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Practicas Microbiologia

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Practicas de Microbiologia
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Prácticas de Microbiología
2º Curso (Lic. Biología)
Departamento de Microbiología y Genética
Universidad de Salamanca
 
 2
Práctica 1
TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA: AISLAMIENTO YRESIEMBRA DE MICROORGANISMOS, MANEJO DELMICROSCOPIO ÓPTICO y TINCIONES.Introducción1. Obtención y mantenimiento de cultivos puros 
El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblacionesextensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbiólogo utilizatécnicas que permiten obtener un
cultivo puro
, y luego cultivar a gran escala dichomicroorganismo.Para obtener cultivos puros se han de utilizar
instrumentos estériles
, es decir, libresde otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue pordiferentes métodos:
1. Calor seco.
Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel oaluminio) se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90 minutos.
2. Calor húmedo.
Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete auna temperatura de 120°C durante 20 minutos en una atmósfera de vapor de agua aelevada presión, lo cual evita la ebullición. Se realiza en el autoclave.
3. Filtración.
Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de unfiltro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de losmicroorganismos.
4. Esterilización química.
Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tiposde plástico) termolábil. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminanuna vez finalizado el proceso de esterilización.
5. Radiación.
La radiación UV o las radiaciones
α
o
γ
pueden utilizarse para esterilizarhabitaciones o algunos plásticos.Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debeutilizar
medios de cultivo
que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de losmismos. Si los nutrientes están en forma de solución acuosa hablamos de medios de cultivo
líquidos
, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemosmedios de cultivo
sólidos
. A veces se utilizan medios de cultivo
semisólidos
, si laconcentración de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante
calorhúmedo
.Para
aislar
un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro delmismo, la técnica más utilizada es la de siembra por
estría en placa Petri
, en medio sólido,que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por división de una única
 
 3célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste enobtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer
diluciones seriadas
que sevierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo
resiembras
en tubosde agar inclinado o bien congelando las células en
glicerol (10-30%) a -80°C
, en
nitrógenolíquido a -173°C
, o mediante
liofilización
.
2. El microscopio 
El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite laobservación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir delos
microorganismos
. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente deiluminación utilizada, se agrupan en:
 
Microscopios ópticos:
La fuente de iluminación es la luz.
De campo claro.
Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadasmediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.
De campo oscuro.
Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobreun fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.
De contraste de fases.
Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, queconsiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio quelas rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ningunatinción de las mismas.
De interferencia.
Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen enrelieve de las mismas.
De fluorescencia.
La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células(bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectrovisible.
Confocal.
 
Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es unmicroscopio computerizado que acopla un láser a un microscopio óptico obteniéndoseimágenes fluorescentes. Análisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especialllamado
 pinhole
que elimina la señal de las regiones que se encuentran fuera de foco.
 
Microscopios electrónicos:
La fuente de iluminación es un chorro de electronesy las lentes son electroimanes.
De transmisión.
Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que sonresistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadascortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a unapantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones queinciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el pasode electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas

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