UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS CAMPUS IV TAPACHULA

MATERIA: LAB BACTERIOLOGIA II

CATEDRATICO: M. en C. MANUEL RLORSA C.

TRABAJO FINAL
ALUMNOS: LEONARDO MENDOZA VILLATORO PAOLA HERNNDEZ ARZETA SEMESTRE: 6
TAPACHULA CHIAPAS, 2012.

GRUPO: B

Staphylococcus
La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, no exigentes, catalasa positivos, con agrupacin en racimos, aerobios o anaerobios facultativos. De los tres gneros que la integran, Micrococcus, Planococcus y Staphylococcus, este ltimo es el nico de importancia mdica. Se caracteriza por ser aerobio anaerobio facultativo, capaz de fermentar la glucosa en anaerobiosis; poseer cidos teicoicos en su pared, y ser sensible a la enzima lisostafina. Dentro del gnero Staphylococcus se conocen ms de 20 especies, de las cuales S. aureus es la ms importante. Otras especies como S. epidermidis y S. saprophyticus son actualmente reconocidas como capaces de actuar como patgenos bajo determinadas circunstancias. En la actualidad el gnero Staphylococcus y, en especial, la especie tipo S. aureus tiene una alta incidencia como agente de infeccin, tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. Es la primera como agente de infecciones, desde superficiales como el fornculo, a profundas como osteomielitis, neumona y endocarditis aguda. A nivel nosocomial se destaca como primer agente de infeccin de heridas operatorias y de prtesis. Asimismo, S. aureus es capaz de causar cuadros TOXICOS por produccin de potentes exotoxinas tales como intoxicacin alimentaria, sndrome de piel escaldada y shock txico. Determinantes de patogenicidad Cualquier enfermedad infecciosa es el resultado de la interaccin entre el microrganismo causal y el husped. Primero analizaremos los factores de patogenicidad con que cuenta S.aureus. Estos pueden ser divididos en tres grupos (tabla 1): a) Componentes de la pared celular. b) Enzimas: Catalasa: podra funcionar inactivando algunos sistemas de ingestin de los PMN. Coagulasas: tanto la coagulasa libre como el llamado clumping factor actan cubriendo a la clula de fibrina y por tanto hacindola ms resistente a la opsonizacin y fagocitosis. Estafiloquinasas: degradan la fibrina y contribuyen a la invasin de tejidos vecinos. Hialuronidasa: hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacridos de los tejidos y por tanto contribuye a la diseminacin a tejidos adyacentes. Lipasas: las cepas de S. aureus productoras de forunculosis crnica son potentes productoras de lipasas que ayudan al microorganismo a diseminarse por los tejidos cutneo y subcutneo. Fosfolipasa C: esta enzima esta asociada con cepas recuperadas de pacientes con distrs respiratorio del adulto y coagulacin intravascular diseminada (eventos que ocurren durante la sepsis). Aparentemente los tejidos afectados por esta enzima se

vuelven ms susceptibles al dao y destruccin por componentes bioactivos del complemento y sus productos durante su activacin. S. aureus produce adems, toda una serie de enzimas como las DNAsas, proteasas y fosfatasas que colaboran en el proceso infeccioso y en la produccin de lesiones.

c) Toxinas: S. aureus puede producir toxinas de accin general como las hemolticas (, , y ) y la leucocidina, y tambin toxinas especializadas como las exfoliatinas, toxina del shock txico y enterotoxinas. Las hemolisinas son importantes toxinas citolticas sobre una variedad de clulas. hemolisina o toxina: tiene efecto letal sobre una variedad de membranas celulares eucariotas, incluyendo la de PMN humanos, as como tambin la de eritrocitos de diferentes especies animales. Es dermonecrtica si se inyecta en forma subcutnea y es letal para animales si se administra en forma intravenosa. Es responsable de la zona de hemlisis observada alrededor de las colonias de S. aureus. hemolisina: es una esfingomielinasa activa sobre diferentes clulas: leucocitos, eritrocitos, fibroblastos. y hemolisinas: se encuentran en algunas cepas de S. aureus y lisan una variedad de clulas diferentes. Leucocidina: es una exotoxina con efecto txico directo sobre las membranas de los PMN humanos, causando degranulacin del citoplasma, hinchamiento celular y lisis. El modo de accin de esta toxina comprende la formacin de poros que alteran la permeabilidad celular para el potasio y otros cationes. Una inyeccin de esta toxina en modelos animales produce una disminucin severa del nmero de leucocitos. Exfoliatinas o toxinas epidermolticas: son producidas por algunas cepas de S. aureus y consisten en dos protenas, bioqumica e inmunolgicamente diferentes, pero con funciones biolgicas similares. La exfoliatina A es un producto de genes cromosmicos, termoestable y es inactivada por el EDTA, mientras la exfoliatina B es de origen plasmdico, es inactivada por el calor y estable frente al EDTA. Ambas tienen actividad proteoltica, actan como superantgenos y disuelven la matriz mucopolisacrida dela epidermis, resultando en la separacin intraepitelial de las uniones en el estrato granuloso. Las cepas productoras de una o ambas protenas son responsables del sndrome de piel escaldada. Toxina del shock txico (TSST-1): Es tambin denominada como enterotoxina F. Esta implicada en la patogenia del sndrome del shock txico. Aunque su rol es poco claro tiene una gran cantidad de actividades biolgicas. En modelos animales potencia la actividad letal de pequeas cantidades de endotoxina.

Patogenia S. aureus produce infecciones de dos maneras: 1. A travs de efectos de toxinas. La tabla 2 muestra los tipos de infeccin que produce S. aureus y la tabla 3 muestra la secuencia de eventos asociados a infecciones serias causadas por S. aureus. 2. En forma directa, por invasin y posterior destruccin tisular local (proceso supurado), o luego de haberse diseminado por va sangunea.

Infecciones por invasin Este tipo de infecciones puede estar producido tanto por cepas de S. aureus residentes como no residentes. El primer paso de la infeccin es la adherencia y colonizacin de las clulas del husped. Se describen tres tipos de adherencia. Por un lado, la adherencia a las clulas de la mucosa nasal mediada por los cidos teicoicos y tambin es importante la adherencia a la mucina de la mucosa nasofarngea. Por otro, la adherencia a piel traumatizada o pequeas disrupciones de piel, as como tambin a objetos extraos y estructuras subendoteliales. Esta adherencia envuelve muchas protenas de la matriz extracelular como fibronectina, fibringeno, elastina, colgeno y otras. Estas protenas interaccionan con diferentes receptores de S. aureus, antes mencionados. Por ltimo, la adherencia de S. aureus a las clulas endoteliales durante los eventos de sepsis es un proceso complejo donde estn involucradas la fibronectina, el fibringeno y la laminina. Una vez los microorganismos atravesaron la barrera cutaneomucosa, llegan al tejido subcutneo o submucoso y se diseminan rpidamente, formando abscesos. Esta es la lesin tpica producida por este microorganismo. Los mecanismos de la invasin son poco conocidos pero a este nivel se desencadena la respuesta inflamatoria del husped que contribuye a la formacin de los abscesos. La respuesta defensiva ms importante por parte del husped son los PMN. Algunas veces el germen puede seguir invadiendo, buscando reas ms profundas y avasculares. Una vez se encuentran alrededor o dentro de los huesos, o protegidos dentro de cogulos, los microorganismos se hacen bastante resistentes al ataque y erradicacin por los mecanismos defensivos del husped.

Slo la mayor intensidad de los factores bacterianos junto al fracaso de los mecanismos defensivos del husped puede llevar a que las bacterias puedan llegar a la corriente sangunea, diseminarse y producir focos de infeccin a distancia llamados abscesos metastsicos. Los eventos que llevan a la sepsis y muerte an no son del todo conocidos. Aparentemente los cidos teicoicos y el peptidoglicano podran actuar como la endotoxina de los bacilos Gram negativos. Adems de infecciones de piel y partes blandas, S. aureus puede producir infecciones invasivas como neumona, osteomielitis, bursitis, artritis y otras.

Infecciones por accin de toxinas Estas infecciones estn causadas por la liberacin al medio de sustancias txicas, que pueden ejercer su accin a cierta distancia del foco infeccioso. 1. Sndrome de piel escaldada: se debe a la produccin de la toxina exfoliativa en un foco, que luego pasa al torrente sanguneo, pudiendo diseminarse hasta regiones alejadas del foco donde no es posible aislar ningn germen. Esta toxina produce la formacin de ampollas y la subsiguiente descamacin de lminas epidrmicas, que puede estar localizada en una regin o estar diseminada por todo el cuerpo. Se presenta con mayor frecuencia en recin nacidos y nios pequeos. 2. Sndrome del shock txico: es un cuadro grave que en el pasado se ha observado asociado a la utilizacin de tampones vaginales por parte de mujeres jvenes. El microrganismo prolifera en el tampn contaminado y produce la toxina del shock txico. El cuadro clnico esta caracterizado por fiebre, hipotensin, exantema cutneo en manos y pies, grados variables de vmitos, diarrea, falla renal, cefalea y conjuntivitis. Evoluciona al shock grave en 48 horas. Tambin se asocia a heridas traumticas o quirrgicas. 3. Intoxicaciones alimentarias: se producen por la contaminacin de alimentos, que suelen ser de elevado contenido en protenas e hidratos de carbono como pasteles, helados y salsas, y con pH superior a 5, que permitirn un rpido crecimiento bacteriano. La mala refrigeracin y conservacin hacen que el microorganismo prolifere, y si es una cepa productora de enterotoxina termoestable, la libera en cantidad suficiente como para producir intoxicacin. El tiempo de incubacin es corto (1 a 6 horas) y los sntomas son vmitos y diarrea de hasta 2 das de duracin, en general sin fiebre, siendo normalmente de rpida recuperacin. Este proceso slo requiere hidratacin y no necesita de tratamiento antibitico.

Cuadros clnicos La lesin caracterstica producida por S. aureus es el absceso, este se puede presentar a nivel de la piel como fornculo. Esta lesin es blanda, eritematosa y caliente. A las 24-48 horas desarrolla una pstula central blanca. Dentro, el material purulento es cremoso, amarillento, y frecuentemente tiene un centro constituido generalmente por un folculo piloso que es el sitio donde la infeccin se inici. Este tipo de infeccin tambin puede aparecer alrededor de cuerpos extraos y entonces el inculo necesario para producir infeccin es ms bajo y la llegada de antibiticos es menor.

Diagnstico microbiolgico Adems de los datos clnicos y epidemiolgicos, fundamentales para la orientacin diagnstica, es preciso confirmarlo con el diagnstico microbiolgico. Toma de muestras Se realizar de la forma habitual, en procesos generalizados con posibilidad de bacteriemia se realizarn hemocultivos. En el caso de procesos supurados se realizar la toma de la muestra con aguja y jeringa, siempre que sea posible. Los estafilococos son bastante resistentes a las condiciones ambientales adversas pero de todas maneras es necesario tomar precauciones en el transporte y conservacin de la muestra. Examen directo En el caso de procesos supurados, el examen directo de la muestra con tincin de Gram nos permitir observar los cocos Gram positivos agrupados en racimos, junto a un gran nmero de leucocitos polimorfonucleares. Cultivo En cuanto a los requerimientos atmosfricos el gnero Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo, por tanto su crecimiento en caldo tioglicolato se har en toda la extensin del tubo. Desde el punto de vista nutricional es no exigente, por lo tanto crece tanto en medios de cultivo pobres, como el agar simple, como en medios ricos, como el agar sangre ovina. Identificacin Pruebas bioqumicas Las pruebas o ensayos bioqumicos son aquellas reacciones que ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos metablicos determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificacin a nivel de especie. Ahora enumeraremos las pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin de los estafilococos.

Prueba de la catalasa Objetivo: separar Staphylococcus y Micrococcus (catalasa positivos) de los gneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativos). Fundamento: la enzima catalasa descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno bajo la frmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto txico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azcares. Procedimiento: se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una porcin de colonia sobre el H2O2 realizndose una emulsin. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados. Esta prueba tambin puede realizarse a partir de un cultivo en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo. Interpretacin de resultados: el desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. Para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus se realizan distintas pruebas bioqumicas que se mencionan en la tabla 5. La lisostafina es una endopeptidasa que cliva los puentes de pentaglicina presentes en la pared de lo estafilococos, por eso el gnero Staphylococcus es sensible a su accin. Dentro del gnero Staphylococcus existen tres especies que se consideran de mayor importancia mdica: S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis. Estas se diferencian segn las pruebas bioqumicas que se detallan en la tabla 6.

Prueba de la coagulasa Objetivo: permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos (ScoN). Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la pared celular. Esta acta directamen te sobre el fibringeno provocando la formacin de cogu los o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado (test en lmina). b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un factor srico(CRF), formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno producindose un cogulo de fibrina (test en tubo). Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y econmica tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarn negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en tubo. Test en lmina Procedimiento: se emulsionan sobre un portaobjetos una o ms colonias en una gota de suero fisiolgico hasta formar una suspensin lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo y se mezclan. Interpretacin de resultados: debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la formacin de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo.

 Test en tubo Procedimiento: se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a 35 C y se chequea la formacin del cogulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzcan un test falso negativo. Interpretacin de resultados: se observa la formacin de un cogulo total o parcial si el test es positivo.

Objetivos.
El alumno ser capaz de obtener las muestras de bacterias necesarias para la practica. Preparara medios de cultivo como st110, agar sangre, agar chocolate, sal y manitol.

Inocular dentro de medios de cultivos ya conocidos para observar las diferentes coloraciones en los medios preparados.

Realizara pruebas de cuagulasa, catalasa y CAMP para conocer el procedimiento adecuado para hacerlas, ademas demostrar que es el patgeno que estamos esperando.

Por ultimo realizara un frotis para observar la morfologa de las colonias tanto macroscpicamente como microscpicamente.

Procedimiento

Discuciones
Pudimos observar las diferentes coloraciones de las bacterias en el medio de sal y manitol, lo cual nos ayudara mucho en el futuro para poder diferenciar a estafilococos aurus de los no patgenos ya que es una de las bacterias que mas aqueja dentro de un nosocomio, el problema fue encontrar bacterias no patgenas como la variedad epidermidis que como carece de importancia clnica casi nadie la tiene aislada para su estudio y por lo tanto no pudimos observarla dentro de una caja de Petri en sal y manitol. La prueba de camp no se pudo observar con claridad por que el laboratorio esta cambiando de reglas y por lo tanto se nos hizo imposible entrar a revisar a tiempo la placa a las 24 hrs y al momento de observarla esta se haba secado por el mal funcionamiento de las estufas en la escuela, as que solo pudimos observar una placa d coloracin caf y un gran crecimiento bacteriano, el halo que se esperaba ver no fue reconocible mas que en una porcin en donde no deba de verse, por lo tanto no sabemos si esto fue repercusin de las dos bacterias en la placa o solo un error de tipo personal, aun asi intentamos describir la prueba para que en alguna segunda ocasin se pueda realizar exitosamente En la prueba de catalasa se observo claramente la generacin de CO2, probamos si el asa no era la que producia el CO2 por si sola al sumerjirla antes de tomar la muestra y no observamos esta liberacin, por lo que podemos decir que fue positiva sin lugar dudas.

Conclusiones
Se obtuvieron las muestras de bacterias Estafilococos aurus y albus siendo imposible obtener la de epidermidis y se trabajo con estas para lo cual sin problema alguno se obtuvieron los medios de cultivo necesarios, Inoculamos las bacterias y pudimos observar una gran mejora de la tcnica de sembrado comparativamente con las anteriores veces lo cual indica que la practica esta rindiendo frutos y ahora podemos tener la seguridad de que se esta realizando un buen trabajo. Las pruebas de catalasa y cualgulasa fueron positivas para estafilococos aurus como se esperaba pero no as para albus y la prueba de CAMP no se observo bien ya que los medios se dejaron mas tiempo de lo debido y se contamino por la mala higiene que se tiene en las estufas bacteriolgicas. El frotis se reslizo observando las acumulaciones en racimos caractersticas de estafilococos de los dos tipos que se trabajaron.

Bibliografa
Romero Cabello. Microbiologia y Parasitologia Humana. 2 Edicion. Editorial Panamericana. pag 257-262. Sheagren J. and Schaberg D. Staphylococci. En Infectious Diseases. Gorbach, Barlett and Blacklow. Pag1697-1703. 1998. Ed WB Saunders. Prieto J y Gomez-Lus ML. Gnero Staphylococcus. Microbiologa Mdica. GarciaRodriguez, Picazo. Pag179-191. 1996. Ed Doyma.

Sitios Web
http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/ginecologia/Vol_45N3/infeccion.htm http://www.chlaep.org.uy/descargas/publicaciones/definicion-y-patogenia.pdf http://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/6.pdf http://www.scielo.cl/pdf/rci/v25n2/art05.pdf http://www.vacunasyviajes.es/vacunasyviajes/Fiebre_Recurrente_Atlas.html