UNIVERSIDAD CATÓLICA

DE SANTA MARÍA

FACULTAD DE CIENCIAS E
INGENIERÍAS BIOLÓGICAS Y
QUÍMICAS

PROGRAMA PROFESIONAL DE
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
 Control de Calidad de vacunas
monovalentes, vivas, nacionales
y extranjeras, contra la
Enfermedad de Newcastle,
mediante pruebas de Esterilidad
y Titulación de virus, 2008.
Presentado por:
REBECCA D. DELGADO MCCULLOUGH

Para optar el título profesional de:

MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA
 I.
Introducción
 El presente trabajo de
investigación tiene la finalidad de
constatar la calidad de las vacunas
monovalentes, vivas, nacionales y
extranjeras, contra la enfermedad
de Newcastle, mediante pruebas de
esterilidad y titulación de virus.
Descripción del problema

No tenemos una evaluación constante

de la calidad de estas vacunas, no solo
libres de patógenos sino su capacidad
inmunogénica, por lo que no podemos
estar completamente seguros de que
las empresas productoras de las
vacunas sigan cumpliendo con las
normas de calidad y lo que indica su
etiqueta en cada lote que producen.
 Justificación
 Aspecto General:
La EN, como otras enfermedades de
las aves, en nuestro país constituye un
riesgo similar al de una bomba de
tiempo para la avicultura comercial,
pudiendo afectar a los productores
avícolas.
Por tal razón se han implementado
agresivos programas de vacunación,
que han ayudado a disminuir
considerablemente estos brotes.
 Aspecto Tecnológico:
El uso de pruebas de esterilidad y
titulación en vacunas contra la EN son
técnicas altamente confiables para
controlar la calidad y asegurar que un
producto contiene la cantidad de
antígeno establecido en la orden de
producción.
 Aspecto Social:
Teniendo en conocimiento la calidad de
las vacunas, permitiéndose tomar medidas
para modificar el programa de vacunación
de ser necesario, obteniéndose una
inmunización más eficaz, se está
beneficiando a los productores avícolas,
disminuyendo un poco su preocupación,
obteniendo una mejor calidad de vida.
 Aspecto Económico:
La manifestación clínica de esta
enfermedad tiene un importante
impacto económico, no sólo por el
incremento en la mortalidad, la
conversión alimenticia o el aumento en
el número de aves retrasadas, sino por
las implicaciones en la movilización y
comercialización que comprometen la
viabilidad económica, no sólo de una
empresa sino de toda una región y de
un país.
Importancia

La importancia del presente trabajo

radica en el conocimiento de la calidad
para verificar que un producto está libre
de microorganismos viables
contaminantes y el reconocimiento de la
cantidad de partículas virales presentes
en la vacuna.
 Objetivo General
Determinar mediante pruebas de
esterilidad y titulación de virus la calidad
de las vacunas monovalentes, vivas,
contra la Enfermedad de Newcastle.

Objetivos Específicos

Constatar que las Asegurar que las

vacunas se hallan vacunas contienen la
libres de cantidad de antígeno
contaminantes establecido en la orden
bacterianos y fúngicos. de producción.
Planteamiento de la Hipótesis

Dado que las vacunas de uso avícola

contra la Enfermedad de Newcastle
contienen antígenos inmunogénicos, es
probable probar su calidad.
 II.
MARCO TEÓRICO
Las cepas del virus de Newcastle varían
ampliamente en cuanto a la severidad
de la enfermedad que pueden provocar
en las aves.
Una de las propiedades más
características de las cepas diferentes
del virus es su enorme variación
respecto a la patogenicidad para los
pollos.
Las cepas del virus de la EN se agrupan
en cinco patotipos sobre la base de los
signos clínicos observados en los pollos
infectados. Estos son:
 Velogénico viscerotrópico
 Velogénico neurotrópico
 Mesogénico
 Lentogénico o respiratorio
 Entérico asintomático
 Distribución Geográfica

La EN se considera
endémica en muchos
países. La vacunación
profiláctica se practica
en casi todos los
países productores de
aves de corral a
escala comercial.
Etiología
La EN es causada por
el Paramixovirus
aviar de tipo I
(APMV-1), que es un
serotipo del género
Avulavirus
perteneciente a la
subfamilia
Paramixovyrinae,
familia
Paramyxoviridae.
 Epidemiología
Parece probable que la gran mayoría de las
aves sea susceptible a la infección con virus
de la EN, tanto de virulencia alta como de
virulencia baja para los pollos, aunque los
signos clínicos observados en aves
infectadas con el virus varían ampliamente y
dependen de factores como:
el virus especie hospedadora
edad estrés medioambiental
estado inmune infección con otros
organismos
Bajo algunas circunstancias la infección con
los virus extremadamente virulentos
puede provocar una mortalidad repentina
alta con signos clínicos relativamente
escasos. Así que los signos clínicos son
variables y están influidos por otros
factores de modo que ninguno puede
considerarse patognomónico.
Patogenia
La variación extrema de la virulencia de
los diferentes aislamientos víricos de la
EN y el uso generalizado de vacunas
vivas implica que la identificación de un
aislamiento como virus de la EN a partir
de aves que muestren signos clínicos no
confirma un diagnóstico, por lo que
también se requiere una valoración de
la virulencia del aislado.
Una valoración definitiva de la virulencia
del virus se basa habitualmente en una
o más de las siguientes pruebas in vivo:
 Tiempo medio de muerte en huevos
 Índice de patogenicidad intracerebral
 Índice de patogenicidad intravenosa
Técnicas de Diagnóstico
La demostración de la presencia del virus
con múltiples aminoácidos básicos en el
punto de escisión de F0 confirma la
presencia de virus virulentos o
potencialmente virulentos, pero la falta
de detección de virus o la detección de
virus de la EN sin múltiples aminoácidos
básicos en el punto de escisión de F0
empleando técnicas moleculares no
confirma la ausencia de virus virulentos.
Identificación del Agente
 Muestras para el aislamiento vírico:
Las muestras procedentes de aves
muertas deberían consistir en frotis
oronasales, tanto como muestras
procedentes de tejidos de pulmón,
riñones, intestino (incluyendo
contenidos), bazo, cerebro, hígado y
corazón.
Las muestras de aves vivas deberían
incluir tanto frotis traqueales como
cloacales (cubiertas de material fecal).
 Se colocan las muestras
en solución salina isotónica
tamponada con fosfato
(PBS), ph 7.0 a 7.4, que
contenga antibióticos.
Las suspensiones deberían
procesarse tan pronto como
fuera posible después de una
incubación durante 1 a 2
horas, a temperatura
ambiente. Cuando es
impracticable el
procesamiento inmediato, las
muestras pueden
conservarse a 4ºC hasta 4
días.
 Cultivo del virus:
Los líquidos sobrenadantes de las heces
o las suspensiones de tejidos obtenidos
mediante la clarificación por
centrifugación durante aproximadamente
10 minutos a una temperatura que no
exceda los 25ºC se inoculan en volúmenes
de 0.2ml en la cavidad alantoidea de cada
uno de al menos cinco huevos
embrionados de aves SPF de 9 a 11 días
de incubación.
 Después de la inoculación, se incuban
de 35 a 37ºC durante 4 a 7 días. Los
huevos que contengan embriones
muertos o moribundos cuando surgen, y
todos los huevos que permanezcan hasta
el final del período de incubación,
deberían enfriarse primero a 4ºC y probar
los líquidos alantoideos para detectar
actividad de hemaglutinación. Los líquidos
que den una reacción negativa deberían
ser pasados en al menos un lote posterior
de huevos.
 Identificación del virus:
El virus de la EN puede confirmarse
empleando antisuero específico en una
prueba de inhibición de la
hemaglutinación. Las reacciones
cruzadas en las pruebas HI entre el
virus de la EN y algunos otros APMVs
pueden causar algunos problemas que
pueden resolverse empleando controles
adecuados de antígeno y antisuero.
  Prueba
de
hemaglutinación
Pruebas
Serológicas
 Pruebade inhibición de
la hemaglutinación
Requisitos para las vacunas y
los materiales de diagnóstico
Las vacunas con virus
vivos pueden administrarse a
las aves incorporándolas en
el agua de bebida,
administrándose como un
spray grueso o mediante
instilación conjuntival o
intranasal. Algunas cepas
mesogénicas se obtienen por
inocuación intradérmica en la
membrana del ala.
 Se han preparado vacunas que dan
resultados óptimos mediante la aplicación
por vías específicas. En general, las
vacunas vivas más inmunogénicasson más
virulentas y, por tanto, es más probable
que causen efectos secundarios adversos.
Por ejemplo, la vacunación con la cepa La
Sota causará problemas
considerablemente mayores en aves
susceptibles jóvenes que la cepa B1,
aunque La Sota induce una respuesta
inmune más fuerte.
 Las vacunas inactivadas se consideran
más caras que las vacunas vivas y su
empleo entraña la manipulación e inyección
de aves individuales. Se preparan a partir
de líquido alantoideo al que se inactiva su
infectividad mediante la adición de
formaldehído o β-propiolactona. Se
incorpora en una emulsión con aceite
mineral y se administra por vía
intramuscular o subcutánea.
 Así las aves individuales reciben una
dosis estándar. No se produce la
propagación subsiguiente del virus ni
reacciones respiratorias adversas. Como
después de la administración no se produce
la multiplicación vírica, se requiere una
cantidad de antígeno para la inmunización
mucho mayor que en el caso de la
vacunación con virus vivos.
 La duración de la inmunidad depende
del programa de vacunación elegido. Una
de las consideraciones más importantes
que afectan a los programas de
vacunación es el nivel de inmunidad
maternal de los pollos jóvenes que pueden
variar considerablemente de granja en
granja, de lote a lote y entre pollos
individuales.
 Por esta razón se emplean diversas
estrategias…
 Las aves no se vacunan hasta las 2-4
semanas de vida cuando la mayoría de
ellos será susceptible.
 Se vacunan con 1 sólo día de vida por
instilación conjuntival o mediante la
aplicación de un spray grueso. Se
establecerá una infección activa en algunas
aves que persistirá hasta que la inmunidad
maternal decrezca. Entonces se llevará a
cabo una revacunación 3-4 semanas más
tarde.
 Cuando se diseña un programa de
vacunación, debe tenerse en cuenta el tipo
de vacuna utilizada, el estado inmune y de
enfermedad de las aves a vacunar y el
nivel de protección requerido en relación a
cualquier posibilidad de infección con el
virus de campo bajo las condiciones
locales.
Por ejemplo:
 Cuando la enfermedad es leve y
esporádica:
1 día de edad → vacuna viva B1
(conjuntival o spray)
18-21 días de vida → viva B1 o La
Sota (agua de bebida)
10 semanas de vida → viva La Sota
(agua de bebida)
en momento de la puesta → vacuna
inactivada (emulsión de aceite)
 Cuando la enfermedad es severa y más
extendida:
1 día de edad → vacuna viva B1
(conjuntival o spray)
18-21 días de vida → viva B1 o La
Sota (agua de bebida)
35-42 días de vida → viva La Sota
(spray o agua de bebida)
10 semanas de vida → vacuna
inactivada o viva mesogénica
en el momento de la puesta →
vacuna viva inactivada o viva
mesogénica
Control del inóculo
 Características del inóculo:
El primer principio a considerar cuando se
selecciona una vacuna viva del virus de la EN
es si se va a usar como vacuna primaria o
secundaria, siendo su patogenicidad la
principal consideración. Los métodos de
applicación y frecuencia de uso son
consideraciones válidas. El uso de Mab ha
demostrado una variación considerable en la
antigenicidad de cepas diferentes. Esto puede
indicar la necesidad de adaptar las vacunas
más cuidadosamente a virus antigénicamente
relacionados con cualquier virus de campo
predominante.
 La consideración más importante en la
selección de un inóculo para preparar
una vacuna inactivada es la cantidad de
antígeno producida cuando crece en
huevos embrionados; raramente es
rentable concentrar el virus. Se han
usado tanto cepas virulentas como
lentogénicas para preparar vacunas
inactivadas, pero las primeras ofrecen un
riesgo innecesario porque supone la
manipulación de grandes cantidades de
virus virulentos así como el peligro de
una inactivación inadecuada y la posible
contaminación consiguiente.
 Método de cultivo:
Se establece un inóculo de trabajo. Si la
cepa se ha clonado mediante dilución
limitante o selección en placa, el
establecimiento de un cultivo maestro sólo
puede implicar la producción de un gran
volumen de líquido alantoideo infectivo
(mínimo 100ml), que puede conservarse
en forma de alícuotas liofilizadas (0.5ml).
 Validacióncomo vacuna:
A los virus del inóculo de origen
desconocido se les debe realizar pases a
través de huevos SPF y ser clonados antes
de producir el inóculo original. También
puede ser conveniente algún pase a
través de pollos SPF. En cualquier caso,
después de su preparación, del inóculo
original se debería comprobar su
esterilidad, seguridad, potencia y
presencia de agentes extraños.
Método de producción

Para la producción de la vacuna, primero

se establece un inóculo de trabajo, a partir
de cualquiera de los lotes de la vacuna
producidos, mediante la expansión de una
alícuota del inóculo original hasta un
volumen suficiente para permitir la
producción de la vacuna durante 12 a 18
meses. Es mejor conservar el inóculo de
trabajo de forma líquida a una temperatura
de -60ºC o inferior porque el virus liofilizado
no siempre se multiplica hasta un título alto
en el primer pase subsiguiente.
 Las vacunas de virus vivo deben
producirse en huevos SPF. El método de
producción es la propagación de virus a
gran escala; todos los procedimientos se
llevan a cabo bajo condiciones de
esterilidad.
 Es habitual diluir el inóculo de trabajo en
PBS estéril, pH 7.2, de modo que
aproximadamente se inoculan 103-104
EID50/0.1ml en la cavidad alantoidea de
huevos embrionarios SPF de 9 ó 10 días de
vida. A continuación se incuban a 37ºC. Se
deberían desechar los huevos que
contengan embriones muertos en las 24
horas. El tiempo de incubación dependerá
de la cepa vírica utilizada y se
predeterminará para asegurar una
producción máxima con el número de
muerte de embriones.
 Los huevos infectados deberían
enfriarse a 4ºC antes de recogerse. Se
quitan las partes superiores de los huevos
y se aspiran los líquidos alantoideos
después de la eliminación del embrión.
Debería evitarse la inclusión de cualquier
resto de yema o de albúmina.
 Se deberían conservar todos los líquidos
inmediatamente a 4ºC y comprobar la
ausencia de contaminación bacteriana
antes de preparar grandes cantidades para
la liofilización o inactivación. Normalmente,
las vacunas vivas se liofilizan. La
metodología depende de los aparatos
utilizados y de la pericia de los fabricantes,
pero esta es una etapa muy importante ya
que una liofilización inadecuada resulta
tanto en pérdidas de título como en un
período de validez reducido.
 En la producción de vacunas inactivadas,
se trata el líquido alantoideo recogido con
folmaldehído (una concentración final típica
es 1/1000) o β-propiolactona (una
concentración final típica es 1/2000 a
1/4000). El tiempo requerido debe ser
suficiente para asegurar que esté libre de
virus vivos. La mayoría de vacunas
inactivadas no se concentran, el líquido
alantoideo normalmente se emulsiona con
aceite mineral o vegetal.
 Generalmente, las vacunas inactivadas
basadas en aceite se preparan como
emulsiones primarias de agua en aceite.
Habitualmente, la fase oleosa consiste en
nueve volúmenes de aceite mineral
altamente refinado, más un volumen de
agente emulsionante. La fase acuosa es el
virus inactivado al que se le adiciona un
emulsionante no uónico. Normalmente la
relación fase oleosa a fase acuosa es de
1:1 hasta 1:4.
 Los fabricantes se esfuerzan para
conseguir un balance entre el efecto
adyuvante, la viscosidad y la estabilidad.
Si la viscosidad es demasiado alta, la
vacuna será difícil de inyectar; si es
demasiado baja, la vacuna es inestable.
Control del proceso
Cada lote de vacuna con virus vivo debe
probarse en cuanto a su viabilidad y
potencia. Para aquellas producidas en
huevos, el control más importante del
proceso es comprobar la ausencia de
contaminación bacteriana y fúngica.
Para las vacunas inactivadas debe
probarse la eficacia del proceso de
inactivación en huevos embrionados,
tomando 25 alícuotas (0.2ml) de cada lote
y realizando pases cada tres veces a
través de embriones SPF.
Control de lotes

Es necesario probar la infectividad de

las vacunas con virus vivos para conseguir
que se administren los niveles adecuados
de virus. Habitualmente se titula el virus
en huevos embrionados de aves hasta
conseguir la EID50. Esto implica realizar
diluciones a la décima del virus; se
inoculan 0.1ml de cada dilución en 5 a 7
huevos embrionados de aves de 9-10 días
de vida.
 Después de 5 a 7 días de incubación
a 37ºC, los huevos se enfrían y se
prueban para demostrar su actividad
hemaglutinante, que es una indicación
de la presencia del virus vivo.
 Esterilidad:
Se define como la ausencia de
organismos vivos. Se logra por
calentamiento, filtración, mediante
tratamiento con óxido de etileno o por
radiaciones ionizantes, y realizando
asépticamente cualquier proceso posteior.
Cada lote de vacuna debe superar una
prueba de esterilidad, además debe
superar pruebas adecuadas para
demostrar que la vacuna está exenta de
virus contaminados (ensayos en cultivos
celulares, pruebas sobre huevos
embrionados).
 Inocuidad:
El uso de pollos para la comprobación
de las vacunas supone la inoculaciónde
10 ó más aves SPF. Se administran 10
dosis de vacuna viva vía supraconjuntival
a cada ave y a continuación las aves se
mantendrán en observación durante 21
días. Ningún pollo debería morir por
causas atribuibles a la vacuna.
 En el caso de vacunas inactivadas, se
administrará una dosis doble por la vía
recomendada a 10 aves de 3 semanas de
edad y se mantendrán en observación
durante 2 semanas para comprobar la
ausencia de signos clínicos de enfermedad
o lesiones locales.
 Potencia:
Para las vacunas vivas, se vacunan 20
aves SPF, empleando la dosis mínima
recomendada. Después de 14-21 días,
cada ave vacunada y 10 aves control se
desafían por vía IM con 105 LD50 del
virus de desafío de la EN. La vacuna para
la prueba si al cabo de 10 días el 90% de
los pollos vacunados sobrevive sin
síntomas de enfermedad, pero todos los
controles mueren en 6 días.
 Para las vacunas inactivadas, se
emplean pollos SPF de 21-28 días. Se
inyectan vía IM 3 grupos de 20 aves con
volúmenes de vacuna equivalentes a 1/25,
1/50 y 1/100 de una dosis. Se mantiene un
grupo de 10 pollos como control. Se
desafían todas las aves mediante inyección
IM de 106 LD50 del virus de desafío de la
EN, 17-21 días más tarde. Se observan los
pollos durante 21 días. La prueba sólo es
válida si todas las aves control de desafío
mueren en 6 días.
La vacuna cumple con la prueba si la
PD50 no es menos de 50 por dosis y si el
límite de confianza menor no es menos de
35 PD por dosis.
 Duración de la inmunidad:
El nivel de inmunidad alcanzado con
cualquier dosis única o régimen de
vacunación de la EN, variará
enormemente tanto con la vacuna como
con la especie hospedadora.
Generalmente, se debería hacer una
evaluación de la longevidad de los
anticuerpos del suero y adoptarse
regímenes de vacunación para mantener
éstos por encima de un nivel aceptable.
 Estabilidad:
El producto o vacuna final, cuando se
almacena bajo las condiciones
recomendadas, debería mantener su
potencia durante al menos 1 año. Las
pruebas de estabilidad acelerada, tales
como la reducción de la infectividad
seguida de la incubación a 37ºC durante
7 días, pueden utilizarse como una guía
para las capacidades de almacenaje de
un lote de vacuna viva.
 Las vacunas en emulsión de aceite,
también deberían someterse a un agente
acelerador mediante almacenamiento a
37ºC, durante un mínimo de 1 mes, sin
separación de las fases acuosa y oleosa.
Las vacunas con virus vivos deben
emplearse inmediatamente después de
su reconstitución. Las vacunas
inactivadas no se deben congelar.
 Conservantes:
Para las vacunas vivas no se deben
incluir conservantes en el producto
liofilizado, pero los conservantes
antimicrobianos pueden incorporarse en
el diluyente utilizado para reconstituir la
vacuna.
 Precauciones (riesgos):
Las vacunas vivas de la EN pueden
representar un riesgo para los humanos.
Se ha informado que los virus de la EN,
tanto los virulentos como los poco
virulentos para los pollos, han infectado a
humanos, causando normalmente
conjuntivitis aguda después de la
introducción al ojo. Habitualmente, las
infecciones son transitorias y no afectan
a la córnea.
 Las vacunas en emulsión de aceite
mineral representan un riesgo serio
para el vacunador. La inyección
accidental de humanos debería tratarse
con prontitud mediante la incisión y el
lavado de la zona, como para el caso de
una herida por inyección de grasa.
 III.
Materiales y
Métodos
 Materiales

 Localización espacial:

El trabajo de laboratorio de la presente

investigación se desarrolló en las
instalaciones del laboratorio de sanidad
animal del SENASA, localizado en la Av. La
Molina 1915, distrito de La Molina, provincia
de Lima, departamento de Lima.
 Localización temporal:

El trabajo de recolección de muestra se

llevó a cabo durante los meses de
Enero a Julio del 2008 y el trabajo de
laboratorio se realizó dentro de los
meses de Julio y Agosto del 2008.
 Material biológico:

Vacunas monovalentes,
vivas, nacionales y
extranjeras contra la
Enfermedad de Newcastle.

Huevos libres de patógenos

específicos (SPF).
 Equipoy Maquinaria:
Computadora personal
Cámara digital
Incubadora a 37.5ºC
Ovoscopio

Estufa de medios 23ºC

Estufa de medios
Agitador de tubos (vortex)
Refrigeradora 4ºC
Autoclave
Cámara de bioseguridad tipo II
Minitaladro
 Material de laboratorio:
Placas Petri Tubos de ensayo
Propipetas Pipetas
Jeringas Balones y matraces
Gradillas Agua destilada estéril
PBS Guantes estériles
Caldo BHI Caldo Thyoglicolato
Agar TSA Agar Sangre
Agar Sabouraud
Algodón
Lejía Alcohol
Gorro Yodo
Mascarillas Marcador indeleble
Tijera Pegamento universal
Lápiz Película autosellante
 Métodos
 Muestreo:

Procedimiento de muestreo:
Se adquirirán 2 muestras de un lote de
cada empresa productora de las vacunas
mencionadas, siendo en total 24
muestras.
A las cuales se les realizarán los
 Esterilidad:

vRetirar del refrigerador los medios y

caldos de cultivo (uno por cada vacuna y
un control, BHI adicional para
reconstituir las vacunas) y colocarlos en
la estufa a 36ºC por aproximadamente
30 minutos para temperarlos.

vMarcar con plumón indeleble en cada

medio y caldo la vacuna que será
sembrada en cada uno.
vColocar en la cabina de bioseguridad los
medios y caldos de cultivo, pipetas, jeringas,
propipeta, vortex, gradilla, envase con
desinfectante, algodón y alcohol. Someterlos
a rayos UV por 15 minutos.
v Apagar los rayos UV, retirar la tapa de la
cabina, encender la corriente de aire y la luz
de la cabina.
vDesinfectarse las manos con alcohol.
Colocar la vacuna dentro de la cabina.
vColocarse el gorro, mascarilla y guantes
estériles.
v Retirar el precinto de la vacuna. Cargar
5ml de agar BHI en la jeringa para
reconstituir la vacuna. Observar que por
presión negativa (vacío) el líquido debe
absorberse rápidamente al frasco de la
vacuna, y la pastilla (vacuna liofilizada)
debe disolverse en aproximadamente 10
segundos lo que indica una buena
liofilización de la vacuna.
vRetirar la tapa de la
vacuna y con una
pipeta extraer la
vacuna disuelta,
aplicar 1ml a cada
caldo de cultivo y
0.2ml a cada medio
de cultivo (colocados
al borde del medio de
cultivo).
vHomogenizar con el
vortex los caldos de
cultivo en los que se
acaba de sembrar.
v Con una pipeta distinta para cada vacuna y
para cada medio se hace el sembrado por
agotamiento, en forma de estrías. Esperar a
que seque. Cada pipeta usada se coloca en
el recipiente con desinfectante.
vColocar los medios de
cultivo Sabouraud en la
estufa de 23ºC (especial
para crecimiento de
hongos y levaduras), los
demás medios y caldos en
la estufa de 36ºC por 14
días.
v Al 7mo día se realizan los
pasajes de los caldos a
medios de cultivo. Para lo
que extraemos del
refrigerador un medio de
cada tipo para cada caldo
de cada vacuna, más uno
de cada tipo para el
control.
vTemperamos los medios en la estufa a 36ºC
por 30 minutos y luego con el plumón
indeleble marcamos la vacuna y caldo para
la que serán destinados.

vColocamos en la cabina de bioseguridad los

medios de cultivo, pipetas, propipeta,
gradilla, vortex, envase con desinfectante,
algodón y alcohol. Los sometemos a rayos
UV por 15 minutos.

v Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de

la cabina, encendemos la corriente de aire y
la luz interna de la cabina.
vNos desinfectamos las manos y colocamos
los caldos sembrados hace 7 días en la
cabina. Nos colocamos el gorro, mascarilla
y guantes estériles.

vExtraemos con una pipeta 0.6ml de cada

caldo, para colocar 0.2ml en cada medio
de cultivo.

v Sembramos en cada medio de la misma

manera descrita anteriormente. Esperar a
que seque.
vColocamos el medio Sabouraud en la estufa
de 23ºC, y los demás medios y caldos en la
estufa de 36ºC por 7 días.
v Al completarse el tiempo señalado se revisan
todos los caldos y medios de cultivo. Los
caldos deben verse traslúcidos y no debe
haber crecimiento de ninguna bacteria u
hongo en los medios de cultivo sólidos.
 Titulación:
vApenas se reciben los
huevos deben ser
colocados en la
incubadora a 37.5ºC.
vCon el ovoscopio
revisar cada huevo
para verificar que el
embrión esté vivo,
marcar con un lápiz el
límite de la cámara de
aire y el lugar a
perforar, volver a
colocarlos en la
incubadora.
v Colocar en la cabina de bioseguridad
tubos de ensayo, pipetas, jeringas,
gradillas, PBS, agua destilada estéril,
propipetas, vortex, tijera, algodón,
plumón indeleble y alcohol. Los
sometemos a rayos UV por 20 minutos.
v Apagamos los rayos UV, retiramos la
tapa de la cabina, encendemos la
corriente de aire y la luz interna de la
cabina.
v Nos desinfectamos las manos con
alcohol. Colocamos la vacuna dentro de
la cabina. Nos colocamos el gorro,
mascarilla y guantes estériles.
v Se reconstituye la vacuna en un tubo de
ensayo con PBS de acuerdo a la dosis
de la vacuna.
Ejemplo: Si la dosis indicada es de
0.03ml por ave, y el frasco es para 1000
dosis, entonces se reconstituirá con
30ml de PBS.
v Por cada vacuna se tendrán 10 tubos de
ensayo con 9ml de agua destilada
estéril. Los tubos deben estar rotulados
indicando la vacuna y dilución que les
corresponderá (10-1 a 10-9).
v En el primer tubo colocar, con una
pipeta, 1 ml de la vacuna reconstituida,
homogenizar con el vortex.
v De la primera dilución extraer 1 ml con
otra pipeta y colocarlo en el siguiente
tubo de ensayo, homogenizar con el
vortex. Se sigue esta sucesión hasta el
último tubo.
v De acuerdo al título que figura en el
frasco de la vacuna se escogerá la
dilución con ese título además de 2
diluciones inmediatamente superiores y
2 inmediatamente inferiores.
v Vaciamos la cabina de bioseguridad y la
desinfectamos con abundante alcohol.
v Colocamos nuevamente en la cabina el
vortex, jeringas de 1ml, minitaladro,
plumón indeleble, alcohol y algodón. Los
sometemos a rayos UV por 20 minutos.
v Apagamos los rayos UV, retiramos la
tapa de la cabina, encendemos la
corriente de aire y la luz interna de la
cabina.
v Nos desinfectamos las manos con
alcohol, colocamos en la cabina las
diluciones a usar en cada vacuna y los
huevos. Nos colocamos otros guantes
estériles.
v Rociamos los huevos con alcohol,
cubriendo la zona a perforar. Con el
plumón indeleble marcar cada huevo
con la vacuna y la dilución que le será
inoculada. Se inoculan 5 huevos por
cada dilución y se reserva 1 huevo
control por cada dilución.
v Con el minitaladro se perforará en el lugar
marcado previamente con lápiz, se
deberá tener mucho cuidado de sólo
perforar la cáscara, NO LA CUTÍCULA.
v Se homogeniza con el vortex la primera
dilución a inocular, con una jeringa se
extrae 1 ml de la dilución. Se inyecta
0.2ml de la dilución en cada huevo.
v Se repite el mismo procedimiento
anterior para cada dilución. Al terminar
de inocular se procede a tapar con Uhu
el agujero perforado.
v Colocar los huevos nuevamente en la
incubadora con la cámara de aire hacia
arriba.
v Se deben revisar diariamente los
huevos, procurando que sea a la misma
hora, y se deberán ir descartando los
muertos teniendo un registro de lo que
se observa cada día.
v Los huevos muertos al igual que el
sobrante de las vacunas deben ser
colocadas en la cámara fría para su
posterior incineración.
Variables de respuesta

Empresa de la que
proviene la vacuna.

Presencia de
contaminantes.
Título adecuado.
Evaluación estadística

 Unidades experimentales:
Cada vacuna muestreada es
considerada una unidad experimental.
Análisis estadístico

 Análisisde frecuencia:
El análisis estadístico se desarrollará
mediante la estadística descriptiva y
cálculos en distribución de frecuencias.
 IV.
Resultados y
Discusión
Características Físico-cualitativas

Previamente a las pruebas de

esterilidad y titulación de virus se debe
observar detenidamente las
características de las vacunas, con el fin
de realizar un mejor control de calidad.
Cuadro Nº01. Resumen de características físico-
cualitativas de las vacunas muestreadas.
Gráfico Nº01. Porcentaje de uso de cepas en las
vacunas muestreadas
Prueba de Esterilidad

Las pruebas de esterilidad son

procedimientos que forman parte del
control de calidad microbiológico en
manufactura y sirven para demostrar que
el producto es estéril, determinando la
ausencia o presencia de microorganismos
contaminantes en este.
Cuadro Nº03. Resultados de la prueba de Esterilidad
en medios de cultivo sólidos.
Cuadro Nº04. Resultados de la prueba de Esterilidad
en caldos de cultivo.
Titulación de virus

Se realiza con el fin de determinar el

contenido viral de cada una de las
vacunas y, por ende, controlar la cantidad
de antígeno a aplicar a cada ave para
producir los anticuerpos necesarios para
lograr la inmunización, y no ocasionar la
muerte del animal.
Cuadro Nº06. Comparación entre el título obtenido en
la prueba realizada y el que figura en el frasco de las
vacunas contra la EN.
Cuadro Nº07. Tabla frecuencial de cumplimiento del
título que figura en el frasco de las vacunas
muestreadas.
Gráfico Nº02. Porcentaje de cumplimiento del título
que figura en el frasco de las vacunas muestreadas.
 V.
Conclusion
es
1. Todas las vacunas muestreadas
aprobaron satisfactoriamente el análisis
físico-cualitativo al que fueron sometidas.
2. En la prueba de Esterilidad, las 12
vacunas, que representan el 100% de las
muestras analizadas, no presentaron
ningún signo de contaminación al no
existir crecimiento microbiológico
(bacterias u hongos) en ninguno de los
medios y caldos en los que fueron
sembradas.
3. En la Titulación de virus, 6 vacunas, que
representan el 50% de las muestras, no
cumplieron con el título indicado por el
fabricante, siendo la diferencia con ese
mismo muy pequeña aún así no cumplen
lo que figura en el frasco. Sólo 4 vacunas,
representando el 33% de las muestras
tituladas, cumplieron el título indicado en
su etiqueta; y 2 vacunas, representando
el 17% de las muestras, no indicaban el
título de la vacuna en el frasco,
imposibilitando así el control de calidad
del título del virus.
 VI.
Recomendacion
es
1. Se sugiere realizar controles de calidad a
cada lote de cada empresa productora de
vacunas contra esta y otras
enfermedades aviares.
2. Complementar estas pruebas con otras
de control de calidad, tales como
inocuidad, pureza o potencia.
3. Realizar pruebas de las vacunas en las
aves de corral para probar la
efectividad y respuesta a la vacuna.
4. Se sugiere que todos los laboratorios
tengan como norma indicar el título de
la vacuna en el frasco.
Muchas
gracias!