apa (20:1:2) Placa se usuc la 60C Benzen : hexan : ndietilamina (25:5.0,5) Benzen : cloroform (4:1) Ciclohexan : cloroform (4:1) Eter de petrol : acetona (4:1)
S8
CANABINOIDE
THC
a), b) iodoplatinat, iodobismutat b) iodobismutat Tampon fosfat 0,5 M (pH 5,5)+ Verde de bromcrezol (0,1% n etanol) + ap (1:2:1) Fast B Blue n NaOH 0,1N
S9 S10
ORGANOCLORURATE DDT ORGANOFOSFORICE Paration
o-tolidina (5% n etanol) + UV Brom + rou de Congo Dianisidina-molibdat sodic, nclzire Albastru de bromfenol + naftilacetat, incubare la 37C Fast B Blue (n ap)
Capitolul 2 METODE DE ANALIZ TOXICOLOGIC SISTEMATIC Substanele toxice pot fi clasificate, n funcie de procedeele folosite pentru izolare i de proprietile lor fizico-chimice n 3 grupe principale: 1. Substane toxice separate sub form de gaze sau de vapori 2. Substane toxice minerale 3. Substane toxice organice nevolatile. n afar de aceste clase principale, mai exist substane toxice diverse, care necesit tehnici de extracie speciale, cum ar fi extracia pe coloane cu schimbtori de ioni, formarea de derivai sau de perechi de ioni sau extracie continu cu un solvent polar. Datorit numrului mare de substane de interes toxicologic, ntr-o analiz toxicologic general trebuie s se ncerce succesiv metode specifice pentru separarea i identificarea fiecrui toxic. Dac, pe baza antecedentelor sau a altor indicaii, nu se caut o substan concret, este necesar s se aplice procedee metodologice programate n mod logic, care s permit izolarea i detectarea prezenei fiecrui grup de substane cu caracteristici fizico-chimice similare. Conform clasificrii anterioare a substanelor toxice, exist trei grupe de metode de analiz toxicologic : - Metode pentru gaze i vapori - Metode pentru toxici anorganici - Metode pentru toxici organici. nainte de a ncepe o analiz toxicologic general, cnd nu exist indicaii cu privire la natura substanei toxice, proba de analizat se mparte n 4 poriuni: 3 destinate celor 3 metode menionate, iar a 4 a se pstreaz pentru operaiunile ulterioare sau pentru confirmare, iar dac este necesar pentru determinarea cantitativ. 2.1. METODE DE IZOLARE PENTRU GAZE I VAPORI Metodele de izolare care se utilizeaz pentru substanele toxice gazoase i volatile depind de natura probei care este supus analizei. Astfel, reinerea gazelor i a vaporilor din aer se face n medii absorbante lichide sau direct n aparatul de analiz, n timp ce din medii biologice, aceste substane se pot izola prin difuzie simpl, antrenare cu un curent de aer, antrenare cu vapori de ap sau distilare.
Metode de analiz toxicologic sistematic 33
2.1.1. Izolarea substanelor toxice gazoase i volatile din aer Detecia substanelor toxice n aer Poluarea atmosferei a devenit o problem cotidian a societii moderne, motiv pentru care supravegherea calitii aerului reprezint un obiectiv central al asigurrii sntii publice. Acest lucru se realizeaz prin evidenierea periodic sau continu a substanelor toxice n aerul industrial sau comunal. Metodele de detecie se pot clasifica n metode chimice, metode fizico-chimice i metode biologice. a) Metodele chimice de detecie se bazeaz pe reacii chimice care au loc ntre substana chimic i diferii reactivi de culoare, care sunt impregnai pe hrtii, creioane sau tuburi indicatoare. - Hrtiile indicatoare sunt benzi sau rondele de hrtie de filtru mbibate cu un reactiv adecvat, care se expun n atmosfera poluat sau prin care se aspir aerul de analizat. Prezena substanei toxice este indicat de modificarea culorii, care survine n urma reaciei dintre aceasta i reactivul de impregnare. Determinrile pot fi i semicantitative, prin aprecierea concentraiei pe baza timpului necesar pentru apariia culorii sau pe baza lungimii poriunii colorate sau a intensitii culorii n funcie de volumul de aer aspirat. - Creioanele indicatoare conin reactivul inclus ntr-un material de umplutur amestecat cu un liant. n atmosfera analizat, se traseaz o linie cu acest creion pe hrtie sau lemn i se apreciaz prezena sau chiar concentraia aproximativ a substanei toxice prin modificarea coloraiei liniei trasate. - Tuburile indicatoare conin reactivul impregnat pe o pulbere adsorbant, cel mai adesea de silicagel, care este introdus n tuburi de sticl gradate, cu diametru uniform. Tuburile indicatoare sunt specifice pentru fiecare substan toxic i sunt comercializate sub form de truse. Pentru a putea fi utilizate, se taie la ambele capete i fie c sunt lsate un anumit timp n atmosfera poluat, fie c sunt adaptate la dispozitive de tip Drger, care permit aspirarea unui anumit volum de aer. n acest caz, determinarea este semicantitativ, concentraia fiind proporional cu lungimea stratului colorat. b) Metodele fizico-chimice de detecie se bazeaz pe msurarea unor constante fizice sau chimice ale substanelor prezente n aer, folosind aparate speciale, printre care se numr i analizoarele de gaze. c) Metodele biologice de detecie utilizeaz animale mici, cum ar fi vrbiile, canarii, oarecii, care au o frecven respiratorie mare i o sensibilitate mare la substanele toxice gazoase. Acestea reacioneaz mult mai repede dect omul i previn asupra polurii atmosferei, n special n locurile de munc nchise, cum ar fi galeriile din mine.
Recoltarea probelor de aer n afar de detecia rapid a substanelor toxice, de cele mai multe ori se recomand i recoltarea de probe de aer n vederea unei analize precise n laborator, care permite nu numai determinarea concentraiei toxicului, dar i determinarea compoziiei atmosferei la locul unui accident. Recoltarea probelor de aer se realizeaz prin mai multe procedee. a) Recoltarea n recipiente nchise (Procedeul de moment) Procedeul este indicat pentru recoltarea substanelor toxice care se gsesc n atmosfer n concentraie mare, pentru analiz fiind suficiente volume mici de aer (pn la 1 litru). Se utilizeaz recipiente cu volum cunoscut, de diferite forme sau capaciti, cum ar fi: - pipetele de gaz (tonometre), care sunt tuburi de sticl de 200-500 ml, prevzute la ambele capete cu robinete (Fig.2.1.) - flacoane de sticl prevzute cu dopuri cu tubulatur de tip sifon (a) sau n form de T (b), care permit vidarea (Fig.2.2.) - baloane sau camere de cauciuc sau material plastic, care au ns o utilizare limitat, deoarece unele substane pot difuza prin material (dioxidul de carbon), iar altele pot fi adsorbite de acesta (dioxidul de sulf). Recoltarea se face prin dislocuire de lichid sau aer, sau prin creare de vid.
Figura 2.1. Tonometre
Figura 2.2. Flacoane de recoltare
b) Recoltarea prin aspirare (Procedeul continuu) Procedeul este indicat pentru recoltarea substanelor toxice ce se gsesc n atmosfer n concentraie mic, pentru analiz fiind necesare volume mari de aer. Aerul este aspirat continuu printr-un mediu absorbant, n care toxicul este concentrat. Aparatura necesar pentru recoltare este alctuit din trei tipuri de dispozitive: dispozitive de aspirare, dispozitive de msurare a volumului de aer aspirat i dispozitive de reinere a substanei toxice. 1. Dispozitivele de aspirare au rolul de a crea o depresiune n sistemul de reinere, care antreneaz ptrunderea aerului n acesta. Ele pot fi aspiratoare hidraulice sau aspiratoare mecanice, n funcie de modul de funcionare i de volumele de aer recoltate. Aspiratoarele hidraulice se folosesc atunci cnd la locul recoltrii exist doar o surs de ap, nu i una de curent electric, iar volumele de aer sunt relativ mici i se recolteaz cu vitez redus. n aceast clas se ncadreaz: - Vasele comunicante (Fig.2.3.), care sunt confecionate din sticl sau metal, au capaciti egale, sunt asamblate prin intermediul unui tub de cauciuc prevzut cu o clem i sunt gradate din 100 n 100 cm3. Vasele comunic ntre ele printr-un dispozitiv de sifonare sau prin orificii laterale. Vasul superior este ataat la dispozitivul de reinere, se umple cu ap i se deschide clema. Datorit diferenei de nivel, apa va curge n vasul inferior, fcnd vid n vasul superior i antrennd astfel aspirarea aerului din exterior prin mediul absorbant din dispozitivul de reinere. Se pot recolta i volume de aer mai mari dect capacitatea vaselor, dac se schimb poziia lor de mai multe ori ntre ele. - Trompa de ap se poate utiliza n locurile unde exist o conduct de ap sub presiune, cu debit mare i uniform. Aspiratoarele mecanice sunt utile pentru recoltarea unor volume mari de aer. Ele pot fi: - Pompe de vid manuale sau electrice, care prezint dezavantajul c sunt grele i sunt sensibile la coroziunea prin vapori acizi sau alcalini. - Aspiratoarele de praf, care sunt pompe electrice de vid modificate, cu debit mare i uor de manipulat. - Pompele cu aer comprimat sunt indicate pentru locurile de recoltare cu risc de explozie i unde exist o instalaie de aer comprimat. - Ejectoarele sunt aparate electrice care recolteaz aerul pe mai multe canale cu debite reglabile, msurnd n acelai timp i volumul de aer aspirat.
Figura 2.3. Tipuri de vase comunicante 2. Dispozitivele de msurare a volumului de aer pot fi gazometre sau debitmetre. - Gazometrele (contoare de gaz) msoar volume mari de aer prin sistemul unor camere separate de membrane speciale, iar volumul aspirat este indicat direct pe cadran. - Debitmetrele msoar debitul de aspirare, deci volumul de aer aspirat n unitatea de timp. Pentru a se calcula volumul, este necesar notarea timpului ct a durat aspirarea. Ele pot fi rotametre sau reometre. 3. Dispozitivele de reinere a substanelor toxice poart denumirea de absorbitoare, barbotoare sau vase spltoare i conin soluii ce se numesc soluii absorbante, n care reinerea toxicului se face prin fenomene fizice (dizolvarea) sau chimice (reacii de precipitare, reacii redox, etc.). Soluia absorbant se alege n funcie de natura substanei toxice, iar volumul necesar se stabilete innd cont de capacitatea barbotorului, de concentraia toxicului i de sensibilitatea metodei de dozare utilizat. Absorbitoarele sunt recipiente de sticl astfel construite nct la trecerea aerului prin soluia absorbant s aib loc o barbotare lent, care s permit un contact prelungit ntre aer i lichid, cu transferul de mas al toxicului. n acelai timp, ele nu trebuie s aspire lichidul n exterior. n funcie de capacitatea lor, absorbitoarele se clasific n microabsorbitoare, care au capacitate redus (1-5 ml soluie absorbant) i permit determinarea concentraiilor mici de substane toxice deoarece favorizeaz concentrarea i
macroabsorbitoare, cu capacitate de 50-100 ml, care sunt indicate pentru reinerea toxicilor aflai n concentraii mari. n funcie de construcia lor, absorbitoarele sunt de diferite tipuri (Fig. 2.4.), dar trebuie s asigure ptrunderea aerului n recipient printr-un sistem care s permit dispersarea sa: un tub cu extremitatea efilat, o bul de sticl perforat, o plac poroas, etc.
Figura 2.4. Diferite tipuri de absorbitoare Un tip special de absorbitor este impingerul, prin care aerul ptrunde n jet puternic i izbindu-se de fundul recipientului se divizeaz, favoriznd reinerea substanei toxice (Fig. 2.5.). Dac substanele toxice din aer se gsesc sub form de aerosoli sau pulberi, cum este cazul substanelor minerale sau a pesticidelor, reinerea lor se poate face att n medii lichide introduse n impingere de capacitate mare, ct i pe medii solide adsorbante. Acestea pot fi membrane filtrante din fibr de sticl, material plastic i chiar hrtie de filtru, cu porozitate ntre 0,01 i 20 m, sau mai nou, spume poliuretanice sau crbune activat condiionate n tuburi de sticl ce pot fi adaptate la dispozitive de aspirare a aerului (Fig. 2.6.). Tuburile cu spume poliuretanice, datorit facilitilor de manipulare i a desorbiei rapide a compuilor, au fost avizate de ctre Agenia American de Protecie a Mediului (EPA) pentru detectarea pesticidelor i a bifenililor policlorurai.
Figura 2.5. Impinger
Figura 2.6. Instalaii de recoltare a aerului
c) Recoltarea direct n aparatul de analiz Poluanii gazoi din atmosfer pot fi determinai direct din mediul poluat cu ajutorul unor aparate ce poart denumirea de analizoare de gaze i care asigur recoltarea, depistarea i dozarea substanelor, individual sau n amestec. Aceste aparate pot fi prevzute cu dispozitive de nregistrare automat a concentraiei de toxic i cu semnalizatoare acustice sau optice ale depirii concentraiilor maxime
admisibile. Principiile de funcionare ale analizoarelor pot fi optice, termochimice sau electrochimice. Analizoarele optice de gaze msoar absorbia luminii de ctre substana toxic sau de ctre produsul de reacie al acesteia cu mediul absorbant. Msurarea absorbiei se poate face n domeniul vizibil, UV sau IR, folosind celule fotoelectrice. Foarte frecvent se utilizeaz spectroscopia IR, care permite monitorizarea cantitilor mici de poluani gazoi (ex. dioxid de carbon, acid azotic) cu ajutorul unor instrumente cu citire direct. Analizoarele termochimice de gaze msoar energia caloric rezultat n urma reaciilor chimice ale substanelor toxice i au fost folosite la determinarea oxidului de carbon, a metanului sau a vaporilor de benzin. Analizoarele electrochimice de gaze msoar variaia conductivitii electrice a soluiei absorbante dup reinerea toxicului din amestecul gazos i pot fi utilizate la monitorizarea dioxidului de sulf, a oxizilor de carbon, a acidului clorhidric sau a vaporilor de benzin. Condiii de recoltare a substanelor toxice din aer La analiza toxicologic a substanelor din aer, trebuie s fie ndeplinite cteva condiii eseniale: - volumul de aer recoltat trebuie s fie suficient - reinerea toxicului trebuie s fie eficient - debitul de recoltare trebuie s fie adecvat, pentru a asigura o reinere eficient. Alegerea aparaturii i a procedeului de recoltare se fac n funcie de volumul de aer ce trebuie recoltat, de caracteristicile metodei de analiz i de natura substanei analizate. n timpul recoltrii se ine cont de viteza i de direcia de micare a aerului, de umiditatea atmosferic, de presiune i de temperatur. nlimea la care se aeaz dispozitivele de recoltare este de 1,5-1,8 m, aproximativ la nivelul cilor respiratorii ale unei persoane adulte. Debitul de recoltare se va regla n funcie de capacitatea de reinere a toxicului n soluia absorbant i de concentraia acestuia n mediul respectiv. Volumul minim de aer recoltat se stabilete n funcie de concentraia n care se gsete substana toxic i de sensibilitatea metodei analitice utilizate pentru determinarea cantitativ. Exprimarea concentraiilor substanelor toxice din aer Aceasta se poate face n uniti de: - greutate / volum, de exemplu n mg/m3 sau mg/l - volum / volum, de exemplu n procente de volum (% vol.), pri pe milion (ppm) sau pri pe bilion (ppb).
2.1.2. Izolarea substanelor toxice gazoase i volatile din medii biologice i din alte produse a) Microdifuzia Aceast metod se poate utiliza pentru izolarea din medii biologice a unor substane foarte volatile (acetona), sau care elibereaz compui foarte volatili, cum este cazul acidului cianhidric pus n libertate de ctre cianuri. Izolarea se realizeaz ntr-un dispozitiv special, cum este celula de microdifuzie Coway (Fig. 2.7.). Proba biologic se plaseaz ntr-unul din compartimentele celulei, se adaug un reactiv care elibereaz compusul foarte volatil, iar acesta difuzeaz n cellalt compartiment, unde este fixat de un reactiv potrivit (ex. soluie de hidroxid de sodiu n cazul acidului cianhidric). n acest mod poate fi determinat i monoxidul de carbon din snge. Astfel, sngele se plaseaz n compartimentul central al celulei, unde se trateaz cu o soluie de saponin-fericianur care, prin hemoliza sngelui, elibereaz monoxidul de carbon. Acesta difuzeaz n compartimentul periferic, unde reacioneaz cu clorura de paladiu. Operaia poate dura ntre 2 i 5 ore la temperatura camerei, pentru a ne asigura c difuzia este complet. Concentraia substanei poate fi apoi determinat spectrofotometric, prelucrndu-se paralel o scar de etaloane preparat n mod identic.
Figura 2.7. Celula de microdifuzie Conway
b) Antrenarea cu un curent de aer Metoda se poate aplica la izolarea din medii biologice a unor substane toxice gazoase (hidrogen sulfurat, hidrogen arseniat) sau volatile (benzen, acid cianhidric). Instalaia este compus din (Fig. 2.8.): - recipientul cu produsul de analizat (A) - absorbitoarele ce conin soluiile absorbante specifice pentru toxicul analizat (B)
- dispozitivul de aspirare (C) - dispozitivul de purificare a aerului, montat naintea recipientului cu produsul de analizat (D).
Figura 2.8. Instalaie de antrenare cu curent de aer
c) Distilarea Aceast metod se utilizeaz pentru izolarea substanelor volatile i se bazeaz pe volatilitile diferite ale componentelor probei. Sub aciunea cldurii, faza lichid trece n stare de vapori. Vaporii obinui sunt condensai prin rcire ntr-un refrigerent, iar lichidul recoltat poart denumirea de distilat. Instalaia de distilare (Fig. 2.9.) este alctuit dintr-un balon de distilare prevzut cu un termometru, adaptat la un refrigerent descendent terminat cu o alonj al crei capt este introdus n recipientul de colectare, de preferin un balon cotat ce conine civa ml de ap distilat sau un alt lichid adecvat. Distilarea simpl poate separa doar compuii care au diferene mari de volatilitate (de ex. diferene ntre punctele de fierbere de mai mult de 50C). Pentru distilarea simpl la presiune atmosferic, separarea obinut este de obicei incomplet. n cazul unei analize toxicologice generale, atunci cnd toxicul nu este cunoscut, se efectueaz dou distilri: o distilare din mediu acid, cnd se separ substanele cu caracter acid i neutru, i o distilare din mediu alcalin, cnd se separ compuii cu caracter bazic. Culegerea distilatului se face pentru toxicii acizi i neutri n ap distilat sau n soluii cu caracter bazic, iar pentru toxicii alcalini n soluii acide.
Fig.2.9. Instalaie de distilare
O variant a distilrii este distilarea fracionat, care permite izolarea unui compus n stare pur i poate fi utilizat n cazul amestecurilor cu mai multe componente. n aceast variant, vaporii vin n contact cu o parte din condensat ntr-o operaie n contracurent care genereaz mai multe talere teoretice comparativ cu distilarea simpl, permind o separare mai bun. Pentru distilarea fracionat, la balonul de distilare se adapteaz un cap de distilare reprezentat de o coloan de tip Vigreux (Fig. 2.10.), care asigur un contact mai bun ntre vapori i lichid. Vaporii de la partea superioar a coloanei sunt condensai, fiind parial ndeprtai. Viteza de curgere a lichidului i a vaporilor este adaptat n aa fel nct n orice punct al coloanei lichidul s aib o concentraie mai mare de substane volatile dect cea care corespunde echilibrului cu vaporii cu care se afl n contact. n consecin, compuii mai volatili vor trece din lichid n faza de vapori, iar cei mai puin volatili, din faza de vapori n faza lichid. Pe msur ce urc n coloan spre refrigerent, vaporii devin mai bogai n compui mai volatili, iar lichidul devine mai concentrat n componenii mai puin volatili, pe msur ce curge n coloan ctre balonul de distilare.
Figura 2.10 Instalaie de distilare fracionat
Pentru substanele care nu sunt stabile la temperatura de fierbere se poate utiliza o alt variant, i anume distilarea n vid, care prin scderea presiunii conduce la o cretere a volatilitii compuilor. Operaia se realizeaz cu ajutorul unui aparat ce poart denumirea de rotavapor (Fig.2.11.).
Figura 2.11. Rotavapor
d) Antrenarea cu vapori de ap Aceast metod se poate aplica atunci cnd substana de analizat are punctul de fierbere superior celui al apei, sau cnd se descompune la temperatura sa de fierbere. Ea se bazeaz pe principiul conform cruia dou substane volatile n amestec emit vapori n cantiti direct proporionale cu tensiunea de vapori a fiecreia din acestea. Prin nclzire, tensiunea de vapori a fiecrei substane crete, independent de cealalt. Cnd tensiunea de vapori a amestecului egaleaz presiunea atmosferic, amestecul ncepe s fiarb i substanele distil. Deoarece suma tensiunilor de vapori ale componentelor amestecului este egal cu presiunea atmosferic, fiecare component distil la o temperatur mai mic dect propria temperatur de fierbere. O instalaie de antrenare cu vapori de ap este prezentat n Fig. 2.12.
Figura 2.12. Instalaie de antrenare cu vapori de ap
2.2. METODE DE IZOLARE A SUBSTANELOR TOXICE MINERALE Substanele toxice minerale pot exista n organism sub form ionic sau sub form de proteinate ale metalelor grele, care sunt puin sau deloc ionizabile. n consecin, vor exista metode diferite de izolare a celor dou grupe de substane din produsele biologice sau din alte probe. 2.2.1. Izolarea substanelor minerale ionizabile a) Dializa Substanele toxice minerale ionizabile sunt acizi, baze sau sruri, ce se pot izola din resturi alimentare, coninut stomacal, vom, prin macerare cu ap urmat de dializ. Aceste substane se izoleaz mai rar din esuturi, deoarece la acest nivel ele se gsesc parial legate sub form de proteinate. Operaia se realizeaz ntr-un dializor, care este un tub de sticl cu diametru de 3-4 cm, prevzut la partea inferioar cu o membran semipermeabil de celofan sau colodiu. n dializor se introduce produsul de analizat, macerat i filtrat n prealabil, iar tot ansamblul este imersat ntr-un cristalizor cu ap distilat, n care se menine 3-6 ore, pentru a avea loc difuzia substanei toxice. Pentru o izolare ct mai complet, lichidul din cristalizor se poate schimba de mai multe ori, urmrindu-se meninerea gradientului de concentraie. Dializatele obinute se reunesc i, dac proprietile substanei toxice permit acest lucru, se concentreaz prin evaporare pn la un volum mai mic. Pentru determinarea cantitativ, dializatul se aduce la un anumit volum, din care se prelucreaz o cot parte. b) Electrodializa Aceast metod este util pentru izolarea ionilor, fie c sunt anorganici (fluoruri, bromuri) sau organici (derivai barbiturici, alcaloizi). Separarea este favorizat de trecerea curentului electric, care determin migrarea ionilor spre anod sau spre catod, n funcie de polaritatea lor, i care n plus favorizeaz i eliberarea toxicului din proteinate. Metoda are avantajul izolrii cantitative a substanelor n stare pur. Aparatura necesar const dintr-un electrodializor (Fig. 2.13.), compus din trei recipiente separate prin membrane semipermeabile. n recipientul central (B) se plaseaz produsul de analizat, mrunit i triturat cu ap distilat i adus la pH-ul optim de disociere. Recipientele A (anodic) i C (catodic) conin ap distilat i electrozii corespunztori. Operaia poate dura ntre 24 i 48 de ore.
Figura 2.13. Electrodializor
2.2.2. Izolarea substanelor minerale neionizabile (fixe) Substanele toxice minerale neionizabile nu pot fi depistate direct n probele de analizat, ruperea legturilor dintre metal i proteine realizndu-se prin distrugerea materiei organice, adic prin mineralizare. Mineralizarea se poate face pe cale uscat (calcinare) sau pe cale umed, alegerea metodei depinznd de volatilitatea compuilor obinui n cursul procesului. a) Mineralizarea pe cale uscat Mai poart denumirea de calcinare i, n funcie de natura agentului oxidant, se clasific n: - Calcinare simpl sau direct, care const n nclzirea probei n cuptoare de calcinare, la temperaturi ridicate, agentul oxidant fiind oxigenul din aerul atmosferic. Ea are avantajul obinerii unei cenui fr reziduu organic, n care metalul se gsete mai ales sub form de carbonat i este concentrat. Dezavantajele constau n durata lung a procesului i n pierderile de toxic prin umflare i debordare, mai ales dac proba nu a fost uscat corespunztor nainte de a fi introdus n cuptor, dar n special prin volatilizarea metalelor (Hg, Zn, Cd), a oxizilor metalici (oxid de arsen) sau a srurilor (clorur de arsen sau de stibiu). - Calcinarea cu amestecuri de oxidani reduce la maxim formarea de metale care pot fi volatile, precum i timpul de calcinare. Se pot folosi ca amestecuri oxidante: azotatul de potasiu mpreun cu carbonatul de sodiu, oxidul de
magneziu singur sau n prezena azotatului sau a acetatului de magneziu. Acest amestec din urm are avantajul de a micora temperatura de combustie i de a reduce pierderile, mai ales n cazul metalelor oxiacide cum este arsenul, care n absena oxidului de magneziu ar trece n sruri volatile. - Calcinarea n curent de oxigen asigur o mineralizare mai rapid, dar necesit o aparatur special i prezint riscul pierderii unor substane prin volatilizare. Calcinarea cu amestec de oxid de magneziu i azotat de magneziu. Tehnica de lucru: 1-2 g produs de analizat mrunit se trateaz cu o cantitate dubl de oxid de magneziu i se adaug n poriuni mici soluie de azotat de magneziu 20% pn se obine o past omogen. Aceasta se introduce ntr-un creuzet, se usuc n etuv la 110C i apoi se calcineaz n cuptorul de calcinare la 500-600C. Se ndeprteaz azotatul prin nclzire cu acid sulfuric concentrat (1-2 ml). Reziduul obinut dup rcire se dizolv n acid clorhidric 10% i se filtreaz. Soluia se folosete pentru identificarea i dozarea substanei toxice, inclusiv a arsenului. b) Mineralizarea pe cale umed Folosete diferite substane cu caracter oxidant: clor, acizi tari, peroxid de hidrogen, permanganat de potasiu, etc., i se realizeaz n mediu apos. n funcie de natura oxidantului, se cunosc mai multe metode: - 1. Mineralizarea cu clor (Metoda Fresenius-Babo-Ogier-Stepanov) Clorul este preparat ex-temporae din clorat de potasiu i acid clorhidric. Durata mineralizrii este lung, ntre 5 i 24 de ore, n funcie de coninutul proteic al probei. Grbirea distrugerii prin creterea temperaturii sau prin mrirea concentraiei de acid clorhidric sau a cantitii de clorat poate determina pierderi datorit formrii unor cloruri volatile, cum ar fi clorura de As (III). Principiul metodei. Clorul liber, datorit caracterului oxidant, distruge materia organic i pune n libertate metalele sub form ionic: KClO3 + 6 HCl Cl2 + H2O 2 HClO 3 Cl2 + KCl + 3 H2O HClO + HCl 2 HCl + O2
Tehnica de lucru. Produsul de analizat solid (fin divizat) sau lichid (eventual concentrat prin evaporare) se introduce ntr-un balon Wrtz. Deoarece n prezena alcoolului etilic clorul poate produce explozii, produsele de analizat care conin etanol vor fi n prealabil supuse distilrii, pentru ndeprtarea acestuia. La probele solide se adaug acid clorhidric 12,5%, pn la obinerea unei mase semifluide. Dac produsul de analizat este lichid, se adaug acid clorhidric concentrat, n aa fel nct concentraia final n acid s fie de 12,5%. Se adaug apoi 1-2 g clorat de potasiu cristale i se fixeaz balonul pe o baie de ap cu temperatura de 50-70C. Balonului i se adapteaz o plnie de separaie n care se gsete o soluie 5% de clorat de potasiu. Pentru fixarea excesului de clor, tubul lateral al balonului Wrtz se conduce, prin intermediul unei tubulaturi de cauciuc, ntr-un flacon care conine soluie 10% de hidroxid de sodiu. Dup nclzire, din plnia de separaie se adaug pictur cu pictur soluie de clorat de potasiu 5%, agitnd puternic coninutul balonului din cnd n cnd. n varianta Stepanov, mineralizarea se poate efectua cu cristale de clorat de potasiu, care se adaug repetat, n poriuni mici, ntr-un balon prevzut cu un refrigerent de aer i montat pe o baie de ap. Mineralizarea se consider terminat atunci cnd produsul din balon are aspect de flocoane galben-verzui. Dup rcire, materialul se transvazeaz ntr-o capsul de porelan, se dilueaz cu ap pn la obinerea unei concentraii de acid de 2-5% i se nclzete pe baie de ap sub ni, pn la ndeprtarea complet a clorului liber, care se verific cu ajutorul unei hrtii indicator iod-amidonate. Adugarea bisulfitului de sodiu poate favoriza eliminarea clorului. Pentru precipitarea unor metale, cum ar fi bariul i plumbul, se adaug 1-2 ml acid sulfuric diluat i se continu nclzirea pe baie de ap la 50C nc 20-30 de minute. Apoi se filtreaz, iar pe filtru se separ precipitatele de clorur de argint, sulfat de bariu i sulfat de plumb, n cazul n care aceste metale sunt prezente n prob, precum i materii organice rmase nedistruse (grsimi, celuloz). n filtrat, substanele toxice se regsesc sub form ionic, ca sulfai sau cloruri solubile, i pot fi determinate prin metodele analitice uzuale. - 2. Mineralizarea sulfonitric (Metoda Denigs) Agenii de mineralizare sunt acidul azotic i acidul sulfuric, iar metoda are avantajul de a distruge complet substanele organice, indiferent de natura lor, n interval de cteva ore.
Principiul metodei. Sub aciunea acidului sulfuric concentrat, care este un deshidratant puternic, i a acidului azotic concentrat, care are proprieti oxidante, materia organic este descompus, transformndu-se n dioxid de carbon, ap, sulfat de amoniu, iar substanele minerale trec n form ionic: H2SO4 2 HNO3 NO + O SO3 + H2O 2NO + H2O + 3 O NO2
Tehnica de lucru. Dac produsul de analizat este lichid sau conine alcool, se concentreaz prin evaporare; dac este solid se mrunete. 50-70 g produs biologic proaspt sau 10-15 g produs biologic uscat se introduc ntr-un balon Kjeldahl, se adaug 8-16 ml acid sulfuric concentrat i cteva perle de sticl. Balonul se nclzete pe sit de azbest la flacr mic sau pe baie de nisip electric, pn la carbonizare. Se adaug apoi, dintr-o plnie de separaie montat la partea superioar a balonului, acid azotic concentrat n picturi. Mineralizarea este considerat a fi terminat atunci cnd lichidul din balon i pstreaz culoarea galben-pai i claritatea timp de 10-15 minute de la ntreruperea adugrii acidului azotic, continundu-se nclzirea. Prezena eventualelor substane organice se verific pe sticl de ceas, prin reacie cu 1-2 picturi de soluie de permanganat de potasiu 2%. Dac mineralizarea este complet, lichidul rmne colorat n roz, n caz contrar se decoloreaz. Purificarea probei urmrete ndeprtarea oxizilor de azot legai sub form de acid nitrozilsulfuric. Aceasta se realizeaz prin diluarea lichidului din balon cu 50 ml ap, cnd n urma hidrolizei rezult acidul sulfuric i acidul azotos. Acidul azotos se elimin prin adugare de uree, de sulfamat de amoniu, de azid de sodiu, sau prin nclzire 10-15 minute. Operaia se repet pn cnd reacia cu difenilamin este negativ. n mineralizat substanele toxice se gsesc sub form de sulfai i uneori n stare de oxidare superioar.
50 Analize i evaluri toxicologice O S O OH NH2 2 HNO2 + O C NH2 O 2 HNO2 + O S OH 2 N2 + CO2 + 3 H2O O NO + H2O H2SO4 + HNO2
NH4 H2SO4 + 2 N2 + 3 H2O
- 3. Mineralizarea sulfonitropercloric (Metoda Kahane) Principiul metodei. Metoda se bazeaz pe capacitatea puternic oxidant a amestecului de acid azotic i acid percloric la temperatura de fierbere a acidului sulfuric, dup carbonizarea produsului organic cu amestec sulfonitric. Dezavantajul metodei const n pericolul de explozie, motiv pentru care trebuie evitat excesul de acid percloric sau supranclzirea. Pentru izolarea metalelor din compuii organometalici folosii ca medicamente sau pesticide, se poate utiliza o semimicrometod care este foarte rapid. Tehnica de lucru a semimicrometodei Kahane. ntr-o eprubet se introduc 0,1-0,2 g produs de analizat, se adaug 1-2 ml acid sulfuric concentrat i se nclzete n baie de ap la fierbere. Se adaug cu atenie 1-2 ml amestec de acid azotic concentrat i acid percloric concentrat (1:1) i se nclzete n continuare 5-10 minute. Lichidul galben deschis se dilueaz cu 8-10 ml ap, se filtreaz i se analizeaz.
- 4. Mineralizarea nitropercloric Utilizeaz drept ageni oxidani acidul azotic i acidul percloric i se aplic la mineralizarea probelor de snge sau de urin, mai ales la izolarea unor metale cum ar fi plumbul sau manganul. Tehnica de lucru este asemntoare cu cea de la metoda sulfonitric.
- 5. Mineralizarea cu acid sulfuric i perhidrol Distrugerea materiei organice este favorizat de prezena perhidrolului, care este un oxidant foarte bun i se recomand pentru mineralizarea unor cantiti mici de probe biologice. - 6. Mineralizarea cu acid sulfuric sau acid azotic i permanganat de potasiu Metoda este indicat pentru mineralizarea probelor de urin, n vederea determinrii plumbului (mineralizare cu acid azotic i permanganat de potasiu) sau a mercurului (mineralizare cu acid sulfuric i permanganat de potasiu). Metoda are dezavantajul de a dura destul de mult n cazul urinelor concentrate (20-36 ore) i de a necesita asigurarea unui exces de agent oxidant pe tot parcursul procesului. - 7. Mineralizarea cu acid sulfuric i azotat de amoniu Metoda se preteaz pentru izolarea metalelor din produsele biologice sau din compuii organometalici, atunci cnd cantitile de probe sunt reduse. - 8. Mineralizarea cu acid azotic i bisulfit de potasiu Metoda este indicat n special pentru izolarea cromului.
2.3. METODE DE IZOLARE A SUBSTANELOR TOXICE ORGANICE Aceste metode permit separarea majoritii toxicilor organici, att a celor organici nevolatili, ct i a celor volatili, care pot fi izolai i sub form de vapori, cum este cazul unor baze organice ca nicotina sau amfetamina. Deoarece n aceast clas se ncadreaz foarte multe din substanele de interes toxicologic ntlnite la ora actual: medicamente, droguri, pesticide, micotoxine, aditivi alimentari, etc., majoritatea progreselor n domeniul tehnicilor de izolare s-au realizat n cadrul acestui grup de metode. Evoluiile au fost dictate nu numai de numrul mare de substane interesate, ci i de particularitile acestora, legate n principal de dozele mici n care sunt utilizate sau care pot produce toxicitate, precum i de dezvoltarea rapid a unor tehnici analitice performante, cu sensibilitate ridicat. Pretratamentul probelor: Hidroliza conjugailor i deproteinizarea Aceste substane sunt analizate frecvent din produse biologice, iar analiza ridic probleme importante, care sunt determinate de faptul c la acest nivel toxicii se gsesc sub form metabolizat, iar att compusul printe ct i metaboliii pot fi
legai de lipide sau de proteinele celulare sau de transport, sau se pot gsi sub form de conjugai. Uneori se urmrete numai determinarea compusului liber, care poate fi separat prin dializ sau ultrafiltrare, dar de cele mai multe ori este necesar dozarea cantitii totale de substan toxic din prob i n acest caz se impun deproteinizarea i hidroliza conjugailor. Conjugarea poate avea loc cu acid glucuronic, grupri sulfat, grupri metil, grupri acetil, aminoacizi sau glutation, dar cel mai des este ntlnit conjugarea cu acid glucuronic. Glucuronidele sunt de mai multe tipuri, n funcie de natura atomului prin care se face legarea toxicului de acidul glucuronic (Fig.2.14.). Hidroliza acestora se realizeaz prin metode chimice sau enzimatice, dar selectivitatea metodei este dependent de tipul de glucuronid. Astfel, ester glucuronidele sunt hidrolizate de enzima -glucuronidaz, sau prin tratament alcalin uor. Hidroliza enzimatic poate fi mpiedicat datorit migrrii gruprii acil, care reprezint o transesterificare intramolecular la nivelul gruprilor hidroxilice ale acidului glucuronic, ce conduce la obinerea unor derivai rezisteni la -glucuronidaz. Poate fi utilizat i o hidroliz acid, dar aceasta nu este selectiv. Eter glucuronidele pot fi hidrolizate enzimatic cu -glucuronidaz. Ele sunt stabile n mediu alcalin, dar sunt hidrolizate de acizi. N-glucuronidele se formeaz prin reacia dintre acidul glucuronic i compuii ce conin grupri aminice aromatice sau alifatice, sulfonamide sau un atom de azot heterociclic. Stabilitatea N-glucuronidelor n soluii acide depinde de natura agliconului i de modul i poziia n care se ataeaz restul de acid glucuronic la aglicon. Conjugaii aminelor aromatice sunt labili n mediu acid, n timp ce aceia ai sulfonamidelor sunt stabili n mediu acid. Aminele teriare se pot conjuga cu acidul glucuronic prin intermediul perechii de electroni ai atomului de azot, formnd compui cuaternari de amoniu. Tratamentul cu beta-glucuronidaz hidrolizeaz astfel de conjugai n msur mai mic dect un tratament alcalin la cald. S-glucuronidele se formeaz pornind de la compui ce conin grupri tiol sau grupri de acid ditionic. Informaiile cu privire la susceptibilitatea lor la diferite procedee hidrolitice sunt limitate i indic o variabilitate considerabil ntre compui. C-glucuronidele sunt formate de compui cum ar fi THC, fenilbutazon, sulfinpirazon. n aceast reacie de conjugare, un atom de carbon din nucleul benzenic sau ciclul pirazolidinic se ataeaz direct de acidul glucuronic prin intermediul unei legturi carbon-carbon, rezultnd un conjugat rezistent la betaglucuronidaz. Conjugaii acizilor carboxilici cu aminoacizii sunt stabili din punct de vedere chimic i pot fi separai prin CSS sau HPLC.
Sulfoconjugaii. Majoritatea fenil-sulfailor vor fi hidrolizai de arilsulfataze, dei unii sunt foarte rezisteni. Un contaminant important al preparatelor de aril-sulfataze disponibile comercial este -glucuronidaza, care trebuie inhibat cu zaharo-1,4-lacton nainte ca utilizarea n scop de diagnostic a acestor sulfataze s fie acceptat. Esterii aril-sulfat sunt labili n mediu acid i pot fi hidrolizai n mediu apos n condiii acide, n timp ce esterii alchil sulfat sunt mai rezisteni.
OCOR OR C
acil glucuronide eter glucuronide C-glucuronide
X COOH H HO H O X H OH H H OH
SR N + N
S-glucuronide
N-glucuronide
Figura 2.14. Tipuri de glucuronide
Deoarece hidroliza enzimatic dureaz mult, n toxicologia de urgen se prefer clivajul conjugailor prin hidroliz acid rapid. Doar ester conjugaii pot fi clivai prin hidroliz alcalin. Hidroliza chimic poate conduce ns la formarea unor artefacte. Un compromis ntre cele dou metode l reprezint utilizarea unor coloane umplute cu glucuronidaz/ arilsulfataz imobilizat, care combin avantajele celor dou tehnici: rapiditatea hidrolizei acide i clivajul blnd al hidrolizei enzimatice. Principala metod de izolare a substanelor organice nevolatile este:
a) Extracia cu solveni organici, capabili s antreneze compusul i s l separe din prob. Aceast metod are mai multe variante, dintre care unele au fost dezvoltate relativ recent. 1. Extracia lichid-lichid (EL-L) este tehnica extractiv cea mai utilizat. Aceast extracie implic separarea analiilor de interfereni prin partiia probei ntre dou lichide (faze) nemiscibile. n majoritatea cazurilor, una din fazele lichide este apoas, cealalt fiind reprezentat de un solvent organic. Conform Legii distribuiei lui Nernst, orice specie molecular se va distribui ntre doi solveni nemiscibili n aa fel nct raportul concentraiilor n cele dou faze este constant: K = Co / Ca unde: K este coeficientul de distribuie, Co este concentraia substanei n faza organic, iar Ca concentraia n faza apoas. O expresie mai util este fracia de analit extras (E): E = CoVo / (CoVo + CaVa) = KV / (1 + KV) unde Vo este volumul fazei organice, Va este volumul fazei apoase, iar V este raportul dintre volumele celor dou faze Vo / Va. Aceast expresie permite calcularea randamentului de extracie: = E x 100. Selectivitatea i eficiena procesului de extracie pot depinde de mai muli factori: - Selecia celor dou lichide nemiscibile. n cazul cuplurilor de solveni apoi i organici, compuii hidrofili vor prefera faza apoas, n timp ce aceia mai hidrofobi se vor regsi n faza organic. De obicei se prefer izolarea analiilor n solventul organic, deoarece acesta poate fi ndeprtat, permind concentrarea substanei prin evaporare. Dac pentru separare i analiz se utilizeaz metoda HPLC cu faze inverse, analitul de interes poate fi extras n faza apoas, pentru a putea fi injectat direct n coloana cromatografic. - Alegerea aditivilor folosii pentru influenarea procesului de echilibru. Astfel, modificarea pH-ului fazei apoase poate favoriza extracia substanelor cu caracter slab acid sau slab bazic n solventul organic. Pentru extracia compuilor cu caracter slab acid (ex. derivai barbiturici, paracetamol, aspirin, THC, majoritatea pesticidelor) se procedeaz la acidularea fazei apoase cu o soluie diluat de acid mineral, cu un acid organic sau cu un tampon cu pH acid, favorizndu-se astfel trecerea substanei n forma neionizat, solubil n solventul organic. n cazul bazelor slabe (alcaloizi, amfetamin, unele medicamente), faza apoas este alcalinizat cu o soluie de hidroxid alcalin, amoniac sau un tampon cu pH alcalin.
De asemenea, adugarea de ageni de cheletare, de complexare sau de formare de perechi de ioni, poate modifica echilibrul de dizolvare. - Raportul dintre cele dou faze nemiscibile (V) poate influena randamentul de extracie. Astfel, cu ct acesta este mai mare, cu att extracia este mai eficient. Pentru o extracie cantitativ ( > 99%), raportul dintre faze trebuie meninut ntr-un interval convenabil: 0,1 < V < 10. Solvenii organici folosii trebuie s aib anumite caracteristici: - o solubilitate n ap redus (mai mic de 10%) - s fie volatili, pentru a putea fi uor ndeprtai dup extracie - s aib proprieti de solubilizare care s asigure recuperarea analiilor n faza organic - s fie compatibili cu tehnicile analitice utilizate n continuare. Cei mai folosii solveni organici sunt: hidrocarburile alifatice, eterul etilic i ali eteri, clorura de metilen, cloroformul, acetatul de etil i ali esteri, cetonele alifatice cu mai mult de 6 atomi de carbon, alcoolii alifatici cu mai mult de 6 atomi de carbon, toluenul i xilenii, sau combinaii de doi sau mai muli dintre acetia. Solvenii organici miscibili cu apa, cum ar fi alcoolii cu mas molecular mic, cetonele, aldehidele, acetonitrilul, dioxanul, nu pot fi utilizai pentru extracia lichid-lichid. Extracia lichid-lichid se realizeaz prin agitarea puternic a celor dou faze puse n contact, care se face de obicei n plnii de separare. Aceast etap are rolul de a asigura un contact intim ntre cele dou faze, crend o suprafa interfacial enorm, care favorizeaz transferul de mas. Dac probele conin surfactani sau lipide, este posibil formarea emulsiilor n timpul agitrii, ceea ce mpiedic separarea fazelor i deci a substanei ce urmeaz a fi izolat. Emulsiile pot fi sparte prin: - adugarea de sare n faza apoas - filtrarea emulsiei prin vat de sticl - filtrarea emulsiei printr-o hrtie de filtru pentru separarea fazelor - centrifugare - adugarea de cantiti mici din diferii solveni organici - utilizarea unui aparat de extracie ce permite nclzirea-rcirea. Clasificarea metodelor de extracie lichid-lichid se poate face n funcie de: - a) eficiena extraciei, n extracie prin echilibrare i extracie exhaustiv - b) solventul folosit, n extracie general i extracie selectiv. Extracia prin echilibrare se bazeaz pe agitarea produsului de analizat cu solventul organic pn la realizarea unui echilibru de partiie a substanei toxice ntre cele dou faze. Tehnica poate fi aplicat atunci cnd se urmrete doar identificarea toxicului, nu i dozarea sa. Extracia exhaustiv urmrete epuizarea produsului de analizat de substana toxic, deci o extracie cu un randament peste 99%, cnd soluia extractiv poate fi
utilizat pentru determinri cantitative. Aceasta se poate realiza fie prin extracii multiple succesive, fie prin rennoirea solventului, n aparate Soxhlet sau n aparate de extracie lichid-lichid continu, n care solventul proaspt, cu densitate mai mare dect a apei, este reciclat continuu, sub form de picturi ce trec prin faza apoas ce conine substana toxic. Extracia n contracurent poate asigura i ea o regsire corespunztoare. Extracia general se realizeaz cu solveni organici care au capacitatea de a dizolva o gam larg de substane toxice, cum ar fi eterul etilic. Metoda este indicat n analizele toxicologice generale, n care natura toxicului nu este cunoscut. Extracia selectiv este aplicabil atunci cnd natura substanei toxice este cunoscut i presupune utilizarea acelor solveni organici n care toxicul are solubilitate maxim. Metode moderne de extracie lichid-lichid sunt microextracia, n care raportul dintre cele dou faze este situat ntre 0,001 i 0,01 i care, dei are un randament sczut, permite o concentrare important a analitului n faza organic, precum i extracia pe coloane. Aceasta din urm presupune utilizarea, n locul plniilor de separare, a unor coloane de extracie n care una din fazele lichide este ncorporat ntr-un mediu inert. Cea de-a doua faz lichid nemiscibil este percolat prin faza imobil, n mod asemntor cromatografiei. Suportul inert este constituit din pmnt de diatomee calcinat, de puritate ridicat, introdus n cartue de polipropilen. Limitele extraciei lichid-lichid sunt: - cantitile mari de solveni organici utilizai - randamentele mici de extracie - necesitatea unor extracii multiple care dureaz mult - obinerea unor extracte diluate care necesit o concentrare dup extracie - prelungirea timpului de extracie cu durata fazei de evaporare - posibilitatea apariiei unor descompuneri mediate de solvent - formarea de emulsii - obinerea de extracte impure - prezena n solvent a unor impuriti care pot interfera n analiz - riscul de mediu datorit vaporilor toxici de solveni organici degajai n timpul extraciei i evaporrii. Aceste dezavantaje au impus dezvoltarea unor noi tehnici de extracie, dintre care cea mai important este: 2. Extracia pe faze solide (EFS), care s-a dezvoltat foarte mult n ultimii ani, devenind una din cele mai utilizate metode de pregtire a probelor. Avantajele acestei tehnici sunt: - obinerea unor randamente crescute de extracie comparativ cu extracia lichid-lichid
- realizarea simultan a izolrii substanei toxice din prob i a preconcentrrii probei, ceea ce asigur o sensibilitate crescut i limite de detecie mici - reducerea consumului de solveni - evitarea formrii emulsiilor - obinerea unor extracte clare - manipularea uoar i posibilitatea automatizrii procesului de extracie n determinrile de rutin - costul redus - timpul mult mai scurt al analizei. Extracia pe faze solide se bazeaz pe adsorbia analitului care este dizolvat n prob pe un adsorbant, de pe care este apoi eluat cu un solvent corespunztor. Adsorbia reprezint fixarea unui gaz, a unui lichid sau a unui solid pe o suprafa solid. Pentru ca aceast fixare s fie utilizabil n scopuri separative, ea trebuie s fie reversibil. Eluia, sau desorbia, const n extracia substanei adsorbite pe faza solid cu ajutorul unui solvent, care n acest caz poart denumirea de eluent. Are loc ruperea legturilor dintre adsorbant i moleculele fixate iniial, care sunt nlocuite pe locurile de adsorbie de ctre moleculele eluentului. ntre aceste interaciuni se stabilete un echilibru: SOLVAT ADSORBANT Adsorbia este influenat de unele proprieti ale moleculelor de substane toxice, cum ar fi: caracterul ionic, polaritatea, polarizabilitatea i configuraia structural. Adsorbanii folosii pot fi: - adsorbani minerali, ca alumina, silicatul de magneziu, aluminosilicaii sau silicagelul - ali adsorbani, cum sunt polimerii reticulai derivai de stiren sau silicagelul modificat prin legare chimic. Aceti adsorbani trebuie s posede anumite proprieti, care sunt eseniale pentru utilizarea lor n tehnicile extractive: - 1. insolubilitatea n solvenii folosii i ineria fa de substanele adsorbite - 2. suprafaa specific important, care s asigure o adsorbie corespunztoare - 3. activitatea, care este dependent de coninutul de ap i care trebuie s fie constant pentru a se asigura o reproductibilitate bun; activarea se face prin nclzirea adsorbantului n etuv la temperaturi ridicate (100-300C). Mecanismele pe care se bazeaz reinerea pe faza solid pot fi: ELUENT
- interaciuni apolare, cnd reinerea se face n mediu polar, iar eluarea n mediu nepolar - interaciuni polare, cnd reinerea se realizeaz n mediu apolar, iar eluarea n mediu polar - schimburi ionice, cnd se folosesc schimbtori de cationi (acid propilsulfonic, benzensulfonic grefai pe silicagel) pentru reinerea substanelor cu sarcin pozitiv, sau schimbtori de anioni (ex. amine cuaternare) pentru reinerea analiilor anionici. Ca i n cazul extraciei lichid-lichid, reinerea substanelor toxice poate fi influenat de pH, mai ales atunci cnd faza solid este reprezentat de silicagel modificat sau de schimbtori de ioni. Pentru silicagelul modificat pH-ul soluiei de condiionare i cel al probei trebuie s fie cel la care compusul nu este ionizat, iar pentru schimbtorii de ioni, pH-ul probei trebuie s fie unul la care analitul i gruprile funcionale de pe suprafaa schimbtorului au sarcini opuse. Dispozitivele de condiionare a fazei solide pentru EFS sunt cartuele sau discurile de extracie (Fig.2.15.).
Fig.2.15. Cartue de extracie de diferite tipuri
Cartuele sunt coloane de polipropilen sau de sticl n care se introduce faza solid i prin care proba sau solventul sunt forate s treac prin aplicarea unei presiuni cu ajutorul unei seringi sau prin aspirare, folosind o instalaie pentru creat vacuum (Fig. 2.16.).
Fig.2.16. Dispozitiv de creat vacuum folosit n EFS
Etapele unei extracii pe faz solid sunt: - 1. Condiionarea cartuului - 2. Trecerea probei prin cartu - 3. Splarea cartuului (pentru ndeprtarea interferenilor) - 4. Eluarea analiilor. Foarte importante pentru obinerea unui randament bun sunt alegerea cartuului i a solvenilor folosii pentru eluare. Mrimea cartuului este dependent de volumul probei de analizat, cantitatea de adsorbant depinde de capacitatea de reinere a acestuia, iar tipul de solvent de matricea probei, apoas sau organic. Pentru matricile apoase, alegerea adsorbantului depinde de solubilitatea analitului n ap sau n solveni organici, iar pentru matricile organice de polaritatea i de miscibilitatea solventului cu apa. n tabelul 2.1. sunt prezentai principalii adsorbani folosii n EFS i analiii reinui pe acetia.
Tabelul nr. 2.1. Tipuri de adsorbani utilizai n extracia pe faze solide

Tipul de extracie Extracie apolar Adsorbant Analiii reinui Grupri hidrofobe: cicluri aromatice, catene alchilice Grupri hidrofile: -OH, NH2, heteroatomi Matricea Ap, soluii tampon, lichide biologice Hexan, uleiuri, cloroform, lipide Ap, soluii tampon acide, lichide biologice Eluenii Metanol, acetonitril, acetat de etil, cloroform, hexan Metanol, izopropanol, aceton Soluii tampon alcaline, soluii tampon cu trie ionic mare Soluii tampon acide, soluii tampon cu trie ionic mare Acizi puternici, baze puternice, amestecuri de solveni organici cu acizi sau baze Aplicaii Droguri, pesticide, substane medicamentoase Separarea lipidelor, aditivilor uleioi, fenolilor, hidrailor de carbon Catecolamine, ierbicide, substane medicamentoase
C18 octadecil C8 octil CH ciclohexil PH - fenil Extracie polar CN cianopropil 2OH diol Si silicagel NH2 aminopropil Extracie cu SCX acid schimbtori de benzen sulfonic cationi PRS acid propil sulfonic CBA acid carboxilic Extracie cu SAX amin schimbtori de cuaternar anioni NH2 aminopropil DEAdietilaminopropil Extracie mixt Bond Elut Certify Clean Screen DAU
Cationi: amine, pirimidin
Anioni: acizi carboxilici, acizi sulfonici, fosfai
Ap, soluii tampon alcaline, lichide biologice Ap, soluii tampon acide, lichide biologice
Acizi organici, vitamine, acizi grai, fosfai
Droguri cu caracter bazic, substane medicamentoase
Substane medicamentoase cu caracter neutru i bazic
b) Extracia cu fluide supercritice Extracia cu fluide supercritice este o nou tehnic de separare care a fost introdus n 1988 pentru a nlocui extracia Soxhlet. Aceast extracie se realizeaz n condiii speciale de temperatur i presiune, care permit atingerea unui punct critic n care materialul nu este nici lichid, nici gazos. Peste acest punct exist un domeniu, denumit domeniu supercritic, n care creteri att ale presiunii ct i ale temperaturii nu au efect asupra materialului, care nici nu va condensa, nici nu va fierbe. Acest fluid, denumit supercritic, are proprieti comune att gazelor ct i lichidelor, adic difuzeaz prin materiale ca i cum ar fi un gaz i are capacitate de dizolvare asemntoare unui lichid. Fluidul de elecie pentru aceast metod este dioxidul de carbon, ai crui parametri critici pot fi uor controlai i care n plus este uor disponibil n form pur i la un cost acceptabil. n unele cazuri, pentru a crete randamentul de extracie al unor compui, n dioxidul de carbon supercritic se pot aduga modificatori, cum ar fi metanolul. Metoda de extracie este considerat a fi selectiv, acest lucru asigurndu-se prin ajustarea presiunii, a temperaturii, a compoziiei fluidului, a fluxului sau a timpului.
Fig.2.17. Aparat pentru extracie cu fluide supercritice
Un aparat de extracie cu fluide supercritice (Fig.2.17.) este alctuit n principiu dintr-o butelie cu dioxid de carbon, o pomp, o camer de extracie, un restrictor sau camer de decompresie i un flacon n care se recolteaz proba. Dac substanele izolate sunt foarte volatile, reinerea lor se face ntr-un dispozitiv de captare cu un adsorbant n faz solid, care este rcit n timpul colectrii i nclzit apoi pentru a promova desorbia.
Astfel de aparate de extracie pot fi cuplate cu diferite coloane sau detectori, permind analiza probelor complexe; un exemplu de cuplare este cel cu un gaz cromatograf. Metoda este util pentru analiza probelor solide, iar n domeniul toxicologiei se aplic n special la analiza probelor de mediu sau a pesticidelor din produsele alimentare. n funcie de modul de solubilizare a substanelor toxice i de agenii folosii pentru precipitarea proteinelor, de-a lungul timpului au fost dezvoltate mai multe metode de izolare a substanelor organice nevolatile. 1. Metoda Stas-Otto-Ogier este prima metod eficient de extracie cu solveni organici, care a fost elaborat de Stas n 1850, n cursul unei expertize pentru izolarea nicotinei. Ea a fost ulterior modificat de Otto i apoi de Ogier, iar tehnica utilizat n prezent se bazeaz pe solubilizarea substanelor toxice n amestec hidroalcoolic slab acidulat, urmat de ndeprtarea impuritilor cu alcool concentrat. Dup ndeprtarea alcoolului, toxicii sunt extrai cu solveni organici, nti n mediu acid, apoi n mediu alcalin. Tehnica de lucru. 50-100 g (ml) produs de analizat, bine mrunit i omogenizat, se introduc ntr-un balon cu fund rotund prevzut cu un refrigerent. Se aciduleaz cu o soluie de acid tartric 5% pn la pH 4 i se adaug un volum dublu de alcool de 95. Volumul de alcool adugat depinde de consistena produsului, el alegndu-se n aa fel nct concentraia alcoolic final s fie n jur de 40-50%. Se macereaz pe baia de ap, timp de 6-12 ore la 50C, sau 3-6 ore la 70C, apoi coninutul balonului se rcete i se filtreaz. Filtratul se purific, ndeprtnd substanele care ar putea deranja analiza. Astfel alcoolul, care este miscibil att cu apa ct i cu solvenii organici i care poate reduce extracia toxicilor deoarece o parte din ei ar putea rmne n faza alcoolic, se ndeprteaz prin distilare sub presiune sczut, nclzind baia la 50C, sau prin evaporare ntr-o capsul, pn la obinerea unui lichid siropos. Lichidul se rcete i se trateaz sub agitare continu cu un volum de 3-4 ori mai mare de alcool de 95, pentru precipitarea proteinelor. Se las s se aglomereze precipitatele floconoase, apoi se filtreaz, iar precipitatul se spal cu alcool. Se repet operaia de 3-4 ori, n final folosindu-se alcool absolut. Purificarea este complet atunci cnd nu se mai formeaz flocoane proteice la adugare de alcool absolut. Se filtreaz, se ndeprteaz alcoolul i se dilueaz cu 50 ml ap.
Lichidul apos acid astfel obinut este prelucrat n continuare pentru ndeprtarea lipidelor sau a coloranilor. n acest scop, el este extras ntr-o plnie de separaie cu un volum egal de eter de petrol, operaia repetndu-se dac este cazul. Extractul de eter de petrol poate conine, pe lng impuriti, i substanele toxice care sunt solubile n acest solvent, cum ar fi acidul salicilic, camforul, glutetimida, insecticidele organoclorurate. Dac se bnuiete prezena n prob a acestor compui, se renun la purificarea prin extracie cu eter de petrol, pentru a evita pierderile sau obinerea unor extracte impurificate i greu de analizat. Pentru o purificare mai avansat se ndeprteaz lecitinele prin precipitare cu aceton, filtrare i eliminarea acesteia prin distilare i evaporare. Lichidul apos acid obinut conine majoritatea substanelor toxice sub form de tartrai (alcaloizi, medicamente cu caracter bazic), sub form liber (glucozizi, cantaridin, etc.), sau ca acizi neionizai (derivai barbiturici, acid salicilic, etc.). n continuare, se procedeaz la fracionarea extractului, care urmrete separarea toxicilor n trei grupe: substane cu caracter acid, substane cu caracter bazic i compui neutri. Aceast fracionare nu este absolut, deoarece exist substane, cum ar fi cafeina sau alte xantine, care au caracter amfoter i se pot regsi n oricare dintre primele dou faze; de asemenea, metaboliii unor substane cu caracter bazic se pot separa i n fraciunea acid, cum este cazul sulfoxizilor fenotiazinelor, al derivaiilor fenolici ai fenacetinei, al metaboliilor benzodiazepinelor, etc. Fracionarea dup Stas-Otto se realizeaz astfel: soluia apoas acid obinut dup extracie i purificare se agit ntr-o plnie de separare cu solventul organic. Dei s-a propus folosirea cloroformului, a acetatului de etil, a diclormetanului, etc., solventul de elecie este eterul etilic, chiar dac unii autori l contest datorit formrii de peroxizi cu caracter exploziv; aceti peroxizi se pot ndeprta prin tratare cu sulfat feros sau pe coloan de alumin. Extractul sau fraciunea eteric obinut conine substanele cu caracter acid (acid salicilic, barbiturice, pirazolon) i neutre (carbamaii). Aceast fraciune poate s necesite purificare, dup care este fracionat la rndul ei. Astfel, ea se extrage cu soluie de bicarbonat de sodiu 5%, cnd se separ acizii tari (fraciunea A1); eterul se reextrage cu soluie de hidroxid de sodiu 0,1N, care reacioneaz cu acizii slabi i compuii fenolici (fraciunea A2). Eterul rmas va conine doar compuii neutri i lipidele. Se evapor la sec i reziduul se dizolv n acid sulfuric 0,1N, obinndu-se fraciunea C, a substanelor organice neutre (Fig. 2.18.). Faza acid iniial se neutralizeaz cu hidroxid de amoniu sau cu carbonat acid de sodiu pn la un pH alcalin (Fig.2.19.). Teoretic, trebuie nti efectuat o
alcalinizare cu hidroxid de amoniu, urmat de extracie cu eter, dup care se alcalinizeaz cu carbonat acid de sodiu i se extrage, acoperindu-se astfel toate posibilitile de extracie a compuilor amfoteri. n practic se face ns o singur alcalinizare pentru substanele bazice, unii autori prefernd hidroxidul de amoniu, iar alii carbonatul acid de sodiu. Dup alcalinizarea soluiei apoase i extracie cu eter (sau diclormetan, sau cloroform), se obine fraciunea alcalin, care conine substanele cu caracter bazic cum ar fi: alcaloizii, bazele cuaternare de amoniu, fenotiazinele, benzodiazepinele, amfetaminele, etc. Aceast faz eteric se extrage cu acid sulfuric 0,1N i rezult fraciunea B. Pentru purificare se pot reextrage fraciunile cu solvent organic, dup modificarea pH-ului, i apoi din nou cu soluie acid pentru substanele bazice sau alcalin pentru substanele cu caracter acid. Fraciunile A, B, C sunt astfel pregtite pentru identificare prin spectrofotometrie n UV, de fluorescen, GC, CSS. n primul rnd se aplic spectrofotometria n UV, prin nregistrarea spectrelor la pH-ul la care se gsesc probele i apoi la pH invers i se compar cu bibliotecile de spectre cunoscute. Observaii: - Dac la aplicarea metodei Stas-Otto-Ogier alcalinizarea s-a fcut cu hidroxid de sodiu, morfina rmne n faza apoas sub form de fenolat hidrosolubil, neextractibil n solveni organici. n acest caz se aciduleaz cu acid clorhidric 10%, apoi se alcalinizeaz la pH 8,0-8,3 cu soluie de carbonat acid de sodiu sau cu soluie de hidroxid de amoniu i se extrage cu cloroform sau amestec de cloroform-alcool amilic (9:1). - La izolarea stricninei se adaug nti solventul organic (eter, sau de preferin cloroform) i apoi se alcalinizeaz, sub agitare continu, deoarece stricnina eliberat prin alcalinizare trece n forma cristalin, greu extractibil n solvent. Dac se alcalinizeaz concomitent cu agitarea, alcaloidul este extras pe msur ce trece n forma bazic, evitndu-se formarea cristalelor. La analiza substanelor toxice volatile (nicotin, amfetamin), extractul eteric alcalin se aciduleaz nainte de evaporare cu acid sulfuric 10% sau acid clorhidric 10%, pentru a evita pierderile prin evaporare.
Proba + HCl (pH 1)
Extractie cu eter FAZA ETERICA Spalare cu solutie saturata de NaCl Extractie cu NaHCO3 5% FAZA ETERICA Extractie cu amoniac 5% sau cu NaOH 0,1 N FAZA APOASA Acidulare cu HCl Extractie cu eter FAZA APOASA
2 TOXICI BAZICI
FAZA ETERICA C
FAZA APOASA
FAZA ETERICA A1
FAZA APOASA Se arunca
Toxici neutri
Metaboliti Carbamati Bromoureide Cloral Cafeina Teofilina FAZA ETERICA A2 Barbiturici Glutarimide Acidulare cu HCl Extractie cu eter
Acizi organici
Acid salicilic Analgezice Metaboliti ai benzodiazepinelor Ac. clorofenoxiacetici Sulfoxizi ai fenotiazinelor Fenoli
FAZA APOASA Se arunca
Figura 2.18. Fracionarea toxicilor acizi i neutri
Faza apoasa anterioara 2 Toxici bazici Alcalinizare cu NaOH Extractie cu eter sau diclormetan si spalarea extractelor cu apa FAZA ETERICA B Separare Extractie cu H2SO4 FAZA APOASA Alcalinizare Extractie cu eter FAZA ETERICA B1 Alcaloizi Fenotiazine FAZA CLOROFORMICA B2 Alcaloizi FAZA APOASA FAZA APOASA
Substante bazice
Identificare directa
FAZA ETERICA
Extractie cu cloroform FAZA APOASA Acidulare cu HCl Alcalinizare cu amoniac Extractie cu cloroform:etanol FAZA APOASA
FAZA ORGANICA B3 Alcaloizi fenolici Morfina Stricnina
Figura 2.19. Fracionarea toxicilor cu caracter bazic
Alte metode sunt: 2. Metoda Dragendorff, care se bazeaz pe solubilizarea substanelor toxice n ap acidulat cu acid sulfuric i precipitarea proteinelor cu alcool, urmate de extracia selectiv cu solveni organici, la un pH optim. 3. Metoda Florance const n solubilizarea toxicilor n ap i precipitarea proteinelor cu acid tricloracetic, care asigur i ionizarea bazelor organice. Din filtratul acid se extrag substanele toxice la pH-ul optim. Metoda nu asigur un randament suficient de bun, deoarece precipitatul format poate reine o parte din compuii de interes. Ea se preteaz pentru izolarea morfinei, stricninei, sulfamidelor, derivailor barbiturici, dar nu i a heterozidelor sau a unor alcaloizi uor hidrolizabili n mediu acid (atropina, cocaina). 4. Metoda Fabre (metoda proteolizei), se bazeaz pe degradarea proteinelor pe cale enzimatic, cu tripsin sau pancreatin, pn la peptide i aminoacizi, dup care se face extracia substanelor toxice i a metaboliilor lor la un pH optim. Metoda este uor de aplicat, conduce la obinerea unor extracte foarte pure i substanele toxice uor hidrolizabile nu sunt afectate. 5. Metoda digestiei acide presupune macerarea pe baie de ap a produsului de analizat cu acid clorhidric, cnd are loc precipitarea proteinelor, urmat de extracia cu solveni organici a substanelor toxice, din mediu alcalin. Prin aceast tehnic se izoleaz substanele i metaboliii cu caracter alcalin, concomitent avnd loc i hidroliza conjugailor. Metoda este contraindicat pentru substanele uor hidrolizabile. 6. Metoda cu tungstat de sodiu se bazeaz pe precipitarea proteinelor cu tungstat de sodiu i extracia din filtrat a substanelor toxice la un pH optim. Ea este rapid, filtratele obinute sunt limpezi i este indicat pentru izolarea compuilor cu caracter acid sau neutru. 7. Metoda cu aceton i sulfat de amoniu (metoda Nicolls) const n deproteinizarea produsului cu sulfat de amoniu i aceton, urmat de extracia cu solveni organici la pH optim. 8. Metoda Griffon-Le Breton se bazeaz pe solidificarea produsului de analizat cu sulfat de sodiu anhidru i extracia selectiv cu solveni organici la pH optim. Ea se preteaz bine pentru izolarea substanelor toxice din organe i din snge. Tehnica de lucru: 10-20 g produs de analizat se tritureaz ntr-un mojar cu puin nisip purificat i cu o cantitate dubl sau tripl de sulfat de amoniu anhidru. n funcie de natura toxicului, se adaug fie 5 g oxid de magneziu (pentru substanele alcaline), fie 1 g acid tartric (pentru substanele acide). Masa obinut trebuie s fie solid, omogen i neaderent i se prelucreaz n una din urmtoarele variante:
se trece coninutul ntr-un flacon conic cu dop rodat, se adaug un volum dublu sau triplu de solvent organic i se agit energic 15-20 minute. Se las n repaus i, dup separarea fazelor, se filtreaz faza organic. Extracia se repet de 2-3 ori. Fazele organice separate i reunite se evapor la sec pe baie de ap; se trece coninutul ntr-un cartu filtrant al aparatului Soxhlet i se extrage exhaustiv cu eter sau cloroform; soluia organic obinut se evapor pe baie de ap; se trece coninutul pe o coloan special, care la partea inferioar are oxid de magneziu, sulfat de sodiu anhidru i uneori crbune activ i se epuizeaz cu solvent organic; soluia organic se evapor pe baia de ap. n funcie de pH-ul necesar, alcalinizarea se poate face i cu hidroxid de sodiu 10% sau cu amoniac concentrat, dar n acest caz, pentru a asigura solidificarea, se adaug un exces de sulfat de sodiu anhidru. Extracia direct cu solveni organici se poate folosi atunci cnd se cunoate natura substanei toxice i cnd se analizeaz o prob puin complex, cum este de exemplu proba de urin. Tehnica de lucru: 5-50 ml produs de analizat lichid se aciduleaz cu acid clorhidric 2N. Se introduce un volum exact msurat din proba acidulat ntr-o plnie de separaie i se extrage de cel puin dou ori cu un volum de eter etilic sau cloroform de 2-5 ori mai mare cnd volumul de prob este mare, sau de 5-10 ori mai mare cnd volumul de prob prelucrat este mic. Se agit energic 1-5 minute. Fazele organice separate i reunite se filtreaz printr-un filtru uscat ce conine puin sulfat de sodiu anhidru i se evapor pe baie de ap. n reziduul obinut se vor identifica substanele toxice i metaboliii cu caracter acid. Faza apoas rmas n plnia de separaie se alcalinizeaz cu hidroxid de amoniu 2N i se extrage cu solveni organici n acelai mod ca i n cazul substanelor cu caracter acid. n reziduul obinut dup evaporarea solventului de extracie se vor identifica toxicii cu caracter bazic.
Capitolul 3 EVALUAREA TOXICOLOGIC A MEDICAMENTELOR De la sinteza unui nou medicament pn la administrarea sa la bolnavi se scurge o perioad de 7-12 ani, timp n care se realizeaz evaluarea sa sub aspectul calitii, securitii utilizrii i eficacitii. Costurile acestei evaluri sunt ridicate, n jur de 200 milioane dolari pentru o singur substan (la nivelul anului 1997) i doar una din 1000 de molecule ajunge s fie comercializat. Aceast perioad poate fi divizat n trei etape: - etapa preclinic - etapa clinic - etapa administrativ. Etapa preclinic urmrete studierea noii molecule sub toate aspectele i experimentarea sa pe animal, ceea ce conduce la o expertiz farmaceutic i la o expertiz farmaco-toxicologic. Etapa clinic are drept scop studierea la om a eficacitii i a toleranei produsului, conducnd la o expertiz clinic ce permite aprecierea raportului beneficiu / risc. Etapa administrativ conduce la nregistrarea medicamentului i la obinerea autorizaiei de punere pe pia. La nivel european, legislaia referitoare la expertiza medicamentelor a fost armonizat progresiv, concretizndu-se n 1995 n crearea Ageniei Europene pentru Evaluarea Medicamentelor, cu sediul la Londra. Agenia European a elaborat un format standard unic al dosarului pentru nregistrare, care a fost adoptat i de Agenia Naional a Medicamentului din Romnia. A) Perioada preclinic 1. STUDIUL FARMACEUTIC Acesta are drept obiectiv garantarea calitii constante a viitorului medicament i se refer la 1.1. Studiul analitic, care urmrete: - definirea caracteristicilor fizico-chimice ale viitorului medicament, prin metode validate de identificare, dozare i control de puritate - studiul de stabilitate, care permite stabilirea duratei de conservare i a condiionrii care asigur o bun conservare - demonstrarea absenei contaminrii bacteriene i virale prin teste biologice de inocuitate in vitro
1.2. Studiul farmacotehnic, care are drept obiectiv realizarea rapid a unei forme farmaceutice ce prezint calitile corespunztoare n vederea realizrii primelor experimente pe animal. 2. EXPERIMENTAREA PE ANIMAL Are drept scop: - crearea unei baze de date cu privire la metabolismul i la eficacitatea substanei - oprirea n aceast etap a acelor compui ale cror efecte duntoare la animal las s se ntrevad lipsa securitii de administrare la om - identificarea organelor asupra crora substana ar putea s aib aciune toxic la om. Studiile efectuate sunt: - Studii de toxicologie, care au drept scop verificarea securitii compusului - Studii de farmacodinamie, care verific eficacitatea substanei - Studii de farmacocinetic, care se refer de asemenea la eficacitatea viitorului medicament. 2.1. STUDIILE DE TOXICOLOGIE Aceste studii constituie prima etap a evalurii securitii unui medicament i trebuie s furnizeze rspunsuri la trei ntrebri: - 1. Care sunt dozele maxime tolerate? - 2. Care sunt organele, esuturile, celulele sau funciile fiziologice afectate de viitorul medicament? - 3. Care este riscul ca substana s induc alterri genetice sau carcinogenez chimic? Studiile de toxicitate se clasific n trei grupe: - I. Studii de toxicitate convenional, care evalueaz toxicitatea acut, toxicitatea la termen scurt dup doze repetate, toxicitatea subcronic i toxicitatea cronic a substanelor; - II. Studii de toxicitate special, care evalueaz mutagenitatea, carcinogenitatea i toxicitatea asupra funciei de reproducere; - III. Studii de toxicitate alternativ, care prevd reducerea numrului de animale folosite i a suferinelor induse acestora prin utilizarea unor sisteme in vitro, dar care nc nu au fost acceptate de instanele de reglementare. 2.1.1. Studiile de toxicitate acut urmresc evaluarea toxicitii acute, adic a efectelor adverse produse pe termen scurt, n urma administrrii unei doze unice de substan, sau a mai multor doze, n interval de 24 de ore. Obiectivele acestor studii sunt: - definirea toxicitii produsului i identificarea organelor int
Evaluarea toxicologic a medicamentelor 71
- prevederea simptomelor intoxicaiei acute la om - facilitarea selectrii dozelor utilizate n studiile de farmacologie sau n celelalte studii de toxicologie. Principalul parametru determinat este doza medie letal (DL50), definit drept doza unic de substan, determinat prin metode statistice, care produce moartea a 50% din animalele de experien. Ea nu este o constant biologic, precizia sa fiind influenat de numeroi factori, n principal de condiiile experimentale i a fost utilizat pentru compararea toxicitii compuilor chimici. Animalele folosite pentru determinarea dozei medii letale se aleg n funcie de: - facilitatea i condiiile de cretere pentru specia respectiv - rapiditatea dezvoltrii - uurina manipulrii n timpul experimentelor - datele de toxicitate disponibile pentru specia respectiv. Cel mai frecvent se folosesc specii de roztoare: obolani, oareci, iepuri, cobai. Normativele europene prevd testarea pe dou specii de roztoare, n general obolani i oareci, n timp reglementrile din SUA i Japonia presupun folosirea a trei specii, dintre care una de neroztoare. Animalele trebuie s fie de aceeai ras, aceeai origine, aceeai vrst, aceeai greutate, sau eventual cu variaii ale greutii corporale de maxim 20% fa de medie, i cu o stare de sntate bun. Ele sunt meninute n condiii standard de vivariu pe toat durata experimentului. Pentru fiecare nivel de doz se utilizeaz cte 10 animale, n loturi fiind inclui un numr egal de masculi i de femele. n cazul evalurii toxicitii acute pe cale cutanat, animalele preferate sunt iepurii, obolanii i cobaii. Calea de administrare a substanelor poate fi oral, cutanat, respiratorie, parenteral, i se alege n funcie de calea de expunere a omului. Reglementrile europene prevd administrarea substanelor pe dou ci, una fiind cea prevzut a fi utilizat la om, iar cealalt trebuind s asigure o biodisponibilitate de 100%, sau ct mai apropiat de aceasta. Nivelurile de doze testate sunt n numr de trei, ele trebuind s ncadreze valoarea DL50 ce se ateapt a fi obinut. Dac nu s-a observat letalitate la o doz de 5000 mg/kg, n general nu se recomand determinarea DL50, ci doar determinarea dozei maxime tolerate, adic a dozei celei mai mari care produce fenomene toxice, fr a induce ns decesul animalelor. Observarea animalelor const ntr-un examen clinic i un bilan al mortalitii imediat dup administrare, frecvent n primele 4 ore i apoi cel puin o dat pe zi, pentru un interval minim de 14 zile. Se observ n special modificrile la nivelul pielii, blnii, membranelor mucoase, sistemului circulator, sistemului nervos central, comportamentului. Animalele decedate pe parcursul experimentului i cele rmase n via la sfritul acestuia sunt autopsiate, iar ficatul, rinichiul
precum i organele care prezint modificri macroscopice sunt supuse unui examen histopatologic. Bilanul mortalitii servete pentru calcularea DL50, prin metode clasice (Bliss, Litchfield i Wilcoxon, etc.) sau cu ajutorul unor programe informatice. Doza medie letal este exprimat n mg/kg greutate corporal, precizndu-se specia i eventual rasa pe care s-a fcut determinarea i calea de administrare. 2.1.2. Studiile de toxicitate dup administrare repetat Obiectivele acestor studii sunt: - determinarea potenialului toxic dup o expunere mai ndelungat la doze care permit supravieuirea - determinarea relaiei doz-rspuns, inclusiv a nivelului la care nu se observ efecte adverse (NOAEL) - identificare organelor int - furnizarea de informaii cu privire la diferenele ntre specii - furnizarea de informaii pentru evaluarea riscului - stabilirea criteriilor de evaluare utilizate n alte studii de toxicitate. Tipuri de studii: - studii de toxicitate pe termen scurt, cnd administrarea compusului testat se face zilnic, timp de 14 sau 28 de zile - studii de toxicitate subcronic, n care substana este administrat 90 de zile - studii de toxicitate cronic, ce prevd o administrare ndelungat, de minim 10% din durata de via a speciei respective, de 6 sau chiar de 12 luni. Durata studiului efectuat depinde de durata preconizat a administrrii la om (Tabel 3.1.). Tabel 3.1. Durata studiilor de toxicitate dup administrri repetate Durata preconizat pentru Durata recomandat pentru administrarea clinic studiul de toxicitate Una sau mai multe doze, ntr-o 14 zile singur zi Doze repetate, pn la 7 zile 28 zile Doze repetate, pn la 30 de zile 3 luni Doze repetate, mai mult de 30 de zile 6 luni, sau chiar 12 luni Animalele folosite trebuie s fie din dou specii, una de roztoare i alta de nerozroare. Dintre roztoare, cel mai frecvent se utilizeaz obolanul, iar dintre neroztoare cinele, primatele sau mini-porcul. Alegerea speciei se face n primul
rnd n funcie de exigenele ageniilor de nregistrare, de sensibilitatea acesteia, care trebuie s fie mare, de metabolismul similar cu al omului, dar i de experiena laboratorului. Nivelele de doze sunt de minim trei, iar mrimea acestora i numrul de animale per doz trebuie s fie suficiente pentru a evidenia: 1) efectul toxic, 2) reversibilitatea sau nu a aciunii toxice, 3) efectul cumulativ sau retard, 4) informaii cu privire la organele int. n general de folosesc ntre 10-20 animale/sex/doz pentru roztoare i 4-6 animale/sex/doz pentru neroztoare. n experiment se mai includ i un lot control negativ i un lot control pozitiv (dac se urmrete o anumit aciune). Calea de administrare este cea preconizat a fi folosit la om. Ea este frecvent cea oral, administrarea fcndu-se n alimente, prin gavaj sau n capsule i mai rar n apa de but. Evaluarea toxicitii se face att pe animalul viu, ct i post-mortem. Pe animalul viu se evalueaz: - semnele vizibile de toxicitate sau mortalitatea, modificarea aspectului, funciilor vitale, a comportamentului - greutatea corporal - consumul de alimente - rezultatele examenului oftalmologic - datele de patologie clinic (parametrii hematologici, enzimatici, biochimici, analiza de urin) Post-mortem se evalueaz: - greutatea organelor - aspectul histopatologic al organelor.
n cazul studiilor de toxicitate cronic, n plus se mai evalueaz i funcia cardiovascular, precum i absorbia substanei n organism. 2.1.3. Studii de mutagenitate Aceste studii urmresc evaluarea potenialului mutagen al substanelor. La ora actual sunt disponibile peste 100 de teste, att in vivo ct i in vitro, care se realizeaz pe diferite organisme:
- teste in vitro: pe bacterii, culturi de celule de mamifere i culturi de celule umane - teste in vivo: pe Drosophilla, mamifere, organisme umane Deoarece multe substane acioneaz ca mutageni numai dup bioactivare i transformare n metabolii electrofili foarte reactivi, iar multe teste de mutagenez se efectueaz in vitro, pentru mimarea metabolizrii se utilizeaz o fraciune a ficatului de obolan, S9. S9 este supernatantul obinut dup centrifugarea timp de 20 de minute la 9000 g a unui omogenat de ficat de obolan i conine sistemele
enzimatice implicate n metabolizarea xenobioticelor (OFMM). Deoarece enzimele de origine microzomal sunt inductibile, se prefer utilizarea unui omogenat de ficat care provine de la animale tratate n prealabil cu inductori enzimatici (bifenili policlorurai, 3-metil colantren, fenobarbital). Testele de mutagenez se pot clasifica, dup tipul de efect asupra materialului genetic pe care l evideniaz, n: - teste care evideniaz mutaiile genice - teste care evideniaz mutaiile cromozomiale - teste care evideniaz alterri primare ale ADN-ului, detectnd repararea i recombinarea acestuia. A) Teste care evideniaz mutaiile genice 1) Teste microbiene in vitro Deoarece mutaiile de acest tip nu sunt vizibile la microscop, aceste teste se bazeaz pe utilizarea de variante biologice cu un caracter specific, sau pe producerea de mutaii letale recesive. Mutaiile la nivelul unui situs specific se pot produce n 2 sensuri: n sensul direct: de la un tip slbatic la un tip mutant; mutaiile sunt puse n eviden prin rezistena lor la un agent toxic, care traduce modificarea unei enzime; n sens revers: de la tipul mutant la tipul slbatic de origine. Se utilizeaz sue auxotrofe, care necesit un factor de cretere, i care pierd aceast cerin prin mutaie, redevenind prototrofe, deci capabile s creasc pe un mediu lipsit de acest factor de cretere. Un exemplu clasic este Testul Ames, care msoar reversia mutantelor histidin-dependente de Salmonella typhimurium la tipul slbatic, histidinindependent. Se incubeaz suele mutante cu substana de testat ntr-un mediu de cultur srac n histidin, care nu permite deci dezvoltarea mutantelor. Dac substana produce mutaii reverse, se formeaz sue histidin-independente, care se pot dezvolta n mediul srac n histidin i pe plac se observ coloniile bacteriene. 2) Teste pe celule de mamifere Se folosesc celule de limfom de oarece, limfoblati umani, celule de plmn sau ovar de hamster chinezesc. De exemplu, se pot folosi linii celulare de fibroblati de ovar de hamster chinezesc femel sau linii celulare de fibroblati de plmn de hamster chinezesc mascul. Aceste dou linii celulare au avantajul de a avea un nivel redus de mutaii spontane, iar cariotipul lor este bine definit. Celulele prezint locusul HPRT, care codific enzima hipoxantin-guanin-fosforibozil transferaz ce intervine n fosforilarea guaninei. Celulele care vor prezenta o mutaie la nivelul locusului HPRT, i vor pierde activitatea enzimatic, sau aceasta va fi redus, deci dac n mediu se introduce 6-tioguanin, din aceasta nu se va sintetiza o nucleotid letal, iar colonia se va dezvolta. Testul const n msurarea
numrului de colonii rezistente la 6-tioguanin, n prezena i n absena agenilor mutageni. Aceste teste pe culturi celulare de mamifere au anumite avantaje: - permit o mai bun extrapolare la om, comparativ cu testele microbiene - exist o corelaie bun cu efectele carcinogene ale anumitor clase de substane - metoda este bine standardizat. 3) Teste microbiene in vivo 4) Teste ce utilizeaz insecte Se folosete musca Drosophilla melanogaster deoarece: - este bine caracterizat din punct de vedere genetic - metabolizeaz substanele toxice asemntor cu mamiferele - timpul de producere a unei generaii este doar de 12-14 zile 5) Teste ce evideniaz mutaii genice la oareci B) Teste care detecteaz mutaiile cromozomiale 1) Teste pe insecte 2) Studii citogenetice pe celule de mamifere: pot fi teste in vitro sau teste in vivo. Teste in vitro: Analiza metafazelor Se utilizeaz celule de limfom de oarece, ovar de hamster chinezesc sau limfocite umane. Substana se testeaz paralel cu doi martori pozitivi cu activitate mutagen cunoscut, unul care acioneaz direct (sulfonat de etilmetan) iar altul care acioneaz dup bioactivare (dimetilnitrozamin). Dup o perioad de incubare corespunztoare, diviziunea celular este oprit prin adugare de colchicin, celulele sunt preparate i se evalueaz anomaliile care apar la nivelul cromatidelor sau cromozomilor (Fig.3.1.).
Fig.3.1. Imaginea unei metafaze
Teste in vivo: Testul micronucleilor se efectueaz pe mduv hematogen de oarece i se bazeaz pe evidenierea unor formaiuni citoplasmatice rotunde, asemntoare ca form, structur i proprieti tinctoriale cu nucleul, motiv pentru care au fost denumite micronuclei (Fig.3.2.). ntre formarea micronucleilor i aberaiile cromozomiale exist o strns legtur, deoarece ei pot lua natere fie din fragmente cromozomiale acentrice, care n anafaz nu se mai pot deplasa spre nucleii n formare, fie din cromozomi ntregi, care nu mai sunt inclui n nucleii fii datorit retardrii anafazice produse prin lezionarea aparatului mitotic. 3) Testul letalitii dominante la roztoare O mutaie letal dominant este o mutaie a unui gamet care provoac moartea zigoilor produi de acest gamet. Individul purttor al acestei mutaii nu este viabil, iar mutaiile letale dominante sunt eliminate automat, prin moartea mutantului. Testul evideniaz efectele toxice asupra celulelor germinale ale masculilor sntoi (oareci sau obolani). Efectele se pot manifesta sub forma unor implantaii care nu sunt viabile, sau sub forma pierderii pre-implantaiilor la femelele fecundate de masculii tratai.
Figura 3.2. Imaginea unor micromuclei i modul lor de formare.
C) Teste care detecteaz repararea i recombinarea ADN-ului 1) Sinteza neprogramat a ADN-ului Testul permite o msurare indirect a lezrii primare a ADN-ului, pe baza reparrii prin excizie. Dac ntr-o cultur celular de hepatocite de obolan se
introduce timidin tritiat, aceasta va fi ncorporat doar dac are loc o reparare a acidului nucleic consecutiv unei leziuni i nu va fi utilizat n procesul de replicare, deoarece celulele aflate n cultur nu se divid. Repararea ADN-ului va fi definit prin cantitatea de timidin radioactiv incorporat per unitatea de greutate de ADN, n raport cu valorile determinate la martori. Msurarea ncorporrii timidinei tritiate se poate face prin autoradiografie. 2) Schimbul ntre cromatidele surori Msoar schimbul reciproc de ADN ntre dou cromatide surori ale unui cromozom n timpul duplicaiei. Celulele sunt marcate cu 5-BRDU (5-bromodezoxi-uridin). Dup dou cicluri de replicare, celulele sunt colorate i se analizeaz i compar frecvena schimburilor per celul i per cromozom (Fig.3.3.). Celulele folosite pot fi limfom de oarece, ovar de hamster chinezesc, limfocite umane.
Figura 3.3. Colorarea diferit a cromatidelor surori dup dou cicluri celulare
3) SOS Chromotest Acest test se bazeaz pe inducerea sistemului SOS, care are un rol important n rspunsul bacteriei E.coli la ageni genotoxici, el fiind un indicator precoce al lezrii ADN-ului. n acest rspuns sunt implicate dou gene: gena lexA, care codific un represor pentru toate genele sistemului i gena recA, care codific o protein capabil s scindeze represorul printr-un semnal activator SOS. Msurarea inducerii sistemului SOS este posibil n urma obinerii unei sue bacteriene n care o alt gen, lacZ, care controleaz sinteza -galactozidazei, a fost plasat prin fuziune genic sub controlul operonului sfiA (o regiune a ADN-ului care regleaz sinteza proteinei sfiA). Represorul lexA se scindeaz n celulele cu ADN lezionat, consecina fiind exprimarea operonului fuzionat (Fig.3.4.). Inducerea operonului sfiA se traduce prin producerea de -galactozidaz, msurat colorimetric prin transformarea o-nitrofenil--D-galactozidei n onitofenol de culoare galben.
acixotoneg atnatsbus
Fig.3.4. Principiul metodei SOS Chromotest
Nici unul din testele cunoscute nu prezint fiabilitate total, nefiind capabil s detecteze toate tipurile de mutaii. De aceea, se prefer utilizarea mai multor teste din categorii diferite, care sunt grupate n baterii de teste. Testele de mutagenez sunt mprite n 3 niveluri:
azadizotcalag tadnics roserper
*Acer
P NDA enuizel SOS lanmes
Acer
Nivelul unu 1) un test de mutaie genic la Salmonella/ microzomi (Ames + activare) 2) un test de mutaie genic pe celule de mamifere 3) un test care evideniaz rupturi cromozomiale pe celule de mamifere (testul micronucleilor) Dac toate testele sunt negative, se presupune absena potenialului mutagen la mamifere. Nivelul doi: se realizeaz dac este pozitiv un singur test din nivelul 1, cu ajutorul testului mutaiei letale la Drosophilla Nivelul trei: pentru evaluarea aprofundat a compuilor care ridic semne de ntrebare: Testul locusului specific (test de mutaie genic la oarece) pentru produii care posed potenial mutagen pe celule germinale de mamifere Testul letalitii dominante pentru produii cu efecte cromozomiale. 2.1.4. Studii de carcinogenitate Deoarece sunt forte lungi i costisitoare, iar interpretarea lor este dificil, aceste studii se realizeaz atunci cnd: - structura chimic a compusului sugereaz un potenial cancerigen - molecula ridic probleme datorit acumulrii, mecanismului de aciune toxic, rezultatelor pozitive n studiilor de genotoxicitate sau de toxicitate a reproducerii - se presupune c molecula urmeaz a fi administrat o perioad lung de timp. Animalele folosite sunt n general roztoare (oareci sau obolani), care au avantajul de a avea dimensiuni reduse i o durat scurt de via, sau mai rar cini i primate. n alegerea speciei, o importan deosebit o au viteza i modul de metabolizare, care trebuie s fie similare cu ceea ce se observ la om. Nivelele de doze sunt 2 sau 3, iar n studiu se include i un lot martor. Numrul animalelor per lot este de 50/sex/doz. Calea de administrare este cea prevzut a fi utilizat la om. Durata administrrii este de minim 18 luni la oareci i 24 de luni la obolani. Examenele efectuate sunt: clinice, verificarea apariiei oricror mase tisulare neobinuite, a letalitii, autopsie, examen microscopic al tuturor tumorilor. n afar de testele de carcinogenitate pe termen lung, se mai poate apela la teste in vivo pe termen scurt, cum ar fi testele de mutagenez, testele de detectare a promotorilor sau testele de carcinogenitate localizat.
2.1.5. Studiile de toxicitate asupra reproducerii Aceste studii se clasific n: - I. Studii de fertilitate la femele - II. Studii de toxicitate a dezvoltrii (embriotoxicitate, fetotoxicitate, teratogenitate) - III. Studii peri-natale i post-natale. Studiile de teratogenez sunt printre cele mai importante i se realizeaz pe 2 specii animale, dintre care una trebuie s fie de ne-roztoare. Animalele trebuie s fie adulte, tinere, gravide primipare, substanele administrndu-se n perioada organogenezei. Se observ: - la femelele gravide, semnele de toxicitate, dar i numrul de corpi galbeni, numrul de implantri i numrul de resorbii; - la fetui (extrai chirurgical cu o zi nainte de natere): numrul fetuilor vii i mori, sexul lor, greutatea i dimensiunile, anomaliile existente. 2.2. STUDIILE DE FARMACODINAMIE Aceste studii urmresc: - determinarea dozei eficace - determinarea duratei i a tipului de efecte farmacologice - apariia eventualelor efecte secundare - determinarea dozelor relative responsabile de efectul principal i de efectele secundare. 2.3. STUDIILE DE FARMACOCINETIC Aceste studii furnizeaz informaii cu privire la cantitatea exact de medicament i/sau metabolii care pot s ajung la nivelul intei biologice i permit optimizarea activitii farmacologice, raionalizarea alegerii unei forme farmaceutice, adaptarea posologiei i a modului de utilizare. B) Perioada clinic n aceast perioad se procedeaz la testarea clinic a viitorului medicament, urmrindu-se evaluarea corect a raportului beneficiu / risc i verificarea eficienei sale prin creterea supravieuirii bolnavilor, scderea incidenei evenimentelor morbide i ameliorarea calitii vieii pacienilor. C) Perioada administrativ n aceast perioad se solicit autorizarea de punere pe pia, documentaia necesar fiind reunit ntr-un Dosar care are un format standard european. Acesta trebuie s conin totalitatea datelor fizico-chimice, farmaceutice, toxicologice, farmacologice, farmacocinetice i clinice, mpreun cu un rezumat al dosarului n care se gsesc informaii administrative i un rezumat al caracteristicilor
produsului. El este nsoit de 3 rapoarte de evaluare critic redactate de experi competeni: raportul de expertiz farmaceutic, raportul de expertiz farmacotoxicologic i raportul de expertiz clinic.
PARTEA EXPERIMENTAL DETERMINAREA DOZEI MEDII LETALE A DNOC Dinitro-orto-cresolul (DNOC) este un pesticid dinitrofenolic, cu absorbie oral i cutanat bun. Experimentul ce urmeaz a fi efectuat urmrete determinarea dozei sale medii letale la oareci, dup administrare intraperitoneal, care asigur o absorbie rapid i deci o apariie rapid a fenomenelor toxice. n vederea determinrii DL50 s-au stabilit, prin tatonri prealabile efectuate pe loturi de cte 2-4 oareci, DL0 i DL100. DL0 este doza cea mai mare la care apar fenomene toxice, fr a se constata decesul animalelor. DL100, sau doza letal absolut, este doza cea mai mic ce determin decesul tuturor animalelor din lotul la care s-a administrat. n cazul DNOC, s-au determinat DL0 ca fiind 0,2 mg/oarece de 20 g, adic 10 mg/kg, iar DL100 egal cu 0,8 mg/oarece a 20 g, adic 40 mg/kg. Se alctuiesc 7 loturi de cte 10 oareci cu greutate medie de 20 g, fiecare lot fiind plasat ntr-o cuc separat i fiind numerotat. Substana va fi administrat i.p., sub form de soluie apoas, n doze n progresie aritmetic, cuprinse ntre DL0 i DL100, conform Tabelului 3.2.: Tabelul 3.2. Dozele administrate i letalitile corespunztoare Nr. lot 1 2 3 4 5 6 7 Doza (mg/kg) 10 15 20 25 30 35 40 Nr. animale n lot 10 10 10 10 10 10 10 Nr. animale moarte 0 1 2 4 6 9 10 Nr. animale vii 10 9 8 6 4 1 0 % Letalitate 0 10 20 40 60 90 100
Dup administrarea substanei, animalele vor fi urmrite sub aspectul manifestrilor clinice i al letalitii, timp de14 zile. Numrul animalelor morte din fiecare lot i procentele corespunztoare de letalitate obinute ntr-un experiment anterior sunt prezentate n Tabelul 3.2.
Metode de calcul al DL50 Calcularea dozei medii letale se poate face prin diferite metode. La ora actual se folosesc n acest scop mai ales programele informatice i unele metode statistice, dar trecerea n revist a primelor metode de calcul poate avea un interes educativ. Ele vor fi aplicate pe datele experimentale din Tabelul 3.2. 1. Metoda Trevan se bazeaz pe reprezentarea grafic a procentului de letalitate n funcie de doz. Curba obinut red distribuia sensibilitilor individuale fa de substana toxic (Fig. 3.5.). Prin extrapolare de pe curb, din dreptul letalitii de 50%, se obine valoarea DL50.
100
% Letalitate sau % Raspuns
80
60
40
20
0 10 15 20 25 DL50 30 35 40
Doza (mg/kg)
Fig. 3.5. Reprezentarea grafic a procentului de letalitate n funcie de doz
Doza medie letal extrapolat este de 27 mg/kg oarece, dup administrare i.p. Metoda Trevan este o metod foarte simpl, dar pentru a asigura exactitatea, numrul de animale pe care se efectueaz experimentul trebuie s fie foarte mare. 2. Metoda integrrii lui Behrens permite creterea ipotetic, artificial, a numrului de animale luate n calcul, asigurnd o determinare mai precis a DL50. Metoda se bazeaz pe ipoteza c, dac un animal triete dup administrarea unei doze oarecare (x), atunci el triete i dup o doz mai mic (x-1), respectiv dac un animal moare dup o doz (x), el va muri i dup o doz mai mare (x+1). Pe baza datelor experimentale prezentate i respectnd principiul integrrii se vor calcula:
- numrul ipotetic al animalelor din lot, care este suma animalelor vii i moarte de la doza luat n calcul, la care se adaug numrul animalelor vii la doze mai mari dect cea luat n calcul i numrul animalelor moarte la doze mai mici; - numrul ipotetic de animale moarte, care este suma animalelor moarte la doza respectiv i a celor moarte la doze mai mici dect doza luat n calcul; - numrul ipotetic de animale vii, care este suma animalelor vii la doza luat n calcul i a animalelor vii la doze mai mari dect aceasta. Din aceste date ipotetice se calculeaz noile procente de letalitate (Tabel 3.3.), care se reprezint grafic n funcie de doza administrat. Tabel nr. 3.3. Numrul ipotetic de animale i procentele de letalitate n metoda Behrens Nr lot 1 2 3 4 5 6 7 Doza (mg/kg) 10 15 20 25 30 35 40 Nr. animale moarte 0 1 2 4 6 9 10 Nr. animale vii 10 9 8 6 4 1 0 Nr. ipotetic animale n lot 38 29 22 18 18 23 32 Nr. ipotetic animale moarte 0 1 3 7 13 22 32 % Letalitate 0 3,4 13,5 38,8 72,2 95,6 100
Ca i n cazul metodei Trevan, valoarea DL50 se obine prin extrapolare pe curb din dreptul letalitii de 50%. Valoarea obinut este de 26 mg/kg. Avantajul acestei metode const, prin mrirea numrului de animale din loturi, n liniarizarea intervalului DL30-DL70, ceea ce permite calculul mai exact al rezultatelor. 3. Metoda Krber aritmetic se bazeaz pe utilizarea unei formule de calcul i poate fi folosit atunci cnd dozele administrate sunt n progresie aritmetic: DL50 = DL100 [ (a x b)] / n unde : a = diferena dintre dou doze succesive b = media animalelor moarte ntre dou doze succesive n = numrul animalelor din lot
4. Metoda Krber logaritmic se poate aplica atunci cnd dozele administrate respect o progresie geometric. Formula de calcul folosit este: log DL50 = log DL100{[(p1+p2) d + (p2+p3) d +.....+ (p6+p7) d]} / 2 unde: p1, p2...p7 = raportul dintre numrul animalelor moarte i numrul total de animale din lot d = diferena ntre logaritmii dozelor luate n calcul 5. Metoda probit este nc mult utilizat i se bazeaz pe transformarea att a probabilitii rspunsului cumulativ, ct i a dozei. Atunci cnd doza este transformat n log doz (x), frecvena rspunsului fa de log dozei urmeaz o distribuie normal gaussian, dP, unde P este probabilitatea corespunztoare fiecrei valori a lui x (Fig. 3.6.).
25
20
Frecventa letalitatii (%)
15
10
20
40
60
80
100
Doza (mg/kg) scara logaritmica
Fig.3.6. Distribuia rspunsului n funcie de doz, normalizat prin transformarea n log doz
Integrarea ecuaiei care este expresia matematic a acestei distribuii normale (dP) este reprezentat grafic printr-o curb sigmoid. Deoarece analiza unei sigmoide este mai dificil dect cea a unei drepte, s-a ncercat transformarea probabilitii rspunsului, n aa fel nct relaia ntre aceasta i log dozei s fie caracterizat de o funcie a unei drepte. Probabilitatea (P) este n mod normal exprimat sub form de procente, sau prin valori cuprinse ntre 0 i 1. Gaddum a propus o msurare a probabilitii rspunsului pe o scal transformat, denumit
deviaia echivalent normal (DEN), sau deviaia standard a distribuiei normale, care poate fi descris matematic printr-o ecuaie. n acest caz, probabilitatea este definit printr-o valoare de pe axa y, relaia fiind ilustrat n Fig. 3.7.
Figura 3.7. Probabilitatea rspunsului exprimat ca procent din populaie sau ca deviaia normal echivalent de la o distribuie normal ( = 0, = 1)
Atunci cnd se reprezint grafic x (log dozei) fa de y, se obine o dreapt. Pentru a facilita calculele, Bliss a sugerat utilizarea unei uniti DEN diferite, denumit probit, a crei valoare este: probit = [(x-) / ] + 5 unde: x = log doz = deviaia medie a log dozei = deviaia standard a log dozei Acest procedeu are rolul de a elimina valorile negative ale DEN atunci cnd valorile P sunt mai mici de 50%, deci probitul este egal cu DEN + 5. Probitul 5 corespunde unei probabiliti a rspunsului de 50%, deci log dozei medii letale.
Bliss i Gaddum au ntocmit tabele (vezi Anexa IV), din care, pe baza procentului de letalitate, se pot afla direct probiii corespunztori. Pentru determinarea practic a DL50 se calculeaz logaritmii dozelor administrate i probiii corespunztori procentelor de letalitate (Tabel 3.4.). Se reprezint grafic valoarea probiilor n funcie de log dozei (Fig. 3.8.) i log DL50 se determin fie grafic, fie de preferin din ecuaia dreptei. Prin antilogaritmare se calculeaz DL50. Tabel nr. 3.4. Logaritmii dozelor i probiii corespunztori procentelor de letalitate n experimentul pentru determinarea DL50 a DNOC-ului Nr. lot 1 2 3 4 5 6 7 Doza (mg/kg) 10 15 20 25 30 35 40 Log doza 1 1,17609 1,30102 1,39794 1,47712 1,54406 1,60205 % Letalitate 0 10 20 40 60 90 100 Uniti probit 3.7184 4.1584 4.7467 5.2533 6.2816 -
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
a = -4,26949 b = 6,59866 r = 0,9614
3,5 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6
log doza
Figura 3.8. Reprezentarea grafic a unitilor probit n funcie de log dozei
Din ecuaia dreptei: y = a + bx se calculeaz, pentru probitul 5, care corespunde unei letaliti de 50%, x, adic log DL50:
5 = - 4,26949 + 6,59866 x, de unde x = 1,40475. Prin antilogaritmare se obine DL50 = 25,39 mg/kg. Extrapolarea dozelor de la animal la om Determinarea dozei medii letale se realizeaz exclusiv pe animale de experien, dar este evident faptul c ne intereseaz s cunoatem gradul de toxicitate al substanelor la om. Pentru aceasta este necesar extrapolarea rezultatelor experimentale la om, lucru care este dificil de realizat, mai ales dac n studiile pe animale de experien s-au observat diferene importante ntre specii. Extrapolarea se realizeaz utiliznd aa numii factori de securitate, iar n cazul substanelor cu potenial cancerigen, pe baza unor modele matematice. Astfel, convenional se apreciaz c DL50 pentru un cine de 20-25 kg este o doz letal pentru un om de 60-70 kg. Deoarece se consider c omul este n general de 8-10 ori mai sensibil dect obolanul, dozele obinute n experimentul pe animal pot fi extrapolate pe baza greutii corporale: sau DL50 / kg om = (DL50 / kg obolan) / 10 DL50 / om = (DL50 / kg obolan x 70) / 10.
TESTAREA MUTAGENITII MICRONUCLEILOR
SUBSTANELOR
PRIN
TESTUL
Materiale necesare: - oareci albi - Ciclofosfamid, soluie injectabil - Tampon fosfat salin pH=7,4 - Ser fetal de viel - Sticle de ceas - Seringi i ace - Eprubete de centrifug - Lame de microscop - Pipete Pasteur - Bac pentru colorarea lamelor - Reactiv May-Grnwald - Reactiv Giemsa - Ulei de cedru - Microscop cu obiectiv cu imersie Prepararea tamponului fosfat salin: - Soluia A : NaH2PO4 . H2O 0,2 M (2,67 g fosfat monobazic se dizolv n 100 ml H2O) - Soluia B : Na2HPO4 . 7H2O 0,2 M (5,36 g fosfat disodic se dizolv n 100 ml H2O). Se amestec 19 ml soluie A cu 81 ml soluie B i se adaug clorur de sodiu pn la o concentraie de 0,9%. Tehnica de lucru: Se administreaz intramuscular, unor loturi de cte doi oareci albi, rasa Swiss albino: - substana de testat, n doz de 1/10 din DL50; - ciclofosfamid, n doze de 200 mg/kg i 500 mg/kg (martori pozitivi) - ap distilat injectabil steril n acelai volum (martori negativi) Dup 24 h se sacrific oarecii prin dislocare de coloan cervical i se recolteaz mduva hematogen din oasele femurale. Aceasta se realizeaz cu ajutorul unei seringi ce conine 10 ml /oarece mediu de cultur (tampon fosfat salin cu 20% ser fetal de viel). Se suspend celulele prin amestecare pe o sticl de ceas i se centrifugheaz 10 minute la 1500 rpm. Din peletul obinut n urma centrifugrii, se etaleaz pe o lam de microscop o pictur i se usc la aer. Se prepar cte dou lame pentru fiecare oarece.
Lamele astfel obinute se coloreaz cu Reactiv May-Grnwald aproximativ 3 minute, se spal cu ap distilat 1 minut, apoi se coloreaz 10-15 minute cu Reactiv Giemsa (diluat 1:3), i se spal din nou cu ap distilat. Pe fiecare lam se numr 2000 de eritroblati policromatofili i se identific celulele care conin micronuclei, exprimndu-se procentual frecventa lor. Sunt considerate micronuclei doar formaiunile cu form regulat, cu un diametru mai mic de 1/3 din cel al nucleului principal, cu aceeai intensitate de culoare ca i acesta i plasate la o distant mai mic dect diametrul acestuia. ntre micronuclei i nucleul principal trebuie s existe un spaiu de separare. Interpretarea rezultatelor: Frecvena apariiei eritroblatilor ce conin micronuclei este comparat cu valorile determinate la martorii pozitivi i la martorii negativi. n general, se consider c prezena micronucleilor la mai mult de 1% din eritroblatii policromatofili indic un potenial genotoxic al substanei.
Capitolul 4 ANALIZA UNOR SUBSTANE TOXICE FIE DE LUCRU 4.1. IDENTIFICAREA UNOR SUBSTANE TOXICE PRIN METODE CHIMICE IDENTIFICAREA ALCOOLULUI METILIC Alcoolul metilic se izoleaz din aer prin captare n ap distilat, iar din medii biologice prin distilare, cu captarea distilatului n ap distilat. Pentru identificare, 2 ml soluie de analizat se trateaz cu 1 ml acid fosforic 25% i 0,5 ml permanganat de potasiu 2%. Dup 10 minute se decoloreaz excesul de permanganat cu sulfit de sodiu soluie saturat (evitnd excesul). Formaldehida format se poate identifica cu: R. Schiff; Acid cromotropic 1% n acid sulfuric concentrat; Acetilaceton sau codein (vezi reaciile de identificare de la formaldehid). n aceste condiii, etanolul nu interfereaz n reaciile de mai sus. Observaii: n cazul prezenei concomitente a formaldehidei, se procedeaz n felul urmtor: 10 ml soluie de analizat se trateaz cu 5 ml azotat de argint 10% i 5 ml hidroxid de sodiu 30%. Se nclzete amestecul sub refrigerent ascendent timp de 30 minute, apoi se distil. n aceste condiii va distila metanolul. Formaldehida reduce azotatul de argint formnd oglinda de argint, iar acidul formic nu distil. Reacii de esterificare: 1 ml prob se trateaz cu 0,1 g acid salicilic i 1 ml acid sulfuric concentrat; la nclzire se degaj miros de salicilat de metil. 2 ml distilat se trateaz cu 2-3 picturi de clorur de benzil sau cu cteva cristale de acid benzoic i 0,5 ml acid sulfuric concentrat. Se neutralizeaz cu hidroxid de sodiu 20%; n prezena alcoolului metilic se degaj un miros specific de benzoat de metil. Identificarea din snge: 2 ml snge se trateaz cu 2 ml acid tricloracetic 20%, apoi se centrifugheaz. Peste 1 ml supernatant se adaug 0,2 ml permanganat de potasiu 1% i 0,1 ml acid fosforic 85%, se agit timp de 1 minut, se reduce excesul de permanganat cu cteva cristale de bisulfit de sodiu. Se adaug 1 ml acid cromotropic 1% n acid sulfuric concentrat i apoi cu precauie 1,5 ml de acid
sulfuric concentrat. La zona de contact a lichidelor apare un inel colorat n violet, iar la agitare coloraia difuzeaz. n absena alcoolului metilic se formeaz o coloraie brun-deschis.
IDENTIFICAREA ALCOOLULUI ETILIC Alcoolul etilic se izoleaz din aer prin captare n ap distilat, iar din medii biologice prin distilare, distilatul captndu-se n ap distilat. 2 ml distilat se trateaz cu 0,5 ml acid sulfuric concentrat i 0,5 ml soluie saturat de acetat de sodiu. Se nclzete la fierbere. n prezena alcoolului etilic se degaj un miros caracteristic de acetat de etil. 2 ml distilat se alcalinizeaz cu carbonat de sodiu 10% sau cu hidroxid de potasiu 10%; se nclzete la cca 40oC, apoi se adaug n picturi soluie Lugol, pn la obinerea unei coloraii galben-brun. Excesul de iod se decoloreaz cu cteva picturi de hidroxid de potasiu 10%. n prezena etanolului se formeaz iodoform cu miros caracteristic (la concentraii mari apare chiar precipitat galben). Observaii: o Reacia este pozitiv i pentru aceton i metiletilceton. o Pentru a diferenia acetona de etanol, se nlocuiete n reacia de mai sus hidroxidul de potasiu 10% cu amoniac concentrat. n cazul etanolului i al acetaldehidei apare un precipitat cenuiu-negru, iar acetona n aceste condiii formeaz iodoform. Peste 2 ml prob se adaug o granul de hidroxid de potasiu i 2-3 picturi sulfur de carbon; se formeaz xantogenat de potasiu. Se aciduleaz cu acid acetic 1%, se adaug apoi 2-3 picturi acetat de cupru 5%; apare un precipitat negru de xantogenat cupric, care trece n xentogenat cupros de culoare galbencrmizie. 2 ml prob se trateaz cu cteva picturi de bicromat de potasiu 5% i 1 ml acid sulfuric concentrat; se obine o coloraie verde datorit sulfatului de crom (III), iar etanolul, n funcie de condiiile de reacie, se oxideaz la acetaldehid sau la acid acetic. Reacia nu este specific, fiind dat de toi alcoolii, precum si de alte substane organice i substane reductoare.
Analiza unor substane toxice : Fie de lucru 93
IDENTIFICAREA FORMALDEHIDEI Formaldehida se izoleaz din aer prin captare n ap distilat, iar din medii biologice prin distilare sau antrenare cu vapori de ap. Avnd caracter reductor, formaldehida reduce reactivul Tollens, reactivul Fehling, reactivul Nessler. La 1-2 ml distilat se adaug 1-2 picturi de fenol 1% (sau rezorcin) i 1 ml acid sulfuric concentrat; la zona de contact apare un inel rou. La 1 ml distilat se adaug 1 ml hidroxid de sodiu 30% i cteva cristale de rezorcin; prin nclzire i fierbere apare o coloraie galben, care trece n rou. La 1 ml distilat se adaug 3 ml acid sulfuric concentrat i cteva cristale de morfin, codein sau ali alcaloizi; apare o coloraie roie-violet sau albastrviolet (reacia Marquis). Peste 1-2 ml distilat se adaug 2 ml soluie proaspt preparat de fenilhidrazin 1%, 2 ml acid clorhidric concentrat i 1 ml hexacianoferat (III) de potasiu 2,5%. n prezena formaldehidei apare o coloraie roie. Reacia nu este specific. La 2 ml distilat se adaug 1 ml reactiv Schiff; n prezena formaldehidei apare o coloraie roie-violet. Prin adugare de acid clorhidric, culoarea datorat altor aldehide dispare, iar cea datorat formaldehidei se intensific spre albastruviolet. Reacia este foarte sensibil (0,2 g / ml), dar nu este specific. La 1-2 ml distilat se adaug 2 ml reactiv acid cromotropic (acid 1,8-dihidroxinaftalen-3,6-disulfonic) 1% n acid sulfuric concentrat i se menine 15 minute n baia de ap n fierbere; n prezena formaldehidei se obine o coloraie violet. 1 ml distilat se trateaz cu 2 ml reactiv acetilaceton i se menine 5 minute n baia de ap n fierbere; n prezena formaldehidei se obine o coloraie galben. Reacia este foarte sensibil i specific.
IDENTIFICAREA ACETONEI Acetona se izoleaz din aer prin captare n ap distilat, iar din medii biologice prin distilare sau antrenare cu vapori de ap, dup deproteinizare cu wolframat de sodiu 10% i acidulare cu acid sulfuric 2N. La 2 ml distilat se adaug cteva picturi de hidroxid de sodiu 10% i se nclzete uor pn la 30oC, apoi se adaug n picturi soluie de iod-iodur, pn cnd soluia rmne de culoare galben-brun; n prezena acetonei, la nclzire se formeaz iodoform cu miros caracteristic. Reacia este pozitiv i pentru alcoolul etilic, dar este mpiedicat de amoniac.
La 2 ml distilat se adaug 2 ml soluie saturat de o-nitrobenzaldehid i cteva picturi de hidroxid de sodiu 30%; apare o coloraie galben, care trece n verde i dup 10-20 minute n indigo. La 2 ml distilat se adaug 2 granule de hidroxid de potasiu i, dup dizolvare, 810 picturi soluie alcoolic de aldehid salicilic 10%; apare o coloraie galbenportocalie care, la nclzire n baie de ap la 60oC, trece n rou-portocaliu, datorit formrii dihidroxidibenzalacetonei (Reactia Frommer). La 2-3 ml distilat se adaug 1 ml Reactiv Imbert. Dup agitare, se toarn cu grij 1 ml amoniac concentrat; n prezena acetonei, la linia de contact se obine un inel violet. 1-2 ml distilat se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu 10% i se adaug cteva picturi de furfurol. n prezena acetonei se formeaz difurfuriliden-acetona, care cu acidul sulfuric d o coloraie violet.
IDENTIFICAREA FENOLULUI Fenolul se izoleaz din aer prin reinere n soluii alcaline (hidroxid de sodiu 0,1 N), iar din medii biologice prin distilare, dup o prealabil hidroliz acid a metaboliilor conjugai. Distilatul se capteaz n mediu alcalin. La 2-3 ml distilat se adaug cteva picturi soluie de clorur feric 1%; n prezena fenolului, apare o coloraie albastr-violet datorit formrii compusului: C6H5OFe3+. Coloraia dispare la adugare de acizi minerali, alcool sau glicerin. La 2 ml distilat se adaug cteva picturi ap de brom; n prezena fenolului se formeaz un precipitat alb-glbui de tribromfenol. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. Reacia nu este specific. Tratnd 1 ml distilat cu 0,5 ml Reactiv Libermann se obine o coloraie roiebrun, care trece n verde i apoi n albastru datorit formrii unor colorani din clasa indofenolilor. La civa ml distilat alcalinizat cu amoniac, se adaug 2-3 picturi hipoclorit 10%; se obine, la o uoar nclzire, o coloraie albastr sau verde (n funcie de concentraie) datorit formrii clor-iminochinonei (reacia Salkowski-Berthelot). Reacia nu este specific. Dac amoniacul din reacia precedent se nlocuiete cu soluie apoas de anilin 1%, se obine o coloraie albastr (se formeaz indofenol), care la adugare de acid vireaz n rou, iar prin alcalinizare redevine albastr. n absena fenolului, apare o coloraie violet prin oxidarea anilinei (reacia moveinei).
La civa ml distilat se adaug cu grij pe pereii eprubetei 2 ml acid sulfuric concentrat i apoi cteva picturi de formol; se formeaz un inel de culoare roie. La 1-2 ml distilat se adaug cteva picturi R. Millon. Dup 10-15 minute apare o coloraie roz-roie. Prin nclzire pe baie de ap i adugare de acid azotic, culoarea apare imediat. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. Reacia este dat i de: crezoli, acid salicilic, tirozina, anilina, acid p-hidroxibenzoic, etc. La civa ml distilat se adaug 1 ml reactiv clorur de p-nitrobenzendiazoniu. Se alcalinizeaz apoi cu hidroxid de sodiu 1 N sau carbonat de sodiu 10%. n prezena fenolului va apare o coloraie roie. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml. Reacia nu este specific, fiind dat de toi fenolii nesubstituii n para. La 1-2 ml distilat se adaug 1-2 ml tampon borat sau fosfat (pH=10) i apoi 1 ml R. Gibbs (2,6-dibrom-chinon-4-clorimid 0,1%, n alcool etilic absolut). Se formeaz o coloraie albastr extractibil n alcool amilic. Sensibilitatea reaciei este de 0,2 g/ml. Reacia nu este specific. 1-2 ml distilat se alcalinizeaz cu carbonat de sodiu 10%, apoi se trateaz cu 1ml soluie de 4-aminoantipirin 2% i 0,5 ml soluie hexacianoferat (III) de potasiu 5%; n prezena fenolului apare o coloraie roie.
IDENTIFICAREA ANILINEI Anilina se izoleaz din aer prin captare n soluii de acid sulfuric sau acid clorhidric. Din medii biologice se izoleaz prin distilare sau antrenare cu vapori de ap, dup o prealabil alcalinizare la pH 8-9. 1 ml distilat se trateaz cu cteva picturi de ap de brom; n prezena anilinei se obine tribromanilina, precipitat de culoare roz. Sensibilitatea reaciei este de 70 g/ml. 1 ml distilat se trateaz cu 1 ml soluie de fenol 1%, 0,5 ml hipoclorit de sodiu 10% i 1 ml hidroxid de sodiu 1%. n prezena anilinei se formeaz fenilchinonimin (indofenol) de culoare albastr. n mediu acid, culoarea vireaz n rou (reacia Jacquemin). Dac se extrage cu eter etilic, stratul de solvent se coloreaz n rou. 1 ml distilat se trateaz cu 0,5 ml soluie de hidroxid de potasiu 10% n etanol i 2-3 picturi de cloroform; se fierbe cteva minute. n prezena anilinei se formeaz fenilcarbilamin (izonitril) cu miros caracteristic (reacia Hoffman). 1 ml distilat se trateaz cu 2 ml hipoclorit de sodiu. n prezena anilinei apare o coloraie albastru-violet, care n exces de reactiv trece n rou murdar. Dac se
extrage cu eter etilic, stratul de solvent se coloreaz n rou (reacia moveinei). Sulfura de amoniu sau hipocloritul de calciu mresc sensibilitatea reaciei. 2 ml distilat se trateaz cu 0,5 ml acid sulfuric concentrat i 2 picturi de bicromat de potasiu 5%. n prezena anilinei apare o coloraie albastr la concentraii mici i brun-neagr la concentraii mari. 1 ml distilat se trateaz cu 1 ml formaldehid; n prezena anilinei se formeaz un precipitat alb. 2 ml distilat se trateaz cu 1 ml acid sulfuric 4 N, 0,1 ml nitrit de sodiu 1 i 1 ml soluie saturat de -naftol n amoniac. Dependent de concentraie, apare o coloraie sau un precipitat rou. Pentru cuplare se pot folosi i amine aromatice. Sensibilitatea reaciei este de 5 g / ml.
IDENTIFICAREA ACIDULUI CIANHIDRIC Acidul cianhidric se izoleaz din aer prin captare n soluii alcaline, iar din medii biologice prin distilare din mediu acid i captarea distilatului n soluii alcaline. 2 ml distilat se trateaz cu o pictur de fenolftalein 1% n etanol i cu acid sulfuric 10%, pictur cu pictur, pn la dispariia culorii roii, apoi se alcalinizeaz cu soluie de borat de sodiu 2% pn la virajul n roz al fenolftaleinei. Se adaug 5-6 picturi sulfat de fier (II) 2%; dac coloraia roz dispare, se mai adaug borax. Se agit 1-2 minute, se adaug cteva picturi sulfat de fier (III) 1% i se aciduleaz cu 1 ml acid clorhidric 10%. Reacia este specific, sensibilitatea reaciei fiind de 10 g/ml. 2 ml distilat se trateaz cu 5-10 picturi polisulfur de amoniu 10%, se fierbe 2 minute (se formeaz sulfocianur de amoniu); dup rcire se aciduleaz cu acid clorhidric 10%, eventual se filtreaz sulful coloidal format. Filtratul tratat cu cteva picturi clorur de fier (III) 1% (proaspt preparat) d o coloraie rousnge datorit formrii tiocianatului de fier (III). Reacia este specific, sensibilitatea reaciei fiind de 2 g/ml. 1 ml prob se trateaz cu cteva picturi azotat de argint 1%; se formeaz un precipitat alb, insolubil n acid azotic, solubil n cianur alcalin. Dac se adaug exces de azotat de argint, se formeaz un precipitat alb de dicianoargentat (I) de argint. 1 ml distilat se trateaz cu 5 picturi azotat de plumb 2%; n prezena acidului cianhidric se formeaz un precipitat alb de cianur de plumb, insolubil n exces de cianur alcalin.
2,5 ml distilat se trateaz cu 1 ml acid picric 1% i se nclzete pe baie de ap, 10 minute la 70-80oC. n prezena acidului cianhidric, n mediu alcalin, se formeaz izopurpuratul de sodiu, de culoare roie. Reacia este specific, sensibilitatea reaciei fiind de 1 g CN-/ml, dar se desfoar lent.
IDENTIFICAREA ARSENULUI
Izolarea arsenului din medii biologice se face prin mineralizare. 1-2 ml soluie obinut dup mineralizare, se trateaz cu hidrogen sulfurat n mediu puternic acid. Se formeaz un precipitat galben de As2S3 sau As2S5, n funcie de condiiile de lucru. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. 1-2 ml soluie care conine ioni AsO43- se trateaz cu 0,5 ml soluie molibdat de amoniu 1% n acid sulfuric 3 N i 1 ml acid azotic concentrat. La nclzire apare o coloraie galben sau un precipitat galben (la cantiti mari de arsen) de arsenomolibdat de amoniu. Dac se adaug cteva picturi de sulfat de hidrazin 0,5% (sau acid ascorbic 1%), va apare o coloraie albastr, datorit formrii albastrului de molibden. Sensibilitatea reaciei este de 0,5 g/ml. Pentru identificarea prin aceast reacie a compuilor arsenului n stare de oxidare inferioar, este necesar oxidarea prealabil (cu ap de brom) la As5+. Reacia Bettendorf: 1-2 ml prob se trateaz cu 1 ml clorur de staniu (II) 10% n acid clorhidric concentrat. n prezena ionilor de As3+ i As5+, va apare o coloraie sau un precipitat negru-brun de arsen elementar. Sensibilitatea reaciei este de 0,5 g/ml. Reacia Bougault: 1-2 ml prob se trateaz cu 2 ml reactiv hipofosforos i se ine 20 minute n baia de ap la fierbere. n prezena ionilor de As3+ i As5+ (formai n mediu puternic acid) va apare o coloraie sau un precipitat negrubrun de arsen metalic. Reacia este catalizat de urme de iod. Reacia Gutzeit: ntr-o eprubet se introduc 1-2 ml soluie de analizat, 2-3 ml acid clorhidric concentrat i cteva granule de zinc; eprubeta se astup imediat cu un dop de vat mbibat n prealabil cu o soluie de acetat de plumb i uscat, pentru reinerea hidrogenului sulfurat. Deasupra se aeaz o hrtie de filtru pe care se pun cteva cristale de azotat de argint. n prezena hidrogenului arseniat degajat, cristalele se coloreaz n galben-verzui, iar la umectare cu ap, pata se nnegrete. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. Reacia Cribier: se procedeaz ca i la Reacia Gutzeit, dar se aplic deasupra dopului de vat o hrtie impregnat cu o soluie de clorur de mercur 5% (uscat n prealabil); se formeaz coloraii galben pn la negru, n funcie de raportul
dintre reactani. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml; ea poate fi mrit prin umectarea hrtiei cu o soluie de iodur de potasiu 10%. Reaciile Gutzeit i Cribier nu sunt specifice, putnd interfera hidrogenul sulfurat, hidrogenul stibiat i hidrogenul fosforat.
IDENTIFICAREA CADMIULUI Soluia care conine ioni de Cd (II), n mediu puternic acid i la tratare cu hidrogen sulfurat, formeaz sulfur de cadmiu, un precipitat galben cristalin. Sensibilitatea reaciei este de 5 g/ml. 1-2 ml soluie de analizat, la tratare cu 1-2 ml soluie 8-hidroxichinolin 1,5% n acid acetic, formeaz n mediu slab acid, neutru sau slab alcalin, un precipitat galben-portocaliu de oxinat de cadmiu. Soluia care conine ioni de Cd (II), la tratare cu cteva picturi de reactiv format dintr-un amestec n pri egale de iodur de potasiu 10% i sulfat de chinin 2%, formeaz un precipitat alb-glbui de iodocadmiat de chinin. Soluia care conine ioni de Cd (II), n mediu neutru sau tamponat cu acetat, d cu cteva picturi de soluie de difenilcarbazid 3% n alcool etilic, o coloraie roie-violet. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. Sensibilitatea crete dac reacia se execut pe hrtie de filtru, dup urmtoarea tehnic: hrtia de filtru umectat cu soluia de reactiv se usuc, apoi se adaug 1-2 picturi din soluia de analizat i se ine n vapori de amoniac. Va apare o pat intens colorat n violet. Sensibilitatea reaciei este de 0,8-1 g/ml. O reacie asemntoare cu cea precedent se poate efectua prin impregnarea hrtiei de filtru cu reactivul p-nitrofenilcarbazid 0,1% n alcool etilic. Se obine o coloraie albastr-violet. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml.
IDENTIFICAREA MERCURULUI
1-2 ml soluie de analizat (obinut dup mineralizare), la tratare cu soluie de iodur de potasiu 1%, formeaz un precipitat rou-portocaliu de iodur de mercur (II), solubil n exces de reactiv, cu formarea complexului anionic [HgI4]2, incolor. n 3-4 ml soluie de analizat, acidulat cu acid clorhidric, se introduce o spiral de cupru, lsndu-se n repaus 2 ore. Se scoate, se spal succesiv cu ap distilat, alcool, eter, se usuc i se introduce ntr-o eprubet uscat mpreun cu un cristal de iod. Partea superioar a eprubetei se rcete cu un manon umezit. Eprubeta se nclzete lent la flacr mic; mercurul i iodul sublim, iar iodura de mercur (II) rezultat se depune pe pereii reci ai eprubetei sub forma unui depozit rou-portocaliu. Spirala de cupru amalgamat, splat i uscat ca mai sus, se introduce n soluie de iod-iodur, lsndu-se n contact 1-2 ore. La adugare de reactiv Polajaev, n prezena mercurului se formeaz un precipitat rou-crmiziu. [Reactivul Polajaev este preparat dintr-un amestec de sulfat de cupru 10%, sulfit de sodiu soluie saturat, bicarbonat de sodiu 8%, n proporie (1:2:1,5)]. 2-3 ml soluie de analizat se trateaz cu cteva picturi soluie proaspt de clorur de staniu (II) 2%. n prezena Hg (II) apare la nceput un precipitat alb de clorur de mercur (I), care devine cenuiu-negru prin separarea mercurului metalic. 1-2 ml prob se trateaz cu cteva picturi reactiv Cheramy; se formeaz un precipitat alb-glbui. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml. 1-2 ml prob se trateaz cu cteva picturi reactiv Cazaneuve. Se obine o coloraie albastr-violet, prin formarea unei combinaii complexe. Sensibilitatea reaciei este de 0,5 g/ml.
IDENTIFICAREA PLUMBULUI
1-2 ml soluie obinut dup mineralizare, prin tratare cu hidrogen sulfurat sau sulfur de sodiu, formeaz n prezena ionilor Pb (II), un precipitat negru de sulfur de plumb, solubil n acid azotic la cald. Sensibilitatea reaciei este de 2 g/ml.
2 ml prob se trateaz cu 1-2 picturi soluie de bicromat de potasiu 10%. n prezena ionilor de Pb (II) se formeaz un precipitat galben de cromat de plumb, insolubil n acid acetic, solubil n acid azotic i hidroxid de potasiu. Sensibilitatea reaciei este de 10 g/ml. 2 ml prob se trateaz cu cteva picturi soluie de iodur de potasiu 10%; ionii de Pb (II) precipit sub form de iodur de plumb galben, solubil n exces de reactiv. Iodura de plumb este solubil n ap la fierbere, iar la rcire se depun cristale sub form de paiete galbene strlucitoare, care privite la microscop se prezint sub form de plcue hexagonale sau stelue. Sensibilitatea reaciei este de 0,3 mg/ml. 1-2 ml prob se trateaz cu 1-2 ml soluie sulfit de sodiu 10%; n prezena ionilor de Pb (II) se formeaz un precipitat alb cristalin de sulfit de plumb. Sensibilitatea reaciei este de 0,5 g/ml. 1-2 ml prob acidulat cu acid clorhidric 10% sau acid azotic 10%, tratat cu 23 picturi iodur de potasiu 40% i 2-3 picturi soluie de cocain 4%, formeaz un precipitat alb-glbui de iodo-plumbat de cocain. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml. Ionii de plumb formeaz cu rodizonatul de sodiu 1% o coloraie brun-violet. Sensibilitatea reaciei este de 0,1 g/ml. Reacia nu este specific; interfereaz ionii de Ba(II), Sr(II). Pe o bucat de hrtie de filtru se pun 2-3 picturi de ap oxigenat 3%, se adaug cte 3 picturi soluie care conine ioni Pb (II) i 3 picturi de amoniac. Hidroxidul de plumb care se formeaz este oxidat de ctre apa oxigenat la PbO2 brun. Excesul de ap oxigenat se distruge innd hrtia de filtru cteva minute n vapori de ap. Se adaug apoi o pictur dintr-o soluie de benzidin 2% n acid acetic glacial, cnd apare o coloraie albastr, datorit oxidrii acesteia la difenilchinondiimin, care cu o molecul de benzidin formeaz un compus de adiie cunoscut sub numele de albastru de benzidin. Sensibilitatea reaciei este de 1,5 g/ml.
IDENTIFICAREA DINITRO-O-CREZOLULUI
Reacii preliminare: 5 ml urin se trateaz cu 1 ml acid clorhidric concentrat, se adaug puin zinc pulbere i se nclzete 5 minute ntr-o baie de ap n fierbere. Dup rcire se filtreaz. Se adaug 2-3 picturi soluie sulfat de ceriu (IV) 0,002 N n acid sulfuric 5%. n prezena DNOC-ului se obine o coloraie roie.
5 ml urin se trateaz cu 1 ml acid sulfuric 10% i 1 ml nitrit de sodiu 0,5%. Se agit, se las n repaus 5-10 minute (la ntuneric). Se adaug 2 ml soluie naftol 0,5% n amoniac 10%. Se agit, apoi se adaug 10 ml eter. Stratul eteric se coloreaz n violet sau n rou. Prin aceast reacie se identific unii metabolii ai DNOC-ului (aminoderivai). 1 ml snge se trateaz cu 5-10 ml metiletilceton i 1 g amestec format din clorur de sodiu i carbonat de sodiu (9:1). Se agit bine. n prezena DNOCului se obine o coloraie galben. Reacia poate servi i la determinarea cantitativ, substana avnd un maxim de absorbie la 438 nm. Identificare dup extracie (Dinitro-o-crezolul se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu acid): O poriune din reziduu se dizolv n 2 ml ap, se adaug 2 ml acid sulfuric 20% i 1-2 granule zinc amalgamat. Dup 15 minute se filtreaz. Filtratul se trateaz cu 1-2 picturi de soluie de bicromat de potasiu 5%. n prezena DNOC-ului se obine o coloraie roie. n locul soluiei de bicromat de potasiu pot fi folosii i ali oxidani: nitrit de sodiu 1%, ap oxigenat, cloramin 4%, sulfat de ceriu (IV) 0,2 N. Toate reaciile anterioare sunt comune i pentru ali dinitrofenoli. O poriune din reziduu se dizolv n 2 ml acid clorhidric 10%, se adaug puin zinc pulbere i se nclzete ntr-o baie de ap timp de 5 minute. Dup rcire se filtreaz. Filtratul de trateaz cu 0,1 ml soluie nitrit de sodiu 0,1%. Se las n repaos 5 minute. Se adaug 1 ml soluie de uree 10%, se agit bine i dup 5 minute se adaug 1 ml soluie de N-naftiletilendiamin 0,1%. Se obine o coloraie violacee. Reacia nu este specific. Interfereaz parationul i alte substane cu grupri nitro sau amine aromatice primare.
IDENTIFICAREA ASPIRINEI DIN MEDII BIOLOGICE Aspirina se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu acid. Reziduul obinut n urma extraciei, prin fierbere cu acid sulfuric 2% degaj miros de acid acetic. Dac reacia se efectueaz n prezen de metanol sau etanol se degaj miros caracteristic de acetat de metil sau etil. Reziduul se trateaz cu 1-2 ml hidroxid de sodiu 1 N i se fierbe 10 minute. Dup rcire se aciduleaz cu acid clorhidric 10% i se adaug dou picturi de clorur de fier (III) 1%. n prezena aspirinei se obine o coloraie violet. Reziduul se dizolv la cald n 2-3 ml ap, se adaug 5 picturi soluie de nitrit de sodiu 10%, dou picturi acid acetic glacial i o pictur sulfat de cupru 10%. Se fierbe dou minute. n prezena aspirinei apare o coloraie roie.
IDENTIFICAREA PARACETAMOLULUI DIN MEDII BIOLOGICE Paracetamolul se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu acid. reziduul obinut n urma extraciei se dizolv n 2 ml ap, se aciduleaz cu acid clorhidric 10%, se adaug 3 picturi nitrit de sodiu 1% i 3 picturi soluie naftol 1% n hidroxid de sodiu 10% (proaspt preparat). n prezena paracetamolului se dezvolt o culoare roie. Reziduul se hidrolizeaz prin nclzire cu 2-3 ml acid clorhidric 4 N n baia de ap, timp de 15 minute. peste 1 ml soluie hidrolizat se adaug 0,5 ml nitrit de sodiu 1%, se agit bine i se las n repaus 10 minute. Se adaug 2 ml uree 10%, se agit i dup 10 minute se adaug 0,2 ml N-naftiletilendiamin 1%, cnd apare o coloraie violet. 1 ml soluie hidrolizat se trateaz cu 2-3 picturi bicromat de potasiu 5%, cnd se dezvolt o culoare roie. 1 ml soluie hidrolizat se trateaz cu 8 ml hidroxid de sodiu 0,2 N, 1 ml fenol 1% i 1 ml soluie hipobromit; se obine o coloraie albastr.
IDENTIFICAREA DERIVATILOR BARBITURICI DIN MEDII BIOLOGICE Derivaii barbiturici se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu acid. Reaciile de identificare se execut fie pe reziduu, fie pe soluiile obinute prin dizolvarea reziduului n ap sau n ali solveni organici. Soluiile apoase formeaz cu sulfat de mercur (II) soluie saturat, un precipitat alb gelatinos, solubil n acid clorhidric 10% sau clorur de sodiu 10%. Soluiile apoase de derivat barbituric dau precipitate colorate n violet cu reactiv Zwiker sau albastru-violet cu reactiv Ioanid. Reziduul se dizolv n puin metanol, se adaug 1-2 picturi azotat de cobalt (soluie saturat n metanol) i 1-2 picturi amoniac concentrat. n prezena derivailor barbiturici se obine o coloraie albastr-violet (Reacia Parri). n locul amoniacului se poate folosi soluie alcoolic 2% de dietilamin n metanol (reacia este deranjat de ap sau de excesul reactivilor).
Reziduul se dizolv n 1 ml cloroform, se adaug 3-4 picturi de soluie proaspt preparat de azotat de cobalt 1% n metanol i soluie de hidroxid de litiu 1% n metanol, pictur cu pictur. n prezena derivailor barbiturici apare un inel albastru. (Coloraia albastr ce vireaz repede n verde indic prezena glutetimidei). Reziduul se dizolv n 1 ml amestec cloroform-piridin (10:1) proaspt preparat i se adaug cteva picturi sulfat de cupru 1%. Stratul cloroformic se coloreaz n violet, iar cel apos rmne colorat n albastru. Derivaii tiobarbiturici coloreaz stratul cloroformic n verde nchis. Reziduul se reia cu acid acetic 10% i se aduce ntr-o eprubet. Se adaug xanthidrol solid n cantitate dubl fa de reziduul luat n lucru. Se nclzete eprubeta n baie de ap 1-2 minute; dup rcire se depune un precipitat cristalin, care se purific prin splri repetate cu etanol (95%) fierbinte. Dup uscare, identificarea derivailor barbiturici se face pe baza punctelor de topire: Barbital (Veronal) 245-246oC; Fenobarbital (Luminal) 242-243oC.
IDENTIFICAREA BENZODIAZEPINELOR DIN MEDII BIOLOGICE Benzodiazepinele se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici, la un pH care depinde de natura benzodiazepinei. Astfel, clordiazepoxidul se izoleaz la pH = 10, n timp de diazepamul se izoleaz la pH = 6,8-7,0. Reziduul obinut prin extracie direct se hidrolizeaz prin tratare cu 2 ml acid clorhidric 4 N i nclzire 10-15 minute pe baia de ap n fierbere. Soluia se rcete, se trateaz cu 0,1 ml nitrit de sodiu 1%, se las n repaus 10 minute, apoi se adaug 2 ml uree 10% se agit bine, se mai las 5 minute n repaus i n final se adaug 0,1 ml N-naftiletilendiamin 1. n prezena benzodiazepinelor (care prin hidroliz formeaz benzoaminofenon), se obine o coloraie rozviolacee (nitrazepamul formeaz un azo-colorant violet). Diazepamul nu d aceast reacie. Reziduul obinut prin extracie dup hidroliz i reluat cu 1 ml acid clorhidric 10%, d direct reaciile de mai sus. Toate reziduurile dau dup dizolvare reacii de precipitare cu unii reactivi generali de precipitare ai alcaloizilor.
IDENTIFICAREA IZONIAZIDEI DIN MEDII BIOLOGICE Izoniazida se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu alcalin. Din snge, identificarea se poate face dup deproteinizare cu acid tricloracetic i filtrare, iar pentru plasm nu este necesar izolarea, dac analiza se efectueaz n primele 24 de ore de la producerea intoxicaiei. 2 ml filtrat se trateaz cu 2-3 picturi soluie alcoolic de vanilin 2%. n prezena HIN-ului apare o coloraie galben. 2 ml filtrat se trateaz cu un volum egal de azotat de argint amoniacal. n cazul prezenei unor cantiti mari de HIN, va apare un precipitat alb, care trece repede n galben, brun i n final negru. n timp, chiar la rece, se formeaz oglinda de argint. La cantiti mici de HIN, formarea oglinzii de argint are loc la cald, dup nclzire n baia de ap. 2 ml filtrat se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu 10%, se adaug 0,5 ml soluie saturat de hexacianoferat (II) de potasiu. n timp, se observ degajare de bule de azot. 1 ml filtrat se trateaz cu 0,1-0,2 ml acid acetic 1% i 0,5 ml soluie alcoolic de p-dimetilaminobenzaldehid 1%; n prezena HIN-ului se obine o coloraie galben-portocalie. 1 ml filtrat se trateaz cu 0,5 ml soluie alcoolic de reactiv fosfomolibdenic 1%. Imediat sau dup alcalinizare cu amoniac, se obine o coloraie albastr (albastru de molibden). Soluia apoas de HIN precipit cu unii reactivi generali de precipitare ai alcaloizilor.
IDENTIFICAREA ANTIDEPRINULUI DIN MEDII BIOLOGICE Antideprinul se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu alcalin. Metaboliii si se izoleaz de asemenea prin extracie cu solveni organici, din mediu alcalin sau acid, iar metaboliii conjugai sunt hidrolizai n prealabil. Teste orientative: la 0,5 ml urin se adaug 1 ml reactiv FNP. n prezena antideprinului sau a altor derivai de dibenzoazepin apare o coloraie galbenverzuie pn la verde (la doze terapeutice) sau albastr (la doze toxice). Reacia este interferat de fenotiazine, care dau coloraii roii.
Tratnd reziduul obinut n urma extraciei cu 1-2 picturi din reactivii oxidani de mai jos, se obin coloraii albastre: Acid azotic concentrat; Hexacianoferat de potasiu 1% n acid sulfuric 1:2; Bicromat de potasiu 2% n acid sulfuric 1:2; Sulfat de ceriu (IV) 0,2 % n acid sulfuric 1:2; Clorat de potasiu 1% n acid sulfuric 1:2; Clorur de fier (III) 1% n acid sulfuric 1:2; Metavanadat de sodiu 0,3% n acid sulfuric 1:2; Amestec acid azotic:acid percloric (1:1); Reactiv Forrest Antideprinul precipit cu unii reactivi generali de precipitare ai alcaloizilor. D pozitiv reacia Vitali.
IDENTIFICAREA FENOTIAZINELOR DIN MEDII BIOLOGICE Fenotiazinele se izoleaz din medii biologice prin extracie cu solveni organici din mediu acid i parial din mediu alcalin. Metaboliii cu caracter alcalin se izoleaz alturi de substanele netransformate, metaboliii cu caracter acid se izoleaz din mediu acid, iar metaboliii conjugai dup o hidroliz acid prealabil. Reziduul obinut n urma extraciei, dizolvat n ap acidulat cu acid clorhidric 10%, formeaz precipitate cu reactivii generali de precipitare ai alcaloizilor. Reziduul se dizolv n 0,2-0,5 ml metanol i se adaug 1-2 picturi acid azotic concentrat. n prezena fenotiazinelor apar coloraii diferite, n funcie de derivatul prezent. Dac peste acest amestec se adaug 1 ml sulfat de fier (II) 5%, 1 ml acid clorhidric 10% i 0,1 g pulbere de zinc, dup fierbere (1-5 minute) apar, n prezena fenotiazinelor, coloraii verzi, roii sau violete (dependent de fenotiazina prezent). Peste reziduul dizolvat n puin metanol se adaug 0,2-0,3 ml reactiv FNP; n prezena fenotiazinelor se obin coloraii roii sau roii-violet, dependent de derivatul fenotiazinic. Peste un amestec format din 0,2 ml acid clorhidric concentrat, 1,5 ml ap i 0,2 ml perhidrol se adaug reziduul de analizat (dizolvat n puin metanol). n prezena fenotiazinelor, la nclzire n baia de ap apar coloraii roii sau violete, n funcie de tipul de derivat fenotiazinic prezent.
Reziduul formeaz la tratare cu 0,1-0,2 ml reactiv chinhidron coloraii portocalii, roii sau albastre, dependent de fenotiazina prezent. Reacia poate fi aplicat i la determinarea cantitativ. Reziduul se dizolv ntr-un ml amestec aceton:ap (1:1), se adaug 1 ml acid clorhidric concentrat i cteva picturi clorur de paladiu (II) 1% n aceton:ap (1:1). n prezena clorpromazinei se obine o coloraie albastr, extractibil n acetat de etil. Reziduul formeaz, la tratare cu sulfat de mercur (II) 1%, o coloraie roie dac conine prometazin; clorpromazina nu d aceast reacie. Reziduul, la tratare cu unul din urmtorii reactivi: acid periodic 1%, acid fosfomolibdenic 1% n metanol, molibdat de amoniu 1% n acid sulfuric (1:2), amestec de acid sulfuric:formaldehid (3:0,1), bicromat de potasiu 1% n acid sulfuric (1:2), cloramin 2% sau ap de brom, d coloraii diferite, nespecifice. Reziduul d coloraii nespecifice la tratare cu unii reactivi de culoare ai alcaloizilor (Mandelin, Erdman, Wasicky etc.).
Reacii de culoare ale fenotiazinelor H2SO4 conc. HNO3 conc. Rou Rou Violetgalben Albastruverde Rougalben Rougalben FeCl3 n H2SO4 Rouviolet Rouviiniu Violet Verde Rouviolet Roucrmiziu Vanadat de amoniu 1% n H2SO4 Molibdat de amoniu 1% n H2SO4 Violaceu-rou Violet-negru Albastru Albastru-verde Rouportocaliu Rou
Substana
HClO4
Cloramin 2% Rou-viiniu Rou Rou-violaceu Verdealbastru Rou-viiniu Rou-brun
Clorpromazina Rou Prometazina Rou Levomepromazina Violet Tioridazina Albastruverde Proclorpro- Roumazina viiniu Trifluopera- Rouzina crmiziu
Rou-viiniu Verde Rou-viiniu Verde purpur Violet Verdealbastru Rou Rou-brun Albastru Albastrupurpur Albastrupurpur Rou-brun
4.2. IDENTIFICAREA UNOR SUBSTANE TOXICE PRIN CROMATOGRAFIE N STRAT SUBIRE IDENTIFICAREA ALCALOIZILOR DIN PULBERI ILICITE SUSPECTE PRIN CSS Drogurile pe baz de alcaloizi opiacei i cocain sunt frecvent comercializate ilicit. Puritatea acestor droguri variaz n limite largi, deoarece n laboratoarele clandestine purificarea produselor obinute este rareori eficient. Morfina, care se obine prin extracie din opiu, conine frecvent cantiti semnificative de codein, noscapin i papaverin, iar heroina, preparat prin acetilarea extractelor de opiu, conine adesea alcaloizi opiacei acetilai. Pe lng contaminani, n pulberile comercializate ilicit se identific adesea substane falsificatoare i diluani. Substanele falsificatoare sunt substane farmacologic active, adugate pentru a mima prezena alcaloidului toxicomanogen. De exemplu, ele pot fi: substane cu gust amar, cum este chinina, pentru pulberile cu heroin sau morfin; anestezice locale, ca procaina sau dicaina, pentru pulberile cu cocain; stimulante ale SNC, cum este cafeina; analgezice ca paracetamolul; substane care anuleaz sau reduc unele efecte neplcute induse, de exemplu manitolul sau sorbitolul, pentru combaterea constipaiei, barbituricele, benzodiazepinele pentru reducerea efectelor psihodepresive. Ca diluani sunt frecvent utilizai hidraii de carbon - glucoza, zaharoza, lactoza, dar i alte substane ca amidonul, creta sau acidul citric. Spre deosebire de contaminani, a cror proporie relativ n dozele diluate rmne constant fa de pulberea-mam (pentru o arj), substanele falsificatoare i diluanii, care se adaug ulterior, pot s fie prezeni n cantiti diferite sau pot lipsi din unele doze. Cunoscnd compoziia chimic a preparatelor ilicite, se poate identifica sursa de furnizare sau originea lor. Principiul metodei: Se identific alcaloizii toxicomanogeni i principalele substane impurificatoare din pulberile suspecte comercializate ilicit, dup separarea lor prin cromatografie pe strat subire (CSS), prin vizualizarea spoturilor separate n lumin UV sau prin revelare cu reactivi de culoare.
Analiza unor substane toxice : Fie de lucru
109
Tehnica de lucru: Orientarea analizei toxicologice prin reacii de culoare: ntr-o capsul de porelan se aplic n trei zone diferite cteva cristale din pulberea-prob. Peste cristale se adaug cu o pipet Pasteur, 1-2 picturi din urmtorii reactivi generali de culoare ai alcaloizilor: acid azotic concentrat, R. Erdman i R. Marquis. Dup cum se observ n Tabelul nr. 1, n prezena alcaloizilor opiacei se obin coloraii predominant galben-portocalii-roii, n timp ce cocaina nu d reacii de culoare cu aceti reactivi. Tabel nr. 1: Alcaloidul Cocaina Morfina Codeina Galben-verzui Dionina Heroina Papaverina Chinina Galben, la cald trece n rou Glbui, trece n rou-ntunecat Galben, verde pal, albastru Albastru-verzui Orange Rou-orange, trece n galben rocat Galben-verzui Rou, trece n brun nchis Albastru la cald Rocat, trece n albastru-violaceu Verzui, trece n albastru Galben, trece la cald n verde Verde Verde-albstrui, albastru HNO3 R. Erdman R. Marquis -
Analiza CSS: Cteva mg de prob se dizolv n 0,5 ml metanol i se aplic pe placa cromatografic corespunztoare (~ 10 l), n paralel cu standardele externe ale alcaloizilor presupui a se gsi n prob i ale ctorva din principalele substane impurificatoare care apar frecvent n pulberile comercializate ilicit. Standardele externe i reactivul de revelare se aleg n funcie de natura alcaloizilor existeni n prob, astfel:
a) pentru alcaloizi opiacei: - placa cromatografic: Silicagel G - standarde externe: Soluii metanolice de morfin, codein, cafein i chinin (~ 10 l) - faza mobil: acetat de etil: metanol: amoniac conc. (85:10:5) - reactiv de revelare: R. Iodoplatinat (morfina spot albastru; codeina spot brun-viiniu nchis; chinin spot brun) b) pentru cocain: - placa cromatografic: Silicagel G - standarde externe: Soluii metanolice de cocain, procain, cafein (~10l) - faza mobil: acetat de etil: metanol: amoniac conc. (85:10:5) - reactiv de revelare: R. Dragendorff (spoturi brune) Dup developare, plcile se usuc i se vizualizeaz zonele separate: n lumina UV, la 254 nm i 365 nm; prin revelare cu R. Iodoplatinat sau R. Dragendorff Se identific alcaloizii prezeni n prob pe baza valorilor Rf i a culorilor spoturilor.
ANALIZA TOXICOLOGIC CALITATIV N CAZUL UNEI INTOXICAII CU SUBSTANE NECUNOSCUTE Acest tip de analiz se poate aplica pe probe biologice puin complexe, cum sunt urina, coninutul stomacal sau produsele suspecte. Separarea substanelor toxice se realizeaz prin cromatografie n strat subire, iar identificarea se face prin metoda standardelor externe. Pentru orientarea analizei toxicologice se poate recurge la reacii de culoare. Orientarea analizei toxicologice prin reacii de culoare FENOTIAZINE: reacia cu FNP Peste 1 ml prob se adaug 1 ml reactiv FNP i se agit 5 secunde. Apariia unei coloraii de la roz la rou, portocaliu, violet sau albastru, indic prezena fenotiazinelor. Un rezultat pozitiv necesit confirmarea prin CSS. IMIPRAMIN I SUBSTANE NRUDITE: Reacia Forrest Peste 0,5 ml prob se adaug 1 ml reactiv Forrest i se amestec timp de 5 secunde. Apariia unei coloraii galben-verde, care vireaz n verde nchis i apoi
111
albastru, indic prezena imipraminei sau a substanelor nrudite. Un rezultat pozitiv trebuie confirmat prin CSS. CARBAMAZEPINA Se adaug 1 ml acid clorhidric diluat (2 M) peste 5 ml prob i 5 ml cloroform, se agit rapid 1 minut i se centrifugheaz 5 min la 3000 rpm. Dup ndeprtarea stratului apos superior, ntr-o eprubet se adaug la 1ml extract cloroformic, 0,2 ml reactiv hipobromit de sodiu i se agit rapid timp de 30 de secunde. Colorarea n albastru-violet a stratului cloroformic indic prezena carbamazepinei. Carbamazepina i metaboliii pot fi detectai i n urin prin CSS, dup extracie cu solveni organici la pH acid. Sensibilitatea reaciei este de 250 mg/l. Reactivi i materiale 1. Acid clorhidric diluat (1M) 2. Soluie de hidroxid de sodiu (0,5M) 3. Tampon clorur de amoniu. Soluie apoas saturat de clorur de amoniu ajustat la pH 9 cu hidroxid de amoniu concentrat. 4. Acid clorhidric (2 ml/l n metanol) 5. Amestec de developare: acetat de etil / metanol / hidroxid de amoniu concentrat (85:10:5) 6. Plci CSS (20 cm x 20 cm, diametrul particulelor 20 m) cu faza staionar silicagel. 7. Etaloane: soluii cloroformice cu concentraie de 0.5 mg/ ml din urmtoarele substane: - Amestec de substane cu caracter acid: amobarbital, fenobarbital, glutetimid - Amestec de substane cu caracter bazic: amitriptilin, nortriptilin, codein, carbamazepin - Amestec de fenotiazine: tioridazin, levomepromazin, clorpromazin Tehnica de lucru Extracia la pH acid (extractul A) a) ntr-o eprubet de centrifug, se adaug peste 5 ml urin 0,5 ml acid clorhidric 1M i 5 ml cloroform. b) Se agit 5 minute, apoi se centrifugheaz 10 minute la 2500 rpm i se separ stratul organic inferior, care se aduce ntr-o capsul de porelan. c) Se evapor extractul pe baie de ap. Extracia la pH bazic (extractul B) a) ntr-o eprubet de centrifug, se adaug peste 5 ml urin 1 ml tampon clorur de amoniu i 5 ml amestec cloroform: izopropanol (9:1).
b) Se agit 5 minute, apoi se centrifugheaz 10 minute la 2500 rpm i se separ stratul organic inferior, care se aduce ntr-o capsul de porelan. c) La extract se adaug 0,25 ml acid clorhidric n metanol (pentru a evita pierderea bazelor volatile) i se evapor la sec pe baie de ap. Identificarea prin cromatografie n strat subire 1) Pe placa cromatografic se definesc 8 culoare verticale, prin trasarea unor linii cu ajutorul unui creion (Fig.1.). Se traseaz linia de start, la 1 cm de la partea inferioar a plcii, iar la 10 cm de la origine se marcheaz limita de developare. 2) Ambele extracte se reiau n 100 l amestec cloroform: izopropanol (9:1) i se aplic pe linia de start 20 l extract A i 3 fraciuni de cte 20 l extract B (Fig.1). 3) Se aplic pe linia de start cte 20 l din amestecurile de etaloane (Fig.1.) 4) Se developeaz placa cromatografic cu amestecul de developare constituit din acetat de etil: metanol: hidroxid de amoniu concentrat (85:10:5) 5) Se usuc placa cromatografic n curent de aer sub ni 6) Se examineaz placa n lumin UV (la 254 i la 366 nm) i se noteaz prezena eventualelor spoturi fluorescente. 7) Se reveleaz fiecare poriune a plcii cu reactivii de revelare indicai n Fig.2. Poriunile plcii care nu se pulverizeaz se acoper cu o plac de sticl curat. 8) Se examineaz placa n lumin UV (la 254 i la 366 nm) i se noteaz prezena eventualelor spoturi fluorescente, n special n poriunea pulverizat cu reactiv Mandelin. 9) Coloraiile obinute cu reactivul Mandelin se pot accentua prin nclzirea plcii n etuv la 100 C timp de 10 minute. Observaii: - Derivaii barbiturici, dup revelare cu fluorescein alcalin, apar n lumin UV la 254 nm sub forma unor spoturi colorate purpuriu pe fond galben-verzui. Glutetimida este vizibil n UV, att la 254, ct i la 365 nm, iar n vizibil, dup revelare cu acelai reactiv, se observ sub forma unui spot colorat n violet, pe fond galben. - Benzodiazepinele i metaboliii lor pot s apar n lumin UV (la 366 nm) sub forma unor spoturi de culoare verde pal sau galben nainte de pulverizarea cu azotat mercuros (extract acid). Chinina, carbamazepina i metaboliii lor dau spoturi fluorescente (la 254 i 366 nm) dup revelarea culoarelor pe care au fost aplicate extractele bazice. n cazurile dificile se poate calcula hRf-ul (Rf x 100), care se compar cu valorile din literatur (Tabel I.). Reproductibilitatea analizei cromatografice se poate asigura prin respectarea saturrii bacului cromatografic i a concentraiei soluiei de hidroxid de amoniu
113
(330 g/l, densitate relativ 0,88). Nu se utilizeaz faza mobil mai mult de 5 ori dac temperatura ambiant este mai mare de 20-25 C (se utilizeaz de mai puine ori dac temperatura este mai mare ).
1 Amestec de medic. cu caract. acid 20 l
4 Extract bazic 20 l
7 Amestec de medic. cu caract. bazic 20 l
8 Extract bazic 20 l
Extract Amestec de medic. acid cu caract. bazic 20 l 20 l
Amestec Extract de medic. bazic cu caract. bazic 20 l 20 l
10 cm
Fig.1. Identificarea prin CSS: pregtirea plcilor i aplicarea soluiilor
1 Amestec de medic. cu caract. acid
4 Extract bazic
7 Amestec de medic. cu caract. bazic
8 Extract bazic
Extract Amestec de medic. acid cu caract. bazic
Amestec Extract de medic. bazic cu caract. bazic
Azotat mercuros (Fluoresceina alcalina)
Iodoplatinat acidulat
Reactiv Mandelin
Acid sulfuric (500 ml/l)
Fig.2. Identificarea prin CSS: revelarea plcilor
Tabel cu valorile din literatur ale hRf i coloraiile spoturilor unor substane medicamentoase separate prin CSS Substana hRf Azotat mercurosa (Fluorescein alcalin)b alb-gria pupuriub alb-gri purpuriu b alb-gri purpuriu b Reactiv de revelare Iodoplatinat R. Mandelin R. Mandelin a acidulat (vizibil) (UV 366 nm)b albastru albastru violet negru albastru violet-brun albastru-pal albastru-pal rou albastru-pal albastru-pal albastru-verzui albastru (galben) verde albastru (galben) -
Acid sulfuric (500 ml/l) rou violet
Amitriptilin Amobarbital Carbamazepin Clorpromazin Codein Fenobarbital Glutetimid Nortriptilin Tioridazin
70 40 57 70 35 29 78 45 67
4.3. DETERMINAREA CANTITATIV A UNOR SUBSTANE TOXICE DIN AER I DIN MEDII BIOLOGICE ANALIZA TOXICOLOGIC A MONOXIDULUI DE CARBON DETERMINAREA CANTITATIV DIN AER PRIN METODA CU CLORUR DE PALADIU Recoltarea probelor: Vasul de recoltare (cu o capacitate bine determinat), se transport la locul de recoltare plin cu ap, unde se las s se scurg apa. nainte de nchidere se introduc n vas: o fiol cu 1 ml soluie sulfat de aluminiu 10% (catalizator) i o fiol cu 1 ml soluie clorur de paladiu 0,1%. Vasul bine nchis se scutur energic pentru ca fiolele s se sparg i reactivii s vin n contact cu oxidul de carbon din aerul recoltat. Apoi se las s stea la ntuneric minimum 4 ore, pn la 24 ore, agitndu-l din cnd n cnd. Principiul metodei: Oxidul de carbon reduce clorura de paladiu (II) la paladiu metalic. Excesul de clorur de paladiu (II) se determin colorimetric cu iodur de potasiu n exces, sub form de tetraiodopaladat dipotasic, de culoare roie-brun. CO + PdCl2 + H2O PdCl2 + 4 KI Pd + CO2 + 2 HCl K2[PdI4] + 2 KCl
Metoda nu este specific; interfereaz substanele reductoare din aer (H2S, SO2, aldehide, cetone etc.). Tehnica de lucru: Lichidul din vasul de recoltare se trece cantitativ, prin splri repetate cu ap distilat, ntr-un balon cotat de 50 ml, astfel ca volumul total al lichidului s nu depeasc 30 ml. Se adaug n poriuni 10 ml iodur de potasiu 15% (proaspt preparat), agitnd dup fiecare adugare. Balonul cotat se completeaz la semn cu ap distilat. Dup 40 minute se msoar absorbana probei i a unui standard (format dintr-un ml clorur de paladiu (II) 0,1%, prelucrat n condiiile probei) la spectrofotometru la 470 nm, fa de ap distilat.
Calcul: 1 mg PdCl2 sic corespunde la 0,157 mg CO, iar 1 mg PdCl2.2H2O corespunde la 0,131 mg CO. mg CO/m3 = {[(1-a) x 0,131] / V} x 1000 unde: a = mg PdCl2.2H2O n exces V = volumul vasului de recoltare (n litri).
IDENTIFICAREA CARBOXIHEMOGLOBINEI (Metoda Wolff) Principiul metodei Prin nclzirea la 55C timp de 5 minute a unei probe de snge diluat i tamponat la pH 5, oxihemoglobina precipit, n timp ce carboxihemoglobina rmne n soluie i i confer acesteia o coloraie roz sau roie, n funcie de nivelul monoxidului de carbon Reactivi: Soluie de tampon aceto-acetic (preparat ex-temporae) din - acid acetic 5 N: 1 volum - acetat de sodiu 3 N: 3 volume Tehnica de lucru - Sngele se dilueaz 1/5 cu ap distilat. - ntr-o eprubet se introduc 1 ml diluie sanguin, msurat exact, i 4 ml tampon aceto-acetic preparat nainte de utilizare. Se agit i se menine exact 5 minute n baie de ap la 55C. Se rcete i se filtreaz. Se examineaz coloraia filtratului. Interpretarea rezultatelor Aceast tehnic permite punerea rapid n eviden a unei intoxicaii acute sau subacute i poate fi util n analizele de toxicologie clinic. O prob de snge ce conine mai mult de 1 ml monoxid de carbon/ml d un filtrat colorat n roz mai mult sau mai puin intens. Pentru doze mai mici, filtratul este limpede, cu o uoar tent galben. Cantitile de monoxid de carbon din snge (ml CO / ml snge) pot fi interpretate astfel: 0-0,4: normal 0,4-0,6: limit normal la muncitori 0,6-1: impregnare uoar 1-2: intoxicaie cronic 3: intoxicaie.
DOZAREA CARBOXIHEMOGLOBINEI PRIN METODA SPECTROFOTOMETRICA Principiul metodei : Metoda se bazeaz pe faptul c sngele normal conine mai multe forme de hemoglobin: forma redus, forma oxigenat i cantiti mici de methemoglobin. Dac se adaug un reductor, cum ar fi ditionitul de sodiu, att forma oxigenat ct i methemoglobina sunt convertite n forma redus (HHb), cu spectrul corespunztor din figur (B). Monoxidul de carbon are o afinitate mult mai mare pentru hemoglobin dect oxigenul i astfel carboxihemoglobina nu va fi redus de ditionitul de sodiu, pstrndu-i spectrul caracteristic cu dou maxime de absorbie (COHb) (spectrul A din figur). Lungimea de und la care diferena de absorban ntre spectrele A i B este maxim, este 540 nm, n timp ce la 579 nm, spectrele au aceeai absorban (punctul izosbestic). Procentul de saturare cu monoxid de carbon a probei de snge poate fi calculat prin msurarea la aceste lungimi de und a absorbanelor probei saturat cu monoxid de carbon (A), probei fr monoxid de carbon (B) i probei provenite de la intoxicai (C), dup reducerea acestora cu ditionit de sodiu.
Spectrele carboxihemoglobinei (A), hemoglobinei reduse (B), i a unei probe de snge provenit de la un pacient intoxicat cu monoxid de carbon (C)
Reactivi: - soluie hidroxid de amoniu 0,4 % (v/v) (se dilueaz 4 ml amoniac 25% la 280 ml cu ap distilat) - ditionit de sodiu (Na2S2O4)
Tehnica de lucru: 0,1 ml snge se dilueaz la 10 ml cu hidroxid de amoniu 0,4 %. Se filtreaz. Se mparte proba n trei pri A, B i C. [Soluia A se satureaz cu monoxid de carbon, proba B se satureaz cu oxigen pur, prin barbotare]. n toate cele trei soluii se adaug cteva cristale (~ 1-2 mg) ditionit de sodiu solid. Se agit i se citesc absorbanele la 540 nm i la 579 nm, fa de un martor de soluie hidroxid de amoniu 0,4 %. Se calculeaz raportul absorbanelor la 540 i 579 nm pentru fiecare soluie: A, B i C. Calcul: Procentul de saturare cu carboxihemoglobin pentru proba de analizat se calculeaz cu ajutorul formulei: % saturare=[(AC-540 /AC-579)(AB-540 /AB-579)] / [(AA-540/AA-579)(AB-540/AB-579)]x100 Valorile normale aproximative pentru raporturile absorbanelor sunt: 1,5 pentru carboxihemoglobina saturat (raport A) i 1,1 pentru hemoglobina redus (raport B). Interpretarea rezultatelor: Se face n funcie de concentraia de carboxihemoglobin din snge, cu ajutorul tabelului de mai jos.
CONCENTRATIA DE CARBOXIHEMOGLOBINA IN SANGE (%) 1 10 15-20 30-35 50-55 66 80 100
SIMPTOMATOLOGIA Fr simptome Fr simptome sau cu simptomatologie nensemnat Simptome uoare: cefalee, vasodilataie cutanat Simptome severe: oboseal, ameeli, vrsturi, tulburri de vedere, tendin de colaps Simptome grave: incontien, posibil sincop, care pot duce lent la moarte. Moarte n aproximativ 5 ore, n com i convulsii Moarte rapid Moarte fulgertoare
ANALIZA TOXICOLOGICA A HIDROGENULUI SULFURAT DETERMINAREA CANTITATIV SUB FORM DE ALBASTRU DE METILEN Recoltarea probelor: Minim 2 l de aer se aspir cu un debit de 0,15 l/minut prin 2 absorbitoare care conin fiecare 10 ml soluie absorbant. Se prevd n plus nc 2 absorbitoare cu cte 10 ml soluie absorbant prin care nu se absoarbe aer, ele constituind probele martor. Deoarece vaporii nitroi deranjeaz reacia, n cazul prezenei lor probele se trateaz cu 5 ml sulfamat de sodiu 10% sau uree 10% i se nclzesc 15 minute la 40oC; pentru determinare se va ine cont de diluia fcut. Principiul metodei: Hidrogenul sulfurat formeaz cu para-dimetil-fenilendiamina n prezena unui oxidant i n mediu de acid clorhidric, tetra-metilendiaminotiazina (albastru de metilen), compus colorimetrabil. Sensibilitatea metodei este de 0,05 g/ml. Metoda, dei specific, este deranjat de vaporii nitroi n cantitate mare, care pot diazota amina aromatic.
NH2
2
+Fe 3 H CH3 N CH3 H C 3
N N CH3 H3C CH3
+ H2S H H3C + N CH3 H N
H N
+ N
SH
N H3C CH3
+ - 2H
N + N H3C CH3 SH N H3C CH3 H3C N CH3
-2e-
NH H3C CH3
+ - 2H
N + N H3C CH3 S N H3C CH3 Cl

-
-2e-
Tehnica de lucru: Coninutul celor dou absorbitoare i al probelor martor se prelucreaz individual. Din fiecare prob, agitat foarte bine, se msoar imediat 5 ml. Paralel cu probele se prelucreaz i o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 0,5-5 g H2S/5 ml soluie absorbant (acetat de zinc 1% sau sulfat de cadmiu). n fiecare prob se adaug cte 1 ml para-dimetilfenilendiamin 0,1% (n acid clorhidric 1:1) i 1 ml azotat de fier (III) 10%. Se agit bine. Dup 30 minute se msoar absorbanele la spectrofotometru la 650 nm, n cuva de 1 cm. Prin raportarea absorbanelor citite la curba etalon se obin concentraiile C1 i C2, n g H2S/prob. Calcul: mg H2S/m3 = 2(C1+C2) / V unde: V = litri aer recoltai.
ANALIZA TOXICOLOGICA A CLORULUI DETERMINAREA CANTITATIV NEFELOMETRIC (METODA ALEXEEVA-JITJOVA) Recoltarea probelor: Se aspir 40-50 l aer, cu un debit de 3 l/minut, prin 2 microabsorbitoare (legate n serie), coninnd fiecare cte 5 ml soluie absorbant (arsenit de sodiu 0,004 N). Pe lng microabsorbitoarele destinate recoltrii clorului se mai prevd nc 2 microabsorbitoare, fiecare cu cte 5 ml soluie absorbant, prin care nu se aspir aer, acestea constituind probele martor. Principiul metodei: Clorul elementar este redus de acidul arsenios la ion clorur, care n mediu de acid azotic se precipit cantitativ cu azotat de argint. Clorura de argint format se determin nefelometric: 2 Cl2 + As2O3 + 2 H2O HCl + AgNO3 As2O5 + 4 HCl AgCl + HNO3
Sensibilitatea metodei este de 2,5 g clor/ml. Reacia nu este specific, interfereaz ali halogeni i ionul cianur. Tehnica de lucru: Coninutul celor 2 microabsorbitoare se reunete prin transvazare cantitativ ntr-o eprubet gradat i se completeaz la semn. n mod similar se procedeaz i cu probele martor. Peste 5 ml din prob i martor, i o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 10-100 g clor/5 ml soluie absorbant, se adaug cte 1 ml acid azotic 10% i 1 ml azotat de argint 10%. Dup 30 minute se omogenizeaz (prin agitare energic), se citete turbiditatea la nefelometru sau la spectrofotometru prevzut cu un dispozitiv T.K. la 470 nm, n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Extincia probei se raporteaz la curba etalon, obinndu-se direct concentraia C n g; din aceasta se scade concentraia probei martor. Calcul: mg clor/m3 = [2 x C] / V unde: V = litri aer recoltai.
ANALIZA TOXICOLOGIC A DIOXIDULUI DE SULF DETERMINAREA CANTITATIV A DIOXIDULUI DE SULF DIN AER PRIN METODA EUROPEAN OFICIAL Principiul metodei: Dioxidul de sulf din aer este reinut ntr-o soluie absorbant de tetracloromercuriat de sodiu. Ionul de diclorosulfitomercurat obinut va reaciona cu formol, formnd o combinaie bisulfidic i apoi cu fuxin (incolor n mediu acid), formnd un compus cu duble legturi conjugate de coloraie violet, a crui absorban poate fi citit la spectrofotometru la 540 nm, concomitent cu o scar de etaloane. Reactivi: - Tetracloromercuriat de sodiu (toxic): 0,50 g HgCl2 + 0,20 g clorur de sodiu + ap distilat ad 1000 ml.
- Anhidrid sulfuroas: soluie standard de bisulfit de sodiu cu concentraia de 0,6g/l SO2; - Formol diluat: 1ml formol 35% diluat cu ap distilat la 1000 ml (se prepar proaspt); - Rozanilin: Se lucreaz cu o soluie diluat astfel: 2ml soluie mam [vezi anexa V] + 5ml HCl + ap distilat ad 100 ml. - Proba de dozat: 50 ml soluie de tetracloromercuriat de sodiu prin care s-a barbotat 1 m3 de aer.
SO2 + (HgCl 4) -- + H2O -(HgCl 2SO3) ion diclorosulfitomercurat + 2H + + 2Cl -
HCHO + 2H + NH3+Cl-
HgCl 2 + HO-CH2-SO3H combinatie bisulfidica Cl + NH-CH2-SO3H
x3
Cl-H3N+
C Cl Fuxina (Rosanilina)
NH3+Cl-
+ HSO 3-CH2-NH Cl
NH-CH2-SO3H + Cl-
Tehnica de lucru: Se prelucreaz n paralel cu o scar de etaloane o prob de 5 ml i o prob diluat 1:1 cu soluie absorbant (tetracloromercuriat de sodiu), conform schemei de mai jos (volumele sunt exprimate n ml). Se las 45 minute la ntuneric i se citete absorbana la spectrofotometru, la 540 nm.
Nr. eprubet Prob Tetracloromercuriat de sodiu Sol. Std. SO2 (60 mg/l) Formol diluat Sol. dil. rozanilin
1 5 0 1 1
2 4,8 0,2 1 1
3 4,6 0,4 1 1
4 4,4 0,6 1 1
5 4,2 0,8 1 1
Proba nedil. 5 0 1 1
Proba dil. 1:1 2,5 2,5 0 1 1
Rezultate: Se reprezint grafic absorbana n funcie de concentraia n SO2 i se determin coninutul probei analizate prin extrapolare din grafic. Se calculeaz cantitatea de SO2 coninut n aerul barbotat (1 m3), care s-a reinut n cei 50 ml de soluie absorbant.
ANALIZA TOXICOLOGIC A OXIZILOR DE AZOT DETERMINAREA CANTITATIV SUB FORM DE AZOCOLORANI Recoltarea probelor: Se poate face dup 2 tehnici: 1. Trecnd aerul cu un debit de 0,2 l/minut prin dou microabsorbitoare legate n serie, coninnd fiecare cte 2 ml soluie absorbant (hidroxid de sodiu 0,01N). 2. n tonometre de 250-500 ml (calibrate n prealabil), prin dislocuirea apei. Principiul metodei: Acidul azotos diazoteaz acidul sulfanilic (sau sulfanilamida), formnd o sare de diazoniu care se cupleaz cu -naftilamina sau cu N-naftiletilendiamina, dnd un azoderivat rou-violaceu, colorimetrabil. 2 NO2 + 2 KOH KNO2 + CH3-COOH KNO3 + KNO2 + H2O HNO2 + CH3-COOK
SO3H
SO3H
+ HNO2 + CH3COOH
+ 2 H2O
NH2
N ]CH3COO
SO3H
NH2
SO3H
+ CH3COOH
N N
NH2
Sensibilitatea este de 0,05 g/ml; reacia nu este specific oxizilor de azot (NO2, N2O4, N2O5) i nu este dat de acidul azotic. Tehnica de lucru: Cnd recoltarea s-a fcut n microabsorbitoare, coninutul lor se trece cantitativ, fiecare n cte o eprubet gradat, i se completeaz volumul la 10 ml cu soluie absorbant. 5 ml din fiecare prob se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 1-10 g/5ml soluie absorbant. n fiecare eprubet se adaug 1 ml Reactiv Griess (amestec extemporaneu din pri egale de R. Griess I i R. Griess II). Dup 10 minute se citesc absorbanele la spectrofotometru la 500 nm, n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Prin raportarea extinciilor probelor la curba etalon se obin concentraiile C1 i C2 n g NO2/prob.
Calcul: mg NO2/m3 = 2 (C1 + C2) / V, unde: V = litri aer recoltai.
ANALIZA TOXICOLOGICA A ALCOOLULUI METILIC DETERMINAREA CANTITATIV CU ACID CROMOTROPIC Izolarea din snge: 10 ml snge se trateaz cu 10 ml soluie saturat de acid picric i 20 ml ap distilat. Amestecul se supune distilrii ntr-o aparatur adecvat. Distilatul se culege ntr-un balon cotat de 50 ml, care conine 5 ml ap distilat. nainte de prelucrare se completeaz balonul la semn. Principiul metodei: Alcoolul metilic se oxideaz la formaldehid, care reacioneaz cu acidul cromotropic (acid 1,8-dihidroxi-3,6naftalendisulfonic) n mediu acid, formnd o coloraie violet, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 1 g metanol/ml.
SO3H HO SO3H SO3H
HO HCHO + 2 HO
CH2
OH
HO
OH
SO3H SO3H
SO3H
SO3H
SO3H
HO [O] - H2O HO
OH
SO3H
SO3H
Tehnica de lucru: 2 ml prob, un martor de reactivi i o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 10-100 g metanol/2 ml ap se aduc n eprubete gradate rcite n ghea. Se adaug n fiecare 1 ml permanganat de potasiu 2% i 0,5 ml acid fosforic 25%. Dup 15 minute, excesul de permanganat de potasiu se decoloreaz cu soluie saturat de sulfit de sodiu, evitnd excesul. Probele (decolorate) se rcesc n ghea, se adaug 5 ml acid cromotropic 0,1% n acid sulfuric concentrat. Se agit, apoi se nclzesc probele n baie de ap n fierbere timp de 30 minute. Dup rcire se completeaz volumul la 10 ml cu acid sulfuric concentrat. Se msoar absorbanele la spectrofotometru la 550 nm, n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanelor se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g metanol/2 ml prob distilat. Calcul: mg metanol/100 ml snge = [100 x V x C] / [1000 x n x p] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml distilat luai n lucru; p = ml snge distilat.
ANALIZA TOXICOLOGIC A ALCOOLULUI ETILIC DETERMINAREA CANTITATIV DIN SNGE PRIN METODA CORDEBARD
Izolarea din snge: 10 ml snge se aduc ntr-un balon de distilare de 250 ml, se adaug 15-20 ml ap i 20 ml soluie saturat de acid picric, sau 40 ml soluie de acid succinic 5%. Se adapteaz balonul la o instalaie de distilare, iar distilatul se culege ntr-un balon cotat de 50 ml care conine 5 ml ap distilat, pn aproape la cot. Dup terminarea distilrii, se completeaz balonul la semn cu ap distilat. Principiul metodei: Alcoolul etilic este oxidat la rece cu bicromat de potasiu n mediu de acid azotic, pn la acid acetic. Excesul de bicromat de potasiu se titreaz iodometric.
3CH3-CH2-OH + 2K2Cr2O7 + 16HNO3 +11H2O
3CH3-COOH + 4Cr(NO3)3 + 4KNO3
Tehnica de lucru: ntr-un flacon cu dop rodat se msoar 5 ml distilat, 3 ml bicromat de potasiu 0,1333 N i 4 ml acid azotic (d=1,42). Se las s reacioneze 15 minute, apoi se adaug 20 ml soluie iodur de potasiu 1%. Se las la ntuneric 5 minute, apoi se titreaz iodul pus n libertate cu tiosulfat de sodiu N/25 (n prezena amidonului ca indicator). Paralel se prelucreaz cel puin dou probe din distilat i dou probe martor cu ap distilat. Calcul: 3 ml K2Cr2O7 0,1333N corespund la 10 ml Na2S2O3 N/25 Echivalentul alcoolului etilic =M/4 = 46,06/4 = 11,515 1 ml C2H5-OH N/25 = 11,515/25,1000 = 0,0004606 g etanol 1 ml Na2S2O3 N/25 corespunde la 1 ml I2 N/25, respectiv la 1 ml K2Cr2O7 N/25. n = nr. ml tiosulfat de sodiu N/25 consumai la titrarea martorului. Cnd n este diferit de 10, se calculeaz factorul F al soluiei de tiosulfat de sodiu: F = 10/n n1 = ml tiosulfat de sodiu N/25 consumai la titrarea probei de distilat (adic a excesului de bicromat de potasiu rmas dup oxidarea etanolului din cei 5 ml distilat). (n- n1) x F = n2F= corespunde la numrul de ml de bicromat de potasiu N/25 consumai de cei 5 ml distilat pentru oxidarea etanolului. Cantitatea de etanol/1000 ml snge = n2F x 0,4606 Observaii: Timpul de 15 minute, necesar oxidrii alcoolului etilic, va fi riguros respectat. Interpretarea rezultatelor: alcoolemia pn la 0,37 g nu este nsoit de manifestri clinice. ntre: 0,37 1,12 g ~ simptomatologie caracterizat prin euforie; 1,12 1,50 g ~ beie uoar; 1,50 2,15 g ~ beie propriu-zis; 2,25 3,00 g ~ beie grav; 3,00 4,00 g ~ beie comatoas; > 4,00 g ~ alcoolemie mortal.
DETERMINAREA CANTITATIV A FENOLULUI TOTAL DIN URIN Determinarea fenolului total din urin se efectueaz pentru aprecierea intoxicaiilor cu fenol sau benzen, care se metabolizeaz n principal la fenol. n ultimul caz, este necesar analiza complementar a benzenului din snge. Izolarea din urin: Fenolul conjugat se hidrolizeaz n mediu acid i apoi fenolul total se izoleaz prin distilare. Se dilueaz 5 ml urin cu 75 ml ap i se aciduleaz cu acid sulfuric 1:1. Se distil la flacr mic, culegndu-se aproximativ 45 ml distilat ntrun balon cotat de 50 ml. Se completeaz balonul cotat la semn cu ap distilat. Principiul metodei: Fenolul reduce acidul fosfomolibdenic (reactivul FolinCioclteu) la albastru de molibden, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 0,2 g fenol/ml. Metoda este specific. Reactivi: 1) acid sulfuric 1:1, v/v 2) Reactiv Folin-Cioclteu: La ntrebuinare, soluia de reactiv se dilueaz cu un volum egal de ap distilat. 3) Carbonat de sodiu 20% 4) Soluie standard stoc de fenol: Se dizolv 120 mg fenol n acid clorhidric 0,1 N ntr-un balon cotat de 100 ml. Se determin coninutul exact de fenol: ntr-un vas conic cu dop rodat se iau 10 ml din soluia stoc i se adaug 20 ml hidroxid de sodiu 0,1 N. Se nclzete pe baia de ap pn la temperatura de 65oC, cnd se adaug repede 20 ml soluie de iod 0,1 N. Se nchide balonul i se titreaz excesul de iod cu tiosulfat de sodiu 0,1 N, folosind ca indicator soluie de amidon (1 ml soluie de iod 0,1 N este consumat de 1,567 mg fenol). 5) Soluie standard de lucru: se dilueaz ex-temporae soluia stoc corespunztoare, pentru a obine o concentraie de 10 g/ml. Tehnica de lucru: ntr-o eprubet se iau 5 ml distilat i se adaug 0,25 ml reactiv FolinCioclteu i 1 ml carbonat de sodiu 20%. n paralel cu proba se prelucreaz i un blanc de reactivi (5 ml ap). Se agit i se introduc eprubetele ntr-o baie de ap. Se msoar absorbana dup 5-10 minute la spectrofotometru, la 720 nm n cuva de 1 cm, fa de blancul de reactivi. Calcul: Cantitatea de fenol din proba analizat (Cp = g fenol/ 5ml) se calculeaz din ecuaia dreptei de calibrare (Fig.1): y = A + Bx, unde:
A = 0,033 B = 0,0168 cunoscnd absorbana probei citit la spectrofotometru.
0.5
y = 0,033 + 0,0168 x r= 0,99972

0.4
Absorbanta
0.3
0.2
0.1
10
15
20
25
Concentratia (micrograme/5 ml)
Fig.1. Dreapta de regresie a curbei etalon pentru dozarea fenolilor i parametrii ei caracteristici
mg fenol total / l urin = [Cp x V] / [n x p], unde V este volumul balonului cotat, n reprezint volumul de distilat prelucrat, iar p este volumul de urin supus distilrii. Interpretarea rezultatelor: Fenolul urinar reprezint un indicator sensibil pentru expunerea la fenol i la benzen. Persoanele neexpuse elimin n mod normal prin urin pn la 10-16 mg / 24 ore fenol total. Fenolul urinar crete i dup administrare de salicilai.
ANALIZA TOXICOLOGIC A FORMALDEHIDEI DETERMINAREA CANTITATIV CU ACETILACETON Recoltarea probelor: Aerul se aspir cu un debit de 0,5 l/minut prin 2 absorbitoare coninnd fiecare cte 10 ml soluie absorbant (ap distilat). Principiul metodei: Formaldehida reacioneaz cu acetilacetona n prezena acetatului de amoniu, formnd 5-diacetil-1,4-dihidrolutin de culoare galben. Metoda este specific. Sensibilitatea reaciei este de 0,2 g/ml. Tehnica de lucru: Coninutul celor 2 absorbitoare se unific i se completeaz la 25 ml. Din acetia se msoar 5 ml, care se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 2-20 g formaldehid/5 ml. n fiecare eprubet se adaug 2 ml reactiv acetilaceton (25 g acetat de amoniu, 2ml acid acetic glacial, 0,2 ml acetilaceton i ap ad 100 ml) i se nclzesc n baie de ap la 100oC. Dup rcire, se msoar absorbana probei i a etaloanelor la spectrofotometru, la 420 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g/prob. Calcul: mg formaldehid/m3 = [5 x C] / V unde: V = litri aer recoltai.
ANALIZA TOXICOLOGIC A ETILENGLICOLULUI Etilenglicolul se analizeaz din aer i din unele buturi alcoolice (vin). Din buturi alcoolice se izoleaz prin antrenare cu vapori de ap. Principiul medotei: Etilenglicolul este oxidat cu acid periodic la formaldehid. Aceasta se condenseaz cu fenilhidrazina, formnd fenilhidrazona, care prin oxidare cu fericianura de potasiu d un compus chinoniminic de culoare roie, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 0,1 g/ml. Metoda nu este specific. Tehnica de lucru: Un volum de 250 ml butur alcoolic se supune antrenrii cu vapori de ap, culegndu-se distilatul ntr-un balon cotat de 100 ml. 5 ml distilat se prelucreaz paralel cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 2-30 g/5ml. n fiecare eprubet se adaug 1 ml acid periodic 0,1 N, se agit i dup 1 or (la temperatura camerei) se adaug 2 ml arsenit de sodiu 0,5 M i se agit bine. Dup 5 minute se adaug 5 ml fenilhidrazin hidrocloric 1%. Se las n repaus 5 minute, apoi se adaug 0,5 ml fericianur de potasiu 2% (proaspt preparat). Dup 10 minute se adaug 0,5 ml acid clorhidric concentrat. Dup 10 minute se msoar absorbanele probei i etaloanelor la spectrofotometru, la 530 nm n cuva de 1 cm, fa de ap distilat. Se calculeaz concentraia probei Cp n g etilenglicol/5 ml distilat. mg etilenglicol/1000 ml butur alcoolic = [Cp x Vb] / [n x p], unde: Vb = volumul balonului cotat; n = ml distilat prelucrat; p = ml butur alcoolic supus antrenrii cu vapori de ap.
IDENTIFICAREA CRISTALELOR DE OXALAT DE CALCIU DIN URIN N INTOXICAIILE CU ETILENGLICOL Analiza sedimentului urinar: Se realizeaz pe o prob proaspt de urin, la 30-60 de minute dup recoltare. Urina se centrifugheaz la 3000 rpm, timp de 3-5 minute. Se ndeprteaz supernatantul, sedimentul se resuspend i este transferat cu o pipet Pasteur pe o lam de microscop, acoperindu-se cu o lamel. Se examineaz la microscop. Interpretarea rezultatelor Deoarece oxalatul este un metabolit al etilenglicolului, prezena cristalelor de oxalat de calciu n urin este o trstur frecvent ntlnit a intoxicaiei cu etilenglicol. n urin se ntlnesc dou forme de oxalat de calciu: - cristale octaedrice de dihidrat - cristale de monohidrat sub form de prism Prima form (dihidrat) (Figura 1) este instabil n condiii fiziologice normale; forma de dihidrat apare doar n prezena unor concentraii urinare crescute de calciu i de oxalat, cum este cazul intoxicaiilor cu etilenglicol. Forma dihidrat se poate transforma n monohidrat. n practica clinic, se verific sedimentul urinar la fiecare or timp de cel puin 5 ore dup ingestie, nainte de excluderea unei intoxicaii cu etilenglicol. Dac se identific cristale de oxalat de calciu dup 2 ore de la ingerare, se administreaz etanol ca antidot i se ncepe hemodializa.
Figura 1. Cristale de oxalat de calciu dihidrat
ANALIZA TOXICOLOGIC A ANILINEI DETERMINAREA CANTITATIV A ANILINEI DIN AER PRIN FORMARE DE AZOCOLORANI Izolarea: Anilina din aer se capteaz prin reinere n soluii absorbante de acid sulfuric sau clorhidric. Recoltarea probelor se face aspirnd V l aer cu un debit de 1 l/minut prin dou absorbitoare legate n serie, coninnd fiecare cte 10 ml soluie absorbant (acid sulfuric sau acid clorhidric 0,01 N). Principiul metodei: Anilina, dup diazotare, se cupleaz cu 1-N-naftiletilendiamina n mediu acid sau cu acidul H (acid 8-amino-1-naftol-3,6-disulfonic) n mediu alcalin i formeaz un diazoderivat de culoare roie. Sensibilitatea reaciei este de 1 g / ml. Reacia nu este specific, fiind pozitiv i pentru alte amine aromatice primare. Tehnica de lucru: Se prelucreaz cte 5 ml din fiecare prob, paralel cu un martor de reactivi i o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 5-25 g anilin/5 ml. n fiecare eprubet se adaug 0,5 ml acid clorhidric 5%, 0,5 ml nitrit de sodiu 1%, se agit i dup 15 minute se adaug 2 ml hidroxid de sodiu 20% i 1 ml soluie de acid H 1%. Se agit i dup 10 minute se msoar absorbanele probelor i etaloanelor la spectrofotometru, la 490 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Calcul: Se calculeaz concentraia celor dou probe (Ca i Cb - g anilin/5 ml prob) prin extrapolare de pe curba de calibrare. mg anilina / m3 aer = 2 x (Ca + Cb) / V, unde V - litri aer recoltai.
DETERMINAREA CANTITATIV A ANILINEI DIN MEDII BIOLOGICE PRIN REACIA INDOFENOLULUI Analiza toxicologic a anilinei din medii biologice (snge, urin, organe) se efectueaz dup izolare prin distilare sau antrenare cu vapori de ap din mediu alcalin (pH = 8-9). Principiul metodei: Anilina, dup oxidare la chinonimin, reacioneaz cu fenolul formnd fenilchinonimina, de culoare albastr n mediu alcalin. Reacia este deranjat de amoniac, toluidine i alte amine aromatice. Tehnica de lucru: Distilatul obinut dup izolare se aduce cu ap distilat la volum fix n balon cotat i se prelucreaz n continuare 5 ml, n paralel cu un martor de reactivi i o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 5-25 g anilin/5 ml. n fiecare eprubet se adaug 1 ml cloramin T 4%, se las n repaus 5 minute, apoi se adaug 1 ml fenol 3%. Dup 10 minute se adaug 2 ml hidroxid de sodiu 2%. Se agit, se las n repaus 10 minute, apoi se msoar absorbanele la spectrofotometru la 615 nm, fa de martorul de reactivi. Calcul: Se calculeaz concentraia probei (Cp - g anilin/5 ml distilat) prin extrapolare pe curba de calibrare. mg anilina / 100 ml snge = [Cp x V x 100] / [n x p x 1000], unde: p = ml snge analizat V = volumul balonului cotat n = ml distilat prelucrai
DETERMINAREA CANTITATIV DIN URIN A P-AMINOFENOLULUI Para-aminofenolul este principalul metabolit al anilinei; se elimin prin urin: liber, acetilat i conjugat cu acid glucuronic. Pentru determinare, produsul conjugat se hidrolizeaz n mediu acid i apoi se distil.
Principiul metodei: p-Aminofenolul liber, prin cuplare cu fenol n prezena oxidanilor formeaz indofenol de culoare albastr (n mediu alcalin), colorimetrabil. Tehnica de lucru: ntr-un balon cu fund rotund se msoar 10 ml urin (recoltat la ieirea din lucru sau n primele 48 de ore de la expunere) i 5 ml acid clorhidric concentrat. Se adapteaz un refrigerent ascendent i se hidrolizeaz pe baie de ap n fierbere timp de 90 minute. Dup rcire se filtreaz printr-un filtru cantitativ, ntr-un balon cotat de 100 ml, splnd de cteva ori balonul i filtrul cu ap distilat. Se completeaz apoi balonul cu ap la semn. 2 ml filtrat se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 2-25 g p-aminofenol/2 ml. n fiecare eprubet se adaug 0,5 ml cloramin T 4% i 1 ml fenol 5%, se agit bine i dup 10 minute se adaug 2 ml amoniac concentrat. Dup 30 minute se msoar absorbana probei i a etaloanelor la spectrofotometru, la 600 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g p-aminofenol/prob. Calcul: mg p-aminofenol/1000 ml urin = [C x V] / [n x p] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prob prelucrat; p = ml urin prelucrat. Interpretarea rezultatelor: n urma expunerii la vapori de anilin, n urin se elimin cantiti de ordinul mg/l urin. La persoanele neexpuse, se pot regsi cantiti de ordinul g/l urin.
DETERMINAREA METHEMOGLOBINEI DIN SANGE Metoda EVELYN MALLOY Principiul metodei: Methemoglobina este o hemoglobin n care fierul se gsete n form feric. Ea este incapabil s fixeze reversibil oxigenul, deci nu poate funciona ca pigment respirator. n mod normal, mai puin de 1% din hemoglobina total (Hb) se gsete
sub form de methemoglobin (MetHb), dar acest procent crete sub aciunea unor derivai ca: nitrii, clorai, derivai de anilin i nitrobenzen, sulfamide, substane cunoscute sub denumirea de methemoglobinizante. Dozarea MetHb sanguine se bazeaz pe absorbia spectrofotometric a MetHb la 630 nm, lungime de und la care oxihemoglobina (HbO2) i cianmethemoglobina (CNMetHb) nu absorb dect foarte puin. Metoda presupune dozarea pe de o parte a MetHb, iar pe de alt parte a Hb totale. Prin adugarea de cianur de potasiu la o poriune de hemolizat sanguin, se transform toat MetHb prezent n CNMetHb. Se msoar absorbana hemolizatului la 630 nm, nainte de adugarea de cianur, cnd se determin absorbana MetHb din snge i a altor compui care pot absorbi la aceast lungime de und, i dup adugarea de cianur, cnd se determin doar absorbana corespunztoare celorlali compui din snge. Diferena ntre aceste dou absorbane este proporional cu cantitatea de MetHb prezent. ntr-o alt poriune de hemolizat se adaug fericianur de potasiu, care transform toat hemoglobina prezent n MetHb. Msurarea absorbanei acestei poriuni de hemolizat nainte i dup adugarea de cianur de potasiu, permite determinarea hemoglobinei totale. Rezultatul este exprimat n procente de MetHb n raport cu hemoglobina total din prob. Reactivi: - tampon fosfat M/20, pH 6,6 - soluie apoas de fericianur de potasiu, 5g/ 100 ml - soluie apoas de KCN 5 g/100 ml, neutralizat cu un volum egal de acid acetic 12%
Tehnica de lucru: a) Prepararea soluiei de hemoglobin ntr-un tub de centrifug se introduc: 0,2 ml snge total bine omogenizat (recoltat pe heparin sau EDTA) i 5 ml ap distilat. Se agit, se ateapt 10 minute, apoi se adaug 5 ml tampon fosfat 6,6. Se centrifugheaz 5 minute la 4000 rpm, pentru a elimina stroma globular. Supernatantul trebuie s fie limpede. b) Determinarea spectrofotometric Citirea se face la spectrofotometru la 630 nm, fa de tampon fosfat M/20, diluat cu ap distilat 1:1.
Eprubeta A Eprubeta B Supernatant 3 ml 3 ml Fericianur de potasiu 5% 1 pictur 0 Ap distilat 0 1 pictur Amestecare. Citire la 630 nm dup 5 minute. KCN 5% 1 pictur 1 pictur Amestecare. Citire la 630 nm dup 5 minute. Absorbia datorat MetHb prezente iniial n snge este A 1B A 2B, unde A1B este absorbana soluiei din eprubeta B, prima citire, iar A2B, este absorbana soluiei din eprubeta B, a doua citire. Absorbia datorat MetHb totale, provenit din oxidarea hemoglobinei i a oxihemoglobinei de ctre fericianura de potasiu i methemoglobina prezent iniial n snge, este A 1A A 2A, unde A1A este absorbana soluiei din eprubeta A, prima citire, iar A2A este absorbana soluiei din eprubeta A, a doua citire. Raportul : [(A 1B A 2B) / (A 1A A 2A)] x 100 exprim cantitatea de MetHb dozat pentru 100 pri de hemoglobin total. Observaii practice importante: Este interzis s eprubetelor n chiuvet, deoarece exist riscul de provoac intoxicaii. Coninutul eprubetelor se concentrat de hipoclorit. Dac pe masa de lucru potasiu, se terge imediat i se spal cu ap. se arunce coninutul cuvelor i emanaii de acid cianhidric care arunc ntr-un vas cu soluie sau pe degete ajunge cianur de
Interpretarea rezultatelor: La subiecii normali, nivelul de methemoglobin este sub 2%. Acest nivel crete n intoxicaii cu: clorat de potasiu, nitrii, anilin, nitrobenzen, ortotoluidin, acetanilid, antipirin, fenacetin, sulfamide, clorochin, xilocain, etc. Methemoglobina este de asemenea prezent n anumite maladii congenitale ce evolueaz cu un deficit al sistemelor de reducere a hemoglobinei. Pancreatita acut hemoragic poate conduce la nivele ridicate de methemoglobin n snge. Moartea survine la nivele de methemoglobin de 66% din hemoglobina total. Dozarea methemoglobinei trebuie s se realizeze ct mai repede posibil, la maxim o or de la recoltarea sngelui, pentru a evita reducerea methemoglobinei la hemoglobin, iar sngele trebuie recoltat pe heparin sau EDTA, nu pe fluorur de sodiu (risc de formare a unui complex fluor-methemoglobin). Dozarea MetHb este dependent de pH. pH-ul reaciei trebuie s fie cuprins ntre 6,6 i 7,2, pentru a evita formarea MetHb alcaline, al crui spectru difer de
cel al MetHb. De asemenea, hemolizatul trebuie s fie perfect limpede dup centrifugare, pentru a nu altera citirile spectrofotometrice. Utilizarea cianurii de potasiu permite evitarea interferenei altor substane, cum ar fi sulfhemoglobina, care dei prezint absorbie la 630 nm, nu va fi dozat, deoarece nu reacioneaz cu cianura de potasiu, iar msurarea se face prin diferen.
ANALIZA TOXICOLOGIC A ACIDULUI CIANHIDRIC DETERMINAREA CANTITATIV DIN SNGE PRIN METODA ARGENTIMETRIC Izolarea din snge : 10 ml snge se aduc ntr-un balon cu fund rotund, se adaug 20 ml ap distilat i 3 ml acid clorhidric 0,1 N. Se adapteaz imediat balonul la o instalaie de distilare i se capteaz distilatul ntr-un balon cotat de 50 ml, ce conine 5 ml hidroxid de sodiu sau de potasiu 0,1 N. nainte de prelucrare, balonul cotat se completeaz la semn cu ap distilat. Principiul metodei: Ionul cianur formeaz cu azotatul de argint cianura de argint, solubil n amoniac, iar excesul de azotat de argint reacioneaz cu iodura de potasiu, dnd iodura de argint, insolubil n amoniac. Aceast opalescen servete drept indicator. KCN + AgNO3 AgCN + 2 NH3 KI + AgNO3 AgCN + KNO3 Ag(NH3)2CN AgI + KNO3
Tehnica de lucru: ntr-un balon Erlenmayer se aduc 15 ml distilat, 2 ml iodur de potasiu 10% i 1 ml amoniac 10%. Se titreaz ncet cu azotat de argint 0,001 N, pn la apariia unei opalescene glbui, care persist prin agitare. Calcul: Rezultatele se exprim n mg HCN/100 ml snge:
mg HCN/100 ml snge = [a x f x 0,02701 x Vb x 100] / [p x n] unde: a = ml AgNO3 0,001 N folosii la titrare, f = factorul soluiei de AgNO3 0,001 N, Vb = volumul distilatului, p = ml snge supus distilrii, n = ml distilat prelucrat.
DETERMINAREA CANTITATIV A TIOCIANAILOR Tiocianaii sunt principalii metabolii ai acidului cianhidric, uor eliminabili pe cale renal. Determinarea cantitativ se poate face din ser i din urin. Principiul metodei: Tiocianii formeaz cu srurile de fier (III) tiocianatul de fier (III) de culoare roie (Reacia Liebig). Sensibilitatea reaciei este de 1g/ml. Reacia este specific. Tehnica de lucru: a) 10 ml urin se aduc ntr-un balon cotat de 25 ml, se trateaz cu 5 ml acid tricloracetic 10% (pentru deproteinizare), se agit i dup 10-15 minute se completeaz cu ap la semn. Se filtreaz. b) 2 ml ser se trateaz cu 2 ml acid tricloracetic 10% i dup 10 minute se completeaz volumul la 10 ml cu ap distilat, apoi se centrifugheaz sau se filtreaz. 2,5 ml filtrat, obinut prin tehnica a) sau b), se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 2-10 g SCN-/2,5 ml astfel: se adaug 1 ml azotat de fier (III) 5% n acid azotic 1N, se agit bine i dup 15 minute se msoar absorbanele la spectrofotometru, la 470 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Absorbanele probelor se raporteaz la curba etalon, obinndu-se concentraia C n g SCN-/prob. Observaii: dac proba de urin este intens colorat, se va citi i absorbana a 2,5 ml din filtrat diluat cu 1 ml ap distilat, fa de martorul de referin. Valoarea obinut se va scdea din absorbana probei de analizat.
Calcul: mg tiocianai/100 ml ser = [100 x C x V] / [n x p x 1000] mg tiocianai/l urin = [1000 x C x V] / [n x p x 1000] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prelucrai; p = ml prob biologic luat n lucru. Interpretarea rezultatelor Tiocianaii se pot gsi n serul provenit de la nefumtori n concentraii pn la 2 mg/100 ml, iar n serul de la fumtori, n concentraii de pn la 3 mg/100 ml. n urin, nivelele maxime sunt de 5 mg/1000 ml la nefumtori i 16 mg/1000 ml la fumtori. Se consider ca indicatori ai expunerii la acid cianhidric sau compui ai acestuia, nivele de peste 8 mg/100 ml ser i peste 30 mg/1000 ml urin.
ANALIZA TOXICOLOGIC A HIDROCARBURILOR AROMATICE: INDICATORI AI EXPUNERII DETERMINAREA ACIDULUI HIPURIC PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC N VIZIBIL Toluenul se utilizeaz ca solvent pentru fabricarea adezivilor, a vopselelor sau a solvenilor pentru vopsele. Intoxicaia acut este de obicei consecina expunerii accidentale masive sau a inhalrii voluntare a adezivilor sau a solvenilor. Aproximativ 80% din doza absorbit este metabolizat la acid benzoic, care este apoi conjugat cu glicina, formnd acid hipuric. Astfel, msurarea excreiei urinare a hipuratului poate fi util pentru evaluarea expunerii cronice la toluen. Deoarece acidul benzoic i benzoatul de sodiu, care se utilizeaz ca i conservani alimentari, sunt de asemenea metabolizai la hipurat, rezultatele determinrilor trebuie interpretate cu pruden. Determinarea cantitativ se realizeaz pe probe de urin. Reactivi: 1. Acid clorhidric diluat (0,05 mol/l)
2. Reactiv dimetilaminobenzaldehid [soluie de p-dimetilaminobenzaldehid (40g/l) n anhidrid acetic ce conine cteva cristale (aproximativ 0,5 g) acetat de sodiu anhidru] 3. Clorur de sodiu 4. Silicagel precipitat Etaloane Urin normal (blanc) i urin n care s-a adugat acid hipuric pentru a obine concentraii de 0,2, 0,5, 1,0 i 2,0 g/l. Toate etaloanele se vor prepara cu aceeai urin. Soluiile sunt stabile timp de o lun dac se conserv la 4C i la ntuneric. Tehnica de lucru: 1. 1 ml prob sau standard se aduce la pH 2 cu acid clorhidric diluat i se adaug clorur de sodiu pn cnd soluia se satureaz. 2. Se adaug 2 ml amestec eter etilic / metanol (9:1), se agit rapid 1 minut i se centrifugheaz 5 minute. 3. Se aspir stratul eteric superior i se transvazeaz ntr-o alt eprubet; se extrage din nou faza apoas cu 2 ml amestec eter etilic / metanol (9:1). 4. Se reunesc extractele eterice i se adaug n alt eprubet aproximativ 0,5 g silicagel precipitat pentru 1 ml soluie eteric. 5. Se evapor solventul, se adaug 3 ml reactiv dimetilaminobenzaldehid i se nclzete la 135C timp de 5 minute. 6. Se rcete, se adaug 4 ml metanol, se agit rapid 1 minut i apoi se centrifugheaz 5 minute. 7. Se aspir extractul metanolic i se trece n alt eprubet. Se adaug 4 ml metanol peste silicagel i se repet extracia. 8. Se reunesc extractele metanolice i se msoar absorbana la 460 nm, fa de un extract obinut din urin fr acid hipuric (blanc). Calcul Se reprezint grafic absorbana soluiilor etalon n funcie de concentraia n acid hipuric i prin extrapolare se calculeaz concentraia probei. Este important s se utilizeze aceeai urin pentru prepararea etaloanelor i a blancului, deoarece excreia hipuratului variaz n funcie de aportul alimentar de benzoat. Sensibilitatea reaciei: 0,1 g/l hipurat
DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC N U.V. A ACIDULUI HIPURIC Principiul metodei: acidul hipuric are un maxim de absorbie la 227 nm, n timp ce acidul uric are dou maxime de absorbie, la 227 i 287 nm. Deci, n prezena ambilor acizi: Absorbana la 227 nm, A227 = ACID HIPURIC + ACID URIC; n timp ce absorbana la 287 nm, A287 = ACID URIC (singur). Deoarece raportul absorbanelor la lungimile de und corespunztoare maximelor acidului uric este constant, A228 = 0,73 x A287, se poate calcula valoarea absorbiei acidului uric la 227 nm i scdea din valoarea absorbiei totale (acid uric + acid hipuric), obinndu-se absorbia datorat numai acidului hipuric. Determinarea absorbanelor n UV se face pe eluatul apos obinut din separarea acidului uric de acidul hipuric, pe rin schimbtoare de ioni. Sensibilitatea reaciei este de 1g/ml. Metoda este specific. Tehnica de lucru: Separarea: Rina Dowex 50 reine substanele interferente, lsnd s treac numai acizii uric i hipuric. Se introduce n coloane un strat de rin de 3 ml. Se aeaz sub coloane eprubete gradate de 20 ml, pentru culegerea eluentului. Se pipeteaz n coloane 1 ml urin proaspt recoltat diluat 1:10 cu ap. Dup ce a ptruns complet n rin, se adaug poriuni succesive de ap pn la recoltarea a aproximativ 19 ml eluent (P) i se completeaz la 20 ml cu ap. Pe alt coloan se trece 1 ml soluie standard diluat 1:10 cu ap, apoi ap, pn cnd n eprubet s-au adunat aproximativ 19 ml lichid (S) i se completeaz la 20 ml cu ap. Pe a treia coloan se trece numai 1 ml ap, obinndu-se blancul (B). Msurarea absorbanelor: se face la un spectrofotometru UV n cuve de cuar de 1 cm, la 227 i 287 nm. Calcul: Rezultatele se exprim n g acid hipuric / litru urin. Se calculeaz absorbana acidului uric la 227 nm: AAU-227 = 0,73 X A287 i se scade din A227 citit (AU +AH), deci: APAH = A(AU+AH)-227 - 0,73 X AAU-287 Se calculeaz astfel APAU i ASAH (pentru standard, A287 trebuie s fie zero, deci se ia AS227 fr corecie). Deoarece standardul are concentraia de 1 g acid hipuric / litru urin: g acid hipuric/litru urin = APAH / ASAH.
Interpretarea rezultatelor Concentraiile urinale ale acidului hipuric sunt cuprinse n mod normal ntre 0,1 i 0,2 g/l; concentraii mai mari de 1 g/l indic o expunere la toluen, dac sunt excluse alte surse de benzoat. Trebuie menionat faptul c n cazul intoxicaiilor acute cu toluen, moartea poate surveni nainte de creterea excreiei de hipurat. DETERMINAREA SULFAT INDEXULUI PRIN METODA NEFELOMETRIC Principiul metodei: Sulfat-indexul este raportul dintre sulful anorganic (eliminat prin urin sub form de sulfai) i sulful total (anorganic i sub form de sulfoconjugai). Sulful urinar se dozeaz msurnd turbiditatea produs prin reacia sulfailor cu clorur de bariu, n mediu acid. Tehnica de lucru: Sulful anorganic: 0,5 ml se trateaz cu 1 ml acid clorhidric 1:10, 5 ml ap distilat i 0,5 ml clorur de bariu 10%. Se agit i dup 30 de minute se msoar turbiditatea la 660 nm n cuva de 1 cm, se noteaz E1. Sulf conjugat + sulf anorganic: 5 ml urin i un martor de reactivi se trateaz fiecare cu 2,5 ml acid clorhidric concentrat (d=1,19) i 2,5 ml ap. Se menin probele pe baia de ap n fierbere 15 minute. Se rcesc i se aduc la 25 ml cu ap distilat. Peste 2,5 ml lichid se adaug 4 ml ap i 0,5 ml clorur de bariu 10%. Se agit i dup 30 minute se msoar turbiditatea probei E2, la 660 nm n cuva de 1 cm, n compensaie cu martorul. Calcul: Nu este necesar o etalonare, ntruct intereseaz numai raportul turbiditilor. Sulfat-index = E1 / E2 Compararea probelor se poate face i fa de o scar de etaloane cu concentraiile cuprinse ntre 10-200 g/6,5 ml, preparat din sulfat de sodiu, peste care se adaug 0,5 ml clorur de bariu 10%. n acest caz, sulfat-indexul este dat de raportul concentraiilor: Sulfat-index = C1 / C2
Interpretarea rezultatelor: n mod normal, sulfat-indexul este 0,85. El este sczut n caz de absorbie recent de benzen sau de alte substane care se detoxific prin sulfoconjugare (cetone ciclice, crezoli, fenoli, naftalin, sulfur de carbon etc.). Pentru o interpretare corect se recomand determinarea sulfat-indexului la muncitori nainte i dup expunere, deci se recolteaz urina de diminea (naintea nceperii activitii) i urina de la sfritul activitii (pn la 3 ore de la expunere).
ANALIZA TOXICOLOGIC A METALELOR DETERMINAREA CANTITATIV A MERCURULUI DIN URIN Analiza toxicologic a mercurului i a compuilor si din probe biologice i din produse agro-alimentare contaminate se face dup izolarea lui prin mineralizare. Mineralizarea probelor: Se msoar p ml urin ntr-un flacon de 250 ml, se adaug 5 ml acid sulfuric concentrat i 15 ml permanganat de potasiu, soluie saturat. Se nclzete pe baie de nisip (moderat, astfel nct lichidul s nu ajung la fierbere), acoperind flaconul cu o sticl de ceas. Se continu nclzirea pn cnd lichidul devine limpede, avnd un precipitat brun la fund. Dac se consum tot permanganatul, se mai adaug civa ml i se continu nclzirea flaconului pn cnd lichidul nu se mai decoloreaz. Dup rcirea lichidului, acesta se filtreaz i se aduce volumul la o valoare fix (V - volumul total al mineralizatului) cu ap. Se prelucreaz n continuare n ml mineralizat. Se reduce excesul de permanganat adugnd 5 ml acid sulfuric (1:1) i nclzind proba 1-2 minute pe baie de ap. Dac persist culoarea roz a permanganatului, se adaug hidroxilamin 10%, pictur cu pictur, pn la obinerea unei soluii incolore. Se las proba n repaus cel puin o or. Principiul metodei: Ionul Hg2+ formeaz cu ditizona (difeniltiocarbazona) la pH 1,5 2, un complex de culoare roie-portocalie.
Analiza unor substane toxice : Fie de lucru 145 C6H5 C6H5 H5C6 NH NH C H5C6 NH NH S Hg2+ C N NH S N N C6H5 Hg NH S N N C6H5 N C 2 H+
Sensibilitatea reaciei este de 0,1 g/ml. Specificitatea metodei este asigurat prin chelatarea celorlalte metale cu EDTA-Na2 la pH 1,5 - 2, condiie n care Hg (II) nu se combin. Tehnica de lucru: Proba astfel obinut se trece cantitativ ntr-o plnie de separaie, se trateaz cu 5 ml EDTA-Na2 0,1 N i se agit. Se adaug apoi 2 ml reactiv ditizona 0,005% (dizolvat n solvent organic - toluen, benzen sau cloroform) i se agit 1-2 minute. Se completeaz stratul de faz organic cu nc 8 ml de solvent organic, se agit i se separ cele dou faze, reinnd faza organic colorat, care se spal, prin agitare n plnie de separaie, iniial cu 10 ml ap distilat, apoi cu 20 ml soluie de splare (amestec format din 98 ml hidroxid de sodiu 0,02 N i 2 ml hidroxilamin 10%). Dup separare, stratul de solvent se filtreaz ntr-o eprubet gradat printr-un filtru uscat i se completeaz volumul la 10 ml cu solvent. Paralel se prelucreaz, n aceleai condiii ca i proba, o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 5-20 g Hg (II) / n ml ap distilat. Se msoar absorbanele probei i etaloanelor la spectrofotometru la 490 nm fa de un martor de solvent organic i se calculeaz concentraia probei (Cp = g Hg (II) / n ml mineralizat prelucrat). Calcul: g Hg (II) / urina din 24 ore = (Cp x V x N) / (n x p), unde N = ml urina recoltat n 24 ore. Interpretarea rezultatelor: La persoanele fr expunere profesional la mercur, se elimin prin urin pn la 24 g Hg (II) / 24 ore. Nivele de peste 100 g / 24 ore sunt considerate semn de impregnare a organismului cu mercur.
DETERMINAREA CANTITATIV A CADMIULUI DIN URIN Analiza toxicologic a cadmiului din probe biologice i din alimente se face dup distrugerea materiei organice prin mineralizare. Mineralizarea probelor: Se supun mineralizrii p ml urin, dup tehnica prezentat la izolarea prin mineralizare a plumbului din urin. Volumul mineralizatului se aduce n final la o valoare fix cu apa (V - volumul total al mineralizatului). Principiul determinrii: Ionul Cd2+ formeaz cu ditizona (difeniltiocarbazona), la pH 9 11, un complex de culoare roie, insolubil n ap i solubil n solveni organici.
C6H5 C6H5 2 C6H5 HN HN NH NH C
2+ S + Cd
C6H5 HN N S N N C + 2H+
N C N
NH S N Cd
C6H5 C6H5
Ditizona se oxideaz uor n contact cu oxigenul din aer la difeniltiocarbodiazon, care nu formeaz chelat. Procesul este mpiedicat de amoniac. Ditizona interacioneaz cu mai multe metale. Selectivitatea reaciei este asigurat de pH-ul alcalin i de prezena anumitor complexani (tartrat, cianur). n prezena unor concentraii de NaOH mai mari de 5%, ditizonaii de Pb2+, Bi2+, Sn2+ i Zn2+ se descompun. Reactivi: 1) Amoniac 25% 2) Soluie de tartrat de sodiu i potasiu 20% 3) Soluie de hidroxid de sodiu 20% 4) Ditizon 0,005% (se dizolv ntr-un solvent organic - toluen, benzen sau cloroform) 5) Soluie etalon Cd2+ (0,2 mg/ml se dizolv la 100C - 0,3262 g clorur de cadmiu n 5 ml HCl 5M i se completeaz la 1000 ml cu ap deionizat)
Tehnica de lucru: Se prelucreaz n ml mineralizat, care se dilueaz cu ap distilat la 25 ml. ntr-o plnie de separaie se trateaz cu 2 ml soluie tartrat 20%, 0,5 ml amoniac 25% i 5 ml soluie hidroxid de sodiu 20%. Se adaug apoi 2 ml reactiv ditizon 0,005% i se agit 1-2 minute. Se completeaz stratul de faz organic cu nc 8 ml solvent organic, se agit i se separ cele dou faze, reinnd faza organic, colorat, care se spal, prin agitare n plnie de separaie, cu 20 ml soluie de splare. Dup separare, stratul de solvent se filtreaz ntr-o eprubet gradat printrun filtru uscat i se completeaz volumul la 10 ml cu solvent. Paralel se prelucreaz n aceleai condiii ca proba o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 4-20 g Cd2+ / 25 ml ap distilat. Se msoar absorbana probei i a etaloanelor la spectrofotometru la 520 nm fa de un martor de solvent organic i se calculeaz concentraia probei (Cp = g Cd2+ / n ml mineralizat prelucrat). Calcul: g Cd2+ / urina din 24 ore = (Cp x V x N) / (n x p),
unde : N = ml urin recoltat n 24 de ore. Interpretarea rezultatelor: Cadmiul nu este un bioelement. n condiii obinuite, se elimin ~ 0,025 mg/litru urin. La persoanele expuse se ating valori > 0,1 mg/litru urin.
DETERMINAREA CANTITATIV A PLUMBULUI DIN URIN Analiza toxicologic a plumbului i a compuilor si din probe biologice i din alimente se face dup izolarea lui prin mineralizare. Mineralizarea probelor: Se msoar p ml urin ntr-un flacon de 100 ml, se adaug 10 ml acid azotic concentrat (d = 1,42) i 30 ml permanganat de potasiu soluie saturat. Se nclzete pe baie de nisip (moderat, astfel nct lichidul s nu ajung la fierbere), acoperind flaconul cu o sticl de ceas. Se continu nclzirea pn cnd lichidul devine limpede, avnd un precipitat brun la fund. Dac se consum tot permanganatul (dispare precipitatul brun), se mai adaug civa ml permanganat i se continu nclzirea flaconului pn cnd lichidul nu se mai decoloreaz.
Dup rcirea lichidului, se reduce excesul de permanganat, adugnd hidroxilamin 10%, pictur cu pictur, pn la dispariia precipitatului brun, i se adaug nc 2 ml hidroxilamin. Volumul mineralizatului se aduce n final la o valoare fix cu ap (V - volumul total al mineralizatului). Principiul determinrii: Ionul Pb2+ formeaz cu ditizona (difeniltiocarbazona), la pH 9 11, un complex de culoare roie.
C6H5 C6H5 2 C6H5 HN HN NH NH C
2+ S + Pb
C6H5 HN N S N N C + 2H+
N C N
NH S N Pb
C6H5 C6H5
Sensibilitatea reaciei este de 0,1 g/ml. Specificitatea metodei pentru ionii Pb este asigurat att de pH-ul alcalin la care se efectueaz extracia (9 11), ct i prin adugare de complexani (citrat, cianur), care leag metalele interferente. Ditizona se oxideaz uor n contact cu oxigenul din aer la difeniltiocarbodiazon, care nu formeaz chelat. Procesul este mpiedicat de amoniac.
2+
Reactivi: 1) Amoniac (d = 0,88) 2) Soluie tampon (conine complexani; se dizolv 100 g acid citric n 60 ml ap deionizat i se adaug amoniac n poriuni mici, rcind sub jet de ap, pn la pH 6,8 viraj n rou aprins cu rou de fenol, ncercnd cu pictura pe o plac de porelan; se adaug apoi 2,5 g sulfit de sodiu i 5 g cianur de potasiu i se aduce cu ap deionizat la 500 ml. Se elimin metalele interferente existente n soluie, prin tratare succesiv cu poriuni mici de ditizon 0,05%, pn cnd culoarea ditizonei nu se mai modific. Se spal de 2-3 ori cu cte 10 ml cloroform i se completeaz volumul la 1000 ml cu amoniac) 3) Ditizon 0,005% (se dizolv ntr-un solvent organic - toluen, benzen sau cloroform)
4) Soluie de splare (se dizolv 0,1 g cianur de potasiu n 1000 ml ap deionizat i se adaug 10 ml amoniac) 5) Soluie etalon Pb2+ (1 mg/ml se dizolv 1,596 g azotat de plumb n 1000 ml acid azotic diluat 1:100) Tehnica de lucru: Se prelucreaz n ml mineralizat, care se dilueaz cu ap distilat la 25 ml. ntr-o plnie de separaie se alcalinizeaz cu 15 ml soluie tampon, apoi se adaug 2 ml reactiv ditizon 0,005% i se agit 1-2 minute. Se completeaz stratul de faz organic cu nc 8 ml solvent organic, se agit i se separ cele dou faze, reinnd faza organic colorat, care se spal, prin agitare n plnie de separaie, cu 20 ml soluie de splare. Dup separare, stratul de solvent se filtreaz ntr-o eprubet gradat printr-un filtru uscat (care conine sulfat de sodiu anhidru) i se completeaz volumul la 10 ml cu solvent. Paralel se prelucreaz n aceleai condiii ca proba o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 4-20 g Pb2+ / 25 ml ap distilat. Se msoar absorbana probei i a etaloanelor la spectrofotometru, la 500 nm, fa de un martor de solvent organic i se calculeaz concentraia probei (Cp = g Pb2+ / n ml mineralizat prelucrat). Calcul: g Pb2+ / urina din 24 ore = (Cp x V x N) / (n x p),
unde N - ml urina recoltat n 24 ore. Interpretarea rezultatelor: Diagnosticul intoxicaiei cu plumb, n special n cazul unei intoxicaii cronice, se stabilete pe baza examinrilor clinice i a analizelor toxicologice (plumbemie, plumburie), ct i pe baza unor analize biochimice (coproporfirine, acid delta-aminolevulinic n urin, hematii cu granulaii bazofile). Valorile normale i patologice ale plumburiei sunt: < 40 g % valori normale < 80 g % valori acceptate 80 120 g % valori excesive > 120 g % valori periculoase
DETERMINAREA CANTITATIV A ACIDULUI -AMINOLEVULINIC DIN URIN Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe condensarea acidului -aminolevulinic (-ALA) cu acetilacetona, cnd rezult un compus cu structur pirolic, care cu pdimetilaminobenzaldehida formeaz un compus de culoare roie, colorimetrabil.
CH3 CO CH2 CO CH3 O H2N
COOH CH2 CH2 C CH2 H3C N -H2O CH3 CO
COOH CH2 CH2 H C O N CH3 CH3
-H2O
COOH CH3 CO CH2 CH2 CH3 N C H N CH3
H3C
Tehnica de lucru: La 1 ml urin (din urina recoltat/24 ore) se adaug 9 ml soluie de diluare (100 ml soluie acetat de sodiu 0,5 N n care se suspend 0,25 g crbune medicinal). Se agit de mai multe ori i apoi se filtreaz. Din filtrat se msoar cte 3 ml n dou eprubete, una constituind proba, iar cealalt martorul. n prob se adaug 0,1 ml acetilaceton i apoi se in ambele eprubete timp de 20 minute n baia de ap n fierbere. Dup rcire se adaug n fiecare 3 ml Reactiv Erlich modificat (1 g p-dimetilaminobenzaldehid se dizolv n 35 ml acid acetic glacial,
se adaug 8 ml acid percloric 70% i se aduce volumul la 50 ml cu acid acetic glacial). Dup 15 minute se msoar absorbana probei la spectrofotometru, la 553 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Aceast valoare se raporteaz la curba etalon obinut prin prelucrarea unor standarde cu concentraia cuprins ntre 1-10 g -ALA/3 ml, obinndu-se concentraia C n g/prob. Calcul: g -ALA/l urin = [C x 1000] / 0,3 g -ALA/24 ore = [C x V] / 0,3 unde: V = volumul de urin recoltat/24 ore (ml). Interpretarea rezultatelor: Valorile normale n urin sunt de 0,6 mg%. Valorile acceptate se situeaz ntre 0,6-2 mg%, valorile ntre 2-4 mg% sunt excesive, iar cele peste 4 mg% sunt considerate a fi periculoase, indicnd o intoxicaie cu plumb.
ANALIZA TOXICOLOGIC A DERIVAILOR BARBITURICI DETERMINAREA CANTITATIV PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC N VIZIBIL (REACIA PARRY) Izolarea din urin: ntr-o plnie de separaie se introduc 25 ml urin, se aciduleaz la pH 4-5 cu acid acetic concentrat i se extrage de cel puin dou ori cu cte 50 ml eter etilic. Extractele eterice reunite se purific prin tratare cu crbune activ i oxid de magneziu. Se filtreaz printr-un filtru uscat ce conine puin sulfat de sodiu anhidru, iar filtrul se spal cu puin eter. Fazele de solvent se evapor la sec pe o baie de ap. Principiul determinrii: Derivaii barbiturici, n soluie alcoolic, formeaz cu azotatul de cobalt n mediu alcalin un complex intern colorat n violet. Sensibilitatea reaciei este de 0,1 mg/ml.

H N O C N H C O C C R2 O R1 Co2+ O C N N Co C O O C C R2 R1
Tehnica de lucru: Reziduul obinut prin extracie cu solveni organici se dizolv n 2 ml metanol. Soluia se trece cantitativ ntr-o eprubet gradat i se completeaz volumul la 4 ml. 2 ml din aceast soluie se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 0,2-5 mg fenobarbital/2 ml metanol. n fiecare eprubet se adaug 2 picturi de azotat de cobalt 1% n metanol i 1-2 picturi de amoniac concentrat. Absorbana probei i a etaloanelor se citete la spectrofotometru, la 565 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n mg derivat barbituric/prob. Calcul: mg derivat barbituric/1000 ml urin = [2 x C x 1000] / p unde: p = ml produs biologic prelucrat.
DOZAREA DERIVAILOR BARBITURICI PRIN SPECTROFOTOMETRIE N UV Metoda se poate aplica pe snge total, plasm sau ser. Etaloane: soluii de concentraii 5, 10, 25, 40, 50 mg/l barbital, preparate n plasm uman, prin diluarea unei soluii apoase de barbital sodic (1,12 g/l, echivalent cu 1,00 g/l acid dietilbarbituric). Tehnica de lucru: Extracia 1. 2 ml plasm (obinui n urma centrifugrii la 2500 rpm timp de 10 min a 3 ml snge) se trateaz cu 0,8 ml HCl 2M i cu 15 ml eter etilic. Se agit 5 min. ntr-o plnie de separaie.
2. Se las 5 min. n repaus pentru separarea fazelor; se ndeprteaz stratul apos inferior. 3. Peste stratul eteric se adaug 5 ml tampon borat i se agit 5 minute. 4. Se las 5 min. n repaus i se ndeprteaz stratul apos 5. Peste faza organic se adaug 5 ml ap distilat, se agit cteva minute, se las 5 min. n repaus, apoi se arunc faza apoas 6. n plnie se adaug 4 g amestec crbune activat / sulfat de sodiu anhidru, se agit, i se separ faza eteric ntr-o capsul 7. Se evapor stratul eteric pe baie de ap 8. Reziduul se reia n ap distilat i se filtreaz soluia ntr-o eprubet Determinarea cantitativ 1. Se etaloneaz spectrofotometrul cu ap distilat 2. ntr-o cuv uscat se introduc 4 ml soluie apoas, peste care se adaug 50 l amoniac concentrat (2 picturi), se omogenizeaz i se verific dac pH-ul este egal cu 10 3. Se citete absorbana la 240 nm fa de ap distilat; dac este necesar, se dilueaz. Se nregistreaz spectrul pe domeniul 190-300 nm (Fig.1). 4. Se adaug n cuv 0,1 ml acid sulfuric concentrat (3 picturi), se omogenizeaz i se verific dac pH-ul este egal cu 2. 5. Se citete absorbana la 240 nm i se nregistreaz spectrul pe domeniul 190300 nm (Fig.1). Dac este necesar, se dilueaz extractul cu ap distilat.
Figura 1. Spectrele UV ale barbitalului la pH 10 (A) i la pH 2 (B)
Pentru a realiza dozarea derivailor barbiturici, se reprezint grafic diferenele ntre absorbanele la pH 10 i pH 2 n funcie de concentraia etaloanelor (exprimat n mg/l snge). Se determin ecuaia dreptei de calibrare, care la rndul ei permite
calcularea concentraiei probei (x), a crei absorban (y) este citit la spectrofotometru. Sensibilitatea reaciei: 2 mg/l derivai barbiturici. Interpretarea rezultatelor: concentraii plasmatice de derivai barbiturici mai mari de 10 mg/l (50 mg/l barbital sau fenobarbital) pot produce fenomene toxice grave.
ANALIZA TOXICOLOGIC A ASPIRINEI DETERMINAREA CANTITATIV DIN PLASM Izolarea: Acidul salicilic i derivaii si medicamentoi se izoleaz din corpuri delicte, snge, urin, coninut stomacal i vom, prin extracie cu solveni organici din mediu acid (salicilatul de metil se izoleaz prin antrenare cu vapori de ap). Se trateaz 2 ml plasm, ntr-o plnie de separaie, cu 0,5 ml acid clorhidric 6 N i cu 50 ml dicloretan. Se agit bine, se separ faza organic i se evapor la sec. Principiul determinrii: Aspirina, dup hidroliz, formeaz cu ionul Fe (III) un compus de culoare violet:
COO O Fe +
Tehnica de lucru: Reziduul obinut se trateaz cu 10 ml hidroxid de sodiu 1N i se fierbe 10-15 minute la flacr mic. Se neutralizeaz cu acid clorhidric 10% (evitnd excesul) i se aduce cantitativ cu ap ntr-un balon cotat. Din aceast soluie, 5 ml se trateaz cu 0,2 ml azotat de fier (III) 0,25%. Dup 15 minute, se msoar absorbana la spectrofotometru, la 530 nm n cuva de 1 cm, fa de ap distilat. Scara de etaloane s-a realizat pentru concentraii cuprinse ntre 1-5 mg aspirin / 5 ml, de la faza de hidroliz, n aceleai condiii. Reprezentndu-se grafic
absorbana soluiilor etalon n funcie de concentraie, s-a obinut dreapta de regresie. Din ecuaia dreptei de regresie: y = A + B x, se calculeaz concentraia probei analizate: Cp [mg aspirin / 5 ml prob prelucrat din balonul cotat]. Calcul: Rezultatul se exprim n mg aspirin / 100 ml plasm: mg aspirin / 100 ml plasm = [Cp x Vb x 100] / [n x p x 1000], unde: Vb este volumul balonului cotat, n = ml prelucrai din balonul cotat, p = ml plasm folosit la extracie. Interpretarea rezultatului: Se va face conform nomogramei Done (fig.1).
Figura 1. Nomograma lui Done pentru aprecierea gravitii intoxicaiei cu salicilai
Nomograma permite aprecierea gradului de intoxicaie cu aspirin pe baza nivelului seric al salicilailor, la diferite intervale de timp de la ingestie. Poate fi folosit numai pentru valorile obinute dup 6 ore de la ingestie.
- intoxicaie uoar (hiperpnee moderat fr acidoz, letargie, vom; eventual uoar febr); - intoxicaie moderat (hiperpnee sever cu acidoz, letargie marcat sau excitabilitate marcat, dar fr com sau convulsii, tulburri gastrointestinale marcate); - intoxicaie sever (hiperpnee sever, afectri neurologice severe care includ com sau convulsii, acidoz metabolic marcat).
ANALIZA TOXICOLOGIC A PARACETAMOLULUI DETERMINAREA CANTITATIV DIN PLASM Izolarea: Paracetamolul se izoleaz din mediu acid, prin extracie cu solveni organici (de preferat cloroform). Se aciduleaz 2 ml plasm (20 ml urin) cu acid acetic 5% la pH 5-6 i se extrag de dou ori cu cte 20 ml (50 ml) cloroform (eter). Extractele organice se reunesc ntr-o capsul i se evapor la sec; reziduul este reluat cu civa ml de acid clorhidric diluat ntr-un balon cotat, care se completeaz apoi la semn cu ap distilat. Principiul metodei: Dup hidroliz acid, din paracetamol rezult para-aminofenolul, care n prezena fenolului i a hipobromitului formeaz indofenol:
OH +H2O/H NH CO CH3
+
OH + OH + 2 NaBrO - 2 NaBr, - 2 H2O NH2
OH
Tehnica de lucru: ntr-o eprubet gradat se iau 2 ml prob (din balonul cotat) i 4 ml acid clorhidric 4 N. Se fierbe pe baia de ap la 100 C timp de 30 de minute i se aduce cu ap la 10 ml. Din aceast soluie (prob hidrolizat) se ia 1 ml, se adaug 8 ml NaOH 0,2 N, 1 ml fenol 1% i 1 ml soluie hipobromit de sodiu (vezi anexa V). Se las la ntuneric 30 de minute. Se citete absorbana la spectrofotometru, la 630 nm n cuv de 1 cm, fat de un martor de reactivi. Curba de etalonare se efectueaz ntre 100 i 500 g / 2 ml , lucrndu-se n condiii identice. Valoarea absorbanei pentru prob se raporteaz la curba etalon i se obine Cp [g / 2 ml prob prelucrat din balonul cotat]. Calcul: Rezultatul se exprim n mg paracetamol / 100 ml plasm: mg paracetamol / 100 ml plasm = [Cp x Vb x 100] / [n x p x 1000], unde: Vb este volumul balonului cotat, n = ml prelucrai din balonul cotat, p ml plasm folosit la extracie. Interpretarea rezultatului: Se va face conform nomogramei Rumack-Matthew (Figura p. 158). Concentraia paracetamolului n plasm se poate obine numai dup 4 ore de la ingestie. Nomograma permite aprecierea potenialului hepatotoxic pentru pacienii netratai cu antidot (N-acetilcistein).
ANALIZA TOXICOLOGIC A ANTIDEPRESIVELOR TRICICLICE DETERMINAREA CANTITATIV A IMIPRAMINEI CU METAVANADAT DE SODIU Izolarea din esuturi: 5 g esut se tritureaz bine cu puin nisip purificat. Se adaug 0,2-0,5 g oxid de magneziu i circa 15 g sulfat de sodiu anhidru i se omogenizeaz. Amestecul obinut se aduce cantitativ ntr-un flacon conic cu dop rodat i se extrage prin agitare energic timp de 10 minute cu 20-30 ml cloroform sau aceton. Dup sedimentare se separ faza de solvent i se repet extracia de cel puin dou ori.
Nomograma Rumack-Matthew pentru aprecierea gravitii intoxicaiei cu paracetamol i a eficienei tratamentului
Fazele de solvent reunite se filtreaz (printr-un filtru uscat) ntr-o capsul i se evapor la sec pe baie de ap. Prin aceast tehnic se separ i metaboliii cu caracter alcalin. Principiul metodei: Antideprinul formeaz cu metavanadatul de sodiu n mediu acid coloraii albastre colorimetrabile. Sensibilitatea reaciei este de 0,5 g/ml. Tehnica de lucru: Reziduul obinut dup extracie se dizolv n 5 ml acid sulfuric 1:2 i se aduce cantitativ (cu acid sulfuric) ntr-un balon cotat de 25 ml. 2 ml din aceast soluie se prelucreaz paralel cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 1-20 g antideprin/2 ml acid sulfuric 1:2. Fiecare eprubet se trateaz cu 0,5 ml reactiv metavanadat de sodiu 0,2% n acid sulfuric
1:2. Se msoar absorbanele la spectrofotometru la 620 nm n cuva de 1 cm, fa de un martor de acid sulfuric 1:2. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g antideprin/prob. Calcul: mg imipramin/100 g esut = [V x C x 100] / [n x p x 1000] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prelucrai din balonul cotat; p = g prob biologic luat n lucru. Interpretarea rezultatelor: La decedai n urma unei intoxicaii acute cu imipramin, au fost determinate concentraii n ficat de 16-46 g/g.
ANALIZA TOXICOLOGIC A FENOTIAZINELOR DETERMINAREA CANTITATIV CU CLORUR DE FIER (III) Izolarea din urin: 25 ml urin se alcalinizeaz la pH 10 cu hidroxid de sodiu 10% sau cu amoniac concentrat i se extrage ntr-o plnie de separaie cu 50 ml diclormetan sau cloroform. Solventul se separ, iar poriunea rmas se mai extrage de cel puin dou ori cu cte 50 ml cloroform sau diclormetan. Fazele de solvent separate i reunite se filtreaz (printr-un filtru uscat) ntr-o capsul, apoi se evapor pe baie de ap. Principiul metodei: Fenotiazinele formeaz cu clorura de fier (III) n mediu de acid sulfuric coloraii caracteristice (verde, rou sau violet), care se determin spectrofotometric n vizibil. Sensibilitatea reaciei este de 1 g/ml. Tehnica de lucru: Reziduul obinut prin extracie cu solveni organici din produse biologice se aduce cantitativ prin splri repetate cu acid sulfuric 1:2 ntr-un balon cotat de 25 ml. Se completeaz la semn cu acid sulfuric 1:2. Peste 2,5 ml din aceast soluie se adaug 0,2 ml clorur de fier (III). Dup 15 minute se msoar absorbana la spectrofotometru n cuva de 1 cm, fa de un martor de acid sulfuric 1:2.
Absorbana probei se raporteaz la o curb etalon obinut prin prelucrarea (n condiiile probei) a 6-8 standarde cu concentraia cuprins ntre 5-50 g derivat fenotiazinic/2,5 ml acid sulfuric 1:2, obinndu-se concentraia C n g/prob. Lungimile de und la care se citesc absorbanele sunt: Clorpromazina: 455 nm, Levomepromazina: 555 nm, Proclorpromazina: 500 nm, Tioridazin: 620 nm. Calcul: mg derivat fenotiazinic/1000 ml urin = [V x C] / [n x p] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prelucrai din balonul cotat; p = ml prob biologic luat n lucru.
ANALIZA TOXICOLOGIC A IZONIAZIDEI DETERMINAREA CANTITATIV DIN PLASM CU p-DIMETILAMINOBENZALDEHID Din plasm HIN-ul poate fi determinat fr izolare. Principiul metodei: HIN-ul formeaz cu p-dimetilaminobenzaldehida o coloraie galbenportocalie, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 1g/ml. Tehnica de lucru: Peste 2 ml plasm se adaug 1 ml acid acetic 1% i 0,5 ml soluie alcoolic de p-dimetilaminobenzaldehid 1%. Paralel se prelucreaz n condiiile probei 10 standarde cu concentraia cuprins ntre 10-100 g HIN/2 ml ap distilat i un martor de reactivi. Absorbanele probei i etaloanelor se citesc la spectrofotometru la 530 nm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g HIN/prob.
Calcul: mg HIN/100 ml plasm = [C x 100] / [2 x 1000]. Interpretarea rezultatelor: Dup doze terapeutice de 300-400 mg HIN / zi, nivelele plasmatice sunt cuprinse ntre 0,5-10 g/ml.
ANALIZA TOXICOLOGIC A BENZODIAZEPINELOR DETERMINAREA CANTITATIV SUB FORM DE AZOCOLORANI Izolarea din urin: 25 ml urin se alcalinizeaz cu carbonat de sodiu sau de potasiu 5% (pH=10) i se aduce ntr-o plnie de separaie; se extrage de cel puin dou ori cu cte 50 ml eter etilic (dicloretan sau amestec dicloretan:acetat de etil 2:1). Fazele de solvent separate i reunite se filtreaz (printr-o hrtie de filtru uscat, splnd filtrul cu puin solvent) ntr-o capsul i se evapor la sec pe baie de ap. Reziduul obinut servete la analiza toxicologic a clordiazepoxidului, nitrazepamului i a unor metabolii. Principiul metodei: Gruparea aminic aromatic primar eliberat prin hidroliz acid, dup diazotare i cuplare cu N-naftiletilendiamin d un derivat de culoare roz-violacee, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 1g/ml.
NH2 O R C NaNO2 HCl R
N O
Cl
CH2 N O NH
CH2
NH2
Cl
N O
NH CH2 CH2 NH2
Tehnica de lucru: a) Reziduul obinut prin extracie cu solveni organici, dup hidroliz, se dizolv n 2 ml acid clorhidric 2N, se aduce cantitativ cu ap distilat ntr-un balon cotat de 25 sau 50 ml. Din aceast soluie se prelucreaz 2 ml, peste care se adaug 0,5 ml acid clorhidric 2N i 0,1 ml nitrit de sodiu 1%; se agit i se las n repaus 10 minute. Se adaug 2 ml uree 10%, se agit bine i dup 5 minute se adaug 0,1 ml N-naftiletilendiamin1%. Paralel cu proba se prelucreaz n aceleai condiii un martor de reactivi i 8-10 standarde cu concentraia cuprins ntre 250-500 g benzodiazepin hidrolizat. Se msoar absorbanele probei i etaloanelor la spectrofotometru la 550 nm, n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g/prob. b) Reziduul obinut prin extracie direct din produse biologice poate fi dozat aplicnd metoda descris mai sus n urmtoarele condiii: reziduul se trateaz cu 10 ml acid clorhidric 4N, se hidrolizeaz prin nclzire (timp de 30 minute) pe o baie de ap n fierbere, evitnd evaporarea. Dup rcire se aduce cantitativ cu ap distilat ntr-un balon cotat de 25 sau 50 ml. Se continu apoi determinarea ca mai sus.
Calcul: mg benzodiazepin/1000 ml urin = [V x C] / [n x p] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prelucrai din balonul cotat; p = ml prob biologic luat n lucru.
DETERMINAREA CANTITATIV A DIAZEPAMULUI PRIN SPECTROFOTOMETRIE N UV
Principiul metodei: Dozarea diazepamului din plasm se realizeaz dup izolarea lui prin extracie cu solveni organici la pH 6,8 7 (extracie lichid-lichid ~ ELL sau extracie pe faz solid ~ EFS). Este uor solubil n aceton, benzen, cloroform, solubil n alcool, greu solubil n eter i practic insolubil n ap.
CH3 N
Cl C6H5
Se determin cantitativ spectrofotometric n UV, diazepamul prezentnd n soluie de HCl 2N trei maxime de absorbie: 242, 287 i 359 nm. Diferena dintre valorile absorbiei maxime i minime este proporional cu concentraia. Sensibilitatea metodei este de 5 g/ml.
Spectrul UV al diazepamului, cu cele trei maxime de absorbie
Reactivi: 1) Tampon fosfat pH 6,8 (0,2M): la 51 ml KH2PO4 0,2M se adaug 49 ml Na2HPO4*12H2O 0,2M 2) Tampon fosfat pH 6,8 (0,002M): se dilueaz 1:100 tamponul 0,2M, ajustnd pH-ul la 6,8 cu Na2HPO4 0,2M 3) HClO4 7% (HClO4 conc. diluat 1:10, v/v, cu apa distilat) 4) NaOH 20% 5) Cloroform 6) Metanol 7) Aceton 8) HCl 2N: 170,8ml HCl 37% (d=1,155) se dilueaz cu ap distilat la 1000ml 9) Soluie etalon de diazepam n HCl 2N, cu concentraia de 0,5mg/ml Izolarea diazepamului din plasm: a) Extracia lichid-lichid: Se aduc p = 2 ml plasm la pH = 6,8 cu 2 ml tampon fosfat pH 6,8 (0,2M) i se extrag ntr-o plnie de separaie cu 10 ml cloroform (benzen), agitnd cteva minute. Se separ faza organic ntr-o capsul de porelan filtrndu-se prin filtru uscat i se evapor la sec pe baie de ap. b) Extracia pe faz solid: Pregtirea probei: - p = 1 ml plasm se deproteinizeaz cu 0,4 ml HClO4 7% i se dilueaz ntr-o eprubet de centrifug cu 2 ml tampon fosfat pH 6,8 (0,2M), se vortexeaz 30 secunde i se centrifugheaz 6 minute la 2500 rotaii/minut; - supernatantul se separ i se neutralizeaz cu 0,1 ml NaOH 20%
Condiionarea cartuului de extracie (C18 300 mg): Se trec prin cartu cu ajutorul unei seringi: - 5 ml metanol (viteza de trecere prin cartu ~ 3ml/min) - de trei ori aer - 5 ml ap distilat (viteza de trecere prin cartu ~ 3ml/min; cartuul trebuie s rmn umectat) - 5 ml tampon fosfat pH 6,8 (0,2M) (viteza de trecere prin cartu ~ 3ml/min; cartuul trebuie s rmn umectat) Trecerea probei prin cartu: - se trece supernatantul neutralizat cu un debit de ~1ml/min (cartuul trebuie s rmn umectat) Splarea cartuului: - cu 5 ml tampon fosfat pH 6,8 (0,002M) (debit - 3ml/min) Eluarea: - de trei ori aer; - 5 ml metanol (debit ~1ml/min) Se evapor metanolul la sec pe baie de ap, sub ni. Tehnica de lucru: Reziduul obinut prin ELL sau prin EFS se dizolv n 3ml HCl 2N. Se msoar absorbana la spectrofotometru la 359 nm si 332 nm fa de HCl 2N. Metoda spectrofotometric este linear pe domeniul de concentraii 5 100 g diazepam /ml HCl 2N. Se reprezint grafic diferena dintre absorbana citit la 359 nm (maxim de absorbie) i cea citit la 332 nm (minim de absorbie) n funcie de concentraie. Observaii: Se prelucreaz mai nti cte o prob marcat cu concentraia de 100 g/ml (Cs-reala), att prin ELL, ct i prin EFS, pentru determinarea randamentelor de extracie. (volumul corespunztor de plasm, precizat n tehnic, se va nlocui cu un volum egal de ap distilat i se va marca cu 100 g diazepam /ml). Cu ajutorul programului Spectra manager, se va obine pentru fiecare metod de extracie concentraia regsit (Cs-regasit), din ecuaia dreptei de regresie obinut pentru domeniul de concentraii 5 100 g/ml. Se calculeaz apoi randamentele de extracie conform formulei: R (%) = [Cs-regasit x 3 / Cs-real] x 100 Pentru determinarea cantitativ a diazepamului din proba de analizat se selecteaz metoda de extracie cea mai eficient.
Calcul: Prelucrarea datelor se va face cu ajutorul programului Spectra manager. Rezultatul final se va exprima n g diazepam /100ml plasm, conform formulei: g diazepam /100ml plasm = Cp x 3 x 100 Interpretarea rezultatelor: n tratamentele cu o doz unic oral de 10 mg diazepam, concentraiile sanguine maxime au fost de ordinul a sutelor de micrograme diazepam / litru snge. n tratamentele cu doze zilnice de 30 mg diazepam, concentraiile maxime au fost de asemenea de ordinul sutelor de micrograme / litru snge. n intoxicaiile severe sau mortale, concentraiile sanguine au fost de 2-30mg / litru snge.
ANALIZA TOXICOLOGIC A MORFINEI DETERMINAREA CANTITATIV PRIN INTERMEDIUL FORMRII ALBASTRULUI DE MOLIBDEN Izolarea metaboliilor conjugai i a morfinei din urin: 20 ml urin se trateaz cu 10 ml acid clorhidric 4N i se fierbe 30 minute pe baie de ap, sub refrigerent ascendent. Dup rcire, se alcalinizeaz la pH=8 cu carbonat acid de sodiu sau cu hidroxid de amoniu concentrat. Amestecul se aduce ntr-o plnie de separaie i se extrage cel puin de dou ori cu cte 25 ml cloroform. Fazele cloroformice reunite se filtreaz (printr-un filtru uscat) ntr-o capsul i se evapor la sec pe baie de ap. Principiul metodei: Morfina, n mediu amoniacal, reduce acidul fosfomolibdenic la molibdat de molibdenil de culoare albastr, colorimetrabil. Sensibilitatea reaciei este de 10 g morfin/ml. Tehnica de lucru: 2,5 ml din soluia obinut mai sus (adus n balon cotat de 25 sau 50 ml) se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 10-100 g morfin/2,5 ml acid sulfuric 0,1N. n fiecare prob se adaug 1 ml soluie alcoolic de acid fosfomolibdenic 1% i 0,5 ml
amoniac concentrat. Absorbanele probei i etaloanelor se citesc la spectrofotometru la 570 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Raportarea absorbanei probei se face pe curba etalon, obinndu-se concentraia C n g morfin/prob. Calcul: mg morfin/1000 ml urin = [C x V] / [n x p] unde: V = volumul balonului cotat; n = ml prelucrai din balonul cotat; p = ml prob biologic prelucrat.
ANALIZA TOXICOLOGIC A UNOR PESTICIDE DETERMINAREA CANTITATIV A MALATIONULUI Izolarea din urin: 50 ml urin se aciduleaz cu acid clorhidric 5% i se extrage de cel puin dou ori cu cte 50 ml eter etilic sau cloroform. Fazele de solvent separate i reunite se filtreaz (printr-un filtru uscat) ntr-o capsul i se evapor la sec pe baia de ap la 50oC. Principiul metodei: Malationul se hidrolizeaz n mediu alcalin la dimetilditiofosfat de sodiu, fumarat de sodiu i etanol. Dimetilditiofosfatul de sodiu formeaz cu ionii de Cu (II) un compus de culoare galben, extractibil n tetraclorur de carbon. Sensibilitatea reaciei este de 10 g malation/ml.
COONa H3CO H3CO S P S CH CH2 COOC2H5 COOC2H5 3NaOH H3CO H3CO S P S Na CH CH COONa 2C2H5 OH H2O
Tehnica de lucru: Reziduul obinut prin extracie cu solveni organici se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 20-200 g malation/prob. Fiecare reziduu se trateaz cu 1 ml hidroxid de sodiu 6N i 25 ml reactiv clorur de fier (III) 0,2% n acid clorhidric 1%. Se agit bine i se las n repaus 15 minute. Se adaug 2-3 picturi de soluie alcoolic de fenolftalein 1% i se neutralizeaz cu acid clorhidric 5N (pn la decolorare). Se aduce cantitativ ntro plnie de separaie, se adaug 2 ml sulfat de cupru 1% i se extrage de dou ori cu cte 5 ml tetraclorur de carbon. Fazele de solvent separate i reunite se filtreaz sau se centrifugheaz. Se msoar absorbanele la spectrofotometru, la 470 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Absorbana probei se raporteaz la curba etalon, obinndu-se concentraia C n g malation/prob. Calcul: mg malation/1000 ml urin = C / p unde: p = ml prob biologic prelucrat.
ANALIZA TOXICOLOGIC A PARAQUATULUI N URIN Paraquatul (1,1-dimetil-4,4-dipiridil) este un ierbicid foarte mult utilizat pe plan mondial. Intoxicaiile cele mai grave sunt datorate ingerrii accidentale sau n scop suicidar, fiind adesea letale. Principiul metodei: n mediu alcalin, paraquatul este redus de ctre ditionitul de sodiu la un radical liber de culoare albastr. Dozarea se face spectrofotometric. Diquatul, un ierbicid nrudit cu paraquatul, d n aceleai condiii o culoare verde. Limita de sensibilitate a metodei este de 1g/ml. Reactivi: 1. Hidroxid de sodiu 1N 2. Ditionit de sodiu (hidrosulfit de sodiu - Na2S2O4) 1% n hidroxid de sodiu 1N (se prepar ex-temporae, dizolvnd 0,1g ditionit n 10 ml hidroxid de sodiu 1N) 3. Soluie saturat de clorur de amoniu
4. Paraquat soluie etalon (0,1mg/ml se dilueaz soluia stoc [200mg/ml] n proporie de 1:2000 cu soluie saturat de clorur de amoniu) Analiza calitativ: ntr-o eprubet se adaug la 1 ml urin, 0,4 ml ditionit de sodiu 1% n hidroxid de sodiu 1N. n paralel se prelucreaz un blanc: peste 1 ml urin se adaug 0,4 ml hidroxid de sodiu 1N. Se compar coloraiile obinute n cele dou eprubete. n prezena paraquatului, apare o coloraie albastr n eprubeta n care s-a introdus ditionit. Diquatul d n aceste condiii o coloraie verde. Analiza cantitativ: Se lucreaz n patru eprubete, conform urmtorului tabel: Etalon 1 0,1 ml urin blanc 2,1 ml 0,2 ml Etalon 2 0,1 ml urin blanc 2,05 ml 0,05 ml 0,2 ml Etalon 3 0,1 ml urin blanc 2 ml 0,1 ml 0,2 ml Proba 0,1 ml urin prob 2,1 ml 0,2 ml
Ap distilat Paraquat 0,1 mg/ml Ditionit de sodiu 1%
Eprubetele se agit i se citesc absorbanele la spectrofotometru, la 600 nm. Se reprezint grafic variaia absorbanei n funcie de concentraie i se obine concentraia probei (Cp - g/0,1 ml urina) prin extrapolare din grafic. Rezultatul final se exprim n mg paraquat / 1000 ml urin. Observaii: Paraquatul se metabolizeaz n proporie mic la om. Se elimin prin urin relativ lent, astfel c poate fi detectat n aceast prob biologic chiar i dup 16 30 de zile de la ingerare.
DETERMINAREA CANTITATIV A DINITRO-ORTO-CRESOLULUI (DNOC) DIN SNGELE TOTAL Principiul metodei: DNOC-ul poate fi uor dozat spectrofotometric din sngele total, deoarece prezint o absorban puternic la 430 de nm, iar concentraiile toxice sunt relativ mari. Sensibilitatea metodei este de 10 mg DNOC/l. Reactivi: 1. Soluie apoas de clorur de sodiu (270 g/l) ce conine 30 g/l carbonat de sodiu 2. Etaloane DNOC cu concentraii de 10, 20 i 50 mg/l n snge total Tehnica de lucru: - 1 ml prob sau standard se trateaz ntr-un tub de centrifug cu 5 ml butanon i apoi cu 1 ml soluie de clorur de sodiu i carbonat de sodiu. - Se vortexeaz 30 de secunde, apoi se centrifugheaz 5 minute la 3000 rpm. Din extractul organic se preleveaz ntr-o eprubet 2 ml. - Se citete absorbana la spectrofotometru la 430 nm n cuvele de 1 cm, fa de butanon. Rezultate: Se reprezint grafic absorbana etaloanelor n funcie de concentraia n DNOC (mg/l), iar prin extrapolare se calculeaz concentraia probei, exprimat n mg/l. Interpretarea rezultatelor DNOC-ul decupleaz fosforilarea oxidativ, simptomatologia intoxicaiei caracterizndu-se prin oboseal, transpiraii excesive, hipertermie i sete intens, care pot conduce la epuizare. n cazurile grave survine decesul. Semnele de toxicitate apar la concentraii sanguine mai mari de 30 mg/l i sunt grave la concentraii mai mari de 60 mg/l.
DETERMINAREA CANTITATIV A DNOC DIN URIN Izolarea din urin: 20 ml urin se aduc ntr-o plnie de separaie, se aciduleaz cu acid clorhidric 10% i se extrage de dou ori cu cte 20 ml eter etilic sau cloroform.
Fazele organice se reunesc, se filtreaz prin filtru uscat cu sulfat de sodiu sicc. ntro capsul i se evapor la sec pe baia de ap. Principiul metodei: Dinitro-orto-crezolul este redus cu zinc i acid clorhidric la aminoderivatul corespunztor care, cu un oxidant (sulfat de ceriu, dicromat de potasiu) formeaz un derivat chinoniminic de culoare roie, colorimetrabil. Sensibilitatea metodei este de 5 g/ml. Tehnica de lucru: Reziduul obinut n urma extraciei cu solveni organici se reia cu 3 ml ap distilat. Se adaug 1 ml acid clorhidric concentrat i 1-2 granule de zinc amalgamat. Se nclzete pe baia de ap la fierbere. Se rcete i se filtreaz ntr-o eprubet gradat de 10 ml. Se adaug 0,1 ml sulfat de ceriu 0,2N n acid sulfuric 5% i se completeaz la 10 ml cu ap distilat. Se citete absorbana dup 15 minute la spectrofotometru, la 490 nm fa de ap distilat. Curba de calibrare se ntocmete din etaloane cu concentraii cuprinse ntre 20 i 200 g/3 ml. Valoarea absorbanei probei se raporteaz la curba de calibrare, extrapolndu-se concentraia probei. Calcul: mg DNOC / 1000 ml urin = C / V, Unde : C = concentraia DNOC n g V = volumul de urin prelucrat
DETERMINAREA CANTITATIV A PARA-NITROFENOLULUI TOTAL DIN URIN Para-nitrofenolul este principalul metabolit al parationului. El se elimin prin urin ca atare i sub form de conjugat. Se izoleaz din urin prin extracie cu solveni organici din mediu acid. Izolarea din urin: ntr-un balon cu fund rotund se introduc 25-50 ml urin i 10 ml acid clorhidric 15% i se fierbe sub refrigerent ascendent, la flacr mic, timp de 60 minute. Dup rcire, produsul se extrage ntr-o plnie de separaie, de cel puin
dou ori cu cte 20 ml eter etilic. Fazele de solvent separate i reunite se filtreaz prin filtru uscat cu sulfat de sodiu sicc. i se evapor la sec. Reziduul se dizolv n ap i se aduce cantitativ ntr-un balon cotat de 25-50 ml, care se completeaz la semn. Principiul metodei: Gruparea nitro a para-nitrofenolului se reduce, cu hidrogen n stare nscnd, la grupare aminic. Aceasta se diazoteaz i apoi se cupleaz cu Nnaftiletilendiamin, formnd un azoderivat de culoare violet, care prezint absorbie n domeniul vizibil. Tehnica de lucru: 5 ml soluie obinut n urma izolrii se prelucreaz paralel cu un martor de reactivi i cu o scar de etaloane cu concentraia cuprins ntre 25-150 g pnitrofenol /5 ml. n fiecare eprubet se adaug 1 ml acid clorhidric concentrat i 1-2 granule de zinc i se nclzesc n baie de ap timp de 10 minute. Se filtreaz cantitativ n eprubete gradate i se completeaz volumul la 10 ml cu ap distilat. Peste 5 ml de soluie prelevai din fiecare eprubet se adaug 0,5 ml nitrit de sodiu 1% i se las 5-10 minute, apoi se adaug 2 ml uree 10%. Dup 10-15 minute se adaug 1 ml N-naftiletilendiamin 1. Dup 15 minute se msoar absorbanele la spectrofotometru, la 540 nm n cuva de 1 cm, fa de martorul de reactivi. Prin extrapolare pe curba de calibrare se calculeaz concentraia C n g p-nitrofenol /5 ml prob. Calcul: mg p-nitrofenol total = [C x V] / [n x p] unde: V = volumul balonului cotat, n = ml prelucrai din balon p = ml produs biologic prelucrat
Interpretarea rezultatelor: n intoxicaii severe cu paration s-au determinat concentraii de 1,6-11,6 mg p-nitrofenol total / l de urin.
DETERMINAREA ACTIVITII COLINESTERAZICE N SNGELE TOTAL Obiectiv: Evaluarea activitii colinesterazice sanguine permite diagnosticarea i supravegherea unei intoxicaii cu insecticide organofosforice. Aceste insecticide inhib colinesterazele, determinnd acumularea acetilcolinei la nivelul plcii motorii a muchilor striai. Principiul metodei: Colinesteraza din sngele total acioneaz asupra unui exces cunoscut de acetilcolin. Acetilcolina nehidrolizat formeaz cu hidroxilamina n mediu alcalin acid acetohidroxamic, care cu Fe3+ d un complex de tip Hantzsch solubil, rouviolet, colorimetrabil:
+ NaOH - 3(R-OH) 3 CH3-CO-NH-OH + FeCl3 - 3 HCl [CH3-CO-NH-O-]3 Fe
3 CH3-COOR + 3 NH2-OH . HCl
Reactivi: 1) Tampon veronal pH 7,4 Soluia A: 2,06 g barbital sodic se dizolv n 100 ml ap distilat Soluia B: 0,365 g barbital se dizolv n 100 ml ap distilat Se amestec 5 ml soluie A cu 95 ml soluie B (se pstreaz la 4C). 2) Soluie stoc de acetilcolin clorhidrat 0,04M (72,66 mg acetilcolin / 10 ml ap distilat; se pstreaz la 4C) 3) Soluie de lucru de acetilcolin clorhidrat 0,004M (se dilueaz soluia stoc de acetilcolin clorhidrat cu tampon veronal, n proporie de 1:10) 4) Soluie de hidroxilamin 2M (1,39 g hidroxilamin clorhidrat / 10 ml ap distilat; se pstreaz la 4C, maximum 2 sptmni) 5) Hidroxid de sodiu 3,5M (28 g NaOH / 200 ml ap distilat) 6) Soluie alcalin de hidroxilamin: se prepar ex-temporae, amestecnd 1ml soluie 2M de hidroxilamin cu 2ml NaOH 3,5M. 7) Acid percloric 1,8M [10 ml HClO4 (d = 1,61) se dilueaz cu 30 ml ap distilat] 8) Clorur feric 0,37M (6g FeCl3 se dizolv n 100 ml HCl 0,1M)
Tehnica de lucru: Se analizeaz sngele total, recoltat pe fluorur de sodiu: Nr. eprubetei Tampon veronal Snge Acetilcolin 0,004M 1 proba 0,95 ml 0,05 ml 1 ml 2 martor de acetilcolin 1 ml 1 ml 3 martor de reactivi 2 ml -
Se agit i se incubeaz 10 minute la 25C (temperatura camerei). n fiecare eprubet se adaug 0,4 ml soluie alcalin de hidroxilamin preparat ex-temporae. Se agit i se las n repaus 2 minute. Ap distilat Acid percloric 1,8M Clorur feric 0,37M 2 ml 0,4 ml 0,2 ml 2 ml 0,4 ml 0,2 ml 2 ml 0,4 ml 0,2 ml
Se filtreaz i se ateapt 15 minute. Se msoar absorbana filtratelor din eprubetele 1 i 2 la spectrofotometru, la 520 nm, fa de martorul de reactivi (eprubeta 3). Calcul: moli acetilcolin nehidrolizat = 4 x [A1 / A2]
Activitatea colinesterazic din snge este dat de numrul de micromoli de acetilcolin hidrolizat n timpul incubrii n prezena a 50 l snge. Activitatea colinesterazic = 4 x [1 (A1 / A2)], unde A1 este absorbana probei (eprubeta 1), iar A2 este absorbana martorului de acetilcolin (eprubeta 2).
Interpretarea rezultatelor: Activitatea colinesterazic normal este de 2,15 0,03. La muncitorii din sectorul agricol expui la insecticide organofosforice se poate observa o diminuare a activitii colinesterazice de 40%. Cnd valorile scad cu peste 50-60% se impune prsirea locului de munc. Intoxicaia cu derivai organofosforici este deosebit de grav la copii.
Capitolul 5 DIAGNOSTICUL CLINIC AL INTOXICAIILOR: STUDII DE CAZURI CLINICE Intoxicaiile acute i cronice reprezint la ora actual prima cauz a consultaiilor medicale de urgen n rile dezvoltate i a doua cauz de deces, dup infecii i pe acelai plan cu accidentele, la persoanele sub 30 de ani din rile n curs de dezvoltare. Marea majoritate a acestor intoxicaii sunt accidentale (70%), fapt care, alturi de ali factori, contribuie la dificultatea stabilirii diagnosticului. Dei, aa cum s-a vzut n capitolul 1, analiza toxicologic joac un rol important n confirmarea diagnosticului, n cele mai multe cazuri stabilirea acestuia se face n principal pe baza simptomatologiei observate. n acest capitol vor fi prezentate cteva cazuri reprezentative de intoxicaii reale, a cror rezolvare va permite aplicarea practic a cunotinelor teoretice acumulate n cadrul cursului i corelarea lor cu unele analize de laborator. Pentru facilitarea rezolvrii problemelor, n tabelele de la sfritul capitolului sunt sistematizate substanele toxice care produc anumite simptome majore, alturi de valorile normale ale semnelor vitale sau ale unor parametri hematologici.
Caz clinic 1: Fumul din incendii arde i....intoxic n timpul unei aciuni de salvare n cazul unui incendiu izbucnit ntr-un apartament, pompierii gsesc mai multe victime: 2 persoane cu arsuri extinse, o persoan cu arsuri pe mai puin de 10% din suprafaa corpului, dar care este n stare de incontien i colaps, i un mort fr arsuri aparente. Cele trei victime cu arsuri sunt transportate la spital, iar decedatul la Institutul de Medicin Legal. Victimele cu arsuri sunt tratate cu pansamente, analgezice, antibiotice, evoluia fiind favorabil dup o sptmn. Pacientul cu arsuri lejere este examinat n serviciul de urgene. Se pare c arsurile nu sunt responsabile de gravitatea tabloului clinic. Se presupune implicarea unui gaz, care fie c a lipsit din atmosfera inhalat (incendiul consum oxigenul), fie s-a acumulat ca urmare a obstruciei cilor aeriene (dioxidul de carbon), fie a fost inhalat dup eliberarea sa prin combustia substanelor ce conin carbon (monoxid de carbon) sau a altor materiale: ln, mtase, lemn, materiale plastice (acid cianhidric).
Diagnosticul clinic al intoxicaiilor: Studii de cazuri clinice 177
Se asigur cile respiratorii ale pacientului i se practic o fibroscopie bronic ce permite extracia secreiilor de mucus. Se recurge la ventilaie asistat sub oxigen pur. Rezultatele de laborator evideniaz: - absena unor tulburri hidro-electrolitice capabile s explice coma i colapsul - o oxicarbonemie prelevat la locul accidentului de 1 mmol/l (normal la nefumtori: < 0,15 mmoli/l - o lactatemie de 9 mmoli/l (normal < 2 mmoli/l) Probleme i discuii - Cum se explic la victimele incendiilor disocierea ntre caracterul discret al arsurilor i gravitatea simptomatologiei? - Pe baza simptomatologiei i a primelor analize de laborator, care este substana toxic implicat n acest caz? - Care este tratamentul specific recomandat n aceast intoxicaie? - Care se presupune c va fi rezultatul analizei toxicologice medico-legale efectuat pe sngele provenit de la decedat?
Caz clinic 2: Cltorie n zorii zilei Doamna D. pleac ntr-o diminea devreme, mpreun cu soul ei, ntr-o vizit la prinii acestuia, care locuiesc la distan de o zi cu maina. Dup 5 ore monotone parcurse pe autostrad, ea ncepe s se simt ru. Acuz lipotimie, nsoit de angoas intens, transpiraii, tremurturi i grea. Reuete totui s ajung la destinaie. Absena sa la cin ngrijoreaz anturajul. Soul i prinii acestuia observaser la sosire c nu se simte bine, dar nu dduser prea mult importan acestui fapt, deoarece doamna D. invocase cldura i oboseala drumului i declarase c dorete s se odihneasc puin n camera sa. Gsind camera goal, socrii o caut n jurul casei i cum nu o gsesc, alerteaz jandarmeria. Doamna D. este gsit pe strad cteva ore mai trziu. Ea este forte confuz, nu recunoate pe nimeni i este incoerent. Este spitalizat imediat, dar agitaia i confuzia se agraveaz. Vorbete de animale nfricotoare care vor s o atace i ncearc s fug din salon. Starea sa necesit imobilizare i un tratament cu sedative. Examenul de laborator relev: - sodiu: 152 mmol/l - potasiu: 3,1 mmol/l - ioni clorur: 107 mmol/l
bicarbonat: 16 mmol/l glicemie: 5,5 mmol/l alcoolemia: zero hematocritul: 48 n condiiile spitalului nu se poate realiza o electroencefalogram sau o tomografie, iar radiografia toracic este normal. Interogarea anturajului nu confirm existena unor antecedente neurologice sau psihiatrice. n zilele precedente, pacientei nu i s-a prescris nici un tratament medicamentos iar soul insist s menioneze c pacienta nu consum alcool. Examenul somatic nu aduce nici un element suplimentar de diagnostic, n principal sub aspect neurologic. Probleme i discuii - Care sunt intoxicaiile ce ar putea fi asociate cu aceast simptomatologie? - Care este ipoteza cea mai credibil de diagnostic? - Care este tratamentul recomandat i starea pacientei dup recuperare?
Caz clinic 3: Produse domestice periculoase Un brbat de 41 de ani, cu antecedente de depresie, este descoperit la domiciliu, la aproximativ 15 ore de la o ingestie voluntar de alcool ..... i benzodiazepine. Este internat n serviciul de urgene la o or dup ce a fost gsit, n com profund, nsoit de dispnee Kussmaul, hipotonie, hiporeflexie, pupile midriatice nereactive. Presiunea sanguin este 120/60 mm Hg, pulsul 85/min, temperatura 36,5C. La examenul fundului de ochi se observ un edem papilar hiperemic important. Electrocardiograma nu este modificat. Determinarea gazelor din snge evideniaz o acidoz metabolic profund. Lactacidemia este 2,2 mmoli/l, iar corpii cetonici sunt abseni. Examenul toxicologic relev o concentraie a metanolului n snge de 150 mg% i prezena benzodiazepinelor n snge i n urin. Pacientul decedeaz la puin timp de la internare. Probleme i discuii - Care este mecanismul ce explic toxicitatea metanolului? Care sunt factorii care dau nota de gravitate a acestei intoxicaii? - Care sunt factorii de prognostic defavorabil n cazul acestui pacient? - Care este tratamentul de baz al acestei intoxicaii?
178
Caz clinic 4 O femeie n vrst de 23 de ani, cntrind 45,8 kg, este implicat ntr-un accident de circulaie. Este arestat sub acuzaia de conducere n stare de ebrietate. La poliie i pierde cunotina i este transportat la spital. Dup ce i va reveni, va povesti urmtoarele: pe stomacul gol a consumat 780 ml butur alcoolic cu concentraia de 50% alcool (v/v) n interval de 2 ore. Accidentul a survenit imediat dup ce a prsit barul. Mai trziu a recunoscut c face abuz e alcool de la vrsta de 13 ani i c a fost externat dintr-un centru de reabilitare a alcoolicilor cu o sptmn nainte de accident. La sosirea n serviciul de urgen, pacienta s-a aflat n com de gradul 1, prezentnd rspuns la stimuli dureroi. Valorile examenului de laborator au fost normale sub aspectul pH-ului, electroliilor i glucozei. Screeningul toxicologic nu a evideniat o intoxicaie medicamentoas. Alcoolemia a fost de 780 mg%. S-a practicat spltur gastric, urmat de administrarea de crbune activat. Dup 2 ore alcoolemia a sczut la 730 mg% i a nceput s rspund la solicitri verbale. La 3 ore alcoolemia a fost de 420 mg%, iar dup 11 ore a fost externat cu o alcoolemie de 190 mg%. Probleme i discuii: - S se calculeze alcoolemia maxim pe care subiectul ar fi trebuit s o prezinte dup absorbia complet a dozei ingerate. Dac valoarea calculat nu corespunde cu alcoolemia determinat la internarea la urgen, s se explice diferenele aprute. - Lund n considerare valoarea alcoolemiei la internare, ar fi eficient hemodializa pentru reducerea concentraiei alcoolului? n acest caz este util hemodializa? - S se calculeze cantitatea de alcool ce ar fi trebuit s se elimine n 11 ore, s se determine nivelul teoretic al alcoolemiei la 11 ore i s se compare cu alcoolemia la externare. S se explice eventualele diferene. OBSERVATII Alcoolemia maxim dup absorbia complet a dozei ingerate se calculeaz cu formula lui Widmark: C = [A x 0,8 x 100] / [G x r] unde: C = alcoolemia (g%) 0,8 = densitatea specific a alcoolului G = greutatea corporal (g) r = raportul de distribuie a alcoolului (= 0,55 pentru femei)
A = cantitatea de alcool ingerat (100%) Viteza de dispariie a alcoolului din snge este de aproximativ 18 mg/100 ml/or.
Caz clinic 5 O femeie sntoas, bine hrnit, se plnge de o albea a imaginilor, ca i cum ar pi pe un cmp nzpezit. n seara anterioar prezentrii n clinica de urgene a consumat 60-90 ml dintr-o votc de 43% alcool i dou pahare de vin. Nu a sesizat nimic neobinuit n seara anterioar. A fost internat la urgen cu o respiraie neregulat, rapid (30 / minut), tensiune arterial 170 / 105 mmHg (n antecedente a avut tensiune labil) i puls 110 bti pe minut. Rezultatele analizei de laborator au fost: - [Na+] = 135 mmoli / l - [K+] = 4,7 mmoli / l - [Cl-] = 107 mmoli / l - [HCO3-] = 6 mmoli / l - pH ul sngelui = 7,21 - pCO2 (presiunea parial a CO2) = 11 mm Hg - pO2 (presiunea parial a O2) = 123 mm Hg Pe baza simptomatologiei s-a presupus existena unei intoxicaii cu metanol, iar examenul toxicologic a evideniat o concentraie a metanolului n snge de 140 mg / 100 ml. Tratamentul aplicat a constat din perfuzie cu etanol, bicarbonat de sodiu i hemodializ timp de 6 ore. Pacienta nu a acuzat alte tulburri n timpul dializei. Nivelele sanguine ale metanolului au sczut la zero la sfritul dializei, iar examenul oftalmologic a evideniat doar o uoar paloare a discului optic, n rest recuperarea fiind complet. Probleme i discuii - Care este sursa cea mai probabil de metanol? - Pacienta a prezentat lacun anionic normal sau crescut? - De ce nu s-a aplicat spltura gastric i nu s-a administrat crbune activat n acest caz? - Explicai apariia trzie a simptomelor intoxicaiei cu metanol (tulburrile vizuale) n acest caz. - De ce este recomandat hemodializa.
180
OBSERVATII Lacuna anionic este diferena ntre concentraia cationilor din ser (Na+ i K+) i suma concentraiilor anionilor de bicarbonat i de clor: (Na+ + K+) (HCO3- + Cl-) Valorile normale ale lacunei anionice sunt n jur de 10 mmoli /l (7-15 mmoli /l). Dac aceste valori sunt mai mari de 15 mmoli /l, acest fapt indic un exces de anioni (corpi cetonici, acid lactic), fapt sugestiv pentru o acidoz metabolic. n cazul intoxicaiilor cu alcool metilic i etilenglicol se observ o acidoz metabolic sever cu lacun anionic.
Caz clinic 6 Nou muncitori prsesc oraul Nouakchott din Mauritania ntr-o diminea de februarie, pentru a ajunge pe antierul aflat la o distan de 40 de km de ora. Deoarece ei nu au ajuns nc pe antier la ora dou dup mas, eful de antier trimite o echip n cutarea lor. Ei sunt regsii la jumtatea drumului, imobilizai n deert. Camionul, livrat din Germania cu o zi nainte, este intact, dar asupra muncitorilor pare s se fi abtut un cataclism. Salvatorii au regsit: 1 mort, 4 persoane comatoase, 3 n convulsii. Singurul dintre muncitori care a putut fi interogat, dei a prezentat semne de encefalopatie, a dat explicaii incoerente: era foarte cald, nu am avut nimic de but, a but tot ce se gsea acolo i nu a fost bine. Muncitorii sunt dui la spitalul din Nouakchott, unde se constat c toi prezint oligoanurie. La toi se observ acidoz metabolic intens (pH ntre 7,20 i 6,85), fr creterea lactailor i fr cetoacidoz. Ei nu prezint nici febr, nici deshidratare, nici tendin de colaps, n ciuda unor tulburri de ritm ventricular de tip hiperexcitabilitate, prezente la 2 pacieni. Cauza nu este deci cldura excesiv. Unul din subiecii comatoi i unul n stare convulsiv vor muri n timpul serii, nainte de a li se asista respiraia. Un altul, aflat n com calm, hipotonic, cu midriaz bilateral, va muri n timpul nopii, n ciuda ventilaiei asistate. Chiar dac nu s-a putut efectua o electroencefalogram, se poate presupune existena decerebrrii. Pentru ceilali pacieni, compania angajatoare a negociat transferul ntr-un spital parizian. Centrul antitoxic solicit laboratorului cercetarea prezenei substanelor toxice n snge i analiza sedimentului din urina adus mpreun cu pacienii. Supravieuitorii, toi cu anurie i acidoz, sunt supui n primul rnd epurrii extrarenale. n 48 de ore vor mai muri nc 2 pacieni, unul consecutiv decerebrrii, iar cellalt datorit unor tulburri paroxistice de ritm, fr anomalie hidroelectrolitic, evocnd deci o miocardit toxic.
Probleme i discuii - Pe baza simptomatologiei i a evoluiei intoxicaiei, care presupunei c sunt rezultatele examenului de laborator? - Care credei c a fost sursa substanei toxice implicat n aceast intoxicaie colectiv? - Comparai eficiena tratamentului prin antidotism comparativ cu tratamentul simptomatic n acest caz particular i apreciai dac decizia de a se aplica doar tratamentul simptomatic a fost cea corect.
Caz clinic 7: Pancreatite ciclice n momentul n care D-nul Z. este internat n secia de toxicologie a unui spital parizian, diagnosticul su a fost deja pus: este primul caz semnalat n Frana de sindrom al uleiului spaniol. n perioada n care se produce aceast intoxicaie, n pres sunt prezentate o serie de intoxicaii, semnalate n special n regiunea Madridului, n urma consumului unor uleiuri vndute la pre redus, care iniial fuseser destinate utilizrii industriale, fiind apoi renaturate. Istoricul D-lui Z. este curios. El este un muncitor de origine marocan, care triete n Frana de mai muli ani i nu are antecedente deosebite. Cu cteva luni n urm, el a nceput s acuze dureri abdominale violente, nsoite de stare de grea. Este examinat n serviciul de urgen al unei clinici de chirurgie, unde se constat urmtoarele: - cretere a amilazemiei la 300 U/l - cretere uoar a transaminazelor: TGO = 120 U/l, TGP = 132 U/l - uor edem al capului de pancreas observat la ecografie, care poate indica o pancreatit acut. Este reinut diagnosticul de pancreatit acut i D-nul Z este internat n clinica de chirurgie, fiind programat pentru operaie. Dou zile mai trziu, soia sa ajunge i ea n aceeai clinic, prezentnd simptome similare: dureri abdominale intense nsoite de o cretere a amilazemiei. n cazul ei, simptomele dispar destul de repede i ea prsete clinica n cteva zile, lsndu-i soul suferind sub observaie. Di pcate, vindecarea D-nei Z este de scurt durat, la puin timp dup ntoarcerea la domiciliu revenind durerile abdominale. n plus, fiul cel mare ntors din vacan acuz i el dureri abdominale violente. Probleme i discuii - Este aceast coinciden de simptomatologie compatibil cu diagnosticul de pancreatit?
182
- Aa cum s-a menionat, noul diagnostic evocat este cel de intoxicaie. De ce natur poate fi intoxicaia care a produs aceste fenomene? - La transferul n secia de toxicologie s-a presupus c este vorba despre sindromul uleiului spaniol, deoarece familia primise o sticl de ulei de la o rud venit din Maroc. Examenul specializat a infirmat aceast ipotez, pe de o parte datorit faptului c simptomatologia nu coincidea, iar pe de alt parte deoarece marca de ulei primit nu a fost niciodat implicat n producerea de fenomene toxice. n noua perspectiv, care este substana pe care medicii, pe baza simptomatologiei comune, o incrimineaz n producerea acestei intoxicaii? - Care este tratamentul specific recomandat pentru rezolvarea acestor cazuri de intoxicaie?
Caz clinic 8 O familie originar din Mali, locuiete ntr-un apartament de dou camere situat ntr-un imobil vechi din nordul Parisului. Tatl are dou soii i 5 copii. Micul Ali, n vrst de 5 ani, se simte sufocat n micul apartament, aa c n fiecare zi urc ntr-o locuin dezafectat unde se joac cu camarazii si, mai mari dect el. Acest copil, care este bine hrnit i normal, ncepe la un moment dat s vomeze, este somnolent i prezint dificulti la trezire. Prinii ngrijorai l duc la spital, unde se constat absena febrei i a unui sindrom meningeal sau traumatic. Sporadic, copilul mai acuz dureri abdominale. Examenele complementare deceleaz: - o anemie normocrom, normocitar - mici opaciti pe radiografia abdomenului fr pregtire, care sunt fr ndoial de origine digestiv - benzi radio-opace dense pe versantul metafizar al cartilajelor de conjugare ale tibiei i peroneului. Probleme i discuii - Care este diagnosticul ce poate fi reinut, pe baza simptomatologiei i a datelor de anamnez? - Cum poate fi confirmat acest diagnostic? - Care este tratamentul specific aplicat n aceast intoxicaie? - De ce micul Ali a fost singurul copil care a prezentat astfel de simptome?
Caz clinic 9 O femeie n vrst de 19 ani, cu un istoric de tulburri psihiatrice i cntrind 70 kg, a ingerat 200 tablete de Codenal (forma farmaceutic britanic), care au coninut n total 2,3 g codein baz i 1,7g fenobarbital. Ea este internat n secia de urgen cu com profund, pupile miotice i respiraie superficial. Pacientei i se administreaz intravenos dou doze de cte 0,4 mg naloxon, dup care ea prezint o mbuntire semnificativ a respiraiei i o uoar dilatare a pupilelor. Analiza coninutului gastric dup spltur a evideniat prezena unor cantiti mari de codein, dar nu s-a procedat la determinarea cantitativ a acesteia n snge sau urin. n continuare s-a administrat nalorfin n perfuzie, 0,7 g/kg/min., dar dup 36 de ore nu s-a constatat o mbuntire a statusului neurologic. Schimbarea antidotului s-a fcut deoarece spitalul nu a dispus de o cantitate suficient de naloxon. S-a ncercat hemodializa, care a fost continuat 6 ore, dar a fost lipsit de rezultat. Dup 5 zile s-a oprit perfuzia cu nalorfin, statusul respirator al pacientei rmnnd satisfctor. S-au observat semne ale lezrii cerebrale i femeia a decedat brusc, n timpul unei crize convulsive, la 10 zile de la internare. Probleme i discuii - Care sunt semnele intoxicaiei cu opioide observate n acest caz? - Necesitatea administrrii unor doze repetate sau continue de antagonist este corelat cu tipul de opioid implicat n producerea intoxicaiei? - Pacienta a ingerat o cantitate mare de codein. Care este cauza cea mai probabil a deprimrii respiratorii observate: codeina sau fenobarbitalul?
Caz clinic 10 O femeie de 28 de ani cntrind 48 de kg, aflat sub tratament de substituie cu metadon (80 mg metadon/zi), ajunge n secia de urgen n stare comatoas, dar cu capacitatea de a-i mica extremitile ca rspuns la stimuli dureroi. Ea afirm c a ingerat aproximativ 90 de tablete, fiecare coninnd 100 mg napsilat de propoxifen i 650 mg paracetamol. Pacienta a adormit, dar s-a trezit dup 10 ore i a vomat de 5 ori. Dup 9 ore nu a mai rspuns la stimuli verbali i a fost adus la urgen de persoanele din anturajul su. La internare s-au constatat urmtoarele: - presiune sanguin 100/70 mm Hg - puls 60/min
184
temperatur rectal 32C diametrul pupilelor 8 mm raluri pulmonare prezena n urin a propoxifenului, metadonei, fenobarbitalului, secobarbitalului, pentobarbitalului, metaqualonei i acidului salicilic. S-a administrat naloxon n bolus de 2,8 mg, fr s se observe un rspuns. S-a fcut spltur gastric cu crbune activat i apoi cu soluie de citrat de magneziu. S-a administrat acetilcistein la 24 de ore de la ingestia medicamentului, administrarea repetndu-se de 5 ori. La 36 de ore s-a iniiat hemodializa, care a continuat timp de 4 ore. Dup aceast perioad pacienta s-a trezit, prnd a fi orientat i a putut s urmeze instruciunile. Ea a fost externat dup dou sptmni de la internare, fr sechele hepatice sau cerebrale aparente. Medicul care a internat-o a afirmat c probabilitatea ca pacienta s fi absorbit ntreaga cantitate de substane ingerate este foarte mare, deoarece ea nu a vomat timp de 10 ore dup ingestie. De asemenea, nivelele serice de paracetamol i propoxifen au fost n concordan cu ingestia masiv care a fost recunoscut de pacient. Probleme i discuii - Pacienta a supravieuit n ciuda tuturor factorilor care prevedeau un prognostic negativ: doza, prezena barbituricilor, intervalul de 24 de ore pn la administrarea acetilcisteinei, lipsa de reacie la administrarea dozei de naloxon. Comentai influena acestor factori i explicai de ce pacienta a supravieuit. - Identificai manifestrile clinice induse de paracetamol i de propoxifen.
Caz clinic 11 Y. i I. sunt doi gemeni de 23 de ani, de origine israelian. Ei vin la Paris n luna iunie, pentru o durat de 8 zile. Cei doi tineri, solizi i n pantaloni scuri, sunt gzduii de un prieten care pleac pentru dou sptmni din localitate lsnd portresei, conform obiceiului, o dublur a cheii de la apartament. Dup trei zile n care nu aude nici o micare n apartament, portreasa se ngrijoreaz i se decide s utilizeze cheia de rezerv i s intre s vad ce s-a ntmplat. Ea i gsete pe cei doi tineri aezai pe fotolii, n stare de prostraie, epuizai i avnd la ndemn un vas n care au vomat. n apartamentul nchis se simte un miros greu de diaree. n buctrie nu sunt semne ale unei mese recente: nu sunt vase murdare, iar coul de gunoi este gol.
Gemenii nu vorbesc limba francez i nu pot s dea explicaii, iar portreasa negociaz spitalizarea lor cu medicul de la Serviciul de Ambulan, care constat prezena unor tulburri digestive difuze, o stare hemodinamic precar i deshidratare major, presupunnd existena unei intoxicaii alimentare. La examinarea n secia de urgen, se constat simetria acestei patologii colective: cei doi subieci prezint midriaz fix, sunt afebrili, incapabili s se in pe picioare, contieni dar epuizai; ei afirm c nu au dormit de la sosirea lor n Frana. Acuz dureri abdominale intense, cu scaune apoase i vomismente, care dureaz de trei zile. Mai spun c nu tolereaz nici un aport de alimente pe cale oral. Dei tulburrile digestive par s indice o intoxicaie alimentar, midriaza este un simptom discordant i poate orienta diagnosticul. Abdomenul este suplu i o radiografie fr pregtire elimin posibilitatea unei perforri sau a unei ocluzii. Fibroscopia gastric nu evideniaz nici un obstacol duodenal. Starea general a pacienilor este alterat, cu: - oligo-anurie - presiune arterial sistolic sub 100 mm Hg - pierdere n greutate de 4 kg - hemoconcentrare intens: proteinemide de 110 g la un pacient i 96 la cellalt, hipocloronatremie (75-124 i 80-128), hipokalemie (2 mmol/l) - pH-ul este aproape 7,4, pierderea de ioni H+ prin vomismente fiind compensat de pierderea de ioni HCO3- prin scaun Pacienii au electrocardiograma normal, ei nu sunt febrili, dar totui au frisoane i piloerecie cutanat. La examenul toxicologic nu s-a gsit nici un toxic cu tropism digestiv: nici colchicin, nici arsen, nici metale grele, iar consumul de ciuperci n luna iunie este puin probabil. S-a suspectat o intoxicaie alimentar de tip botulism, stafilococie sau salmoneloz, dar nici o ncercare de identificare nu a avut succes. Tratamentul aplicat a fost unul simptomatic i a constat din: aport de glucoz, lichide i electrolii prin perfuzii. n urma tratamentului a reaprut rapid diureza, s-a restabilit hemodinamica i au disprut tulburrile hidro-electrolitice. Au mai persistat nc 48 de ore midriaza i piloerecia cutanat. Probleme i discuii: - Care este diagnosticul pe care l evoc asocierea midriazei cu piloerecia cutanat? - Care a fost cauza ce a determinat starea patologic observat la cei doi tineri i care sunt simptomele caracteristice? - A fost tratamentul aplicat cel adecvat? S-ar mai fi putut recurge i la o alt intervenie terapeutic?
186
Caz clinic 12 Un brbat de 39 de ani, cunoscut drept alcoolic, este spitalizat cu o infecie submandibular consecutiv unei fracturi. La examenul de laborator efectuat la internare se constat urmtoarele: - activitatea seric a unor enzime: ASAT = 5640 U/l, ALAT = 354 U/l, LDH = 655 U/l, fosfataza alcalin = 385 U/l - parametri biochimici: bilirubina = 165 mg/dl (fa de valorile normale de 0,1-1,2 mg%) - timpul de protrombin = 21 sec. (fa de control: 10,6 sec.). Deoarece aceste valori nu au corespuns unui ficat alcoolic, pacientul a fost interogat, ncercndu-se s se identifice alte cauze. n final, el a admis c a ingerat cte 3,8 g paracetamol pe zi (n total 21 g) n urm cu o sptmn. Pacientului i s-a aplicat tratament prin hemoperfuzie, datorit encefalopatiei incipiente. n ziua a patra, valorile ASAT i ALAT au fost de 925, respectiv 647 U/l, bilirubina 35 mg/dl, iar timpul de protrombin de 16,1 sec. (fa de control 10,9 sec.). S-a decis ntreruperea hemoperfuziei, iar n urmtoarele zile starea pacientului s-a mbuntit, el fiind externat fr sechele. Probleme i discuii: - Pacientul a ingerat aproximativ 21 g paracetamol n interval de o sptmn, ceea ce nu reprezint n mod normal o doz toxic. Care este motivul pentru care s-a produs intoxicaie la aceast doz? - Revedei procedeul hemoperfuziei. Credei c hemodializa ar fi fost eficient? Argumentai opinia dumneavoastr.
Caz clinic 13: Intoxicaii cu salicilai la copii 13 a) Un bieel de 18 luni ce cntrete 10 kg este adus la spital cu urmtoarele simptome: febr, iritabilitate, hiperventilaie i hematemez. El a fost tratat n ultimele dou zile pentru o infecie a cilor respiratorii superioare. Prinii spun c i-au administrat doar cte o tablet de aspirin pentru copii la interval de 4-6 ore. Deoarece s-a suspectat totui o intoxicaie cu salicilai, s-a solicitat laboratorului determinarea nivelului salicilailor. Concentraia determinat a fost de 55 mg/dl, iar pacientul a fost transferat ntr-un centru medical mai mare, pentru investigaii suplimentare. La sosirea n noul spital, pacientul a fost letargic, dar treaz. Examenul fizic a evideniat semne de deshidratare moderat i o temperatur de 40,5C. Pulsul a fost
de 220 bti/min., presiunea sistolic de 90 mm Hg, frecvena respiratorie de 70/min, fa de valorile normale la copii de 80-160 bti pe min., 100-140 mm Hg i respectiv 20-50/min. Rezultatele examenului de laborator au fost urmtoarele: - Sodiul: 148 mEq/l - Potasiul: 7,2 mEq/l - Bicarbonatul: 11 mEq/l - Glucoza: 87 mg/dl - Azotul ureic: 158 mg/dl - Creatinina: 3,9 mg/dl - Leucocitele: 16000/mm3 - Timpul de protrombin: crescut - Presiunea parial a CO2: 20 mm Hg - pH: 7,34 - Nivelul sanguin al salicilatului: 168 mg/dl. Tratamentul a constat n creterea volumului circulant prin perfuzii cu ser fiziologic, glucoz i bicarbonat. La perfuzie s-au adugat 50 g/l albumin. S-a practicat de asemenea spltur gastric cu ser fiziologic coninnd crbune activat i sulfat de magneziu. S-a administrat oxigen, iar copilul a fost plasat sub ventilaie artificial. Datorit debutului insuficienei renale i a persistenei nivelurilor crescute de salicilai, s-a iniiat dializa peritoneal cu o soluie de Impresol 1,5%, ce conine 5% albumin. Dup 24 de ore, nivelul seric al salicilailor a sczut la 40 mg/dl, iar azotul ureic a fost redus la 34 mg/dl. Dup 48 de ore, nivelul salicilailor a fost doar de 4 mg/dl, iar funcia renal a fost mbuntit semnificativ. S-a decis ntreruperea dializei, iar biatul a continuat s prezinte semne de mbuntire a condiiei sale. Dup 12 ore de la ntreruperea dializei, pacientul a devenit hipotensiv i a nceput s prezinte semne de oc aseptic, nsoite de leucocitoz. S-a pus diagnosticul de cogulare intravascular diseminat, iar hemocultura a evideniat prezena E.coli. n ciuda administrrii de antibiotice i a altor msuri suplimentare de tratament, victima a decedat n ziua a patra de spitalizare. 13 b) Cu 12 ore nainte de internarea n serviciul de urgen, un biat de 5 ani, fr alte probleme de sntate, a acuzat dureri de stomac i a vomat. Mama copilului a observat c respiraia acestuia era rapid, dificil, iar micuul s-a plns de zgomote n urechi. Mama a gsit o cutie goal de aspirin pentru copii i a decis s duc biatul la spital. La internare pacientul a fost letargic, dar treaz. S-au observat semne de deshidratare, iar examenul fizic a relevat o temperatur rectal crescut (n jur de
188
40C), o presiune sanguin de 110/64 mm Hg, un puls de 120 bti/min i o frecven respiratorie de 45/min. Rezultatele examenului de laborator au fost urmtoarele: - concentraia seric a salicilatului: 61 mg/dl - glucoza: 160 mg/dl - presiunea parial a CO2: 25 mm Hg - pH-ul seric: 7,3 - concentraia bicarbonatului: 15 mEq/l - examenul urinei: pH = 5,3 i cetonurie Pacientul a supravieuit n urma aplicrii unui tratament de ntreinere. Probleme i discuii: - Comentai doza de aspirin pe care se presupune c a primit-o pacientul din cazul 1. Este probabil ca aceasta s reprezinte ntreaga cantitate de aspirin ingerat? Dac da, care sunt factorii care au condus la apariia complicaiilor i care au determinat creterea nivelului de salicilai? - Pacientului 1 i s-a administrat albumin n perfuzie. n ce scop? - Este posibil ca pacientul din cazul 2 s fi ingerat o cantitate mai mare de salicilai dect victima din cazul 1, dei nivelul seric a fost mai mic? Dac da, de ce? - A prezentat vreunul din pacieni acidoz metabolic? - Pacientul din cazul 1 a avut o glicemie normal, n timp ce la pacientul 2 s-a observat hiperglicemie. Cum se explic aceast diferen?
Tabel 6.1. Substane ce induc acidoze metabolice toxice Mecanisme I. Agresiune acid direct Inhibarea respiraiei celulare Necroz celular Metabolismul muscular lips de oxigen Substane toxice Acidifiani: Clorur de amoniu Clorhidrat de arginin Toxici ce produc hipoxie histotoxic: Cianuri Substane caustice: Acizi i baze tari Convulsivante: Izoniazid Amfetamine Stricnin Cloraloz Teofilin Salicilai Alcooli: Etilic Metilic Etilenglicol II. Pierdere de baze Digestiv Renal III. Eliminare insuficient a ionilor de H+ Substane toxice ce produc diaree Acetazolamida Toate insuficienele circulatorii toxice Insuficien renal acut toxic Tetracicline degradate Semne biologice complementare Hipercloremie
Hiperlactatemie Hipovolemie Hiperlactacidemie (anoxie celular) Hipokalemie Alcaloz respiratorie iniial Hiperlactacidemie Acidoz formic Creterea ac. oxalic urinar Hipokalemie Urin alcalin Hipoxie celular + suprimarea filtrrii glomerulare Acidoz tubular
190
Tabel 6.2. Substane ce induc hipoxii toxice Tablou clinic Substan toxic sau cauz Plmn normalHipoxemie Anestezice, opiacee, Paralizia centrului tranchilizante, respirator insecticide, stricnin Tabel 6.4. Convulsii Curara Paralizie muscular Organofosforice Deficit atmosferic de O2 Gaze sufocante, brom Exces de CO2 Concentraie excesiv de vapori nitroi, H2S, hidrocarburi n aer Obstrucia cilor Edem glotic Edem caustic al limbii, aeriene faringelui, laringelui (acizi i baze tari) Hipersecreie bronic Organofosforice Parasimpatomimetice Bronhospasm Halogeni Caustice volatile Plmn anormal Hipoxemie Perturbarea difuziei Edem pulmonar Inhalare de lichid gastric Fibroz pulmonar
Tratament
Ventilaie asistat
Ventilaie asistat Atropin, ventilaie asistat Reanimare cu aer pur
Eliberarea cilor aeriene
Ventilaie asistat Atropin Aleudrine aerosol Corticoizi injectabili
Caustice: clor, amoniac Opiu Suprainfecii Paraquat
Antibiotice, corticoterapie Oxigenoterapie
Tabel 6.2. Continuare Tablou clinic Anomalii circulatorii sau sanguine Prbuire tensional Hemoglobin inactiv Substan toxic sau cauz Colaps toxic Oxid de carbon Methemoglobinemie Tratament
Oxigenoterapie hiperbar Ventilaie asistat cu O2 pur, albastru de metilen, exsanguinotransfuzii n cazuri grave
Plmn normal Snge normal Cianuri Hipoxie tisular Fluoruri Hidrogen sulfurat
Kelocianor, hidroxicobalamin, ventilaie asistat cu O2
Tabel 6.3. Substane toxice i condiii ce determin bradicardii sinusale Cauze ale bradicardiilor sinusale Hipotermia < 35C Digitalicele Betablocantele Stabilizanii de membran Anticolinesterazicele: prostigmin, insecticide organofosforice, carbamice Clonidin (utilizat n tratamentul sindromului de abstinen la heroinomani)
192
Tabel 6.4. Substane toxice ce produc convulsii Tipul convulsiilor Clonii Toxici incriminai Derivai triciclici, antidepresive, hipocalcemiante Clorochin Bromur de metil Semne asociate Anomalii ale conducerii intraventriculare Idem Sindroame cerebelare i extrapiramidale
Mal convulsiv
Hiperexcitabilitate neuromuscular
Sruri de bismut Sevraj la barbiturice sau Abuz recent ntrerupt benzodiazepine Acidoz metabolic Izoniazid Acidoz metabolic + Etilenglicol anurie Stricnin Hipoglicemie Hipoglicemiante Hipersecreie bronic Cloraloz Diabet insipid Litiu Abuz recent ntrerupt Sindrom de sevraj Alcool Barbiturice Benzodiazepine
Tabel 6.5. Substane ce pot produce com calm Cauze toxice ale comei calme De obicei nsoit de bradipnee i mioz Morfina Codeina Codetilina Barbituricii cu aciune rapid Poate fi nsoit de bradipnee i mioz Benzodiazepine Ciclopirolone (zopiclon) i Imidazopiridine (zolpidem) Meprobamat Fenotiazine sedative Baclofen Cloralhidrat Bromuri hipnotice Alte miorelaxante: clorproetazin
194
Tabel 6.6. Alterarea nivelului de contien. Bolnavul este confuz sau delirant? Alterare funcional (psihiatric) Stabil Variabil Prezent Adesea nelinitit, halucinatorie, uneori doar bizar sau complex, n orice caz neadaptat la realitate Dac apar halucinaii, ele sunt auditive n general normal (exceptnd situaia tratamentelor anterioare cu neuroleptice, cnd pot s apar tremurturi, akatisie) Fr deprimare respiratorie Alterare organic (toxic, metabolic, neurologic) Fluctuant Inexistent sau de scurt durat Absent Puin accesibil sau intermitent, niciodat foarte elaborat
Nivelul de contien Atenia Orientarea Gndirea
Percepia Motricitatea
Dac apar halucinaii, ele sunt vizuale i tactile Agitaie Tresriri Tremurturi Fasciculaii Clonii sau convulsii focale sau generalizate
Tabel 6.7. Substane toxice ce pot produce halucinaii Substane incriminate n producerea de halucinaii Canabis Acid lisergic (LSD) Difenhidramin Alcool Hidantoine Amantadin Levodopa Amitriptilin Lophophora williamsi (cactus) Amfetamin Metilfenidat Atropin Morfin Baclofen Trihexifenidil Bismut (sruri) Unele ciuperci toxice Bromocriptin Orice anticolinergic Camfor
Tabel 6.8. Substane ce induc hipertermii toxice Etiologie Salicilai Amfetamine Atropinice Teofilin Cafein IMAO i triciclice Hormoni tiroidieni Nitroderivai ai fenolilor i crezolilor Sruri ale metalelor grele (staniu, nichel, plumb, cobalt, zinc) Fenotiazine i butirofenone Anestezice gazoase Unele curarizante Hipertonie persistent dup anoxie sau convulsii Complicaii infecioase sau tromboembolice Cocain i crack Semne asociate Hiperpnee Delir halucinator Tahicardie Hipokalemie-hiperglicemie-acidoz
Transpiraii de culoare galben ce pteaz lenjeria (Sindrom neuroleptic malign) (Hipertermie malign) Hipertonie-mioliz Hiperkalemie
196
Tabel 6.9. Hipokalemii de natur toxic Mecanismul de producere Captarea celular a potasiului Substane incriminate Perfuzii alcaline Beta-adrenergice Teofilin Clorochin (i ali stabilizani ai membranelor) Coca Corticoizi Diuretice Digitalin Emetice Antibiotice (neomicin) Metale (arsen, mercur) Ciuperci toxice Colchicin Fosfor Tricloretilen Sindrom de sevraj alcoolic
Pierdere renal de potasiu
Pierdere de potasiu prin vomismente Pierdere de potasiu prin diaree
Tabel 6.10. Valorile normale ale unor parametri sanguini Parametru Azotul ureic din snge Bicarbonat Bilirubina seric Total Direct Indirect Gazele din snge PH PCO2 PO2 Calciu Seric Total Cloruri Creatinin Glucoz Hemoglobin (snge total) Femei Brbai Lactat dehidrogenaza Fosfataza alcalin Potasiu Sodiu Transaminaze SGOT (ASAT) SGPT (ALAT) Valoarea normal 8-25 mg% (2,9-8,9 mM/l) 24-28 mEq/l (24-28 mmoli/l) 0,1-1,2 mg% 0,1-0,3 mg% 0,1-1,0 mg% 7,35-7,45 (arterial) 7,36-7,41 (venos) 35-45 mm Hg (arterial) 95-100 mm Hg (arterial) 8,5-10,5 mg% 4,2-5,2 mEq/l 95-106 mEq/l (95-106 mM/l) 0,8-1,2 mg% 65-110 mg% 12-16 g% 13,5-18 g% 110-259 UI/ml 5-13 uniti% (King-Armstrong) 3,5-5,0 mEq/l 136-145 mEq/l
198
Tabel 6.11.Valorile normale ale semnelor vitale Semnul vital Frecvena respiratorie Adult Copil Pulsul Adult Copil Presiunea sanguin Adult Sistolic Diastolic Copil Sistolic Diastolic Temperatura Valoarea normal 12-18 / min. 20-50 / min. 60-90 bti / min. 80-160 bti / min. 100-140 mm Hg 60-90 mm Hg 80 (+ 2 x vrsta n ani) 2/3 din cea sistolic 37C (36-37,4C)
Capitolul 6 NTREBRI I PROBLEME
ntrebri cu rspunsuri multiple 1. Ce informaii se pot obine dintr-un studiu de toxicitate acut: A) Nivelul care nu produce efect observat (NOEL) B) DL50 C) Indicele terapeutic D) Organele int ale aciunii toxice E) Toate cele de mai sus 2. Indicele terapeutic este raportul dintre: A) DT50 / DL50 B) DE50 /DL50 C) DL50 / DE50 D) DE50 /DT50 E) DL1/DE99 3. Dac se inhaleaz particule cu diametru de 20m, la ce nivel al sistemului respirator vor fi depozitate: A) alveole B) nas C) trahee D) bronhii E) bronhiole terminale 4. ntr-un studiu experimental, la animale se administreaz un compus volatil. Dup doze mici, compusul se elimin din organism pe cale renal sub form de metabolit. La doze mari, metabolismul este saturat. Dac acest compus este marcat radioactiv, ce credei c se observ dup administrarea unei doze mari: A) o scdere a radioactivitii aerului expirat B) o cretere a radioactivitii n urin C) o cretere a radioactivitii n fecale D) o cretere a radioactivitii att n urin ct i n aerul expirat E) o cretere a radioactivitii n aerul expirat n defavoarea urinei
ntrebri i probleme 201
5. Absorbia cror compui este facilitat de creterea pH-ului stomacal: A) baze organice slabe B) acizi tari C) acizi organici slabi D) baze tari E) nici una din substanele de mai sus 6. Coeficientul de partiie lipide /ap al unei substane este un indicator al: A) carcinogenitii B) unui timp de njumtire lung C) potenialului de bioacumulare D) unui volum aparent de distribuie mic E) toxicitii cronice 7. Metabolizarea unui compus exogen poate avea drept consecin: A) acumularea compusului n esuturi B) creterea excreiei urinare C) scderea toxicitii D) modificarea structurii chimice E) creterea toxicitii 8. Fenomenul de inducie enzimatic implic: A) o cretere a sintezei enzimei B) o cretere a activitii enzimei C) o cretere a greutii ficatului D) o modificare a specificitii de substrat a enzimei E) o cretere a fluxului biliar 9. Ce efecte pot produce asupra embrionului substanele care acioneaz n prima sptmn de sarcin, dup fertilizarea oului: A) moarte B) malformaii C) anomalii funcionale D) retardarea creterii E) sterilitate 10. O substan teratogen poate produce malformaii congenitale ca urmare a: A) expunerii masive a mamei nainte de fertilizare B) expunerii femelei n timpul organogenezei C) expunerii masculului n timpul spermatogenezei D) expunerii nou-nscutului prin intermediul laptelui
E) nici unul din rspunsurile de mai sus 11. Care din urmtoarele aspecte este cel mai important n determinarea nivelului de toxicitate al unei substane chimice: A) structura chimic B) doza C) metabolismul compusului D) excreia compusului E) detoxifierea metabolic a compusului Probleme Problema nr.1. Structura de mai jos este cea a unui medicament nou ipotetic, care este destinat administrrii orale. Artai schema de metabolizare previzibil. Menionai enzimele care catalizeaz reaciile de metabolizare prevzute.
CH2OCH2CH2OH
Problema nr.2. Compusul de mai jos este un potenial nou medicament. Care sunt metaboliii previzibili? Artai schema de metabolizare i enzimele implicate. Care sunt metaboliii care ar putea prezenta toxicitate?
O CH2COC2H5
NH2
Problema nr.3. Compusul de mai jos este un potenial rodenticid, la care se preconizeaz o expunere a roztoarelor prin intermediul alimentelor. Sugerai cile posibile de metabolizare i enzimele implicate. Indicai posibilii metabolii toxici ce s-ar putea forma.
202
H3C N
CH3 Cl
Cl OH
Problema nr.4. Monoxidul de carbon este un toxic responsabil de numeroase decese. Discutai mecanismul de aciune toxic i tratamentul intoxicaiei. Un mecanic auto expus ntr-un garaj la o concentraie n aer de 0,1% monoxid de carbon este expus unui risc? (Concentraia oxigenului n aer este 21%, iar constanta lui Haldane este 240.) Care sunt factorii care ar putea influena gravitatea intoxicaiei i deznodmntul acesteia? Problema nr.5. n tabelul de mai jos sunt prezentate efectele diferitelor tratamente combinate n intoxicaia cu cianur de potasiu la oareci. Interpretai aceste date i explicai mecanismele care stau la baza eficienei tratamentului. Descriei mecanismul aciunii toxice a cianurii. Tratament Experiment Oxigen NaNO2 Na2S2O3 EDTACo2 DL50 Nr. hiperbaric (g/kg) (g/kg) (mg/kg) (mg/kg) 11,8 0 0 0 1 1102 0 0 0 + 2 21,2 0 0 0,1 3 21,2 0 0 0,1 + 4 34,8 0 1,0 0 5 39,0 0 1,0 0 + 6 51,7 0 1,0 0,1 7 73,0 0 1,0 0,1 + 8 94,0 15,0 0 0 9 93,0 15,0 0 0 + 10 + i - indic prezena, respectiv absena oxigenului hiperbar oarecii au fost tratai cu nitrit de sodiu sau tiosulfat de sodiu nainte de administrarea cianurii de potasiu, sau cu EDTA dicobaltic, dup administrarea cianurii.
Problema nr.6. Substana de mai jos este un medicament hipotensiv potenial. Ea poate fi administrat oral sau prin plasture dermic, iar compusul printe este activ farmacologic. Care sunt cile metabolice previzibile pentru acest compus? Pot fi anticipai factori genetici care ar putea s influeneze metabolismul acestui compus? Dac da, este de presupus c aceti factori ar putea avea consecine farmacologice sau toxicologice? Este previzibil existena unor diferene de metabolism ntre cele dou ci posibile de administrare?
NO2
O H3COC NH
Problema nr.7. Compusul de mai jos a fost sintetizat n vederea utilizrii ca un nou colorant alimentar. ns, expunerea cronic a oarecilor la substana administrat n apa de but a condus la o cretere semnificativ a incidenei tumorilor pulmonare i a altor efecte toxice (vezi Tabel). Totui, la obolani nu s-a constatat o cretere a incidenei tumorilor pulmonare. Aceste efecte nu au fost observate la doze mai mici. Se estimeaz c ingestia la om ar fi de 1 g / kg / zi. innd cont de structura compusului, care sunt metaboliii ce presupunei c s-ar putea forma pe baza datelor prezentate; sugerai mecanisme posibile pentru efectele observate. Ce alte experimente ai recomanda pentru a v susine ipoteza? Din datele de mai sus, cum ai recomanda productorului s procedeze cu acest compus cu destinaie de colorant alimentar? Explicai poziia dumneavoastr.
204
NO2
N N Cl Cl Cl Cl
Cl Cl Cl Cl
Cl
Specie oarece oarece oarece (martor) obolan obolan (martor)
Doza (mg/kg/zi) 500 500 0 500 0
Calea de administrare Ap de but Injecie subcutan Ap de but -
Toxicitate Hemoliza eritrocitelor Nu a fost detectat Mrirea ficatului, fr hemoliz -
Incidena tumorilor 25% 19% 20% 12% 13%
ANEXA I Valori limit de expunere profesional pentru agenii chimici

Nr.c rt. Denumire Valoare limit mg/m3 aer Concentraia Concentraia medie maxim admis
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32.
Acetaldehida Acetat de etil Aceton Acetonitril Acid acetic Acid bromhidric Acid cianhidric Acid clorhidric Acid fluorhidric Acid formic Acid ortofosforic Acid oxalic Acid picric Acid sulfuric i anhidrid sulfuroas Alcool etilic Alcool metilic Aluminiu i oxizi (pulberi) Aluminiu i oxizi (fumuri) Amoniac Anhidrid acetic Anilin Arsen i compui anorganici 3-4 benzpiren (benz(a)piren) Benzen Benzidin Benzine (carburani) Bioxid de carbon Bioxid de sulf (anhidrid sulfuroas) Brom Cadmiu i compui (exprimai n Cd) Cianuri i cianogeni (exprimai n CN-) Clor
90 400 1200 70 25 0,30 8 1,50 9 1 1 0,1 0,50 1900 260 3 1 14 15 3 0,01 3,25 300 9000 5 0,7 0,05 0,50 -
180 500 6,7 1 15 2,50 2 1 9500 10 3 36 25 5 0,100 500 10 1 1
Anexa I 207
33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67.
Clorur de vinil Crom trivalent Cupru (fumuri) Cupru (pulberi) 2,4D (acid 2,4-diclor-fenoxiacetic) DDT (p,p-diclordifenil-tricloretan) Dieldrin (1,2,3,4,10,10hexaclor6,7epoxi-1,2,4a,5,6,7,8,8a,octahidro1,4,5,8,dimetano-naftalin) Dietilamina Difenilamina Dimetilamina Dinitrofenol 4,6-dinitro-o-crezol Eter etilic Etilenglicol Fenol Fluor Formaldehida Hexan (n) Hexaclorcilohexan (HCH, Lindan) Hidrocarburi alifatice (white spirit, solvent nfta, ligroina, petrol lampant, motorin) Hidrocarburi policiclice aromatice (fraciunea extractibil n benzen) Hirdogen arseniat Hidrogen sulfurat Iod Mercaptan (metil i etil) Mercur Mercur (compui organici) Metan Nichel i compui Nichel carbonil Nicotina Nitrobenzen Ozon Oxid de carbon Oxid de etilen
7,77 0,50 0,50 5 0,50 0,20 30 4 3,8 0,70 0,05 300 52 5 1,58 1,20 170 0,30 700 0,20 0,10 10 0,50 0,05 1200 0,10 0,05 0,5 5 0,10 20 1,80
0,20 1,50 10 1 0,25 6 9,4 1 0,20 800 104 3,16 3 0,50 1000 0,30 15 1 1 0,15 0,01 1500 0,50 0,10 0,20 30 -
68. Oxizi de azot (exprimai n NO2) 69. Oxid de cadmiu (fumuri) 70. Parathion (o,o-dietil-o-p-nitrofeniltiofosfat) 71. Plumb i compui (n afar de PbS) 72. Rezorcin (m-dihidroxi-benzen) 73. Stiren (monomer feniletilen) 74. Sulfur de carbon 75. Tetraclorur de carbon 76. Tetraetil i trietil plumb 77. Toluen 78. Trinitrotoluen (TNT) 79. Warfarin sau Cumaten (3--fenil-acetil-etil-4-hidroxicurarin)
5 0,05 0,05 0,05 10 50 10 30 0,01 100 0,50 0,10
8 0,10 0,15 0,10 15 150 20 50 0,03 200 1 0,30
Anexa II 209
ANEXA II Limite biologice tolerabile (LTB)

Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. Substana Acetona Alcool metilic Anilina Arsen i AsH3 Benzen Indicator biologic Acetona Metanol p-amino-fenol methemoglobina Arsen Acid S-fenilmercapturic Fenoli totali Sulfat index compui Cadmiu Proteine Tiocianai Fenol total Fluor Mercur COHb p-nitro-fenolul total Activitatea colinesterazic Activitatea colinesterazic Plumb Acidul -ALA Coproporfirine urinare Protoporfirine urinare 15. 16. Sulfura de carbon Toluen Acid 2-tio-tiazolidin 4 carboxilic Testul iodazida Acidul hipuric o-crezol Material biologic urin urin urin snge urin pr urin urin urin urin snge urin urin urin urin snge urin snge urin snge snge urin snge pr urin urin snge urin urin urin urin LBT propuse 50 mg/l 6 mg/l 10 g/l 1,5% Hb total 50 g/gC 0,5 mg/100g 25 g/gC 50 mg/l >0,8 mg/l 5 g/gC 5 g/l 2 mg/l 30 mg/l 50 mg/l 5 mg/gC 10 g/l 35 g/gC 5% Hb 500 g/l scdere >30% scdere >30% 150 g/l 40 g/100 ml 3 g/cm 10 mg/l 300 g/l 100g/100 ml eritrocite 4 mg/l E = 6,5 2 g/l 3 mg/l
6.
Cadmiu anorganici
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
Compuii cian (acid cianhidric, cianuri, cianogen) Fenol Fluor - compui Mercur i compui Oxid de carbon Parathion Pesticide organofosforice Plumb
ANEXA III Concentraii terapeutice, toxice sau letale ale unor substane toxice
Substana snge Acid acetilsalicilic Acetaminofen Amitriptilina Amfetamina Antidepresive triciclice Arsen Barbiturice: - aciune lung - aciune medie - aciune scurt Benzen Brom Cadmiu Cafeina Carboxihemoglobina Cianura Clordiazepoxid Normal/ Terapeutic Ser/ plasm 20-200 10-20 0,04-0,2 0,02-0,15 0,1-0,25 0-0,2 5-20 0,3-10 0,1-8 0-0,0006 0,0006 1-3,5% (nf) 5,8 (f) 0,02 (nf) 0,04 (f) 50 0-0,00036 2-10 0-0,0014 0-10 0,5-1,5 0,1 >10% (nf) >15% (f) 0,2 5,5 0,05 15 0,1-1 15 Concentraii n mg/l Toxice snge Ser/ plasm 150 400 0,3-0,5 0,2 0,5 0,6 (a) 0,01-0,5 (c) 0,05 10 20 10 Letale /Postmortem snge Ser/ urin plasm 500 500 1500 1,5 0,5 1 10
urin
urin
0,05-0,2 0,02-0,03
1-5
0,5-10 25
2 0,5
2,5 25-700
0-0,01
0,002-0,05
1-20 (a) 0,05-5 (c)
10 50 30 20 1 2 1 80 50% 1
0,2
1 5,6 25
80
0,004-0,1 0,4-2
0-0,03 (nf) 0,01-0,8 (f)
1 (a) 3 1
0,5 8
20
Cloroform Clorpromazina - la copii Cocaina Codeina DDT Diazepam Digitoxina Digoxina Dinitro-o-crezol Etanol Eter etilic Etilenglicol Fenciclidina Fenobarbital Flunitrazepam Fluor Glutetimida Haloperidol - la copii Hidrogen sulfurat Imipramina Izoniazida Levomepromazina
0,03-0,1 0,5
0,01-0,3 0,04-0,08 0-0,3 0,01-0,1 13 g/l 0,1-1 0,003-0,025 0-0,002
70-250 1 0-10 5-20 5 0,025-0,125
0,05-1 0,5 0,2 1,5-15 0,03 0,003 30-40 g/
390 3 1 1,6 10 0,005
3 1 1,8 20 0,03-0,1 0,005 75
1,2 35 50
25
1,5-30 0,9-1 g/l 0 0,01-0,2 10-25 0,001-0,015 0-0,5 0,2 0,0005-0,04 0,04 4-20 0,2-3
1.000
4.000 1,4-1,89 g/l 2.000 0,5 60 2 30-100
5.000
6-30
0,02 30
200500 0,1-0,8 15-30 0,05 0,5 10-80 0,05 0,010,05 0,3-1 20 0,4
300 0,4 0,3 50 2 1
600 5 40 17-300 7
10
0,04-0,15 0,2-10 0,005-0,15
400
1 65 8
0,92 2 50 0,4
10-50 470
Litiu LSD Meprobamat Mercur Metanol MDMA (Ecstasy) Morfina Nitrazepam Nortriptilina Oxazepam Paracetamol Paraquat Plumb Chinidin Chinin Stricnin Tioridazin Tiociani Toluen Tramadol trifluoperazin Warfarina
3-26 0,0017-0,01
4,2-8,3 0,3-1,4 mmol/l 0,001 5-15 0-0,004 0-1,5 0-0,3 0-0,1 0,03-0,1 0,05-0,2 0,1-1,4
0,001 25-100 0-0,007 0-2 0-17 0-0,5 0,2-5
0,2 200
0-0,1
10 1,5 mmol/l 0,002 10-25 0,3 100 0,5-6,5 (a) 0,1 0,2 0,2
0,002-0,03 0,3
14 2,5m mol/l 0,005 43 0,5 1.000 0,6 0,2 1 10 1500 1
34 3mEq/l 0,005 120 400 [0,42] 0,1 5 1 3 2
7mmol/ l 200 0,8
0,5
5 1-10 25-100
10-20
400 0,1 0,7 10 2 0,15-1 1-4 (nf) 3-12 (f) 1-4 (nf) 17 (f) 3 1 0,1-1 1-2
0,2
0,6
0,60,20
0,05-1,3 0,36
0,35 2-8
10-100 5-10
5-15 10 2 6-35
30 10 9-12 5 1,5-15 0-5 4
15 12 5 200 10 2 5
140 0,5-2
0-0,001
1-5
2-3
1-10
(a) = intoxicaie acut; (c) = intoxicaie cronic; (f) = nivel la fumtori; (nf) = nivel la nefumtori
ANEXA IV Valorile probit corespunztoare procentelor de letalitate

% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0,0 2,6737 2,9463 3,1192 3,2493 3,3551 3,4452 3,5242 3,5949 3,6592 3,7184 3,7735 3,8250 3,8736 3,9197 3,9636 4,0055 4,0458 4,0846 4,1221 4,1584 4,1936 4,2278 4,2612 4,2937 0,1 1,9098 2,7096 2,9665 3,1337 3,2608 3,3648 3,4536 3,5316 3,6016 3,6654 3,7241 3,7788 3,8300 3,8783 3,9242 3,9678 4,0096 4,0498 4,0884 4,1258 4,1619 4,1970 4,2312 4,2644 4,2969 0,2 2,1218 2,7429 2,9859 3,1478 3,2721 3,3742 3,4618 3,5389 3,6083 3,6715 3,7298 3,7840 3,8350 3,8830 3,9286 3,9721 4,0137 4,0537 4,0922 4,1295 4,1655 4,2005 4,2345 4,2677 4,3001 0,3 2,2522 3,7738 3,0046 3,1616 3,2831 3,3836 3,4699 3,5462 3,6148 3,6775 3,7354 3,7893 3,8399 3,8877 3,9331 3,9763 4,0178 4,0576 4,0960 4,1331 4,1690 4,2039 4,2379 4,2710 4,3033 0,4 2,3479 2,8027 3,0226 3,1750 3,2940 3,3928 3,4780 3,5534 3,6213 3,6835 3,7409 3,7945 3,8448 3,8923 3,9375 3,9806 4,0218 4,0615 4,0998 4,1367 4,1726 4,2074 4,2412 4,2743 4,3065 0,5 2,4242 2,8299 3,0400 3,1881 3,3046 3,4018 3,4859 3,5605 3,6278 3,6894 3,7464 3,7996 3,8497 3,8969 3,9419 3,9848 4,0259 4,0654 4,1035 4,1404 4,1761 4,2108 4,2446 4,2775 4,3097 0,6 2,4879 2,8556 3,0569 3,2009 3,3151 3,4107 3,4937 3,5675 3,6342 3,6953 3,7519 3,8048 3,8545 3,9015 3,9463 3,9890 4,0299 4,0693 4,1073 4,1440 4,1796 4,2142 4,2479 4,2808 4,3129 0,7 2,5427 2,8799 3,0732 3,2134 3,3253 3,4195 3,5015 3,5745 3,6405 3,7012 3,7574 3,8099 3,8593 3,9061 3,9506 3,9931 4,0339 4,0731 4,1110 4,1476 4,1831 4,2176 4,2512 4,2840 4,3160 0,8 2,5911 2,9031 3,0890 3,2256 3,3354 3,4282 3,5091 3,5813 3,6468 3,7070 3,7228 3,8150 3,8641 3,9107 3,9550 3,9973 4,0379 4,0770 4,1147 4,1512 4,1866 4,2210 4,2546 4,2872 4,3192 0,9 2,6344 2,9251 3,1043 3,2376 3,3454 3,4368 3,5167 3,5882 3,6531 3,7127 3,7681 3,8200 3,8689 3,9152 3,9593 4,0014 4,0419 4,0808 4,1184 4,1548 4,1901 4,2244 4,2579 4,2905 4,3224
% 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
0,0 4,3255 4,3567 4,3872 4,4172 4,4466 4,4756 4,5041 4,5323 4,5601 4,5875 4,6147 4,6415 4,6681 4,6945 4,7207 4,7467 4,7725 4,7981 4,8236 4,8490 4,8743 4,8996 4,9247 4,9498 4,9749
0,1 4,3287 4,3597 4,3902 4,4201 4,4495 4,4785 4,5070 4,5351 4,5628 4,5903 4,6174 4,6442 4,6708 4,6971 4,7233 4,7492 4,7750 4,8007 4,8262 4,8516 4,8769 4,9021 4,9272 4,7524 4,9774
0,2 4,3318 4,3628 4,3932 4,4231 4,4524 4,4813 4,5098 4,5379 4,5656 4,5930 4,6201 4,6469 4,6734 4,6998 4,7259 4,7518 4,7776 4,8032 4,8287 4,8541 4,8794 4,9046 4,9298 4,9549 4,9799
0,3 4,3349 4,3659 4,3962 4,4260 4,4554 4,4842 4,5126 4,5407 4,5684 4,5957 4,6228 4,6495 4,6761 4,7024 4,7285 4,7544 4,7808 4,8058 4,8313 4,8566 4,8819 4,9071 4,9323 4,9574 4,9825
0,4 4,3380 4,3689 4,3992 4,4290 4,4583 4,4871 4,5155 4,5435 4,5711 4,5984 4,6255 4,6522 4,6787 4,7050 4,7311 4,7570 4,7827 4,8083 4,8338 4,8592 4,8844 4,9096 4,9348 4,9599 4,9850
0,5 4,3412 4,3720 4,4022 4,4319 4,4612 4,4899 4,5183 4,5462 4,5739 4,6011 4,6281 4,6549 4,6814 4,7076 4,7337 4,7596 4,7853 4,8109 4,8363 4,8617 4,8870 4,9122 4,9373 4,9624 4,9875
0,6 4,3443 4,3750 4,4052 4,4349 4,4641 4,4928 4,5211 4,5490 4,5766 4,6039 4,6308 4,6575 4,6840 4,7107 4,7363 4,7622 4,7879 4,8134 4,8389 4,8642 4,8895 4,9147 4,9398 4,9649 4,9900
0,7 4,3474 4,3781 4,4082 4,4378 4,4670 4,4956 4,5239 4,5518 4,5793 4,6066 4,6335 4,6602 4,6866 4,7129 4,7389 4,7647 4,7904 4,8160 4,8414 4,8668 4,8920 4,9172 4,9423 4,9674 4,9925
0,8 4,3505 4,3811 4,4112 4,4408 4,4698 4,4985 4,5267 4,5546 4,5221 4,6093 4,6362 4,6628 4,6893 4,7155 4,7415 4,7673 4,7930 4,8185 4,8440 4,8693 4,8945 4,9197 4,9448 4,9699 4,9950
0,9 4,3536 4,3842 4,4142 4,4437 4,4727 4,5013 4,5295 4,5573 4,5848 4,6120 4,6389 4,6655 4,6919 4,7181 4,7441 4,7699 4,7955 4,8211 4,8465 4,8718 4,8970 4,9222 4,9473 4,9724 4,9975
% 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74
0,0 5,0000 5,0251 5,0502 5,0753 5,1004 5,1257 5,1510 5,1764 5,2019 5,2275 5,2533 5,2793 5,3055 5,3319 5,3585 5,3853 5,4125 5,4399 5,4677 5,4959 5,5244 5,5534 5,5828 5,6128 5,6433
0,1 5,0025 5,0276 5,0527 5,0778 5,1030 5,1282 5,1535 5,1789 5,2045 5,2301 5,2559 5,2819 5,3081 5,3345 5,3611 5,3880 5,4152 5,4427 5,4705 5,4987 5,5273 5,5563 5,5858 5,6158 5,6464
0,2 5,0050 5,0301 5,0552 5,0803 5,1055 5,1307 5,1560 5,1815 5,2070 5,2327 5,2585 5,2845 5,3107 5,3372 5,3638 5,3907 5,4179 5,4454 5,4733 5,5015 5,5302 5,5592 5,5888 5,6189 5,6495
0,3 5,0075 5,0326 5,0577 5,0828 5,1080 5,1332 5,1586 5,1840 5,2096 5,2353 5,2611 5,2871 5,3134 5,3398 5,3665 5,3934 5,4207 5,4482 5,4761 5,5041 5,5330 5,5622 5,5918 5,6219 5,6526
0,4 5,0100 5,0351 5,0602 5,0853 5,1105 5,1358 5,1611 5,1866 5,2121 5,2378 5,2631 5,2898 5,3160 5,3425 5,3692 5,3961 5,4234 5,4510 5,4789 5,5072 5,5359 5,5651 5,5948 5,6250 5,6557
0,5 5,0125 5,0376 5,0627 5,0878 5,1130 5,1383 5,1637 5,1891 5,2147 5,2404 5,2666 5,2924 5,3186 5,3451 5,3719 5,3989 5,4261 5,4538 5,4817 5,5101 5,5388 5,5681 5,5970 5,6280 5,6588
0,6 5,0150 5,0401 5,0652 5,0904 5,1156 5,1408 5,1662 5,1917 5,2173 5,2430 5,2689 5,2950 5,3213 5,3478 5,3745 5,4016 5,4289 5,4565 5,4845 5,5129 5,5417 5,5710 5,6008 5,6311 5,6620
0,7 5,0175 5,0426 5,0677 5,0929 5,1181 5,1434 5,1689 5,1942 5,2198 5,2456 5,2715 5,2976 5,3239 5,3505 5,3772 5,4043 5,4316 5,4693 5,4874 5,5158 5,5446 5,5740 5,6038 5,6341 5,6651
0,8 5,0201 5,0451 5,0702 5,0954 5,1206 5,1459 5,1713 5,1968 5,2224 5,2482 5,2741 5,3002 5,3266 5,3531 5,3799 5,4070 5,4344 5,4621 5,4902 5,5187 5,5476 5,5769 5,6068 5,6372 5,6682
0,9 5,0226 5,0476 5,0728 5,0979 5,1231 5,1484 5,1738 5,1993 5,2250 5,2508 5,2767 5,3029 5,3292 5,3558 5,3826 5,4097 5,4372 5,4649 5,4930 5,5215 5,5505 5,5799 5,6098 5,6403 5,6713
% 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
0,0 5,6745 5,7063 5,7388 5,7722 5,8064 5,8416 5,8779 5,9154 5,9542 5,9945 6,0364 6,0803 6,1264 6,1750 6,2265 6,2816 6,3408 6,4051 6,4758 6,5548 6,6449 6,7507 6,8808 7,0537 7,3263
0,1 5,6776 5,7095 5,7421 5,7756 5,8099 5,8452 5,8816 5,9192 5,9581 5,9986 6,0407 6,0848 6,1311 6,1800 6,2319 6,2873 6,3469 6,4118 6,4833 6,5632 6,6546 6,7624 6,8957 7,0749 7,3656
0,2 5,6808 5,7128 5,7454 5,7790 5,8134 5,9488 5,8853 5,9230 5,9621 6,0027 6,0450 6,0893 6,1359 6,1850 6,2372 6,2930 6,3532 6,4187 6,4909 6,5718 6,6646 6,7748 6,9110 7,0969 7,4087
0,3 5,6840 5,7160 5,7488 5,7824 5,8169 5,8524 5,8890 5,9269 5,9661 6,0069 6,0494 6,0939 6,1407 6,1901 6,2426 6,2988 6,3595 6,4255 6,4985 6,5805 6,6747 6,7866 6,9268 7,1201 7,4571
0,4 5,6871 5,7192 5,7521 5,7858 5,8204 5,8560 5,8927 5,9307 5,9701 6,0110 6,0537 6,0985 6,1455 6,1952 6,2481 6,3047 6,3658 6,4325 6,5063 6,5893 6,6849 6,7991 6,9443 7,1444 7,5120
0,5 5,6903 5,7225 5,7554 5,7892 5,8239 5,8596 5,8965 5,9346 5,9741 6,0152 6,0581 6,1031 6,1503 6,2004 6,2536 6,3106 6,3722 6,4395 6,5141 6,5982 6,6954 6,8119 6,9600 7,1701 7,5758
0,6 5,6935 5,7257 5,7588 5,7926 5,8274 5,8633 5,9002 5,9385 5,9782 6,0194 6,0625 6,1077 6,1552 6,2055 6,2591 6,3165 6,3787 6,4466 6,5220 6,6072 6,7060 6,8250 6,9774 7,1973 7,6520
0,7 5,6967 5,7290 5,7621 5,7961 5,8310 5,8669 5,9040 5,9424 5,9822 6,0237 6,0669 6,1123 6,1601 6,2107 6,2646 6,3225 6,3852 6,4538 6,5301 6,6164 6,7169 6,8384 6,9954 7,2262 7,7478
0,8 5,6999 5,7323 5,7655 5,7995 5,8345 5,8705 5,9078 5,9463 5,9863 6,0279 6,0714 6,1170 6,1650 6,2160 6,2702 6,3285 6,3917 6,4611 6,5382 6,6258 6,7279 6,8522 7,0141 7,2571 7,8782
0,9 5,7031 5,7356 5,7688 5,8030 5,8381 5,8742 5,9116 5,9502 5,9904 6,0322 6,0758 6,1217 6,1700 6,2212 6,2759 6,3346 6,3984 6,4684 6,5464 6,6352 6,7392 6,8663 7,0335 7,2904 8,0902
Anexa V 217
ANEXA V Reactivi speciali Reactiv azotat mercuros: se dizolv 1 g azotat mercuros n 100 ml ap distilat i se adaug acid azotic concentrat pn cnd soluia devine limpede. Reactiv Bertrand: acid silicowolframic 5% n ap distilat. Reactiv Bouchardat: se dizolv 2 g iodur de potasiu n 10 ml ap distilat, se adaug 2 g iod i dup dizolvare se completeaz cu ap la 100 ml. Reactiv Caseneuve: soluie saturat de difenilcarbazid n benzen, alcool sau eter. Reactiv Cheramy: 1g iodur de potasiu i 0,25 g clorhidrat de chinin se dizolv n 100 ml ap distilat. Reactiv chinhidron: preparat extemporaneu din 1 ml p-benzochinon, 0,03 i 4 ml acid fosforic concentrat. Reactiv Donath: 1 g arseniat monopotasic se dizolv n 100 ml acid sulfuric concentrat. Reactiv Dragendorf: peste o suspensie de 5 g carbonat de bismut n 50 ml ap distilat se adaug 10 ml acid clorhidric concentrat i iodur de potasiu dizolvat n 40 ml ap. Dup 24 ore precipitatul eventual format se separ prin filtrare. Reactiv Erdman: 1 ml acid azotic concentrat, 20 ml ap. 80 ml acid sulfuric concentrat. Reactiv Forest: se amestec 25 ml soluie apoas de dicromat de potasiu (2 g/l) cu 25 ml acid sulfuric diluat (300 ml/l), 25 ml soluie apoas de acid percloric (200 g/kg) i 25 ml acid azotic diluat (500 ml/l). Reactiv FNP: 5 ml soluie apoas de clorur feric (50 g/l) se amestec cu 45 ml soluie apoas de acid percloric (200 g/kg) i 50 ml acid azotic diluat (500 ml/l). Reactiv Folin-Cioclteu: ntr-un balon de 250 ml prevzut cu refrigerent ascendent cu reflux, se dizolv n 70 ml ap, 10 g wolframat de sodiu, Na2WO4.2H2O p.a. i 2,5 g molibdat de sodiu, Na2MoO4 p.a. Se adaug 25 ml acid fosforic 85% p.a. i 50 ml acid clorhidric concentrat (d = 1,19). Se monteaz refrigerentul ascendent la balon i se fierbe la reflux timp de 10 ore. Se deconecteaz refrigerentul, se adaug 15 g sulfat de litiu, Li2SO4 p.a., 5 ml ap, 2 picturi de brom i se continu fierberea, deschis, fr refrigerent, timp de 15 minute, pentru ndeprtarea excesului de brom. Se las s se rceasc i se completeaz cu ap distilat la 100 ml. Soluia obinut se filtreaz. Culoarea reactivului trebuie s fie galben-aurie. Se conserv n sticle brune, bine nchise, timp de mai multe luni. Dac n timp soluia capt o tent verzuie, se trateaz din nou cu brom. La ntrebuinare, soluia astfel preparat se dilueaz cu un volum egal de ap distilat.
Reactiv Frhde: 0,1-1 g molibdat de amoniu se dizolv n 100 ml acid sulfuric concentrat. Reactiv Griess I: 0,5 g acid sulfanilic n 150 ml acid acetic 15%. Reactiv Griess II: 0,1 g -naftilamina se dizolv la uoar nclzire n 150 ml acid acetic 15%. Reactiv hipobromit de sodiu: se dizolv 0,5 ml brom, cu precauie i rcind continuu, n 5 ml soluie de hidroxid de sodiu 400 g/l. Reactiv Ioanid: 2 g sulfat de cupru amoniacal se trateaz cu 40 ml amoniac 1% i 2 ml piridin. Reactiv iodoplatinat acidulat: se dizolv 0,25 g clorur de platin, 5 g iodur de potasiu i 5 ml acid clorhidric concentrat n 100 ml ap distilat). Reactiv Lafon: 5 g selenit de amoniu n 100 ml acid clorhidric concentrat. Reactiv Libermann: nitrit de potasiu 5% n acid sulfuric concentrat. Reactiv Mandelin: se suspend 1 g vanadat de amoniu fin pulverizat n 100 ml acid sulfuric concentrat; se agit bine nainte de utilizare. Reactiv Marquis: 1 ml formol 40%, 30 ml acid sulfuric concentrat (se prepar nainte de ntrebuinare). Reactiv Marm: se dizolv 2 g iodur de potasiu i 1 g iodur de cadmiu n 100 ml ap distilat. Reactiv Mayer: peste 20 ml soluie de iodur de potasiu 5% se adaug 50 ml soluie fierbinte de clorur de mercur (II) 10%. Dup rcire se filtreaz i se completeaz cu ap distilat la 100 ml. Reactiv Mecke: 0,5 g de selenit de sodiu se dizolv n 100 ml acid sulfuric concentrat. Reactiv Sonnenschein: se dizolv 10 g fosfomolibdat de amoniu n puin ap distilat i se adaug 0,25 ml acid azotic concentrat, apoi se completeaz cu ap distilat la 100 ml. Reactiv Schiff: 0,2 g fuxin bazic se dizolv n 140 ml ap distilat i se rcete pe ghea. Se adaug 5 ml sulfit de sodiu, 5 ml acid clorhidric (250g/l) sub agitare i se completeaz cu ap la 200 ml. Dac soluia este colorat, aceasta se decoloreaz cu crbune activ. Se ine la ntuneric 12 ore nainte de utilizare. Reactiv Tollens: la 10 ml azotat de argint 5% se adaug amoniac concentrat pn la dizolvarea precipitatului format. Reactiv Trinder: 40 g clorur mercuric dizolvat n 850ml ap + 120 ml acid clorhidric1M + 40 g azotat de fier (III) dizolvat n 1l ap. Reactiv Zwiker: 4 ml sulfat de cupru 10% se trateaz cu un amestec format din 1 ml piridin i 5 ml ap distilat. Reactiv Wasicky: 2 g p-dimetilaminobenzaldehid, 6 g acid sulfuric concentrat i 0,4 ml ap distilat. Rozanilin: soluia mam se obine prin macerarea la rece, timp de 48 de ore, a urmtorului amestec: 500 mg para-rozanilin (fucsin bazic) n 100 ml ap
Anexa V 219
distilat, urmat de filtrare. Se lucreaz cu o soluie diluat astfel: 2ml soluie mam + 5ml acid clorhidric concentrat + ap distilat ad 100ml. Soluie apoas de hipobromit de sodiu: se amestec 3 ml ap de brom saturat cu 20 ml soluie de carbonat de sodiu (2,2 g carbonat de sodiu anh. la 20 ml ap). Tampon borat pH 8,4: se dizolv 22,4 tetraborat de sodiu n 76 ml acid clorhidric 1M i se completeaz la 2l cu ap distilat. Tetracloromercuriat de sodiu (toxic): 0,50 g HgCl2 + 0,20 g NaCl + ap distilat ad 1000 ml. Amestec de sulfat de sodiu i crbune activat: se adaug 100 mg crbune activat la 100 g sulfat de sodiu anhidru, se amestec i se nclzete ntr-o capsul la 100C timp de 8 ore. Se rcete i se conserv ntr-un recipient nchis ermetic.
RASPUNSURI LA NTREBRI I PROBLEME ntrebri 1. Corect: E) toate cele de mai sus 2. Corect: C) DL50 / DE50 3. Corect: D) bronhii 4. Corect: E) o cretere a radioactivitii n aerul expirat n defavoarea urinei 5. Corect: C) acizi organici slabi 6. Corect: C) potenialului de bioacumulare 7. Corect: D) modificarea structurii chimice 8. Corect: A) o cretere a sintezei enzimei 9. Corect: A) moarte 10. Corect: B) expunerii femelei n timpul organogenezei Probleme 1. Cile metabolice prevzute sunt prezentate n Fig. 1, iar enzimele implicate sunt: (a) citocromul P450; (b) glucuronoziltransferaza sau sulfotransferaza; (c) alcool dehidrogenaza; (d) aldehid dehidrogenaza; (e) epoxid hidrolaza; (f) glutation-S-transferaza; (g) acil CoA transferaza i ligaza sau glucuronoziltransferaza; (h) -glutamiltransferaza; (i) glicinaza; (j) acetiltransferaza. 2. Posibilele ci metabolice ale compusului 2 sunt prezentate n Fig.2. Gruparea aminic ar putea fi hidroxilat cu formarea iniial a unei hidroxilamine (reacia h), care are potenial toxic, i apoi, n urma oxidrii chimice, a unui compus nitrozo. Aceti compui sunt hematotoxici, afectnd n principal hematiile. Enzimele implicate n aceste reacii sunt: (a) citocrom P450; (b) epoxid hidrolaza; (c) glutation-S-transferaza; (d) -glutamiltransferaza; (e) glicinaza; (f) acetiltransferaza; (g) Nacetiltransferaza; (h) citocrom P450; (f) glucuronoziltransferaza; (j) se poate produce dehidratarea la un pH acid al urinei; (k) esteraz; (l) glucuronoziltransferaz sau acil CoA transferaz i ligaz; (m) alcool dehidrogenaz; (n) aldehiddehidrogenaz. 3. Posibilele ci de metabolizare ale potenialului rodenticid sunt prezentate n Fig.3. Demetilarea aminei substituite va conduce la o amin primar care poate fi hidroxilat, rezultnd un metabolit cu potenial toxic. Nucleul aromatic poate fi oxidat cu formarea unui epoxid care este reactiv i deci toxic. Acest fapt este potenat de prezena celor doi atomi de halogen. Enzimele implicate n aceste transformri sunt: (a) citocrom P450; (b) rearanjare chimic; (c) gluation-S-transferaza; (d) -glutamiltransferaza; (e) glicinaza; (f) acetiltransferaza; (g) Nacetiltransferaza; (h) glucuronoziltransferaza sau sulfotransferaza; (i) epoxid hidrolaza; (j) dehidratarea la un pH acid al urinei; (k) reacii de oxido-reducere reversibile (ne-enzimatice).
Rspunsuri la ntrebri i probleme 221
CH2OCH2CH2OH CH2OR1 (a) (b) (a) (b) CH2OH (c)
CH2OCH2CH2
OR1
CH2OCH2CH2OH O HO (e) CH2OCH2CH2OH
OHCCH2OH (c) (d) (c) CHO COOH COOH CH2OCH2CHO (d) COOH (d) CH2OCH2COOH (g) CO OR (g) CH2COCH2CO R HO (h) (f) GS HO GSH CH2OCH2CH2OH
Glu (i) Gly (j) Conjugat N-acetilcisteina CH2OCH2CH2OH
HO (b) CH2OCH2CH2OH
R1O
Figura 1. Cile metabolice posibile ale compusului 1 (GSH = glutation, R = acid glucuronic sau glicin, R1 = acid glucuronic sau sulfat)
221

O CH2COC2H5 OH O NHCOCH3 (b) CH2COC2H5 (k) O CH2COH O CH2COC2H5
OH NH2
O CH2COC2H5 (a)
C2H5OH CH3CHO CH3COOH
O CH2COC2H5 OH GSH NH2 O CH2COC2H5 OH NH2 (c) O
NH2 (h) O CH2COC2H5
NH2 (l) O CH2COR1
NHOH (i) O CH2COC2H5
NH2
O CH2COC2H5
SG NH2 Glu Gly
(d) (e) O CH2COC2H5 OH NH2 SCH2CHCOOH NH2 (f)
HNOR NH2
NHCOCH3 SCH2CHCOOH
O CH2COC2H5 OH
(j)
NHCOCH3 SCH2CHCOOH NH2
Fig.2. Cile posibile de metabolizare a compusului 2 (GSH = glutation, R = acid glucuronic, R1 = acid glucuronic sau glicin)
Rspunsuri la ntrebri i probleme 223

NHCH3 Cl H3C N CH3 Cl (a) Cl OH GSH (c) N(CH3)2 Cl OH (a) NHOH Cl (a) NH2 Cl (g) Cl OH Cl NHCOCH3 Cl
Cl OH (a) N(CH3)2 Cl O Cl GSH OH (c) N(CH3)2 HO Cl (i)
*
SG OH (b) HO OH Cl (k) NO Cl
N(CH3)2 Cl
Cl OH N(CH3)2 HO Cl HO (h) N(CH3)2 Cl OH
Cl
GS OH (d) (e) Glicina
Cl
Glutamat
HO OH
Cl OR N(CH3)2 HO Cl (j) NHCOCH3 CHCH2S COOH Cl NHCOCH3 CHCH2S COOH HO
Cl
N(CH3)2 HO NH2 CHCH2S COOH Cl Cl (f)
N(CH3)2 Cl
Cl
Figura 3. Cile posibile de metabolizare a compusului 3 (*Conjugatul cu glutation va fi metabolizat n continuare conform cilor (d), (e), (f), (j). R = acid glucuronic sau sulfat)
223
224 Analize i evaluri toxicologice 4. Principala aciune a monoxidului de carbon const n legarea acestuia de hemoglobin, care nu mai este disponibil pentru transportul oxigenului. Hemoglobina poate lega patru molecule de oxigen sau de monoxid de carbon, dar afinitatea sa pentru monoxidul de carbon este mai mare; carboxihemoglobina complet saturat nu mai poate transporta oxigenul. Legarea monoxidului de carbon induce i o modificare alosteric a hemoglobinei, care modific curba de disociere a oxihemoglobinei, astfel nct oxigenul legat de aceeai molecul de hemoglobin este eliberat mai greu. Haldane a descris reacia oxigenului i a monoxidului de carbon cu hemoglobina prin ecuaia: ([COHb] / [HbO2]) = M ([pCO] / [pO2]) unde M = constanta lui Haldane, care are valoarea n jur de 240. Pentru a calcula riscul la care este expus mecanicul auto n garaj se poate utiliza ecuaia lui Haldane. Presiunea parial a gazelor poate fi echivalat cu concentraia lor. Valorile acestora sunt deci 0,1 pentru monoxidul de carbon i 21 pentru oxigen. Din ecuaie se poate calcula raportul ntre carboxihemoglobin i oxihemoglobin, care este: 240 x (0,1 / 21), adic n jur de 1,1 sau mai mult de 50% carboxihemoglobin. O concentraie de carboxihemoglobin de 40-50% este apropiat de valorile letale, deci mecanicul este expus unui risc real. Riscul ar fi mai mare dac mecanicul ar lucra doar ntr-un spaiu nchis, fr surs de aer proaspt i dac nu s-ar deplasa i n mediul exterior nepoluat. Riscul este crescut i la persoanele care fac un efort fizic, deci au o frecven respiratorie crescut, precum i la anemici, la care capacitatea sngelui de a transporta oxigenul este deja diminuat. 5. Din datele prezentate n problem se observ c doza letal a cianurii la oareci este n jur de 11 mg/kg. Aceast doz nu este influenat de administrarea oxigenului hiperbar, dar este afectat de administrarea nitritului de sodiu, cnd toxicitatea cianurii este redus aproape la jumtate (DL50 mai mare). Nici n aceast variant oxigenul hiperbar nu are nici un efect. n cazul administrrii tiosulfatului de sodiu, toxicitatea este redus la aproape o treime, iar oxigenul hiperbar poate scdea puin mai mult aceast toxicitate (DL50 34 fa de 39). Atunci cnd la oareci se administreaz att tiosulfat de sodiu ct i nitrit de sodiu, scderea letalitii este mai mare dect n fiecare din cazuri luate separat, dar este aproximativ aditiv (DL50 21+ 35, fa de 52). Totui, oxigenul hiperbar scade i mai mult toxicitatea. Se pare c oxigenul hiperbar crete eficiena tiosulfatului de sodiu, atunci cnd este administrat singur, sau n combinaie cu nitritul de sodiu. Mecanismul care explic acest fapt nu este pe deplin cunoscut i este dificil de explicat, deoarece ionul cianur blocheaz lanul de transport al electronilor i ntrerupe astfel utilizarea oxigenului. De aceea, oxigenul ar trebui s nu aib efect asupra toxicitii. Efectul aparent ar trebui s fie corelat cu mecanismul de aciune al tiosulfatului de sodiu, care contribuie la detoxifierea cianurii prin conversia sa, sub aciunea enzimei rodanaza, la tiocianat, uor excretabil prin urin. Efectul aditiv al nitritului de sodiu i al tiosulfatului de sodiu este consecina faptului c cele dou antidoturi acioneaz prin mecanisme diferite. Nitritul de sodiu convertete hemoglobina n methemoglobin, capabil s lege uor cianura, formnd cianmethemoglobin. Cianura are afinitate mai mare fa de methemoglobin dect fa de citocromoxidaza din lanul de transport al electronilor, n prezena methemoglobinei fiind reluat funcia mitocondrial. Cianura trebuie totui s fie eliminat, iar n plus concentraia de methemoglobin care poate fi tolerat este limitat. Tiosulfatul de sodiu favorizeaz conversia cianurii la tiocianat mai puin toxic i mai uor eliminabil, iar oxigenul hiperbar poate interveni n aceast reacie sau n procesul total.
Rspunsuri la ntrebri i probleme 225 EDTA-ul dicobaltic este antidotul cel mai eficient. El acioneaz ca un agent chelatant, legnd cianura liber din snge, cu formarea unui complex ce poate fi eliminat renal. Pe msur ce concentraia din esuturi scade, cianura difuzeaz din mitocondrii, elibernd citocrom oxidaza. 6. Dup administrare oral, medicamentul ar putea fi redus de nitroreductazele bacteriene din intestin (Fig.6), formndu-se o grupare amino. Aceasta la rndul ei poate fi acetilat de acetiltransferazele din snge i ficat.
NO2 NO2
CH3OH O NH (a) HOC
O CH3OC (c)
NH (b) Glicina NO2
NH2 O HOOCCH2NHC
O CH3OC (d) NH
(e)
NH
*
NO2 OH
NHCOCH3 O NH CH3OC
O CH3OC
NH
Figura 6. Cile metabolice posibile ale compusului 6 [(a) esteraza; (b) acetil CoA i ligaza; (c) nitroreductaza; (d) N-acetiltransferaza; (e) citocrom P450. Poate avea loc i conjugarea cu acid glucuronic, caz n care (b) este glucuronoziltransferaza] Catena lateral ester poate fi hidrolizat de esterazele din snge i din alte esuturi, formndu-se un acid. Acesta poate fi apoi conjugat cu un aminoacid cum ar fi glicina sau acidul glucuronic. Nucleul aliciclic ar putea fi hidroxilat. Reacia ar putea implica o izoenzim a 225
226 Analize i evaluri toxicologice citocromului P450 care prezint polimorfism genetic. Structura medicamentului este similar cu cea a medicamentului debrisoquine, care este afectat de polimorfismul izoenzimelor citocromului P450. De aceea, factorii genetici care ar putea influena metabolismul acestui compus sunt polimorfismul hidroxilazelor de tip debrisoquine i fenotipul acetilator. n cazul hidroxilazelor, este influenat viteza de dispariie a compusului printe. Deoarece acesta este compusul farmacologic activ, consecina ar fi o diferen de rspuns farmacologic ntre cele dou fenotipuri. Totui, proporia i viteza celorlalte ci de metabolizare, hidroliza urmat de conjugare, reducerea urmat de acetilare, ar influena de asemenea efectul variaiilor genetice ale citocromului P450 asupra nivelului medicamentului nemetabolizat, determinnd dac o cretere a nivelului acestuia este suficient pentru a modifica efectul farmacologic. Fenotipul acetilator ar afecta dispariia i probabil detoxifierea metabolitului amino al medicamentului. Astfel, acetilatorii leni ar fi expui la o concentraie mai mare de metabolit amino substituit, care ar putea fi toxic dup hidroxilare / oxidare. Dac medicamentul se administreaz prin plasture dermic, este puin probabil s aib loc reducerea gruprii amino. n acest caz nu are loc nici acetilarea. De aceea, metabolizarea compusului poate fi mai limitat i este mai probabil ca ea s fie influenat de variaiile genetice ale citocromului P450. 7. Compusul pare s determine o uoar cretere a incidenei tumorilor la oarecii expui prin apa de but, nu i la cei la care administrarea s-a fcut intraperitoneal. La obolan nu se observ o cretere a incidenei tumorilor. i efectele toxice sunt diferite ntre cele dou specii, la obolan observndu-se o mrire a ficatului care nu este nsoit de hemoliz, n timp ce la oarece se observ hemoliz. Hemoliza se observ ns doar atunci cnd compusul se administreaz la oareci pe cale oral. Aceasta sugereaz rolul bacteriilor intestinale. Structura conine o grupare nitro, care poate fi redus de nitroreductazele bacteriene din intestin [(a) n Fig. 7], rezultnd un metabolit hidroxilamin care poate fi responsabil de hemoliz. Acet fenomen nu se observ ns la obolan. La aceast specie se observ mrirea ficatului, care ar putea avea mai multe cauze. Astfel de cauze ar putea fi producerea de tumori, acumularea de lipide sau de lichid, inducerea enzimelor microzomale sau peroxizomale. Producerea de tumori i acumularea de lipide pot fi detectate prin examen histopatologic. Acumularea de lichid poate fi determinat prin cntrirea ficatului proaspt i dup uscare. Inducerea enzimelor microzomale i peroxizomale poate fi nsoit de o cretere a numrului peroxizomilor sau a cantitii de reticul endoplasmatic neted, care pot fi observate n microscopia electronic. Efectele diferite la cele dou specii pot fi consecina unor diferene de metabolism. Acest fapt ar trebui investigat prin analiza n plasm i urin a metaboliilor compusului. Rolul metaboliilor rezultai n urma reducerii asupra toxicitii ar trebui determinat prin folosirea unor animale de experien lipsite de germeni intestinali. Cile de metabolizare prevzute sunt prezentate n Fig. 7. Este de ateptat ca produii rezultai n urma reducerii s fie responsabili de efectele hemolitice. Este de asemenea previzibil faptul c acest compus policlorurat ar putea fi un inductor enzimatic. Prin urmare, expunerea repetat ar putea modifica metabolismul compusului, fapt care ar trebui investigat. Dozele de compus administrate au fost mari comparativ cu ceea ce se ateapt a fi doza la care omul ar fi expus, iar metabolismul ar putea fi diferit la om, mai ales la doza la care ar avea loc expunerea (metabolismul este dependent de doz). Efectele biochimice, metabolismul i efectele patologice ar trebui determinate la doze mai mici, dei efectele menionate mai sus nu au fost observate la doze mai mici. Structura
Rspunsuri la ntrebri i probleme 227 compusului poate sugera o acumulare a fragmentului reprezentat de hidrocarbura policiclic policlorurat.
NO2 (a) NH2
N N Cl Cl Cl Cl NHOH Cl
N N Cl Cl Cl
Cl (b) Cl NO2 Cl (a) Cl
Cl
Cl Cl NH2 (b) (a) NH2 Cl NH2 Cl Cl Cl Cl
Cl
NHCOCH3
(c)
Cl
NH2 NH2 NH2 Cl Cl Cl Cl (c) Cl Cl Cl (d) NHCOCH3 Cl Cl Cl Cl Cl Cl (e) NH2 Cl GSH NH2
Cl (d) Cl Cl Cl
Cl
NHOH Cl
Cl
Cl Cl
Cl Cl Cl Cl Cl HCl Cl Cl
Cl
Cl Cl Cl Cl
Cl
Cl Cl Cl Cl
SG
Figura 7. Posibilele ci de metabolizare ale compusului 7 [(a) nitoreductaza; (b) azoreductaza; (c) citocrom P450; (d) N-acetiltransferaza; (e) glutation-S-transferaza]
227
228 Analize i evaluri toxicologice Dac mrirea ficatului s-a datorat proliferrii peroxizomilor, acesta este un fenomen tipic pentru roztoare. Multe medicamente i ali compui sunt inductori ai enzimelor microzomale. Totui, acest compus este propus a fi utilizat ca i colorant alimentar. Cunoaterea mecanismului care st la baza efectelor toxice la ambele specii ar putea contribui la luarea unei decizii n legtur cu paii de urmat n viitor. De exemplu, dac apariia tumorilor la oareci ar putea fi corelat cu un anumit metabolit, acesta ar putea fi dozat la voluntari umani dup administrarea unei singure doze de colorant alimentar. Apoi, ar putea fi determinat un raport de doze real pentru compararea ntre oareci sau obolani i om, iar o decizie ar fi luat n cunotin de cauz. Avnd aceast informaie, compania ar putea s decid continuarea dezvoltrii produsului, chiar dac n mod normal creterea semnificativ a tumorilor la una din specii ar fi suficient pentru a opri cercetrile.
Bibliografie 229
BIBLIOGRAFIE
1. BISMUTH c., DALLY S.: Cas cliniques en Toxicologie, Flammarion MdecineSciences, Paris, 1994 2. BOGUSZ M.J.: Hyphenated liquid chromatographic techniques in forensic toxicology, J.Chromatogr. B, 733:65-91, 1999 3. BRANDENBERGER H., MAES R.A.A, editors: Analytical Toxicology for Clinical, Forensic and Pharmaceutical Chemists, de Gruyter, Berlin, 1997 4. BRUNK S.D.: Thin-Layer Chromatography Using the Toxi-Lab System, in Analysis of Addictive and Misused Drugs (editor ADAMOVICS J.A.), Marcel Dekker Inc, New York, 1995 5. CHAMBERLAIN J.: The Analysis of Drugs in Biological Fluids, 2nd Ed., CRC Press, Boca Raton, 1995 6. COTRU M., PROCA M.: Toxicologie analitic, Editura Medical, Bucureti, 1988 7. DRUMMER O.H.: Chromatographic screening techniques in systematic toxicological analysis, J.Chromatogr. B, 733:27-45, 1999 8. FLANAGAN R.J., BRAITHWAITE R.A., BROWN S.S., WIDDOP B., WOLFF F.A.: Elments de toxicologie anlytique, Organisation mondiale de la Sant, Genve, 1997 9. FOLEY T.: Enzyme immunoassays, in Analysis of Addictive and Misused Drugs (editor ADAMOVICS J.A.), Marcel Dekker Inc, New York, 1995 10. FRANKE J.P., de ZEEUW R.A.: Solid-phase extraction procedures in systematic toxicological analysis, J.Chromatogr. B, 713:51-59, 1998 11. GAD S.C.: Statistics and Experimental Design for Toxicologists, 3rd ed., CRC Press, Boca Raton, 1999 12. GAILLARD Y., PEPIN G.: Testing hair for pharmaceuticals, J.Chromatogr. B, 733:231-246, 1999 13. GOSSEL T.A., BRICKER J.D.: Principles of Clinical Toxicology, 3rd ed, Raven Press, New York, 1996 14. HENNION M.-C.: Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography, J.Chromatogr. A, 856:3-54, 1999 15. HODGSON E., LEVI P.E.: A textbook of Modern Toxicology, Appleton & Lange, Stamford, 1997 16. KAMOUN P.: Appareils et mthods en Biochimie, 3e dition, Flammarion MdecineSciences, Paris, 1987 17. KLEIN J., KARASKOV T., KOREN G.: Clinical applications of hair testing for drugs of abuse the Canadian experience, Forensic Science International, 107:281-288, 2000 18. LEVY J.M.: Supercritical Fluid-Solid Sample Preparation: A Selective Extraction Strategy, LC-GC International, 13(3): 174-181, 2000 19. LOGHIN F., MARCHAND J.: Lvaluation toxicologique et clinique des medicaments dans lUnion Europenne, Tipografia UMF Cluj-Napoca, 1997 20. MAHUZIER G., HAMON M., FERRIER D., PROGNON P.: Chimie analytique, vol. 2. Mthodes de separation, Masson, Paris, 1999 21. MAJORS R.E.: Distillation as a Sample Preparation and Separation Technique, LCGC International, 12(1):19-23, 1999
230 Analize i evaluri toxicologice 22. MAJORS R.E.: Liquid extraction techniques for sample preparation, LC-GC International, 10(2): 93-101, 1997 23. MAUER H.H.: Systematic toxicological analysis procedures for acidic drugs and/or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/or doping control, J.Chromatogr. B, 733:3-25, 1999 24. MOFFAT A.C., JACKSON J.V., MOSS M.S., WIDDOP B.: Clarkes Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids and Post-mortem Material, 2nd Ed., Pharmaceutical Press, London, 1986 25. POLETTINI A.: Systematic toxicological analysis of drugs and poisons by hyphenated chromatographic and spectroscopic techniques, J.Chromatogr. B, 733:47-63, 1999 26. POOLE C.F., GUNATILLEKA A.D., SETHURAMAN R., Contributions of theory to method development in solid-phase extraction, J. Chromatogr. A, 885:17-39, 2000 27. PREDA N., ARIESAN M.: Lucrri practice de Toxicologie, Litografia IMF ClujNapoca, 1989 28. REPETTO M.: Toxicologia Fundamental, 3rd ed, Diaz de Santos, Barcelona, 1997 29. REPETTO M.: Toxicologia fundamental, Segunda edicin, Editorial cientifico-medica, Barcelona, 1988 30. RIVIER L.: Is there a place for hair analysis in doping controls?, Forensic Science International, 107:309-323, 2000 31. SOCACIU C.: Mutageneza chimica, Ed.Genesis, Cluj-Napoca, 1996 32. STROLIN-BENEDETTI M., CALDWELL J.: Isolation and Identification of Metabolites, in Comprehensive Medicinal Chemistry. The rational design, mechanistic Study & Therapeutic Application of Chemical Compounds, vol. 5, (HANSCH C., SAMMES P.G., TAYLOR J.B., editori), Pergamon Press, Oxford, 1990, p.479-501 33. TAGLIARO F., TURRINA S., SMITH F.P.: Capillary electrophoresis: principles and applications in illicit drug analysis, Forensic Science International, 77:211-229, 1996 34. TIMBRELL J.A.: Study toxicology through questions, Taylor & Francis, London, 1997 35. WATSON I.D.: Clinical Analysis from Biological Matrices, in Sample Preparation for Biomedical and Environmental Analysis (STEVENSON D., WILSON I.D., edt.), Plenum Press, New York, 1994, p.71-78 36. WENNING R.: Potential problems with the interpretation of hair analysis results, Forensic Science International, 107:5-12, 2000 37. xxx : Norme generale de protecia muncii, MMSS, MSF, Bucureti. 2002

Analize Si Evaluari Toxicologice

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Analize Si Evaluari Toxicologice

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Felicia Loghin Daniela Popa Bela Kiss Rodica Anton

ANALIZE I EVALURI TOXICOLOGICE

Editura Medical Universitar Iuliu Haieganu Cluj-Napoca 2003

ANALIZE I EVALURI TOXICOLOGICE

Copyright 2003 EDITURA MEDICAL UNIVERSITAR IULIU HAIEGANU CLUJ-NAPOCA

Prof. Dr. MARIUS BOJI Conf. Dr. RADU OPREAN

Director: Prof. Dr. Liviu Vlad

1 1 16 32 32 45 51 69 82 82 89 91 91 91 92 93 93 94 95 96 97 98 99 99 100 101 102 102 103 104

176 200 206 209 210 213 217 220 229

2 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape

4 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape

6 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape

Screening medicamente: Digoxin, Litiu

Snge total 2 ml COHb (heparinizat) Urin 20-50 ml Screening medicamente

20-50 ml Screening medicamente

8 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape

10 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 11

12 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 13

14 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 15

16 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 17

18 Analize i evaluri toxicologice

Acid tricloracetic Etanol

Analize toxicologice: Clasificare, etape 19

20 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 21

22 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 23

24 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 25

26 Analize i evaluri toxicologice

B radical ce se roteste liber

Analize toxicologice: Clasificare, etape 27

28 Analize i evaluri toxicologice

Analize toxicologice: Clasificare, etape 29

DERIVATI FENOLICI SI XANTINICI BENZODIAZEPINE CARBAMATI

FENOTIAZINE SI METABOLITI (SULFOXIZI)

ALCALOIZI SI DIFERITE AMINE AMFETAMINE

a) stricnina b) morfina c) sulpirid Amfetamina

ORGANOCLORURATE DDT ORGANOFOSFORICE Paration

Metode de analiz toxicologic sistematic 33

34 Analize i evaluri toxicologice

Figura 2.1. Tonometre

Figura 2.2. Flacoane de recoltare

Metode de analiz toxicologic sistematic 35

36 Analize i evaluri toxicologice

Metode de analiz toxicologic sistematic 37

38 Analize i evaluri toxicologice

Figura 2.5. Impinger

Figura 2.6. Instalaii de recoltare a aerului

Metode de analiz toxicologic sistematic 39

40 Analize i evaluri toxicologice

Figura 2.7. Celula de microdifuzie Conway

Metode de analiz toxicologic sistematic 41

Figura 2.8. Instalaie de antrenare cu curent de aer

42 Analize i evaluri toxicologice