Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Licenciatura en Ciencias mencin Qumica

Seminario
Validacin de un mtodo de cromatografa de lquidosespectrometra de fluorescencia para la cuantificacin de cuatro quinolonas en msculos de pollo y cerdo, siguiendo las directrices de la norma europea EC/657/2002

Autores:

lvaro Etcheverry Mariana Montanares Daniela Bobadilla Nicols Faras aetcheverry@ug.uchile.cl mariana.montanares@gmail.com danii.bobadilla@gmail.com nicolasfariasr@gmail.com

e-Mail:

Fecha de entrega: 11/05/2012 INTRODUCCIN Las quinolonas son un grupo de compuestos estructuralmente relacionados con comprobada actividad antimicrobiana1, ampliamente utilizados en la industria agropecuaria para disminuir las infecciones de origen bacterial en animales que son posteriormente utilizados en la produccin de alimentos para el hombre. Poseen una alta actividad frente a bacterias Gram-negativas y Grampositivas, incluyendo a aquellas que ya presentan resistencia frente a otros antibiticos, como lactamas y sulfonamidas. La administracin de quinolonas, tales como pollos y cerdos que son criados para consumo humano, ha dado como resultado la presencia de residuos en los tejidos animales, lo que da como resultado un potencial peligro para el consumidor. Especficamente, se ha reportado una fuerte relacin entre el uso de quinolonas en la produccin de salmn y el desarrollo de resistencia por parte de la bacteria Campylobacter jejume, que causa infecciones en humanos2. En base a esto, es que instituciones internacionales como la Agencia Regulatoria Japonesa y la Agencia Regulatoria Europea han establecido Lmites Mximos de Residuos (LMR) para estos compuestos, los que se indican en la Tabla N13,4.. Tabla N1: Lmites mximos de residuos para cuatro quinolonas, segn la norma europea y la norma japonesa Unin Europea Compuesto Pollo (mg/kg) Ciprofloxacina + Enrofloxacina cido oxolnico Flumequina 0.1 para la suma de las concentraciones de ambos compuestos. 0.1 0.4 Cerdo (mg/kg) La misma que para el pollo. 0.1 0.2 Japn Pollo (mg/kg) 0.05 para la suma de las concentraciones de ambos compuestos . 0.03 0.5 Cerdo (mg/kg) La misma que para el pollo. 0.02 0.5

Varios mtodos de detccin, tales como ultravioleta (UV), fluorescencia o espectroscopa de masas (MS) son usados en combinacin con cromatografa de lquidos (LC) para la determinacin de quinolonas. Sin embargo, se intenta establecer un mtodo analtico basado en LC combinado con un detector de fluorescencia (LC-FI), y su validacin respectiva de acuerdo al esquema sugerido por la directriz de la Unin Europea EC/657/2002.
1 2

A. Posyniak, K. Mitrowska. Bulletin Veterinary Institute in Pulawy, 52, 427-430, (2008). S. Zhao, H. Jiang, X. Li, T. Mi, C. Li, J. Shen, Journal of Agricultural Food Chemistry, 55, 3829-3834, (2007). 3 Council Regulation 37/2010 of European Communities. 4 Maximum Residue Limits (MRLs) List of Agricultural Chemicals in Foods, The Japan Food Chemical Research foundation. Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan.

MTODO EXPERIMENTAL Los reactivos y los productos qumicos: Las muestras estndares de matrices musculares de cerdo y pollo se utilizaron para la preparacin de curvas de calibracin en un intervalo de concentracin de 0.025-0.2 mg/kg. Estos patrones de calibracin se prepararon a partir de muestras de cerdo y pollo comprado en un mercado local en Santiago. Despus de eliminar la grasa y el tejido conectivo se obtuvo una pasta homognea de las matrices usando un procesador de alimentos. Al homogeneizado, se le aadieron cinco concentraciones diferentes de la solucin multi-estndar (0,025-0,2 mg kg-1). Las seis muestras de control fueron preparadas aadiendo a los homogeneizados de cerdo y pollo la solucin de control multi-estndar con el fin de obtener un valor de concentracin cerca del LMR de la Unin Europea (0.1 mg/kg) y otras 6 muestras de control fueron preparadas de forma similar a la mitad del LMR (0,05 mg/kg). Las muestras fortificadas se dejaron en reposo en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente antes de iniciar el procedimiento de extraccin. Instrumentacin: El aparato de HPLC comprenda una serie de cuatro bombas, un auto-inyector de Agilent (Santa Clara, CA, EE.UU.) equipado con un detector de fluorescencia y un detector UV-Vis DAD (arreglo de diodos), y los datos fueron obtenidos mediante un programa de anlisis de datos "ChemStation". La separacin cromatogrfica se logr utilizando una columna X-Terra RP-18 (3.5 m, 150 x 4.6 mm) Waters (Milford, EE.UU.) y una pre-columna Waters RP-18 (3.5 m, 3.9 x 20 mm). La fase mvil consisti en una mezcla de un tampn fosfato de sodio 0.05 M a pH 3 (A) con acetonitrilo (B). Se utiliz una elusin en gradiente lineal de 82% A durante 5 min; 67% A durante 10 minutos y finalmente 82% A durante 3 minutos adicionales, y un flujo de 1 mL/min. La longitud de onda de excitacin de fluorescencia se encontraba en 280 nm y la longitud de onda de emisin en 450 nm durante los primeros 9 minutos del anlisis y en 310 nm y 360 nm de 9 a 27 min. RESULTADOS Curvas de calibracin: Las curvas de calibracin obtenidas en tres das diferentes para las cuatro quinolonas fueron lineales en el rango de concentracin de 0.005-0.200 mg/kg, lo que incluye la mitad del LMR y LMR. En todos los casos las pendientes e intersecciones de cada compuesto en cada matriz eran esencialmente las mismas.

Valores promedio y coeficientes de variacin: Tabla N2: Valores promedio (g/kg) y coeficientes de variacin de las muestras. Promedio (g/kg) (CV%) Analito Da Cerdo 1 Enrofloxacina 2 3 1 Ciprofloxacina 2 3 1 c. Oxolnico 2 3 1 Flumequina 2 3 39.95 (5.7) 40.71 (1.8) 42.56 (4.4) 43.69 (5.5) 44.73 (1.1) 47.50 (4.5) 43.00 (9.1) 42.18 (5.6) 34.95 (14.4) 39.24 (4.1) 40.21 (2.1) 41.43 (4.5) LMR Pollo 44.42 (2.6) 44.10 (3.5) 41.28 (7.5) 50.23 (3.3) 47.19 (4.2) 47.11 (3.8) 40.77 (3.8) 41.35 (3.5) 39.21 (8.4) 44.37 (2.3) 41.87 (3.8) 42.30 (6.1) Cerdo 81.85 (7.3) 88.62 (2.2) 87.31 (3.4) 90.53 (6.2) 95.33 (2.5) 96.16 (2.6) 80.60 (8.9) 88.99 (3.3) 81.64 (5.7) 76.83 (11.4) 88.10 (2.0) 87.43 (6.8) LMR Pollo 87.34 (4.4) 88.96 (3.1) 82.92 (4.2) 97.70 (3.4) 95.90 (3.3) 95.15 (5.0) 80.90 (4.3) 81.51 (4.4) 81.72 (2.6) 91.74 (4.1) 82.81 (4.7) 87.56 (4.5)

Evaluacin de los lmites de deteccin (LD) y cuantificacin (LC): El lmite de deteccin se define como la cantidad mnima de sustancia que puede ser detectada en un lmite de confianza dado (generalmente 95%) pero no necesariamente cuantificada con precisin. En general, se informo de una concentracin o cantidad de sustancia y que se deriva de la seal ms pequea que se puede detectar con una certeza razonable de un mtodo analtico particular. El lmite de cuantificacin se define como la cantidad de analito que puede determinarse cuantitativamente con un nivel aceptable de exactitud y precisin de repetitividad. En el presente estudio los valores de LD y LC se estimaron a partir del anlisis de 9 muestras en blanco de msculo 4

de cerdo y el pollo, la evaluacin de la desviacin estndar de las seales de la media en los tiempos de retencin de cada una de las quinolonas. Los valores obtenidos se resumen en la Tabla N3. Tabla N3: Lmites de deteccin y lmites de cuantificacin para las cuatro quinolonas en el detector de fluorescencia. Cerdo Analito LD (g/kg) 1.3 1.1 4.1 2.4 LC (g/kg) 4.3 3.8 13.5 8.0 LD (g/kg) 1.2 2.7 13.0 13.2 Pollo LC (g/kg) 2.0 5.3 18.4 17.0

Enrofloxacina Ciprofloxacina c. Oxolnico Flumequina

Como se esperaba, los lmites de deteccin y cuantificacin determinados para el cido oxolnico y la flumequina son superiores a los obtenidos para la enrofloxacina y ciprofloxacina ya que muestran una respuesta instrumental menor que los del grupo de las fluoroquinolonas. La diferencia entre el LD y el LC de cido oxolnico y flumequina en ambas matrices podra explicarse por el hecho de que el procedimiento de eliminacin de impurezas en la matriz de cerdo es ms eficiente que la matriz de pollo. CONCLUSIONES Es posible identificar y cuantificar simultneamente cuatro quinolonas presentes en los msculos de pollo y cerdo, mediante una metodologa utilizando HPLC y un detector de fluorescencia. El mtodo utilizado provee resultados satisfactorios en cuanto al rango de trabajo, recuperacin, precisin e incerteza. El mtodo es adecuado para anlisis de rutina en pruebas de campo, tomando en cuenta que puede ser llevado a cabo durante un da de trabajo. Para la ciprofloxacina y la enrofloxacina no se cumple la norma europea ni la norma japonesa. Para el cido oxolnico slo se cumple la norma europea. Mientras que para la flumequina se cumple tanto la norma europea como la norma japonesa. BIBLIOGRAFA VASQUEZ-MARTINEZ, Y. et al. Validation of a liquid chromatography-fluorescence spectrometric method for the quantification of four quinolones in pig and chicken muscle fllowing the european unin gudieline EC/657/2002. Journal of Chilean Chemical Society. 56 (1): 554-558, 2011. 5