FACULDADE ESTCIO DE S DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUMICA PRTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINO APOIO TCNICO Rafael e Euler

Campo Grande MS 2008 INTRODUO A Objetivos Gerais das Aulas Prticas de Bioqumica As aulas prticas de Bioqumica tem como objetivo criar condies para que os estudantes sejam capazes, ao final do curso, de: 1. Manipular os equipamentos freqentemente utilizados em laboratrio de bioqumica. 2. Conhecer por meio de reaes efetuadas no laboratrio, as propriedades qumicas das substncias que compem os organismos vivos. 3. Interpretar resultados experimentais. B Normas do Laboratrio de Bioqumica 1. Espectrofotmetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos, somente devero ser manuseados pelos alunos aps instrues, a fim de se evitar danos irreparveis. 2. Em dias e hora pr-determinados, os alunos tero sua disposio professores e tcnicos encarregados de orienta-los na execuo e interpretao dos referidos trabalhos. 3. Aps o uso de um bico de gs, ou de gua, no deixa-los aberto, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente. 4. No lanar nas pias quaisquer materiais, com exceo de gua, para evitar a corroso dos encanamentos. C Preveno de Acidentes 1. Trabalhar sempre protegido por avental. 2. No fumar dentro do laboratrio. 3. Ao acender o bico de gs, ter o cuidado de no abrir a torneira de gs, antes que tenha a mo o palito de fsforo acesso. 4. No operar com substncias inflamveis (lcool, ter) nas proximidades de uma chama. Usar banho de gua ou areia. 5. Os reagentes txicos ou corrosivos, lcali ou cidos fortes (quando concentrados), no devero ser pipetados com a boca.

TRABALHO PRTICO

IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS OBJETIVOS ESPECFICOS No final desse trabalho prtico, o estudante dever saber: 1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminocidos. 2. O significado de seguintes reaes particulares. Reao xantoprotica Reao de Sakaguchi Reao de aminocidos que contm enxofre. 1. Reaes Gerais dos Aminocidos a.Formao de sais com cidos e bases devido natureza de on dipolar dos aminocidos O conhecimento das propriedades cido-bsicas dos aminocidos, extremamente importante para o entendimento de muitas propriedades das protenas. Alm disso, separar, identificar e quantificar os diferentes aminocidos, que so passos necessrios para a determinao da composio e seqncia aminocidos das protenas, baseada no comportamento caractersticos de cada um destes monmeros. Os aminocidos so cristalizados a partir de solues aquosas neutras em sua forma totalmente ionizada como ons dipolares ou zwitterions. Embora tais ons dipolares sejam eletricamente neutros e no se movam em um campo eltrico, eles possuem cargas opostas nos seus dois plos. Quando um aminocido neutro dissolvido em gua, ele pode se comportar como um cido (doador de prtons) ou como uma base (aceptor de prtons). OHR-CH(+NH3)-COOH H
+

OHR-CH(+NH3) COOH
+

R-CH(NH2)-COO-

[ A-] Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------[ HA]

onde HA um cido qualquer

Podemos, por uma curva de titulao, calcular os diferentes pK, s de um determinado aminocido bem como o seu ponto isoeltrico, a partir da relao:

PK, 1 + pK,2 pI = ---------------------2 Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20 aminocidos proticos.

Procedimento experimental

Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de gua Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol), observar que a tirosina no se dissolve. Adicionar, gota a gota, NaOH 2N e acompanhar a dissoluo da tirosina precipitada. Adicionar, gota a gota, HCl 10% e notar a formao de precipitado. Prosseguir a adio de HCl at dissoluo da tirosina. Escrever as reaes envolvidas nos diversos passos da experincia, usando a estrutura da tirosina e explicar cada etapa do processo. +
NH3 H HO CH2 C COO
-

TIROSINA OBSERVAO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem: pH 0,0 2,5 rosa; pH 2,5 6,5 amarelo; pH acima de 7,0 - roxo pK, s da tirosina: pK1 = 2,20; pK2 = 9,11; pK3 = 10,07 Responda: Qual o pI da tirosina? Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina, os mesmos resultados seriam observados? Por que?

b. Reao com Ninhidrina A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) um composto heterocclico que forma um derivado corado, aps reagir com aminas, com os amingrupos dos aminocidos livres ou de terminaes de protenas e peptdeos. A ninhidrina oxida o aminocido, produzindo CO2 , NH3 , e um derivado aldedico com um tomo de carbono a menos e, conseqentemente, reduzindo. Posteriormente, a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amnia liberada formando um complexo violeta ou prpura. Exceto o derivado da prolina, que amarelo. As reaes podem ser equacionadas da seguinte maneira:
H

O OH OH O + H R C COOH NH2

CO2

C O

O OH H

Ninidrina reduzida
O HO HO

NH3

Ninidrina oxidada
O
+ H + 3 H2O +

O N

Como a intensidade da colorao Complexo colorido do complexo formado proporcional concentrao de aminocidos ou peptdeos pequenos, esta reao freqentemente utilizada para determinao quantitativa de aminocidos em soluo.

Procedimento experimental Tubo 1 2 3 4 5 6 Amostra/Concentrao gua Glicina 0,5 mM Prolina 0,5 mM Leucina 0,5 mM Aspartame 0,19%* Soluo protica Volume - mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Ninhidrina 0,1% (gotas) 5 5 5 5 5 5

* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil ste ), adoante 200 vezes mais potente do que o acar. Dissolver o contedo de um envelope em 20 mL de gua destilada. Aps a adio da ninhidrina, aquec-los em banho-maria a 100 C por 3 minutos. Compare os resultados com o branco (tubo 1). Anote os resultados e explique-os.

2. Reaes especficas de identificao de aminocidos a. Aminocidos com grupos guanidina: Reao de Sakaguchi
H2N C NH R NH2
OH

Os aminocidos com grupo guanidina [ Um complexo verde com o naftol (

] desenvolvem em meio alcalino ) que, em presena de

hipoclorito de sdio (NaClO) passa a avermelhado. Identifique o (s) aminocidos (s) contendo o grupo guanidina. Procedimento experimental Amostra/Concentra Volume NaOH 2,5 Naftol NaClO - 0,5% o mL N gotas gotas mL 1 gua 1,0 3 3 1 2 Arginina 0,5 mM 1,0 3 3 1 3 Glicina 0,5 mM 1,0 3 3 1 4 Triptofano 0,5 mM 1,0 3 3 1 5 Soluo Protica 1,0 3 3 1 Misturar e observar a cor, que desaparece aps alguns minutos, usando o tubo 1 como controle. Anote os resultados e explique-os. Tubos

b. Reao xantoprotica Especfica para aminocidos que apresentam anel aromtico. O precipitado branco que se forma devido ao do HNO3 (cido mineral forte), e o desenvolvimento da cor amarela ocorre por formao de nitrocompostos (anel aromtico + NO 2 ). Relacione os aminocidos aromticos e suas respectivas estruturas. Procedimento experimental *** OBSERVAO: Para que se garanta a segurana, os experimentos a seguir devero ser efetuados na capela. Tubos 1 2 3 4 5 Amostra/Concentrao gua Glicina 0,5 mM Triptofano 0,5 mM Tirosina 0,5 mM Soluo Protica Volume - mL 2 2 2 2 2 HNO3 - mL 1 1 1 1 1

Anote os resultados e explique-os. c. Reao para aminocidos contendo enxofre Aminocidos que contm enxofre, em meio alcalino e, quente, liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sdio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2 Pb, formando o PbS, que escurece a reao: H H

R C NH2 COOH

NaOH

Na2S

R C NH2

Aminocido com enxofre

COOH Sulfeto de sdio Aminocido sem enxofre PbS CH3COONa

Acetado de sdio

Na2S

(CH2COO)2Pb

Sulfeto de sdio Acetado de chumbo

Sufeto de chumbo

Cite os aminocidos que contm enxofre, com suas respectivas frmulas estruturais. Procedimento experimental Tubos 1 2 3 4 Amostras gua Cistena Glicina Soluo Protica Volume - mL 2 2 2 2 NaOH 2 N 100 C mL 1 1 1 1 (CH3COO)2Pb mL 0,5 0,5 0,5 0,5

Anote os resultados obtidos e explique-os.

CARACTERIZAO DE PROTENAS
I INTRODUO As protenas, que so macromolculas de peso molecular definido, so eletrlitos cujo comportamento se ajusta aos mesmos princpios fsicos de eletrlitos de massa molecular menor. A natureza qumica dos radicais R (cadeias laterais) dos aminocidos que compe a estrutura primria das protenas determina a sua estrutura secundria e/ou terciria. O comportamento fsico-qumico das protenas est relacionado a vrios fatores. A solubilidade por exemplo, depende pH, fora inica do meio, constante dieltrica do solvente e temperatura. Em geral as protenas so menos solveis no ponto isoeltrico. Neste pH as protenas no apresentam carga efetiva (as cargas positivas so iguais s negativas) e portanto no atuam como foras eletrostticas entre as outras molculas presentes no meio. De ambos os lados do pH isoeltrico todas as molculas tero carga efetiva positiva ou negativa. Nestes casos,pelo fato das molculas de protenas se repelirem, haver menor tendncia para agregao e precipitao. II OBJETIVOS ESPECFICOS No final deste trabalho prtico o aluno estar familiarizado com as propriedades fsicoqumicas das protenas, bem como as tcnicas e reaes de identificao das mesmas. III REAO DO BIURETO 3.1 Fundamento C O A reao do biureto ocorre com substncias que contenham grupos e grupos nitrogenados. Sendo assim, essa reao positiva para todas as protenas e peptdeos graas s suas ligaes peptdicas. Estas molculas, quando tratadas com uma soluo diluda de sulfato de cobre, em meio alcalino, do colorao prpura caracterstica, devido formao do complexo de coordenao entre o tomo de cobre e 4 tomos de nitrognio.
NH

HN R CH O C HN

Cu

NH HC NH

C O

Biureto - (complexo de coordenao entre peptdeos e cobre II, de cor prpura)

3.2 Procedimento Montar uma bateria com: Tubos Amostra CuSO4 a 0,5% mL NaOH a 10% mL 1 gua, 2 mL 0,5 0,5 (a) 2 Clara de ovo , 2 mL 0,5 0,5 3 Gema de ovo(b), 2 mL 0,5 0,5 (c) 4 Leite , 2 mL 0,5 0,5 5 Extrato de Soja(d), 2 mL 0,5 0,5 Solues preparadas por: a) homogeneizao de 1 clara de ovo com 50 mL de gua; b) homogeneizao de 1 gema de ovo com 50 mL de gua; c) homogeneizao de 50 g (5 colheres mdias) de leite em p com 100 mL de gua; d) homogeneizao de 10 g de farinha de soja de semente de soja em 100 mL de gua destilada. Observar que em alguns tubos haver formao de uma colorao violeta, caracterstica de reao positiva, enquanto que no tubo contendo apenas gua e os reagentes verificar-se- uma cor azul escura caracterstica do cobre em meio alcalino (formao de Cu (OH)2 e de xidos de Cu).

IV REAES DE PRECIPITAO DE PROTENAS

4.1 Reaes de Precipitao de Protenas com Desnaturao 4.1.1 Termocoagulao Coagulao pelo calor As protenas so termolbeis, quando submetidas ao do calor desnaturam irreversivelmente. Procedimento Colocar em tubos de ensaio solues contendo protenas (ovo, soro, etc); Aquecer, e observar a coagulao. 4.1.2 Coagulao com cidos minerais Reao de Heller Fundamento Os cidos minerais fortes desnaturam as protenas, transformando-as em metaprotenas, insolveis. A reao de Heller (reao de protenas com HNO3 concentrado) freqentemente utilizada para a pesquisa de albumina na urina e permite a dosagem semi-quantitativa. Esta reao sensvel a concentrao da ordem 1:30.000. Procedimento Experimental ***OBSERVAO: Para que se garanta a segurana, o experimento a seguir dever ser efetuado na capela, pelo professor, de maneira demonstrativa.

Colocar um tubo de ensaio: 2 mL de soluo protica Juntar cuidadosamente e vagarosamente, pelas paredes do tubo, 2 mL de HNO3 concentrado, sem misturar. Observar no limite de separao das duas camadas um anel branco (protena e meta-protena). 4.1.3 Precipitao com Sais de Metais Pesados Alguns sais de metais pesados precipitam as protenas, por exemplo: HgCl 2, AgNO3 CuSO4, FeCl3, (CH2COO)2Pb (acetato de chumbo), etc. Outros somente precipitam protenas em meio cidos. Por exemplo: Na2WO4 (tungstato de sdio). Procedimento A Soluo Protica CuSO4 0,5% FeCl3 1% (CH2COO)2 Pb mL 1% 1 2 2 2 *gotas 3 2 *gotas 4 2 *gotas * Adicionar gotas das solues de metais pesados soluo protica, at observar a formao de precipitado. Procedimento B Colocar em um tubo de ensaio: 2 mL de soluo protica; 1 mL de soluo de Na2WO4 10% Agitar. Notar que no ocorre precipitao;

Tubo

Ento Juntar: 0,5 mL de H2SO4 10%. Forma-se imediatamente um precipitado.

Esta reao utilizada em anlises clnicas para desproteinizao de sangue (mtodo de Follin Wu), quando os mtodos de dosagens de Glicose, Uria, Creatinina, assim o exigem.

Interprete os resultados observados. 4.1.4 Precipitao com Solventes Orgnicos Colocar em tubo de ensaio: 2 mL de soluo protica; 1 mL de etanol. Notar a formao de um anel branco na separao das camadas. 4.1.5 Precipitao por reagentes alcalides Os reagentes alcalides (cido pcrico, ctrico, tnico, etc...), agem pelo seu niom e reagem com as protenas formando sais (proteinados) insolveis. Esta reao s possvel se

a protena apresentar carga positiva, portanto, no lado cido do seu pI. Quando adicionamos base, re-dissolve o precipitado formado. Reao de Esbach Procedimento Experimental Colocar em tubo de ensaio: 2 mL de soluo protica; 1 mL do reativo de esbach (cido pcrico 1,0g / cido ctrico 2,0g em 100 mL de H2O). Forma-se um precipitado amarelo. Juntar: 1 mL de NaOH 10%. Observar a dissoluo do precipitado. Explicar.

ENZIMAS I
Objetivos Especficos Ao final deste trabalho prtico o estudante dever saber: Manipular experimentalmente solues de enzimas; Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade; Manipular reaes catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar semiquantitativamente a influncia da concentrao de enzima, temperatura e do pH na atividade enzimtica.

Procedimento Experimental 1. Atividade da Catalase Enzima presente em quase todas as clulas animais. a. Em um tubo de ensaio colocar: 10 gotas de sangue 5 mL de gua destilada homogeneizar 1 mL de H2O2 3% (10 volumes) agitar b. Note a formao de espuma abundante. Procure uma explicao para o fato. Esquematize a reao ocorrida. 2. Atividade da Peroxidase A peroxidase uma enzima encontrada em todas as plantas superiores, sendo rara em tecidos animais. As excees so leuccitos, hemcias, fgado e rins. a. Colocar em dois tubos de ensaio: Tubos 1 2 Reativo Kastle-Meyer 1,0 1,0 gua - mL 5,0 Sangue diludo mL 5,0 H2O2 3% gotas 3 3

b. Note o aparecimento imediato de cor rosa, que se intensifica, lentamente, no tubo que contm sangue. OBS.: O reativo de Kastle-Meuer uma soluo alcalina de fenolftalena reduza (AH 2), que oxida diidroxifenis na presena de H2O2, formando a quinona correspondente. No sendo oxidada pelo perxido de hidrognio (H2O2), nem pelo oxignio molecular (O2). O sangue contm peroxidase, que transfere dois tomos de hidrognio do substrato (AH 2) para H2O2, que convertido em H2O, oxidando assim a fenolftalena, que adquire colorao rsea, em meio alcalino. AH2 + H2O2
Fenolftalena reduzida

2H2O

A+

Fenolftalena oxidada

IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS
Introduo Os carboidratos podem ser identificados por meio de vrias reaes. Algumas dessas reaes envolvem a formao de complexos corados, e a especificidade da identificao depende da estrutura dos carboidratos. Assim, h reaes gerais e outras para estruturas mais especficas, como aquelas, para aldoses, cetoses, mono e dissacardeos redutores, etc. Objetivos Especficos No final deste trabalho prtico, o estudante dever saber: Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos Significado dos seguintes testes: Molisch, Barfoed, Seliwanoff e Benedict.

1. Reao de Molich Os carboidratos e algumas substncias, que se transformam em furfural ou seus derivados na presena de H2SO4, reagem com alta naftol, formando compostos de condensao, de cor violeta, e de estrutura incerta. Abaixo esto representadas as reaes de formao de furfural e de hidroximetilfurfural, respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose.
O O C5H10O5
+

C H

H2SO4

-naftol
O

furfural
HOH2C C6H12O6
+

Composto violeta

C H

H2SO4

-naftol Composto violeta hidroximetilfurfural

Procedimento experimental Preparar os seguintes 8 tubos de reao: Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Amostra gua Glicose 0,1 M Frutose 0,1 M Sacarose 0,1 M Amido 0,1% Maltose 0,1% Aspartame 0,2% (*) Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Alfa-naftol 5% em etanol gotas 3 3 3 3 3 3 3

Ciclamato/sacarina

1,0

Pela parede do tubo inclinado, adicionar lentamente, sem agitar, 2 mL de h2SO4 concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). Anotar os resultados, usando o tubo 1 (branco, controle) como referncia. ( *) Aspartame = L aspartil-L fenilalanina metil ster. O teste de Molisch serve para identificar carboidratos. Estes, pela ao desidratante do cido sulfrico, transformam-se em furfural no caso de pentoses, ou hidroximetilfurfural no caso de hexose. Estes, por sua vez, reagem com os fenis (timol, natol), dando origem a um composto de cor roxa. A colorao verde que s vezes se forma, deve ser desprezada. Para o bom xito desta reao necessrio que o tubo esteja seco, e que haja a menor agitao possvel. 2. Reao de Barfoed Atravs desta reao se distingue um mono de um dissacardeo, pela velocidade com que se forma Cu2O, a partir da reao entre acetato cprico e o carboidrato. Oreativo de Barfoed oxida os monossacardeos ( a mono-cidos ) mais rapidamente que os dissacardeos permitindo, portanto, a diferenciao entre ambos ( mon e dissacardeos ). Cu+2 (aq) + CH3COO- (aq) + carboidrato Cu2O (prec.) + CH3COO- (aq) + carboidrato oxidado

3. Reao de Seliwanoff Na presena de HCl, as cetoses, mais rapidamente do que as aldoses, formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff, que contm resorcinol (1,3 bezenodiol), produzindo compostos avermelhados. A reao exige aquecimento em banho fervente, e positiva tambm para sacarose que, nas condies do teste, hidrolisada em glicose e frutose. Mesmo a glicose pode dar reao positiva, se o aquecimento for prolongado, porque na presena de HCl, ocorre a sua transformao em frutose. A concentrao do HCl na reao no deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N). A reao que ocorre a seguinte:
Aquecimento

Cetose + HCl

O H resorcinol

Composto violeta

furfural Procedimento experimental Preparar 5 tubos de ensaio: Tubos 1 2 3 4 5 Amostra gua Frutose 0,1 M Glicose 0,1 M Sacarose 0,1 M Pentose 0,1 M Volume mL 1 1 1 1 1 Seliwanoff (Resorcinol 0,05 % em HCl 2 N) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Aps misturar o contedo dos tubos, colocar em banho de gua fervente, e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, at no mximo 15 minutos. Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou no de precipitado de cor marrom avermelhado, retirar o tubo do banho. Para dissolver o precipitado eventualmente formado, acrescente algumas gotas de etanol absoluto, agitando o tubo. Anotar os resultados obtidos, lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referncia.

4. Reao de Benedict Utilizada para identificao de carboidratos redutores. ons de metais como, cobre, prata, ferro, mercrio, etc, so reduzidos por grupos aldedos ou cetnicos livres de vrios carboidratos. Colocando-se hidrxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma suspenso que, sob aquecimento, se precipita como xido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se compostos redutores forem acrescentados suspenso, o Cu (OH)2 reduzido a Cu2O, que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reaes abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presena e na ausncia de agentes redutores, em meio alcalino e a quente. Ausncia de composto redutor: Meio alcalino Cu(OH)2 (azul) Aquecimento CuO + (preto) H2O

Presena de composto redutor: Meio Alcalino Cu (OH)2 (azul) Aquecimento Cu2O + (amarelo/vermelho) H2O

Como no prtico utilizar uma suspenso de Cu2+, e tambm para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado da reao, acrescenta-se ao meio da reao um composto orgnico solubilizador que, em meio alcalino adequado, reage com os ons metlicos, formando um complexo inico solvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja, nomeio da reao, ons metlicos disponveis para se reduzirem. No caso do reagente de Felihling, emprega-se CuSO4 2%, solubilizado por tartarato de Na + e de K+ 10%, dissolvido em NaOH 2 M; no caso de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO 4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%, dissolvidos em Na2CO3 2 M. Os testes de carboidratos redutores so positivos para compostos com grupamento OH glicosdico livre, mas negativos para polmeros de cadeias longas. Assim, amido no d reao positiva, a no ser aps a sua hidrlise, e a reao tanto mais positiva quanto maior a extenso da hidrlise. At alguns anos atrs, o teste de substncias redutoras, sobretudo na urina, era empregado no diagnstico de pacientes diabticos, ou suspeito de s-lo, de modo rotineiro. Atualmente, h testes mais sensveis para dosagem rpida de glicose, baseadas em ensaio enzimtico (glicofita/glicose-oxidase) e que so muitos mais prticos, por no exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados.

Procedimento experimental Identificao de substncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo) Preparar 9 tubos de ensaio: Tubo Amostra 1 gua 2 Glicose 0,1 M 3 Frutose 0,1 M 4 Sacarose 0,1 M 5 Amido 0,1% 6 Maltose 0,1 M 7 Aspartame 0,2% 8 Ciclamato/Sacarina 9 Urina humana Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Reagente de Benedict 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Resultado

Aquecer todos os tubos em banho de gua fervente , durante 5 minutos. Anotar os resultados obtidos (se positivo, numa escala de 1 a 4 cruzes, + a ++++), comparando com o tubo 1 (controle). Explique os resultados.

IDENTIFICAO DE POLISSACARDEOS
Objetivos Especficos No final deste trabalho prtico o estudante dever saber: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Extrair gros de amido de batata Preparar solues de amido Reconhecer a presena de amido pelo teste de iodo Lugol Realizar a hidrlise qumica do amido Determinar a progresso de hidrlise pelos testes de iodo e Benedict Reconhecer os produtos de hidrlise parcial e total de amido Extrair e caracterizar o glicognio heptico significado das reaes e operaes realizadas

I. Extrao e identificao do amido O amido no pode ser detectado pelos testes de reduo, porque dispe de um nmero muito reduzido de resduos de glicose livre, para determinao da atividade redutora. Na estrutura do amido, a cadeia linear constituda por resduos de glicose ligados entre si por ligaes (1,4), enquanto na cadeia ramificada ocorrem ligaes (1,4) e (1,6). A cadeia linear (amilose) solvel e a cadeia ramificada (amilopectina), insolvel. O amido da batata constitudo por 98% de amilose e 2% de amilopectina. Na presena de iodo, o amido forma um complexo de cor azulada, de composio incerta. Esse complexo se desfaz sob aquecimento, perdendo a cor azul, mas refeito quando resfriado. A celulose, tambm um polmero de glicose, mas constitudo de ligaes (1,4) no reage com iodo, enquanto o glicognio, semelhana do amido, reage formando um complexo de cor avermelhada. Tambm, semelhan do amido, o glicognio formado por ligaes de tipo (1,4) e (1,6). Procedimento experimental A. Extrao do amido 1. Raspar integralmente uma batata, com uma lmina de vidro, transferindo as raspas para um bquer de 250 mL 2. Adicionar aproximadamente 50 mL de gua destilada e agitar com basto de vidro 3. Filtrar em gaze, recolhendo o filtrado em um bquer de 500 mL. Espremer a gaze 4. Extrair novamente o amido da raspa com 50 mL de gua, filtrando em gaze e recolhendo o filtrado no bquer de 500 mL 5. Deixar o amido se depositar no bquer aproximadamente 20 minutos 6. Descartar, cuidadosamente, o lquido sobrenadante. B. Preparao da soluo de amido 1. Colocar aproximadamente 25 mL de (amido) completo para 50 mL (gua quente) 2. Adicionar aproximadamente 50 mL de gua destilada fria ao deposito de amido, obtido em A.6 3. Adicionar esta ltima suspenso gua em ebulio, lentamente, sob constante agitao

4. Continuar o aquecimento at que se forme uma soluo opalescente em banho-maria, fervente 5. Utilizar esta soluo para as experincias subsequentes

C. Deteco do amido reao com Lugol Tubos 1 2 3 4 5 6 Amostras gua Amido obtido em B Maltose 0,1% Celulose Glicose 0,1 M Sacarose 0,1 M Quantidades mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Lugol (iodo 5% em KI 10%) gotas 2 2 2 2 2 2 Resultado

Aquecer em banho de gua fervente, durante 1 a 2 minutos, os tubos que dissolveram cor com Lugol. Observar. Resfriar. Observar novamente. Anotar os resultados, usando sempre o tubo 1 (controle) como referncia. D. Hidrolise cida do amido A estrutura polimrica do amido pode ser desfeita por hidrlise das suas ligaes glicosdicas. Fisiologicamente, o amido hidrolisado enzimaticamente pela amilase salivar e pela amilase pancretica. Quimicamente, obtm-se resultado semelhante empregando-se HCl concentrado, quente. Durante a hidrlise do amido so formados compostos intermedirios, de cadeias de glicose de tamanhos variveis, e no final do processo obtm-se uma mistura de glicose e maltose. Procedimento experimental: Transferir 25 mL de amido para um elenmyer e adicionar 1 mL de HCl concentrado, aquecer em banho maria fervente por 30 minutos. Sendo que deve retirar, logo que adiciona o HCl, 1 mL da soluo e transferir 0,5 mL para um tubo e 0,5 mL para outro tubo de ensaio. Adicionar em um dos tubos 3 gotas de lugol, observar a colorao, e no outro adicionar 1 mL do reativo de Benedict e aquecer em banho maria fervente, observar a colorao. Repetir o processo em intervalos de 5 a 5 minutos.

Amido

amido solvel + maltose

Eritrodextrina + maltose
Acrodextrina + maltose

M altose

Glicose

EXTRAO E CARACTERIZAO DE LIPDEOS

I. Extrao de lipdeos de semente se soja Procedimento experimental a. Extrao Em copo de 100 mL pesar 10 g de soja moda e seca Adicionar 25 mL de lcool Agitar por 5 minutos Filtrar atravs de papel de filtro, para um bquer Lavar o resduo com 10 mL de lcool por duas vezes Evaporar o filtrado em banho de areia, com agitao constante at diminuio total do lcool Observar o resduo amarelo e oleoso. Esse leo ser utilizado como material para as provas seguintes. b. Caracterizao 1. Solubilidade Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados, colocar 3 gotas de leo vegetal em cada um e adicionar 3 mL de: 1- gua 2- HCl a 4% 3- Na2CO3 a 2% 4- NaOH a 10% 5- Etanol 6- ter Sulfrico 7- Clorofrmio 8- Benzeno 9- Acetona Agitar vigorosamente e verificar: a) b) c) d) Insolubilidade no 1 e 2 tubos Emulso estvel n 3 e 4 Solubilidade parcial no tubo n 5 que se torna total pelo aquecimento Solubilidade total no demais tubos.

Juntar mais 20 gotas de leo nos tubos contendo: ter Clorofrmio Benzeno Acetona Observar a grande solubilidade do leo nesses solventes.

I DOSAGEM DE GLICOSE
Vrios mtodos foram propostos para a determinao de glicose. No incio, era utilizado o seu poder redutor, vrias tcnicas neste sentido foram desenvolvidas. Os oxidantes mais empregados foram os ons cobre e os ons ferricianeto; ambos, em meio alcalino. Naturalmente, estes mtodos sofrem interferncias de outros agentes redutores, presentes na amostra, o que determina a falta de especificidade para a anlise em questo. Outros mtodos, aonde a glicose reage diretamente com certas substncias orgnicas, foram desenvolvidos. Destas substncias, a ortotoluidina a mais utilizada. Posteriormente, os mtodos enzimticos foram surgindo e colocados em prtica. Como exemplo, podemos citar o mtodo de glicose-oxidase e o mtodo da hexoquinase. 1 MTODO DA ORTOTOLUIDINA A glicose reage especificamente com a ortotoluidina, a quente e em presena de cido actico glacial, produzindo uma mistura, em equilbrio, uma glicosilamina e a correspondente base de Schiff. A intensidade da cor medida, fotometricamente. AMOSTRA Soro, plasma, urina, lquor e outras. O soro deve ser colhido em jejum e livre de hemlise. REATIVOS A Reativo cromognico Num frasco de 2.000 mL, colocar 1 g de tiouria, acrescentar 940 mL de cido actico glacial e 60 mL de ortotoluidina. Misturar at completa dissoluo e guardar em frasco escuro. A temperatura ambiente, estvel por 12 meses e, em geladeira, por 24 meses. B Soluo padro de glicose Pesar, exatamente, 1 g de glicose e dissolver em 800 mL de gua destilada. Adicionar 1 g de cido benzico e diluir com gua destilada at completar 1.000 mL. Estvel por um ano, quando conservada em geladeira. Procedimento
a. Tomar 3 tubos, e proceder como a seguir:

Branco Amostra Padro gua destilada 0,05mL Soro 0,05 mL Padro 0,05 mL Reativo cromognico 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL Misturar e colocar os tubos, em banho fervente, durante 10 minutos. Esfriar em gua corrente por 2 a 3 minutos e ler as absorvncias, em 630 nm. CLCULO Glicose (mg/dL) + Absorvncia da amostra / Absorvncia do padro x 100

NOTAS a. A urina e o lquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma. b. A hemoglobina at 350 mg/dl e a bilirrubina at 20 mg/dl no interferem no mtodo sem desproteinizao. Quantidades maiores do erros positivos. c. A lactose e a galactose, presentes em casos de gravidez e durante a lactao ou em casos raros de galactosemia infantil, podem reagir com a ortotoluidina, manose tambm. d. importante o uso de ortotoluidina, a mais incolor possvel. A adio de tiouria como antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. A absorbncia desta soluo frente a um branco de cido actico no deve ser superior a 0,015 e. recomendavel no desproteinizar com cido perclrico. O resfriamento, em gua muita fria, pode provocar turvao. f. A reao segue a lei de Beer at 1.500 mg/dl. Quando os valores forem maiores que 300 mg/dl, diluir a soluo final com reativo de cor, efetuar novamente as leituras e calcular, multiplicando o resultado final pelo fator de diluio, at 1.500 mg/dl. g. Somente os mtodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a glicose urinria, em concentraes inferiores a 0,2 g/dl. VALORES DE REFERNCIA Soro e plasma 70 a 110 mg/dL Sangue total 60 a 100 mg/dL Lquor 40 a 70 mg/dL Urina at 30 mg/dL ou at 0,25 g/24 horas.

2 GLICOSE ENZIMTICA
Finalidade Sistema enzimtico para a determinao de Glicose no sangue, lquor e lquidos ascticos, pleural e senovial em mtodo cintico. Somente para uso diagnstico in vitro. Princpio A glicose oxidase catalisa a oxidao da Glicose de acordo com a seguinte reao: GOD Glicose + O2 + H2O cido Glucnico + H2O2 H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ao catalisadora da peroxidase, atravs de uma reao oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor proporcional concentrao da glicose na amostra. POD 2H2O2 + 4 Aminoantipirina + fenol REAGENTES Enzimas conservar entre 2 8 C Tampo Conservar entre 2 8 C. Tampo fosfato pH 7,4 Padro 100 mg/dl Estvel entre 15 25 C. Aps o manuseio armazenar, bem vedado, entre 2 8 C, para evitar evaporao. INFLUNCIAS PR-ANALTICAS cido ascrbico em concentraes acima de 100 mg/L interferem na reao diminuindo os resultados. Nas 24 horas que sucedem ingesto aguda de lcool, ocorre significativa reduo na glicemia. As redues podem tambm ser significativas nos indivduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calrico. AMOSTRA A amostra de sangue deve ser obtida aps jejum de no mnimo 8 horas ou de acordo com recomendao mdica. Usar plasma ou soro tomando as precaues a seguir. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da gliclise. As amostras de sangue no contendo um antiglicoltico, devem ser centrifugadas imediatamente aps a colheita e o plasma ou soro, separados das clulas ou cogulo. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de lquor e lquidos asctico, pleural e senovial. Nas amostras com antiglicoltico, a concentrao da glicose permanece estvel por at 24 horas. No plasma, soro e outros lquidos separados das clulas, a glicose permanece estvel por 3 dias entre 2 8 C, quando no ocorre contaminao bacteriana. Antipirilquinonimina + 4H2O

INTERFERNCIAS Bilirrubina at 16 mg/dL, Hemoglobina at 160 mg/dL e Triglicrides at 750 mg/dL no produzem interferncias significativas. PROCEDIMENTO Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Padro Reagente de cor Branco 2,0 mL Teste 0,02 mL 2,0 mL Padro 0,02 mL 2,0 mL

Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 C durante 15 minutos. Determinar as absorvncias do teste e padro em 505 nm. A cor estvel por 60 minutos. CLCULOS Glicose (mg/dL) = Absorvncia do teste x 100 / Absorvncia do padro LINEARIDADE A reao linear at 400 mg/dl. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0,85%), dosar novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. VALORES DE REFERNCIA Plasma: 70 a 110 mg/dL Lquor: 2/3 da glicemia em amostras colhidas simultaneamente. SIGNIFICADO CLNICO Valores elevados ocorrem nos vrios tipos de diabetes primrias, nos estados de intolerncia glicose e nas diabetes secundrias a vrias doenas (hipertiroidismo, hiperpituitarismo, hipoadrenocorticismo, etc). Valores diminudos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a vrias causas. Quando a ocorrncia de sintomas de hipoglicemia relacionada alimentao, duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e ps-prandial. Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo, tumores extrapancreticos, sndrome auto-imune (formao espontnea de anticorpos para receptores da insulina), insuficincia supra-renal e/ou hipofisria, doena heptica grave e alcoolismo. A hipoglicemia ps-prandial classificada em hipoglicemia alimentar, hipoglicemia do diabtico tipo II e do paciente com intolerncia glicose. A reduo da concentrao de glicose nos lquidos corporais encontra-se relacionada a processos inflamatrios ou infecciosos. A concentrao de glicose no lquor representa um dos parmetros para a distino entre meningite bacteriana e virtica. OBSERVAES A limpeza e secagem adequadas do material utilizado so fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos

A gua utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade A urina contm numerosas substncias, principalmente o cido rico, que interferem nos mtodos utilizando a reao GOD-POD levando a resultados falsamente diminudos.

COLESTEROL
Principio O colesterol no soro quantificado atravs das seguintes reaes enzimticas: 1. steres de colesterol 2. colesterol livre + O2 col. esterase col. esterase colesterol livres mais cidos graxos colesterona + H2O2

3. 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + p-hidroxibenzoato peroxidase 4 - antipirilquinonimina + 4 H2O Amostra Soro ou plasma isentos de hemlise (anticoagulante - heparina). Jejum de 12 a 16 h. Amostra quando refrigerada de 2 a 8C se conserva por 7 dias, se mantida a 10C conserva-se por 3 meses.O uso de anticoagulantes como: citrato, EDTA e Oxalato, provocam resultados ligeiramente diminudos. Procedimento Identificar trs tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL Soluo padro Amostra 20 L

P 2,0 mL 20 L -

Misturar por agitao e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37C. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotmetro em 510 nm zerando o aparelho com o branco. Calculo Colesterol (mg/dL) = Valores de referencia Em termos estatsticos, na populao brasileira, em ambos os sexos, os nveis de colesterol situam-se na faixa de 150 240 mg/dL. Colesterol (mg/dL) < 200 200 239 > 240 absorvancia do teste ---------------------------- x 200 absorvancia do padrao

Desejvel Risco moderado Alto risco (DCI)

TRIGLICERIDES
Principio Os triglicrides so determinados de acordo com as seguintes reaes: Triglicride lpase da lipoprotena glicerolquinase Mg+2 glicerol + acido graxo glicerol - 3 - fosfato + ADP

Glicerol + ATP

Glicerol - 3 - fosfato + O2

glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2 oxidase 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + ESPAS peroxidase quinoneimina + 4 H2O

Amostra A amostra deve ser obtida aps jejum de 12 a 14 h. Soro. O analito e estvel por 2 - 8C. O armazenamento prolongado da amostra no e recomendado porque varias substancias podem ser hidrolisadas liberando glicerol, levando a obteno de resultados falsamente elevados. Procedimento Tomar trs tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Amostra 0,01 mL Padro Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL

Padro 0,01 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37C. O nvel da gua do banho deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar as leituras das absorvancias do padro e do teste em espectrofotmetro em 540 nm. Calculo Triglicrides (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------- x 200 absorvancia do padrao

Valores de referencia Desejvel Limiar alto Elevado Muito elevado Triglicrides < 200 200 400 400 1000 > 1000

LDL - COLESTEROL
Fundamento As lipoprotenas de baixa densidade (LDL ou -lipoprotenas) separam do soro, pecipitando-as seletivamente pela adio de polmeros de alto peso molecular. Aps centrifugar, no sobrenadante fica o resto de lipoprotenas (HDL e VDL); o colesterol ligado s mesmas determina-se utilizando o sistema enzimtico Colesterol oxidase/peroxidase com colorimetria segundo Trinder (Fenol/4-AF). Pela diferena obtida entre o colesterol total e o determinado no sobrenadante, obtm se o colesterol ligado as LDL. Amostra Soro a) Coleta: o paciente deve estar em jejum (de 12 a 16 h) b) Aditivos: no so necessrios c) Substncias interferentes conhecidas: os soros hipertrigliceridemicos (com quilomicrons) produzem sobrenadantes turvos; a bilirrubina interfere nos nveis maiores de 50 mg/L Procedimento Em um tubo de Kahn, colocar: Amostra 200 L Reagente precipitante 100 L Homogeneizar agitando (sem inverter) durante 20 segundos e deixar 15 minutos no banho Maria a 20-25C. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Separar rapidamente o sobrenadante. Vide limitaes do procedimento. Utilizar o sobrenadante como amostra para o ensaio colorimetrico. Em trs tubos de fotocolorimetros marcados B (branco), P (padro) e D (desconhecido), colocar: B P D Sobrenadante 100 L Padro 20 L Reagente de 2 mL 2 mL 2 mL trabalho Misturar e incubar 5 minutos a 37C quando seja utilizado o reagente de trabalho de Colestat enzimtico AA/liquida ou 15 minutos a 37C quando seja utilizado aquele de Colestat enzimtico. Tirar do banho Maria e esfriar. Ler em espectofotometro a 505 nm.

Calculo do resultado LDL colesterol (g/l) = colesterol total (*) (D x f) f = 0,624 P (*) valor obtido com Colestat enzimtico ou Colestat enzimtico AA liquida. Valores esperados Risco baixo ou nenhum (pessoas normais): menores de 140 mg/dL Risco moderado (pessoas com probabilidade de contrair ECC): entre 140 e 190 mg/dL Risco elevado (pessoas suspeitas de ter ECC): acima de 190 mg/dL

HDL COLESTEROL
Principio Lipoprotenas de baixa densidade (LDL) e muita baixa densidade (VLDL), so precipitadas seletivamente por polietilenoglicol tamponado. No sobrenadante, resta apenas a frao de alta densidade HDL. O teor de colesterol da frao HDL e determinado pelo sistema enzimtico colesterol 250 Dolis/colesterol enzimtico liquido Dolis. Amostra Soro. Estvel por 4 dias, sob refrigerao de 2-8C. Aps a precipitao, o sobrenadante, permanece estvel por 15 dias se mantido a - 20C. o paciente deve estar em jejum obrigatrio de 12 h. Procedimento Identificar trs tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL Soluo padro Sobrenadante 50 L

P 2,0 mL 50 L -

Misturar por agitao e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37C. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotmetro em 510 nm, zerando o aparelho com o branco. Calculo Absorvancia do teste Colesterol HDL (mg/dL) = ---------------------------- x 50 x 2 Absorvancia do padrao Valores de referencia Col. LDL(mg/dl) Col. HDL fem (mg/dl) Col. HDL masc (mg/dl) desejvel < 130 > 65 > 55 risco moderado 130 - 159 45 - 65 35 55 Alto risco > 160 < 45 < 35

CIDO RICO
Principio O cido rico e determinado de acordo com as seguintes reaces: cido rico + O2 + H2O uricase alantoina + CO2 +H2O2 peroxidase antipirilquinonimina + 4 H2O

2 H2O2 + DHBS + 4 aminoantipirina

Amostra Usar soro, rina e lquidos (aminiotico e sinovial). O analto e estvel por 3 dias entre 2 8C e por 6 meses a 10C. Procedimento Tomar trs tubos de ensaio e proceder como a seguir : Branco Teste Amostra 0,02 mL Padro Reagente de trabalho 1,0 mL 1,0 mL

Padro 0,02 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37C. O nvel da gua do banho deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar as leituras das absorvancias de padro e do teste em espectrofotmetro em 520 nm. Calculo cido rico (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------- x 6 absorvancia do padrao

Valores de referencia Soro: homens Soro: mulheres Urina Acido rico (mg/dl) 2,5 a 7,0 1,5 a 6,0 250 a 750 por 24 h

PROTEINAS TOTAIS - PP
Fundamento As ligaes peptdicas das protenas (-HN-CO-) reagem com ons cpricos em meio alcalino (reagente do biureto), formando um complexo de colorao violeta, cuja absorbncia medida em 545 nm e diretamente proporcional a concentrao de protena na amostra. Amostra Soro ou plasma (heparinizados). O analito e estvel por 8 dias entre 2-8C. Procedimento Pipetar em tubos de ensaio identificados: Tubos Branco gua destilada 20 L Amostra Padro Biureto 1000 L

Teste 20 L 1000 L

Padro 20 L 1000 L

Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Ler absorbncia do padro e do teste, zerando o aparelho com o branco em 545 nm. Calculo O calculo pode ser efetuado atravs do Fator de Calibrao. Fc = Cp ------Ap

Ct = Fc x At, onde: Cp = concentrao do padro Ct = concentrao do teste Ap = absorbncia do padro At = absorbncia do teste Valores de referencia Soro Plasma Protenas totais 6,0 a 8,0 g/dL 6,8 a 8,3 g/dL