PERAKITAN MIKROBA REKOMBINAN

Irfan D. Prijambada Fak. Pertanian UGM

Mikroba untuk Kegiatan Industri

Mengisolasi dari alam Rekayasa genetik untuk mengubah sifat mikroba yang sudah umum digunakan sehingga dapat memproduksi bahan baru

Mengisolasi Mikroba dari Alam untuk Kegiatan Industri

Hanya sedikit yang dapat ditumbuhkan dalam media pertumbuhan buatan. Kegiatan mencari mikroba yang berpotensi untuk kegiatan industri disebut Bioprospecting. Lingkungan ekstrem menarik. Pengembangan teknik penumbuhan yang efektif terhadap beaya.

Rekayasa Genetik Mikroba Tak Terarah untuk Kegiatan Industri

Dapat dilakukan melalui mutasi menggunakan agensia mutagenik atau radiasi UV

Contoh: Pengembangan Penicillium penghasil penicillin yang tinggi

Dapat dilakukan melalui fusi protoplas antar jasad yang secara filogenetik berjauhan hubungannya; sering digunakan pada rekayasa genetik khamir (yeasts) dan jamur Rekayasa genetik alami

Menumbuhkan mikroba dalam keadaan marginal (stressful) dan menapis (selecting) galur mikroba baru dengan kemampuan tumbuh yang lebih baik pada keadaan tersebut. Muncul karena mutasi spontan.

Rekayasa Genetik Mikroba Terarah untuk Kegiatan Industri

Melalui penyisipan potongan DNA yang mengandung gen menggunakan teknologi rekombinasi DNA untuk menghasilkan produk protein tertentu. DNA hasil rekombinasi dapat dipindahkan ke dalam jasad yang lain untuk menghasilkan sifat yang dikehendaki di jasad tersebut. Gen harus bisa diekspresikan.

Pengendalian Ekspresi Gen

Melalui modifikasi pada daerah pengatur transkripsi (transcriptional regulation), memfusikan protein, dan menghilangkan daerah pengatur umpan balik (feedback regulation controls)

Cara ini merupakan bagian dari pengendalian jalur metabolisme untuk mengendalikan atau meningkatkan produksi suatu bahan.

Vektor Ekspresi
Vektor yang memiliki promoter untuk dapat melakukan transkripsi suatu gen dalam suatu spesies yang dikehendaki.

Sifat-Sifat Inang yang Dikehendaki

(untuk memproduksi protein rekombinan)

Tumbuh cepat Nutrisi murah Tidak banyak persyaratan Bukan patogen/tidak menghasilkan toksin

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein

E. coli

Informasi genetiknya sudah sangat dipahami Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi, Protein intraseluler, Produksi protein rendah

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein

Bacillus

Informasi genetiknya sudah sangat dipahami Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Tumbuh sangat cepat dan tidak banyak persyaratan Produksi protein tinggi Sulit ditransformasi Protein intraseluler Pilihan vektor terbatas

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein

Streptomyces

Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler
Tumbuh lambat

Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Khamir Inang untuk Ekspresi Protein

Saccharomyces

Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh
Tumbuh cepat

Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Jamur Inang untuk Ekspresi Protein

Trichoderma

Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Kemampuannya dalam fermentasi belum banyak dipahami Sulit ditransformasi Tumbuh lambat Pilihan vektor terbatas

DNA Rekombinan

Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme yang berbeda

Bakteri dan manusia Bakteri dan tanaman Virus dan manusia

Penggunaan Mikroba Rekombinan

control

Penggunaan Mikroba Rekombinan (1A)

Produksi protein untuk penelitian

Analisis hubungan fungsi protein alami dan mutannya. Analisis struktur protein.

Penggunaan Mikroba Rekombinan (1B)

Produksi protein komersial

Enzim untuk kegiatan industri

Amilase, amiloglukosidase dan ksilosa isomerase untuk industri terkait pati Protease, selulase dan lipase untuk industri detergen Protease untuk industri keju Penicillin acylase untuk industri farmasi

Industri Keju:

Industri keju memerlukan rennet, enzim protease yang diperoleh dari lambung anak sapi yang masih menyusu dan belum makan rumput. Pada tahun 1960 FAO memprediksi akan adanya kekurangan rennet karena kebutuhan daging dunia mendorong peternak untuk memelihara sapinya hingga dewasa. Usaha untuk mencari enzim protease pengganti rennet dimulai. Chymosin (rennet hasil rekayasa genetika) dihasilkan pada awal tahun 1980an dari mikroba (Escherichia coli, Kluyveromyces lactis dan Aspergillus niger) yang direkayasa. Chymosin telah mengalami pengujian yang ketat untuk menjamin keamanan penggunaannya.

Industri Keju:

Chymosin memiliki sifat dan fungsi yang sama dengan rennet yang diperoleh dari anak sapi. Enzim ini dapat digunakan untuk menghasilkan keju yang kualitasnya sama dengan keju yang dihasilkan menggunakan rennet dari anak sapi yang lebih baik daripada jika menggunakan rennet dari jamur atau hewan selain sapi. Chymosin pertama kali digunakan untuk pembuatan keju pada tahun 1988. Pada saat ini hampir 90% rennet dihasilkan dari khamir terekayasa. Penggunaan Chymosin didukung oleh kelompok vegetarian dan kelompok agama yang menolak konsumsi bagian tubuh sapi.

Penggunaan Mikroba Rekombinan (1C)

Produksi protein komersial Protein pengobatan

Insulin untuk pengobatan diabetes Interferon-gamma untuk pengobatan kanker Faktor VIII untuk pengobatan hemofili Erythropoetin untuk pencairan gumpalan darah

Example: Production of perlu menyuntikkan Pasien diabetes recombinant insulin untuk mengontrol kandungan human insulin in E. coli
glukosa dalam darah mereka

Lilly

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (1)

Prepronsulin diproduksi oleh se-sel dalam kelenjar pankreas. Preproinsulin adalah polipeptida tunggal. Preproinsulin diproses oleh enzim proteolitik menjadi Insulin. Pada Insulin, rangkaian polipeptida A dan B dihubungkan oleh ikatan disulfida.
N B chain A chain C C chain

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (2)

Pada Insulin sintetis, polipeptida A dan B diklon secara terpisah ke dalam vektor ekspresi berbasis lac-promoter

http://members.tripod.com/diabetics_world/lillys_rdna_insulin.htm

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (3)

Promoter lac, ekspresi diinduksi

Polipeptida A dan B yang telah dimurnikan dicampur

Kondisi campuran dibuat oksidatif agar terbentuk ikatan disulfida

Purifikasi dan penghilangan bgal dari polipeptida insulin

Humulin

Penggunaan Mikroba Rekombinan (2)

Meningkatkan kemampuan mikroba

Meningkatkan kemampuan penambatan nitrogen Meningkatkan kemampuan melarutkan fosfat Meningkatkan kemampuan menggunakan substrat kompleks seperti selulosa ksilosa, dan amilum Ketahanan terhadap kekeringan, logam berat & senyawa beracun lainnya

legume

Nitrogen tertambat (amonia)

Karbon tertambat (malat, sukrosa)

rhizobia

Penambatan Nitrogen Biologis:

N2 + 8 flavodoxin+ 8H+ + 16 MgATP2+ 18 H2O
nitrogenase

2NH4+ + 2OH- + 8 flavodoxin + 16 MgADP- + 16H2PO4- + H2 1. Secara stoichiometri jarang terjadi. 2. Sangat menghabiskan energi karena stabilitas N2 yang berikatan rangkap tiga 3. Menghasilkan N tertambat (amonium) yang langsung diasimilasi menjadi biomolekul yang mengandung N (asam amino glutamat)

Gen yang Terlibat dalam Penambatan N2

Pengaruh overekspresi nifH terhadap penambatan nitrogen fixation dan pertumbuhan tanaman

Pertumbuhan P. vulgaris 45 hari setelah inokulasi menggunakan R. etli. 1, Tidak diinokulasi tidak dipupuk; 2, diinokulasi menggunakan CFN42 (wt); 3, diinokulasi menggunakan HP55 (nifHcDK); 4, tidak diinokulasi tetapi dipupuk 10 mM KNO32 mMNH4NO3.

Penggunaan Mikroba Rekombinan (3)

Untuk penanganan lingkungan tercemar

Mikroba pemakan minyak Prince William Sound Alaska Degradasi raksa di lingkungan untuk membersihkan lingkungan tercemar

Penggunaan Mikroba untuk Rekayasa Genetika Tanaman

Agrobacterium tumefaciens dan

Rekayasa Genetika di Alam

Watak Mikrobanya

A. tumefaciens adalah bakteri Gramnegative, non-sporing, motile, rod-shaped, Berkerabat sangat dekat dengan Rhizobium yang dapat membentuk bintil penambat nitrogen pada tanaman legume. Memiliki plasmid yang berukuran besar, disebut Ti.

Agrobacterium tumefaciens

Tertarik kepada luka atau bagian terbuka dari dinding sel tanaman Menghasilkan asetosiringon yang diinjeksikan ke dalam tanaman yang memungkinkan masuknya plasmid Ti ke dalam tanaman Plasmid Ti plasmid masuk ke dalam tanaman dan diintegrasikan secara acak dalam kromosom tanaman Plasmid Ti menyandi opin dan nopalin, dua produk gen yang memacu tumbuhnya tumor pada tanaman terinfeksi

Ti plasmid

Agrobacterium tumefaciens

Gen-Gen dalam Plasmid Ti

tra region mengendalikan pemindahan plasmid dari bakteri ke sel tanaman vir menginduksi pembelahan tak terkendali dari sel tanaman inang t region (tDNA) kumpulan gen yang mengendalikan pemindahan tDNA ke dalam kromosom sel tanaman inang

Dari Ti plasmid mengkonstruksi Plasmid Integrasi

Vektor Integrasi
Plasmid

Chromosome

Rekayasa Genetika Tanaman dan Plasmid Ti

See you .