UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDIS FACULTATEA DE MEDICIN, FARMACIE I MEDICIN DENTAR

MICROBIOLOGIE

CAIET DE LUCRRI PRACTICE

PROF.DR. SAC CONSTANTIN

ASIST.UNIV. Dr. REAN ADRIANA

STERILIZAREA

Noiunea de steril semnific lipsa total a oricrei forme de via de pe suprafaa i din interiorul obiectelor, a substanelor lichide i/ sau solide. Sterilizarea const deci, n totalitatea mijloacelor ce duc la distrugerea sau ndeprtarea complet a microorgasnismelor (bacterii n rm vegetativ sau spori, fungi, protozoare, virusuri). Metodele de sterilizare sunt: - prin ageni fizici: 1. cldura uscat i cldura umed; 2. radiaiile; 3. filtrarea; 4. ultrasunetele - ageni chimici: 1. oxid de etilen 2. - propilolactona 3. glutaraldehida 4. formaldehida AGENII FIZICI FOLOSII N STERILIZARE I. CLDURA Bacteriile n forma lor vegetativ, ct i sporii bacterieni i virusurile sunt distruse prin cldur, prin carbonizarea i coagularea proteinelor.Durata sterilizrii depinde de temperatur, presiune, umiditatea mediului n care are loc sterilizarea, precum i de performana aparatului utilizat. Sterilizarea prin cldur uscat. 1. Flambarea const n trecerea obiectelor direct prin flacr; este o metod de sterilizare specific laboratorului de microbiologie, utilizat pentru: - ansa de platin ( bacteriologic), care se nclzete pn la incandescen, cnd se atinge 0 temperatura de 3200 C; operaiunea se efectueaz nainte i dup orice manoper efectuat cu ansa; manevra trebuie efectuat cu grij, deoarece materialul infecios ncrcat pe ansa bacteriologic, sub influena cldurii poate s fiarb i s mprtie particole n mediu, periclitnd att personalul din laborator ct i mediile de cultur care se pot astfel contamina. Acest risc se poate reduce foarte mult, dac flambarea se realizeaz n interiorul unui cilindru metalic nclzit electric. - gtul baloanelor i eprubetelor nainte de deschidere i dup nchidere; - suprafaa extern a capetelor pipetelor Pasteur; - fiolele cu produse liofilizate, dup deschidere i nainte de solvirea coninutului; Stropirea cu alcool i aprinderea unor instrumente de mic chirurgie, ace de sering, etc. este o metod incorect, care nu se recomand nici n situaii de urgen. 0 2. Sterilizarea prin cldur uscat n cuptorul Poupinel se realizeaz la 18o C i dureaz o or. Prin acest procedeu se sterilizeaz: sticlria de laborator, instrumente chirurgicale metalice, seringi de tip Luer, instrumente stomatologice cum sunt: oglinzi stomatologice, sonde, pense, excavatoare, ace (de nerv, Kerr, Hedstrom, Lentullo), matricea i portmatricea, pietre de lefuit, freze dentare, linguri metalice pentru amprentare, apstoare de limb, instrumentarul pentru extracie, deprttoare,etc.

- nainte de a fi introduse n cuptorul Poupinel, ntreg instrumentarul se spal cu ap i detergeni, se cltete bine, se usuc i se ambaleaz; sticlria de laborator va fi mpachetat n hrtie alb, individual sau grupat.Eprubetele, baloanele, cilindrii se astup cu dopuri i se acoper cu capioane de hrtie legat cu sfoar;nainte de ambalare, pipetele se astup cu dopuri de vat la partea unde se aspir, pentru a preveni att aspirarea produsului ct i contaminarea acestuia cu flora bucal a persoanei care lucreaz.Instrumentarul stomatologic se sterilizeaz n cutii metalice speciale, nchise. - nu se sterilizeaz la Poupinel: seringi cu armtur metalic, filtre bacteriologice, obiecte din cauciuc, piele, blan i materiale plastice. Controlul sterilizrii: hrtia de ambalaj iniial alb, trebuie s fie nglbenit la sfritul 0 sterilizrii. Dac a rmas alb, nseamn c nu s-a atins temperatura de 180 C, iar dac este carbonizat se va rupe n timpul manipulrii obiectelor care au fost ambalate, compromind asfel sterilizarea.Un alt test const n introducerea n cuptor a unor zaharuri cu punct de 0 caramelizare cunoscut, n jur de 180 C. 3. Incinerarea este utilizat pentru sterilizarea materialului infecios din laborator, nainte de aruncare, de exemplu tampoane de vat, burei, produse patologice, cutile animalelor de laborator infectate. Sterilizarea prin cldur umed. 0 1. Fierberea n ap la 100 C, timp de 30 de minute,distruge formele vegetative ale bacteriilor i virusurile, dar nu i sporii, care ar necesita un timp mai ndelungat, de 4-5 ore. - prin fierbere se pot steriliza: lenjeria i vesela bolnavilor, i profilactic, n epidemii, se fierb apa, fructele, legumele, laptele. Deoarece prin fierbere sporii nu sunt distrui, aceast metod este improprie i nu se recomand pentru sterilizarea instrumentarului chirurgical i/ sau stomatologic. 0 2. Autoclavarea utilizeaz vapori de ap sub presiune, la 120 C, timp de 30 de minute, i este considerat metoda cea mai practic de sterilizare prin cldur umed. Autoclavul este un cazan metalic, cilindric, cu perei dubli, rezisteni la presiune ridicat, prevzut cu un sistem de nchidere care asigur etaneitatea, manometru, robinet de eliminare a aerului i o supap de siguran care se deschide cnd presiunea din aparat depete valorile de siguran. n interior, autoclavul prezint un suport pentru obiectele de sterilizat i un tub de nivel care indic nivelul apei. La autoclav se pot steriliza: ntregul instrumentar metalic chirurgical i stomatologic, medii de cultur, seringi de sticl cu armtur metalic, obiecte din cauciuc (sonde), materialul infecios provenit de la bolnavi i produsele patologice ale acestora, recoltate pentru analize de laborator, casolete de vat, pansamente, halatele personalului. - nu se sterilizeaz : medii de cultur albuminoase i zaharoase, obiecte din plastic, piele, blan. Controlul sterilizrii: - teste chimice bazate pe utilizarea unor substane chimice cu punct de fuziune cunoscut, care se nfioleaz mpreun cu un colorant i se introduc n autoclav odat cu materialul de sterilizat. - teste bacteriologice: se introduc n eprubete nchise cu dop, fire de bumbac sau mtase nmuiate ntr-o cultur sporulat (b. subtilis) i se sterilizeaz n autoclav. Dup sterilizare, se nsmneaz n bulion i se urmrete dac bulionul rmne steril. 1. Pasteurizarea este o metod de sterilizare imperfect, deoarece nu distruge dect formele vegetative ale bacteriilor, are ns avantajul pstrrii vitaminelor n produsele alimentare. Este folosit pentru lichide cum sunt laptele, berea, vinul, sucurile de fructe, i se 0 realizeaz la diferite temperaturi, sub 100 C, cu durata variabil. n funcie de aceti doi factori (temperatura i durata), deosebim urmtoarele tipuri de pasteurizare:

joas la 60 - 65 C, o or; 0 0 medie la 70 - 75 C, 20 de minute; 00 nalt la 85 90 C, cteva secunde; Ultrapasteurizarea const n injectarea de vapori supranclzii direct n lichidul de 0 sterilizat, meninut sub presiune i supus unei curgeri turbulente la 150 C , cteva secunde. 2. Tyndalizarea const n nclzirea repetat, timp de 3 zile, cte 1-2 ore, la 0 0 temperatura de 56 - 90 C, a unor medii albuminoase sau vaccinuri, care nu suport alt tratament termic pentru sterilizare. Sterilizarea prin radiaii. 1. Radiaiile ultraviolete (neionizante) sunt emise de lmpi bactericide cu lungimea de und de 3537A.Prin aceast metod sunt distruse bacteriile, virusurile, ciupercile n cteva minute i sporii bacterieni n cteva ore.Aceste radiaii sterilizeaz aerul i suprafeele netede i curate; - sunt utilizate pentru sterilizarea aerului n laboratoare de microbiologie, n institute de cercetare , boxe pentru nou-nscui, sli chirurgicale. 2. Radiaiile ionizante gamma i razele X au avantajul penetrrii, fiind astfel utilizabile pentru sterilizarea unor produse preambalate. Radiaiile gamma sunt emise spontan de Co radioactiv i sunt mai puin costisitoare dect razele X; realizeaz o sterilizare complet, fr a altera materialul de sterilizat. Sunt larg folosite pentru sterilizarea produselor alimentare preambalate i a unor echipamente medicale. Sterilizarea prin filtrare. Filtrarea const n trecerea lichidului de sterilizat printr-o substan poroas care reine bacteriile, cnd porii sunt de ordinul micronilor, sau chiar i virusurile, n cazul membranelor de colodiu, de unic folosin, cu pori de ordinul 0,01m. Filtrarea sterilizant se folosete pentru lichide alterabile sub aciunea cldurii.Dup natura substanei poroase, filtrele pot fi: - filtre Seitz din azbest i fibre de celuloz cu pori de diferite dimensiuni; filtrarea se poate efectua cu presiune pozitiv sau cu presiune negativ, prin racordare la o pomp de vid, i sunt cele mai utilizate filtre n laboratorul de microbiologie. - filtre de sticl Jena; - filtre de porelan Chamberland- Pasteur, rar folosite astzi. STERILIZAREA CHIMIC Sterilizarea prin ageni chimici este deosebit de util pentru echipamente medicale sensibile la cldur, cum ar fi seturile pentru transfuzii de snge, seringi de plastic, instrumentele pentru cateterizri; se folosete de asemenea pentru sterilizarea ncperilor aseptice. 0 Oxidul de etilen lichid la temperaturi sub 10,8 C, devine gazos la temperaturi peste aceast valoare, i este foarte inflamabil, chiar i la concentraii mici;din acest motiv, se utilizeaz n amestecuri cu CO2 sau Freon, care sunt gaze neinflamabile. n aceste combinaii puterea bactericid a oxidului de etilen este pstrat, fiind omorte att formele vegetative ct i endosporii. Utilizarea efectiv a oxidului de etilen necesit controlul precis al concentraiei, temperaturii i umiditii aerului; n prezent exist autoclave moderne care ofer condiiile optime pentru utilizarea acestui gaz pentru sterilizarea de rutin a echipamentelor medicale i de laborator; avnd putere de penetrare foarte bun, se poate aplica la materiale preambalate.Se mai utilizeaz i n programele spaiale, pentru sterilizarea unor componente a navelor spaiale. III. II.

- propiolactona este bactericid, sporicid, fungicid i viricid, dar nu are puterea de penetrare a oxidului de etilen, dei este activ n concentraii mult mai mici. Are o arie de utilizare restrns din cauza proprietii cancerigene i a penetrabilitii reduse. Glutaraldehida n soluie apoas 2% omoar bacteriile, sporii fungii i virusurile i este utilizat pentru sterilizarea echipamentelor urologice, instrumentelor cu lentile, etc. Formaldehida este la temperatura camerei un gaz puternic iritant i toxic, care polimerizeaz i trece n paraformaldehid solid. Prin nclzire aceasta trece din nou n starea gazoas de formaldehid. n starea gazoas, formaldehida este folosit pentru sterilizarea unor ncperi nchise, are ns o putere de penetrare limitat.

AGENII CHIMICI ANTIMICROBIENI. DEZINFECTANTE I ANTISEPTICE Dezinfectantele sunt substane chimice capabile s omoare formele vegetative ale bacteriilor patogene, dar nu i sporii; se utilizeaz uneori termenul germicid, aproape sinonim cu dezinfectantul, cu deosebirea c se refer att la microorganismele patogene ct i la cele nepatogene. Antisepticele sunt substane chimice care se aplic de obicei pe tegumente i mpiedic multiplicarea bacteriilor, fie prin omorrea acestora, fie inhibnd creterea i activitatea metabolic a microorganismelor respective. Condiiile pe care ar trebui s le ndeplineasc un agent chimic ideal: - activitate antimicrobian cu spectru larg, la concentraii ct mai joase: - solubilitate n ap i / sau alcool; - stabilitate n timp; - s nu fie toxic; - omogenitate; - s nu fie inactivate n contact cu substanele organice de pe tegumente; - s fie active la temperatura camerei; - penetrabilitate; - s nu fie corozive; - s aib proprieti deodorizante; - pre de cost sczut; Bineneles, nici un dezinfectant sau antiseptic cunoscut nu posed toate aceste caliti, dar din numrul mare care se gsesc astzi se va alege cel mai potrivit cu scopul n care urmeaz a fi folosit. Principalele grupe de dezinfectante i antiseptice: Fenolul i compuii nrudii este unul din primii ageni chimici folosii, introdus de J. Lister (1827-1912 ) ca antiseptic aplicat preoperator pe tegumente.n prezent sunt utilizai mai mult compuii nrudii, mai puin toxici, cum sunt lizolul ( podele, perei, mobilier din spitale, termometre, etc.) i hexaclorofena, inclus n spunuri, ampoane, deodorante. 0 Compuii de alcool. Acoolul etilic 70-90 este bactericid i viricid ,dar nu distruge sporii bacterieni; este utilizat n special ca antiseptic tegumentar. Halogenii. Iodul i compuii iodai, mai ales sub form de tinctur de iod, sunt antiseptice tegumentare eficiente, cu un spectru antimicrobian foarte larg, la care se adaug i aciunea sporocid; iodoformul are proprieti asemntoare, n plus nu

pteaz i nu irit pielea. Clorul i compuii nrudii (hipoclorit, cloramina ) sunt utilizai curent pentru dezinfecia apei potabile, a piscinelor Metalele grele i compuii nrudii (mercur, argint, zinc, cupru) sunt folosite ca antiseptice, n diferite pudre, unguente profilactic i n tratamentul unor leziuni tegumentare minore. Detergenii sub forma spunurilor i a detergenilor anionici i cationici sunt larg utilizate n dezinfecie. Cei mai folosii sunt compuii de amoniu cuaternar, din grupa detergenilor cationici, cu aciune bactericid asupra germenilor Gram- pozitiv i Gramnegativ, n concentraii relativ mici. Mijloace specifice de sterilizare n stomatologie Se consider c n stomatologie exist patru mijloace de baz eficiente n sterilizare: - autoclavarea- considerat cea mai eficient metod de sterilizare la un pre de cost sczut; exist astzi autoclave moderne, tip caset, care realizeaz sterilizarea n numai 6 minute. 0 - cldura uscat , n curent rapid (rapid flow), la 190 C, timp de 6 minute pentru instrumente neambalate, i 12 minute pentru instrumentarul mpachetat. - Vapori chimici, n aparate tip chemiclave, pentru frezele i instrumente de mn din carbon. - Oxidul de etilen, pentru ncperi, timp de 8-10 ore.

Mijloace specifice de dezinfecie n stomatologie Instrumentele care urmeaz a fi sterilizate prin dezinfecie, necesit inroducerea ntr-o baie de ultrasunete nainte de a fi frecate cu periua, manual.Curirea cu ultrasunete pare a fi de 16 ori mai eficient dect curirea manual.Exist n prezent 6 grupe majore de dezinfectani recunoscui de ADA( American Dental Association). - hipocloritul de sodiu, n diferite diluii , de la 1/5 1/ 100, cu durat de aplicare ntre 10 i 30 de minute.(conurile de gutaperc se in n soluia nediluat timp de 1 minut ). - Iodoforii, cu durat de aplicare 10 minute, au i aciune rezidual; principiul activ este iodul 1%. - Sprayuri cu fenol- alcool; - Compui sintetici pe baz de fenoli, n diluie de 1:32, cu durata de aplicare 10 minute. - Sprayuri apoase fenolate, 10 minute. - Glutaraldehida sau glutaraldehid n combinaie cu ali compui, durata de aplicare ntre 10-30 minute.

Recoltarea i transportul produselor patologice

Produsele patologice ( prob de laborator sau prelevat biologic) sunt secreiile, excreiile, umorile organismului, fragmente de organe sau esuturi obinute prin biopsie, apa , alimentele, n care se pot gsi microorganismele ce determin mbolnviri. Diagnosticul bacteriologic const n izolarea i identificarea bacteriilor din produsele patologice, iar corectitudinea lui depinde esenial de respectarea riguroas a unor reguli privind modul de recoltare al produselor patologice, metodele de conservare i procedura de transport, de la punctul de recoltare la laborator.n acest sens, trebuie cunoscute i ndeplinite urmtoarele condiii: - care este produsul patologic ce urmeaz a fi recoltat, n care ar putea fi gsite microorganismele patogene n faza respectiv a bolii; de exemplu, n febra tifoid, n primele zile se recolteaz snge, iar dup 2-3 sptmni de evoluie, materii fecale, pentru c acolo vom gsi bacilii tifici n aceast etap. - care este metoda de recoltare cea mai corect, prin care se poate evita contaminarea din exterior a produsului patologic respectiv; instrumentarul de recoltare (ace pentru puncie, seringi, sonde, tampoane faringiene, etc.), precum i recipientele n care se pstreaz i se transport produsele patologice vor fi sterile, iar cel care efectueaz manopera de recoltare va respecta regulile de asepsie i antisepsie specifice fiecrei proceduri; - care este momentul optim din timpul zilei, corespunztor momentului n care germenii se afl n cantitate maxim n produsul respectiv; de exemplu, urina se recolteaz dimineaa, pentru c n timpul nopii s-a produs o acumulare mai mare de bacterii, sau ntr-o septicemie, sngele pentru hemocultur se recolteaz n momentul frisonului, dac se poate, sau mcar n plin puseu febril; - care este cantitatea necesar din fiecare produs; - cum trebuie ambalat produsul respectiv pentru a feri de contaminare personalul care l manipuleaz; - timpul optim n care trebuie s ajung la laborator pentru a fi prelucrat; acesta variaz de la produs la produs, precum i n funcie de bacteria ce urmeaz a fi izolat;astfel, urina poate fi n general pstrat la frigider, la + 4C, pentru 24 de ore, n timp ce lichidul cefalorahidian LCR recoltat ntr-o meningit, trebuie prelucrat imediat, deoarece meningococii se autolizeaz n mediul extern foarte rapid, ducnd la un rezultat fals negativ; - cnd produsele patologice nu pot fi transportate imediat la laborator, trebuie cunoscute procedeele de conservare ale acestora. - indiferent de felul produsului patologic, toate instrumentele utilizate pentru recoltare, precum i recipientele n care se recolteaz, vor fi sterile. Orice produs patologic va fi obligatoriu nsoit de un buletin de analiz, care va cuprinde urmtoarele date: - numele i prenumele pacientului, vrsta, domiciliul sau numrul foii de observaie i al salonului de spital, diagnosticul prezumptiv, indicaii asupra unui eventual tratament cu antibiotice administrat nainte de recoltare, felul i proveniena produsului, data mbolnvirii, data i ora recoltrii. Vom reda n continuare metodele de recoltare pentru principalele produse patologice:

Recoltarea sngelui pentru examenul bacteriologic. Hemocultura reprezint izolarea n medii de cultur i identificarea germenilor ce se gsesc n torentul sanguin n timpul bacteriemiilor i septicemiilor.Trebuie subliniat aici, c n condiii normale, sngele este steril. Principalele indicaii pentru efectuarea unei hemoculturi, sunt: 1. bacteriemia

septicemia oc postoperator fr cauz aparent oc postoperator dup manopere pe tractul genito-urinar stri febrile de cauz necunoscut, cu durata prelungit mai multe zile febr i frisoane la pacieni cu: arsuri infectate, infecie urinar, infecii tisulare rapid progresive, plgi postoperatorii septice, pacieni cateterizai; 7. persoane tarate, aflate sub tratament cu: antibiotice, corticosteroizi, imunodepresive, antimetabolice, sau alimentai parenteral. Pentru corectitudinea acestui examen bacteriologic, trebuie respectate urmtoarele reguli, n ceea ce privete tehnica de recoltare: - momentul recoltrii trebuie s fie n plin puseu febril, sau n timpul frisonului, deoarece acesta corespunde multiplicrii maxime a bacteriilor; - aseptizarea tegumentului unde urmeaz a se efectua puncia venoas se face dup splarea cu ap i spun, cu un antiseptic de tipul tincturii de iod sau Betadina (povidoneiodine); - zona punciei venoase se izoleaz cu cmpuri sterile; - seringa i acul pentru puncia venoas vor fi sterilizate prin autoclavare sau vor fi de unic folosin, desfcute din ambalajul steril la patul bolnavului, n momentul punciei; uzual, se folosesc seringi de 20ml;dup recoltare, nsmnarea se va face imediat la patul bolnavului, n trei balonae cu mediu de cultur.Gtul balonaelor se cur n prealabil cu tinctur de iod, se usuc i apoi se mai terg o dat cu alcool 70%; raportul optim snge/ mediu de cultur este de aproximativ 1/50 1/100, de obicei recoltndu-se n jur de 5-8 ml snge.nainte de a fi introdus n mediul de cultur, acul se flambeaz, i nu va atinge pereii interiori ai recipientelor. - unul din balonae conine mediu pentru aerobi, unul pentru anaerobi i unul pentru aerobii care se incubeaz n atmosfer de CO2; balonaul cu mediu pentru anaerobi nu se va agita, pentru ca stratul de izolare de la suprafaa mediului s rmn intact. - dac se tie c pacientul a urmat tratament antibiotic nainte de recoltare, se pot introduce n mediile de cultur unele substane cu efect inhibitor asupra antibioticelor respective. - toate recipientele se eticheteaz, menionndu-se numele i prenumele bolnavului, vrsta, data, ora, numrul probei ( care corespunde cu cel nscris n registrul de analize medicale), i orice alte informaii pe care le solicit laboratorul. Ca msur general de protecie, toate probele se consider ca fiind potenial infecioase, de aceea manipularea lor se face cu maximum de atenie, i este indicat folosirea mnuilor de cauciuc sterile. n laborator, mediile de cultur nsmnate se introduc la termostat , la 370, i se fac citiri zilnice.n cazul n care dup 3 zile, toate culturile, subculturile i frotiurile colorate Gram sunt negative, se poate da un rezultat provizoriu negativ, continundu-se incubarea i citirile pentru nc 7-14 zile, dup care, n absena creterii microbiene, se poate da un rezultat final negativ. n cazul unor culturi pozitive, se anun medicul clinician imediat, pentru a se putea ncepe tratamentul specific ct mai precoce.Citirile se pot face i automatizat, prin aparate de tip Bactec, care sunt foarte sensibile i deceleaz creterea microbian mult mai repede, putnd scurta durata tehnicii foarte mult. Rezultate fals pozitive se pot obine n special datorit contaminrii cu germenii tegumentari. Recoltarea sngelui pentru examene serologice.n unele afeciuni sau n unele stadii evolutive ale unor boli, diagnosticul direct bacteriologic este dificil, i este mai convenabil

2. 3. 4. 5. 6.

s se cerceteze anticorpii specifici din serul bolnavilor, ceea ce numim n mod curent diagnostic serologic sau indirect. Pentru aceasta se recolteaz snge integral cu o sering steril care nainte de recoltare se cltete cu ser fiziologic steril, pentru c urmele de ap de pe pereii seringii ar putea produce hemoliz .Sngele se las pe masa de lucru la temperatura camerei, 1-2 ore, dup care se decanteaz serul. Recoltarea urinii pentru urocultur. Indicaiile cele mai frecvente sunt n cazul infeciilor aparatului urinar ( rinichi, uretere, vezic urinar, uretr), urina fiind un mediu de cultur excelent pentru majoritatea bacteriilor care populeaz i infecteaz tractul urinar. - infeciile urinare sunt una dintre cele mai comune infecii bacteriene, cu o frecven ceva mai mare la femei, afectnd, toate vrstele, cu manifestri variate, de la forme asimptomatice, pn la forme grave, sistemice. - infecia se produce de obicei pe cale ascendent, de la uretr. - frecvena mai mare la femei a infeciilor acute se explic prin lungimea mai mic a uretrei, o condiie favorizant n plus, pentru transmiterea ascendent a infeciei. - Tehnica recoltrii. Se recolteaz prima urin de diminea, deoarece n aceasta se concentreaz un numr mai mare de germeni.Organele genitale externe se spal cu ap i spun i se cltesc cu ser fiziologic, dup care primul jet de urin se arunc i se recolteaz jetul mijlociu, ntr-un recipient steril.Urina se poate obine i prin sondaj vezical sau prin aspiraie suprapubian (direct din vezic),dar aceste metode sunt rezervate situaiilor cnd miciunile spontane nu sunt posibile.Trebuie subliniat c orice manevr de sondaj vezical crete riscul contaminrii cilor urinare pe cale ascendent. Prelucrarea probelor se face imediat sau urina se poate pstra la frigider, la + 4oC, 24 de ore.Pe buletinul de analiz care nsoete proba se va specifica dac pacientul a primit tratament antibiotic sau soluii diuretice nainte de recoltare ( ar putea da rezultate fals negative prin diluarea mare a urinii). - Interpretarea rezultatelor.Urocultura se exprim cantitativ, prin numr de germeni pe ml de urin.Se consider c un numr sub 10 000 germeni / ml nu au semnificaie patologic, bacteriile provenind din contaminare extern n timpul recoltrii; ntre 10 000-100 000 germeni/ ml, rezultatul este dubios i se repet proba; peste 100 000 germeni/ ml indic infecie urinar.Asocierea la bacteriurie a piuriei ( prezena puroiului n urin) pledeaz puternic pentru o infecie urinar. Recoltarea produselor patologice din tractul respirator. Pentru diagnosticul infeciilor respiratorii sunt utile: sputa, exudatul faringian, secreiile nazale i exudatul rinofaringian. Recoltarea exudatului faringian este indicat n urmtoarele situaii: - angine, faringite , posibil de etiologie bacterian(cel mai frecvent implicat Streptococcus pyogenes ), sau micotic ( Candida albicans ), amigdalite . - stabilirea originii focarului de infecie n scarlatin, reumatism articular acut, glomerulonefrit acut (complicaii poststreptococice); - detectarea purttorilor de Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphteriae, Staphilococcus aureus. Tehnic Recoltarea se face dimineaa, fr toaleta prealabil a cavitii bucale, pacientul nu va mnca, bea sau fuma nainte de recoltare.Se utilizeaz tampoane faringiene sterile, introduse n recipiente speciale ( eprubete sterile) care conin ser fiziologic sau un mediu special de transport; se pot folosi i recoltoare speciale asemntoare unor eprubete cu capac care le nchide ermetic i care conin mediul de transport n care se descarc tamponul faringian cu care s-a efectuat recoltarea.Pacientul va deschide gura larg, cu capul uor nclinat spre spate, i cu ajutorul tamponului faringian se terg pereii posteriori ai faringelui, amigdalele, i toate zonele inflamate, sau care prezint aspecte patologice

(secreii, ulceraii, false membrane, etc), evitnd atingerea luetei (declaneaz reflexul de vom),a obrajilor, limbii i buzelor, precum i contaminarea tamponului cu saliv.Dac proba nu va fi prelucrat n ora urmtoare, aceasta se poate pstra la frigider. Recoltarea secreiilor nazale este indicat n leucemii acute, pacieni propui pentru transplante, dializai, precum i n cadrul anchetelor epidemiologice, pentru stabilirea originii unor epidemii. Tehnica utilizeaz aceleai tampoane ca pentru exudatul faringian, dar de dimensiuni mai mici, i const n tergerea secreiilor din fosele nazale, urmat de descrcarea pe mediile de transport. Recoltarea secreiilor nazo-faringiene se face corect utiliznd sonde nazale flexibile care prezint o extremitate nfurat ntr-un tampon de vat, i care se introduc printr-o narin n nazofaringe. Indicaiile metodei sunt: - izolarea de pneumococi, meningococi sau Haemophilus influenzae; - n tuse convulsiv pentru izolarea agentului etiologic Bordetella pertussis - detectarea purttorilor de Neisseria meningitidis, implicat n etiologia unor meningite. Este indicat prelucrarea imediat a probei. Recoltarea sputei. Este important de neles i explicat pacienilor c sputa reprezint produsul provenit prin expectoraie, din profunzimea arborelui bronic, i nu trebuie confundat cu saliva sau cu secreiile rinofaringiene. Indicaii : - pneumonii bacteriene, cu Mycoplasma, de etiologie viral, sau micotic - tuberculoz pulmonar - bronit cronic - broniectazie( dilatarea patologic a bronhiilor) Tehnic. Pacientul va tui i va expectora ntr-un recipient steril, cantitatea necesar fiind n general de 1-3 ml, cu excepia suspiciunii de tuberculoz, cnd este necesar o cantitate mai mare.Se trimite la laborator i se prelucreaz imediat; sputa nu se poate pstra la frigider.La bolnavii cu tuse uscat, iritativ, neproductiv, se poate stimula secreia arborelui bronic prin aerosoli cu soluii hipertonice nclzite. Recoltarea materiilor fecale pentru coprocultur.n mod normal, n scaunul persoanelor aparent sntoase se pot gsi urmtoarele microorganisme: Candida albicans, Clostridia, Enterococcus, Escherichia coli, unele specii de Proteus, Pseudomonas aeruginosa, specii de Salmonella, Staphilococcus. Prezena Candidei albicans, n cantitate mare, dup tratamente cu antibiotice, este considerat patologic; modificarea florei intestinale normale sub aciunea antibioticelor determin frecvent transformarea unor microorganisme saprofite n patogene. Materiile fecale reprezint produsul patologic cu cea mai mare ncrctur de bacterii, fungi, virusuri, att sub aspectul numrului ct i a varietii lor.De rutin, coprocultura se efectueaz pentru depistarea urmtorilor ageni patogeni: Salmonella, Shigella, Campylobacter, Escherichia coli enteropatogen ( la nou-nscui) i stafilococi n cultur pur.De regul, o coprocultur negativ nu infirm diagnosticul de infecie bacterian, de aceea n prezena semnelor clinice de infecie bacterian se recolteaz trei coproculturi, dac primele dou au fost negative.n cazul coproculturilor pozitive, n scop profilactic, de prevenire a rspndirii infeciei, att contacii direci ct i bolnavul convalescent vor trebui s aib trei coproculturi negative. Tehnic. Se recolteaz scaunul emis spontan, n recipiente sterile, fr urme de urin.Din aceste recipiente se trece o cantitate mic, n coprorecoltoare speciale (recipiente de form cilindric, prevzute cu un capac cu linguri), incluznd toate fragmentele cu aspect patologic: urme de snge, mucus, puroi, etc.Este bine ca examinarea lor s se

10

efectueze n cteva ore de la recoltare;dac nu este posibil, se pot conserva n soluii saline glicerolate. Recoltarea secreiilor i a puroiului din plgi infectate. n plgi se pot gsi specii ale urmtoarelor microorganisme, patogenitatea lor fiind dependent de numrul lor: Actinomyces, Bacteroides, Clostridium perfringens sau alte specii, Escherichia coli i alte enterobacteriaceae, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Staphylococcus (mai ales S. epidermidis), Streptococcus, maifrecvent speciile faecalis i pyogenes. Trebuie acordat o atenie deosebit speciilor anaerobe, a cror prezen este constant n cile respiratorii superioare, tubul digestiv, cile urinare, de unde pot invada cu uurin ntreg organismul, determinnd infecii grave, septicemii, adeseori cu sfrit letal.Urmtoarele produse patologice conin cel mai frecvent ageni patogeni cu semnificaie clinic deosebit: - puroiul provenind din plgi profunde sau abcese, n special cnd sunt nsoite de un miros fetid; - esuturile necrozate din gangrena gazoas; - secreii provenite din plgi din vecintatea unor membrane mucoase; - lichidul drenat din plgi postoperatorii; - lichidul ascitic; Tehnic. Recoltarea n cazul unor colecii deschise se face prin tergere cu ajutorul unor tampoane sterile care se introduc apoi n recipiente care se nchid ermetic; n cazul coleciilor nchise, recoltarea se face prin puncionare i aspirare cu un ac gros, dup dezinfecia prealabil a tegumentelor cu tinctur de iod ; pe ct posibil, se procedeaz n aa fel nct contactul cu oxigenul s fie ct mai redus (pentru a favoriza dezvoltarea anaerobilor).Incubarea se face obligatoriu n condiii de aerobioz i anaerobioz.Dac plaga este uscat, tampoanele se umezesc n soluie salin steril. Examenul macroscopic al puroiului sau exudatelor recoltate, poate furniza uneori informaii importante: - puroiul de etiologie streptococic are un aspect seros, este subire; - puroiul stafilococic este gelatinos; - prezena bacilului pioceanic (Pseudomonas aeruginosa) d o culoare verzui- albstruie; - n actinomicoz, puroiul are aspect granulos, sulfuros; Recoltarea secreiilor uretrale. Indicaia cea mai frecvent este n diagnosticul uretritelor specifice (uretrita gonococic, produs de Neisseria gonorrhoeae), i a celor nespecifice ( chlamidiazic, bacteriene, virale, micotice, trichomoniazice). Tehnic. La brbat se face toaleta organelor genitale externe cu ser fiziologic steril, apoi cu ansa se prelev secreia de la nivelul meatului uretral.Recoltarea se face dimineaa, nainte de urinare.

11

MEDIILE DE CULTUR Majoritatea bacteriilor i ciupercilor pot fi cultivate n laborator pe medii inerte, acelulare, iar restul microorganismelor, cum sunt bacteriile cu habitat obligatoriu intracelular (rickettsi, chlamydii) i virusurile, pe culturi de cellule, ou embrionate precum i pe animale de experien. Mediile de cultur asigur condiiile necesare dezvoltrii i multiplicrii bacteriilor, n vederea izolrii i identificrii lor. Aceste condiii sunt: - s asigure substane nutritive necesare creterii i reproducerii celulei bacteriene (ap, azot, surs de carbon, factori de cretere, vitamine, minerale). - s aib un Ph corespunztor dezvoltrii bacteriilor n general 7,2 7,4 cu excepia brucelelor 6,8 i a vibrionului holeric ph=9 - s asigure condiii de aerobioz sau anaerobioz - s fie sterile i meninute n recipiente sterile, care s mpiedice contaminarea nainte i dup nsmnare - s fie clare, pentru a putea permite observarea oricrei modificri aprute, pentru a asigura studiul caracterelor culturale. Clasificarea mediilor de cultur Mediile de cultur se pot clasifica dup mai multe criterii : 1. Dup provenien : a. naturale (cartoful, laptele) b. artificiale- simple bulionul - agarul - complexe bulion+ser+ascit sau snge - geloz+ser+ascit sau snge c. sintetice mediu Sauton, etc. 2. Dup scop i compoziie : a. medii uzuale : bulionul i geloza b. medii speciale sau complexe - medii albuminoase : - mediul Loffler (ser coagulat) - mediul Dorset (cu ou) - bulionul cu adaos de ser, snge sau ascit ; - geloz cu adaos de ser, snge sau ascit ; - medii de diagnostic : sunt bazate pe fermentarea unor hidrai de

12

carbon, care vor vira culoarea unui indicator de ph.Nu este singura metod utilizat, de exemplu mediul Wilson Blair pentru Salmonele conine ca factor selectiv verdele briliant, factorul de diagnostic fiind producerea de H2S. Reacia indicatoare este formarea sulfitului de bismut negru cu luciu metalic. - medii de imbogire - ce favorizeaz n mod selectiv dezvoltarea anumitor specii bacteriene din produsul patologic cu flor asociat (mediul Muller Kauffmman). - medii selective: sunt medii complexe ce conin elemente care mpiedic dezvoltarea unor germeni permind selectarea altora, uor de recunoscut pe baza unor caractere metabolice (mediul Wilson-Blair, Istrati-Meitert, Tinsdal). - medii speciale- sunt acele medii pe care se cultiv numai anumite bacterii ca de ex: Lvenstein Jensen pentru bacilul Koch, mediul Tinsdale pentru bacilul difteric, mediul Bordet- Gengu pentru bacilul tusei convulsive. 3 Dup starea fizic: a. medii lichide (bulionul, apa peptonat) b. medii solide (geloza, etc) semisolide (geloza 0,5%) 4. Dup coninutul n oxigen molecular: a. medii aerobe b. medii anaerobe (mediul Tarozzi i geloza Veillon).

c.

Prepararea mediilor uzuale Mediile uzuale sau simple sunt medii artificiale pe care se dezvolt cea mai mare parte a germenilor patogeni. Prin medii uzuale nelegem bulionul i geloza. Bulionul este un decoct de carne la care se adaug pepton i clorur de sodiu. Decoctul de carne se prepar din carne slab de vit sau de cal care se cur de oase, tendoane, aponevroze grsime, se toac la main, iar la 1 kg se adaug 2000 ml ap de la robinet. Se las la macerat la rece 24h. n acest interval se realizeaz autoliza esuturilor i solubilizarea produselor de autoliz n ap. Se fierbe apoi 30' , pentru a accentua dizolvarea substanelor solubile i a coagula albuminele nehidrolizate, apoi se filtreaz prin tifon dublu sau hrtie de filtru. Decoctul de carne astfel obinut se repartizeaz n baloane nchise cu dopuri de vat i se sterilizeaz la autoclav.

13

Preparaea bulionului propriu-zis : la 1000 ml zeam de carne se adaug 5 g NaCl i 10 g pepton. Se fierbe n continuare pn la solubilizarea complet apoi se face corecia ph-ului. Se sterlizeaz din nou la autoclav. Peptonele menionate sunt amestecuri de substane care se obin prin hidroliza enzimatic sau acid a proteinelor de origine animal. Prin coninutul de peptide i aminoacizi constituie o surs de azot pentru bacteriile cultivabile. Prepararea peptonelor tehnic vorbind constituie patente de firm. Geloza simpl se prepar din bulion la care se adaug agar-agar. Agar-agarul este un gel extras dintr-o alg marin roie. Din puct de vedere chimic este un polimer al unui ester sulfuric al galactozei. Dup purificare este inodor, incolor, fr gust, i netoxic pentru microorganisme. Este insolubil n ap rece, dar solubil n ap la temperatura de fierbere. Dup rcire produce gelifierea mediului n concentraie de 0,5- 1%. Agarul nu are valoare nutritiv. Cultivarea bacteriilor pe medii solide a constituit un pas hotrtor n dezvoltarea microbiologiei n general i a diagnosticului bacteriologic n special. Marele avantaj const n faptul ca microbii nu se dezvolt n amestec ci n colonii izolate, putnd rezulta n final culturi ,, pure bacteriene. Mediile mbogaite sunt medii care au un aport nutritiv mbogit prin adugarea de snge, ascit, ser, zaharuri. Cel mai utilizat mediu de cultur mbogit este geloza snge 10% care se prepar prin adugarea a 10 ml snge la agarul topit i rcit la 45C. La noi n ar se folosete sngele de oaie. Pe acest mediu se observ dac bacteriile au sau nu activitate hemolitic. n prezent mediile de cultur de baz, precum i reactivii suplimentari care se adaug, sunt produse de firme specializate, existnd o adevrat industrie productoare de medii. La noi n ar mediile sunt preparate de institutul Dr. I. Cantacuzino, iar pe plan internaional, amintim : DIFCO (SUA), Merk (Germania), Unipath (Anglia), Biomerieux , Sanofi n Frana, etc.

14

IZOLAREA I IDENTIFICAREA BACTERIILOR DIN PRODUSELE PATOLOGICE Microbiologia clinic are rolul de a preciza: - etiologia unei infecii - stabilirea chimioterapicului cel mai performant - depistarea purttorilor sntoi de germeni patogeni. Metodele de laborator pentru diagnosticul infeciilor sunt directe i indirecte. Metodele directe constituie de fapt diagnosticul bacteriologic sau virusologic i constau n : - evidenierea direct prin microscopie - evidenierea antigenelor microbiene prin reacii imunoenzimatice, imunofluorescen, reacii de precipitare ; - tehnici de izolare i identificare a microbului infectat. Metode indirecte urmresc rspunsul immmmun umoral i celular la antigenele microbului (dg serologic i imunologic). ETAPELE IDENTIFICRII BACTERIILOR : 1. Recoltarea i transportul. Recoltarea este unul din punctele de ntlnire dintre laboratorul de microbiologie i clinic. Dac recoltarea nu este corect nici o tehnic de laborator nu va putea ndeprta aceast eroare. De aceea trebuie s se cunoasc : - care este produsul patologic n care se pot gsi bacteriile ; - momentul optim de recoltare ; - dac proba este steril sau conine flor normal ; - procedeul cel mai corect de recoltare ; - cantitatea necesar pentru fiecare prob ; - cum trebuie ambalat acel produs pentru a-l feri de contaminare - procedeele de conservare (se studiaz recoltarea produselor patologice : secreia nazal, faringian, sputa, sngele, puroiul, materiile fecale, urina, secreia uretral, secreia vaginal, secreia cervical, LCR). 2. Examenul direct: - macroscopic - microscopic - nativ - frotiu (din cultur sau din produs patologic)

15

3. nsmnarea pe medii de cultur 4. Identificarea culturilor 5. Antibiograma. Examenul macroscopic este foarte important att pentru diagnosticul n sine ct i pentru alegerea mediului de cultur cel mai corespunztor izolrii bacteriilor. n produse patologice ca : Sputa se va urmri aspectul acesteia o sput ruginie ndreptnd atenia spre o infecie pneumococic ; una verzuie spre b.piocianic; aspectul cremos spre stafilococ, o sput numular spre TBC. Mirosul fetid ndreapt atenia spre cercetarea germenilor anaerobi. Puroiul puroiul cremos stafilococ seros - streptococ verde - piocianic gronjos - actinomicoz cazeos - TBC Urina prezena de filamente atrage atenia spre o infecie gonococic. Lichidul cefalo- rahidian purulent atrage atenia spre etilogie meningococic sau cu ali germeni piogeni, pe cnd un lichid clar spre TBC sau etiologie virotic. Materiile fecale cu mucus i snge, ndreapt investigaiile spre dizenteria bacterian, fecale lichide cu grunji riziformi spre holer. Examenul microscopic direct sau prin frotiuri colorate A efectua un frotiu nseamn a etala pe o lam de sticl o poriune mic n strat subire din produsul patologic sau dintr-o cultur bacterian. Timpii efecturii unui frotiu : - etalarea pe lam - uscarea - fixarea - colorarea Studiul frotiului nu furnizeaz date n legtur cu : - morfologia bacteriilor (coci, bacili, spirili) - dispoziia lor (n ciorchine, n lan, n diplo) - relaia lor cu celelalte celule existente pe frotiu (intra- sau extracelular) - dac exist o singur specie sau mai multe - dac produsul este paucibacilar sau bogat n bacterii. Tehnica efecturii unui frotiu : Materiale necesare : PP sau cultur bacterian, lame de sticl curate i degresate, pipete Pasteur sau anse bacteriologice, flacr, colorani, microscop, oleu de cedru.

16

n cazul PP lichide se trece de cteva ori prin flacr vrful unei pipete Pasteur se deschide flaconul cu PP se flambeaz gura acetuia, se va absorbi o cantitate mic n pipet. Se nchide recipientul flambnd din nou gura acestuia. Se depune o pictur din PP pe mijlocul unei lame de sticl i se ntinde cu vrful pipetei. Pipeta se depune ntr-un recipient cu dezinfectant, iar frotiul se las la uscat. Din culturile de mediu solid se fac frotiurile depunndu-se n prealabil pe lam o pictur de ser fiziologic steril n care se va emulsiona o cantitate mic de cultur luat cu ansa. Fixarea este necesar pentru a face ca produsul s adere de lam, s omoare bacteriile, i s nlesneasc absorbia colorantului, pe suprafaa acestora. n acest scop se trece lama de 3-4 ori prin flacr ncalzind-o pe faa opus frotiului. O fixare prea insistent degradeaz germenii, iar fixarea insuficient are ca urmare splarea produsului de pe lam n timpul colorrii. Fixarea se poate face i cu substane chimice (sol May Grunwald, alcool metilic). Colorarea frotiurilor: Coloraiile pot fi simple cnd se utilizeaz un singur colorant, i combinate cnd acioneaz doi sau mai muli colorani. Colorarea se realizeaz datorit unor procese fizice i chimice care depind att de compoziia chimic a celulei bacteriene ct i de structura colorantului. Nucleo- proteinele din citoplasma celular mresc afinitatea pentru colorani bazici. De aceea se folosesc colorani bazici din grupa anilinei. Coloraia simpl cu albastru de metilen. Se acoper frotiul fixat cu colorantul, i se ine 1-2 minute. Se spal cu ap , se usuc i se examineaz la microscop. La examenul microscopic fondul preparatului apare colorat n albastru deschis, iar bacteriile n albastru nchis. Coloraia combinat Metoda Gram se acoper frotiul fixat cu sol violet de genian sau cristal violet 1 min. - se spal cu lugol i se acoper cu lugol 2 minute - se ndeprteaz lugolul i se decoloreaz cteva secunde cu alcoolaceton - se spal cu ap - se acoper lama cu sol de fuxin fenicat diluat 1 /10 - se spal cu ap - se usuc i se examineaz la microscop

17

Metoda Gram permite clasificarea bacteriilor n dou mari categorii : Gram pozitive i Gram negative. Bacteriile Gram positive apar colorate n violet nchis, cele Gram negative n rou. Explicaia diferenierii bacteriilor n Gram positive i negative este legat de cantitiile de lipoizi din membrana celular. Bacteriile Gram negative avnd o cantitate mai mare de lipoizi se dizolv dup tratarea cu alcool-aceton pierznd colorantul. Coloraia Gram se utilizeaz pentru studiul majoritii bacteriilor.

18

IZOLAREA I IDENTIFICAREA BACTERIILOR DIN PRODUSELE PATOLOGICE PARTEA A-II.A

Dup examinarea frotiurilor din produsele patologice, etapa urmtoare n diagnosticul bacteriologic este izolarea bacteriilor n culture pure. n acest scop produsele patologice se nsmneaz pe medii de cultur apreciate ca favorabile pentru speciile pe care le suspectm a fi ageni patogeni. Sunt obligatorii condiiile de asepsie boxe, camere sterilizate cu ultra violete pentru a evita contaminarea cu microflora aerului ambiant. nsmnarea se poate efectua direct pe medii favorabile sau pe medii mbogite (medii care prin substratul ce l conin inhib dezvoltarea selectiv a unor germeni, dar permite nmulirea bacteriilor pe care urmrim s le izolm). De obicei mediile de mbogire sunt lichide. n mod curent din produsul patologic se ia un mic fracment cu ansa sterilizat, se depune pe peretele eprubetei n apropierea nivelului de lichid, se spal peretele cu mediu de cultur prin nclinarea eprubetei. Se flambeaz gura eprubetei att la nchidere ct i la deschidere. Tuburile se noteaz i se introduc la termostat la 37C timp de 12- 18h. Cnd produsul patologic este recoltat cu tampon, acesta se cufund n mediul lichid. Prin aceste metode se urmrete s se obin izolarea bacteriilor n colonii individualizate i aprecierea existenei unei singure specii bacteriene n produsul patologic sau a mai multora. n acest din urm caz vor fi analizate numai cele aparinnd speciilor patogene. Tehnici de obinere a coloniilor izolate: Tehnica diseminrii produsului patologic pe medii solide Se flambeaz ansa, se ncarc cu produsul patologic, se descarc n striuri dense, continundu-se ,,epuizarea pe suprafaa unui alt mediu sau sector. Epuizarea se poate efectua pe geloz nclinat, descrcnd ansa succesiv pe suprafaa a 5-8 tuburi sau pe suprafaa mediului turnat n 2 plci Petri. n cazul produsului patologic recoltat cu tampon faringian se descarc pe o arie triunghiular a mediului turnat i cu o baghet de sticl n form de L se face diseminarea, printr-o micare de rotaie pe suprafaa mediului. Dup incubaie de 20- 24h la 37C se va observa o cretere confluent n zona n care s-a nceput nsmnarea i cu ct este distana mai mare de aceast zon voe fi colonii izolate, bine individualizate.

19

Tehnica diluiilor succesive n medii lichide Se pregtesc pe un stativ 6-10 eprubete cu mediu de cultur lichid. n primul tub se nsmneaz produsul patologic cu ansa sau pipeta Pasteur. Se trece o pictur n tubul 2, se omogenizeaz prin barbotare, apoi se trece o picturn tubul 3 i se continu astfel pn la ultimul tub. Se introduc la termostat la 37C pentru 20h. n ultimele tuburi se va gsi cte o simgur specie bacterian, cea care a fost cantitativ mai bogat. Tehnica combinat a diluiilor n mediu lichid i diseminarea pe mediu solid Tehnica este similar cu cea a diluiilor succesive doar c din ultimul tub se pune o pictur pe suptafaa unui mediu turnat n cutie Petri i se disemineaz cu ansa. Izolarea prin mijloace biologice Bacteriile pot fi izolate i chiar identificate prin inlocularea produselor patologice la animale de laborator. Animalele fac o boal cu manifestri tipice pentru o bacterie dat i din umorile sau esuturile acestora se poate izola agetul patogen.

20

ANTIBIOGRAMA
Antibiograma const n determinarea sensibilitii bacteriilor la antibiotice. Majoritatea moleculelor de antibiotice au fost grupate pe baza structurii lor chimice n familii de antibiotice; pe lng acestea, mai exist grupe mai mici, sau chiar molecule izolate. Principalele mecanisme de aciune prin care antibioticele reuesc s omoare bacteriile - efect bactericid -, sau cel puin s mpiedice multiplicarea lor, - efect bacteriostatic -, sunt: inhibarea sintezei peretelui celular; mpiedicarea sintezei proteice pe ribosomi; aciune asupra acizilor nucleici; inhibarea sintezei acidului folic; distrugerea membranei citoplasmatice; Clasificarea antibioticelor dup modul de aciune asupra bacteriilor: A. Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular: I. BETA- LACTAMICE: 1. Penicilinele ( cu administrare oral, injectabil, cu aciune retard, cu spectru ngust sau larg de aciune, sau rezistente la penicilinazele stafilococice), cum sunt Penicilinele V, G, Meticilina, Oxacilina, Ampicilina, Amoxicilina, etc. 2. Cefalosporinele ( de mai multe generaii). 3. Monobactami : Aztreonam. 4. Carbapenemi : Imipenem. 5. Inhibitori de betalactamaze: acidul clavulanic, sulbactam i tazobactam, n diferite combinaii, de exemplu: Augmentin (Ampicilin + Acid clavulanic), Amoxiclav (Amoxicilina + Acid clavulanic). II. GLICOPEPTIDE : Vancomicina; III. FOSFOMICINA, antibiotic nencadrat n familie,utilizat n asociere IV. CICLOSERINA V. BACITRACINA B. Antibiotice care mpiedic sinteza proteinelor pe ribozomi:

21

1. Aminociclitoli

Aminoglicozide:

Streptomicina,

Gentamicina,

Kanamicina, Neomicina; 2. Tetracicline : Tetraciclina, Doxiciclina ; 3. Fenicoli: Cloramfenicol; 4. Macrolide: Eritromicina, Lincomicina, etc; 5. Acidul fusidic; C. Antibiotice cu aciune pe acizii nucleici: asupra sintezei ADN : 1. Quinolone: Acidul nalidixic (Negram), Fluoroqinolone: Ciprofloxacin, Ofloxacin, etc. 2. Nitrofurani : Nitrofuran ( Furazolidon); 3. Nitroimidazoli : Metronidazol, Tinidazol; asupra sintezei ARN: 4. Rifamicine : Rifampicina ( Sinerdol) ; D. Antibiotice care inhib sinteza acidului folic: 1. Sulfonamidele ( Sulfametoxazol, Sulfatiazol, Sulfatiazina, etc.); 2. Diaminopirimidine:Trimetoprim, Sulfametoxazol + Trimetoprim Biseptol ); 3. Sulfone : antibiotic de excepie, antilepromatos ( Dapsona); 4. Acid paraaminosalicilic PAS; E. Antibiotice cu aciune pe membrana citoplasmatic: 1. Peptidele ciclice : Polimixinele ( Polimixina B, Colimicina, etc.); 2. Gramicidina; Sensibilitatea germenilor la antibiotice se determin prin concentraia minim inhibitorie (CMI) de antibiotic care n condiii standard inhib ( mpiedic) creterea germenilor respectivi, i prin concentraia minim bactericid (CMB) de antibiotic care n condiii standard are efect bactericid.Ambele valori se exprim n mcg /ml i se raporteaz la nivelul minim, respectiv maxim pe care l poate realiza antibioticul respectiv n ser ( umori). Dac att raportul dintre nivelul seric minim (Nsm) i CMI sau CMB ct i raportul dintre nivelul seric maxim (NsMx) este supraunitar, tulpina bacterian testat este sensibil la antibioticul respectiv. Dac raportul Nsm / CMI sau CMB este subunitar, iar raportul MsMx / CMI sau CMB este supraunitar, tulpina bacterian testat este moderat sensibil. (

22

Dac ambele rapoarte sunt subunitare, tulpina testat este rezistent. Determinarea CMI se realizeaz pe culturi pure, prin mai multe metode, dintre care mai frecvent se utilizeaz tehnica diluiilor pe medii lichide i tehnica difuzimetric n gel. Vom detalia n continuare, determinarea CMI prin tehnica difuzimetric n gel: Principiu: pe medii de cultur gelozate ( n general, mediul Mueller-Hinton) se aplic microcomprimate de antibiotice care difuzeaz prin mediu, realiznd concentraii din ce n ce mai mici. Mediul de cultur se nsmneaz n striuri dense cu o cultur pur a bacteriei de testat, se aplic antibioticele pe suprafaa nsmnat i se termostateaz 24 de ore la 37 o C. Bacteriile vor crete pe suprafaa mediului pn n zona unde n momentul multiplicrii lor, antibioticele difuzate se vor afla la o concentraie egal cu CMI. Astfel, n jurul antibioticelor la care bacteria este sensibil, vor aprea zone de inhibiie de dimensiuni mai mari sau mai mici, n funcie de gradul de sensibilitate fa da fiecare antibiotic. Citirea se face cu ochiul liber, msurnd diametrul zonei de inhibiie n mm, care se compar cu valorile nscrise ntr-un tabel standardizat pentru fiecare laborator, n funcie de condiiile specifice de lucru, rezistent. Metoda permite i identificarea antibioticelor cu aciune sinergic ( a cror asociere este recomandat) , respectiv a celor cu aciune antagonist ( care nu se asociaz). Dac dou antibiotice sinergice sunt plasate pe mediul de cultur una n vecintatea celeilalte, se constat c zona de inhibiie care apare ntre ele este mai mare, pentru c acolo au acionat ambele antibiotice; dimpotriv, n cazul a dou antibiotice care i antagonizeaz efectele, zona de inhibiie dintre ele va fi de diametru mai mic. n prezent, unele laboratoare utilizeaz metoda modern de determinare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice, care este computerizat, prin sistemele Bactec, reducerea timpului de lucru i creterea fiabilitii rezultatelor. Buletinul de antibiogram va cuprinde obligatoriu, pe lng datele generale nscrise n orice buletin de analiz, toate antibioticele testate ,inclusiv pe cele la care tulpina rezistent prezint rezisten. avantajele fiind exprimnd rezultatele prin sensibil, intermediar sensibil i

NOIUNI GENERALE DESPRE IMUNITATE

23

Imunitatea organismului uman este asigurat prin: 1. Rezistena (imunitatea) nespecific (natural, constitutiv), realizat la rndul ei prin: - linia I de aprare, reprezentat de piele i mucoase, factori de aprare la poarta de intrare; - linia a-II-a, reprezentat prin factorii tisulari: - celulari - polimorfonuclearle i sistemul fagocitar mononuclear SFM; - umorali - de natur proteic; 2. Rezistena specific (dobndit ): - spontan - pasiv, transplacentar i - activ, prin boal - artificial pasiv, prin administrarea de seruri imune ( care conin anticorpi specifici); - activ, prin vaccinri Reaciile serologice sunt utilizate n diagnosticul de laborator indirect, serologic sau imunologic al unor boli infecioase i constau n detectarea anticorpilor specifici din serul pacienilor, produi ca rspuns la ptrunderea unui antigen ( bacterii, virusuri,etc.) n organism. Aceste determinri pot fi calitative, sau cantitative, exprimate prin titruri de anticorpi.n prezent, ne stau la dispoziie mai multe tipuri de teste, folosite n funcie de specificul necesitilor de diagnostic, precum i de dotarea laboratorului respectiv: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Precipitare. Aglutinare. Reacia de fixare a complementului RFC. Fluorescen. Marcarea cu radio- izotopi ( RIA Radioimmunoassays) Msurarea activitii enzimatice ( ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays) Noiuni generale despre anticorpi. Anticorpii sunt imunoglobuline care mediaz imunitatea umoral; ei pot fi detectai prin electroforez ELFO , unde migreaz cu fraciunea , , i cea mai mare parte cu globulinele serice. Structura anticorpilor este asemntoare literei Y, fiind constituii din 2 lanuri grele H ( heavy) i 2 lanuri uoare L ( light), unite ntre ele prin puni disulfidice S - S; n microscopia electronic se vede c fiecare molecul de anticorp este format din 2 fragmente Fab ( antigen- binding = care leag antigenele ), de unde rezult bivalena anticorpilor, care sunt capabili s fixeze cte 2 molecule de antigene.Experimental, prin digestia enzimatic cu papain a unei molecule de Ig G , de exemplu, se obin 2 fragmente Fab i 1 fragment Fc ( cristalizabil). Fab determin specificitatea anticorpilor, prin cei 107 aminoacizi terminali situai pe lanurile H ct i pe cele L; acest segment este denumit regiune variabil (variabilitatea aminoacizilor din aceast regiune determin specificitatea anticorpilor); restul din Fab i Fc este regiunea constant ( CH iCL). Clasele de imunoglobuline IgM, IgA, IgG, IgD, i IgD sunt determinate de tipul lanului greu din imunoglobulina respectiv. ANTIGENELE

24

Orice substan capabil s produc n organismul gazd un rspuns imun i s reacioneze specific cu celulele mediatoare sau moleculele rezultate, este un antigen. Anticorpii Ac produi de limfocitele B ( LB) sensibilizate, reacioneaz numai cu poriuni foarte mici din antigen Ag, numite epitopi, iar restul moleculei se numete carrier. Epitopii determin specificitatea Ag. Molecula carrier, numit i antigen parial, determin antigenicitatea, dar nu poate reaciona specific cu anticorpii; ea stimuleaz limfocitele T ( LT) sensibilizate de macrofage.Haptena sau Ag incomplet, const din epitopi separai de molecula carrier, poate reaciona specific cu Ac, dar nu induc un rspuns imun.

AGLUTINAREA Aglutinarea const n aglomerarea n grmezi a celulelor bacteriene dintr-o suspensie iniial omogen, sub influena anticorpilor specifici. Dup aspect, aglutinarea poate fi: - de tip H, sau flagelar, determinat de antigene situate pe flagelii celulei bacteriene; este o aglutinare n grmezi mari, asemntori fulgilor de zpad, lax, i care se desface uor prin agitare. - De tip S, sau somatic, cu antigene situate pe peretele bacterian, este fin, granular, omogen i nu se desface prin agitarea tubului. Reacia de aglutinare prezint 2 caracteristici: - sensibilitate, adic reacia se produce i dac serul care conine anticorpii este diluat foarte mult; diluia cea mai mare de ser la care reacia nc se mai produce, se numete titrul serului aglutinant. - specificitate, adic Ag reacioneaz ntotdeauna cu Ac specifici. Aplicaiile reaciei de aglutinare: - reacii de sero-diagnostic, n care se evideniaz i titreaz Ac din serul bolnavilor folosind ca Ag diferite bacterii (agenii etiologici ai b0lii pe care dorim s-o diagnosticm). - identificarea unor bacterii, folosind seruri aglutinante, care conin Ac specifici. Reaciile de aglutinare pot fi efectuate pe lam (calitativ), sau n tuburi( cantitativ). Un exemplu de aplicaie a acestor reacii sunt unele boli febrile, cu debut i evoluie pn la un moment dat asemntoare, n care diferenierea se face tocmai pe baza unor reacii de aglutinare; este cazul febrelor tifoide i paratifoide (Salmonella typhi i paratyphi A,B, C), tifosul exantematic (Ricketssioz), bruceloz (Brucella), tularemie (Francisella).n toate aceste infecii, titrul anticorpilor este variabil, n funcie de faza evolutiv a bolii, sau dac persoana a fost vaccinat n antecedente sau nu. n general se efectueaz dou determinri, la interval de 710 zile, o cretere de 4 ori a titrului anticorpilor la a doua determinare, fiind considerat semnificativ pentru diagnosticul de boal. n febra tifoid i febrele paratifoide se practic reacia Widal, cantitativ, n tuburi, n care se pun n contact diluii succesive ale serului de bolnav (Ac) cu o cultur vie de bacili tifici i paratifici A i B, forme flagelate (Ag).n cazul n care serul bolnavilor conine anticorpi aglutinani antitifici, suspensia bacterian va fi aglutinat. n bruceloz, se pot efectua reaciile de aglutinare n tuburi, dup procedeul Wright, sau pe lam, Huddleson. n reacia Wright se pune n contact serul bolnavilor cu o cultur formolizat de brucele (antigen Wright).Se realizeaz diluii succesive ale serului n tuburi, i reacia este considerat pozitiv, dac dup 24 de ore la 37oC i o or la temperatura camerei,

25

dup agitarea tuburilor, depozitul rezultat se desface n grunji fini.Reacia este negativ dac lichidul din tuburi rmne tulbure.n reacia Huddleson, se folosete o suspensie fenolat de brucele ca antigen, care se pun n contact cu serul de cercetat, pe lam, iar interpretarea rezultatelor este calitativ. n tifosul exantematic, produs de Rickettsia Prowazecki se practic reacia Weil-Felix, n care se pun n contact diluii succesive ale serului de bolnav cu antigenele standardizate, nericketsiene, reprezentate de o suspensie de bacil Proteus OX 19.Reacia Kudicke-Steuer este un procedeu rapid, de diagnostic orientativ, efectuat n marile epidemii, cnd este necesar examinarea unui numr foarte mare de probe;se efectueaz pe lam, folosind o pictur de snge periferic cu o pictur de antigen Proteus.Reacia este pozitiv cnd pe lam apare aglutinarea. Datele de mai sus sunt prezentate sintetic in tabelul de mai jos: Numele Tipul reaciei Boala Agentul etiologic Antigenul folosit reaciei serologice Widal Aglutinare Febrele tifoide Salmonella typhi Bacili tifici i cantitativ i paratifoide i paratyphi A, B, paratifici, forme C flagelate Wright Aglutinare bruceloz Brucella Cultur formolizat de cantitativ Brucella( atg. Wright) Huddleson Aglutinare bruceloz Brucella Suspensie fenolat de calitativ Brucella Weil - Felix Aglutinare Tifos Rickettsia Antigene cantitativ exantematic prowazecki nerickettsiene: cultur de proteus OX19 KudickeAglutinare Tifos Rickettsia Proteus OX 19 Steuer calitativ exantematic prowazecki

26

REACIA DE PRECIPITARE n testele de precipitare are loc o reacie ntre antigene solubile i anticorpii specifici acestora; la locul de ntlnire al celor dou soluii, rezult un precipitat vizibil cu ochiul liber, format din complexele antigen - anticorp.Reacia poate fi inhibat n situaia n care unul din cele dou componente se afl n exces, de aceea sunt folosite teste n care difuziunea antigenelor i a anticorpilor s se fac ct mai lent, pn se atinge concentraia optim pentru reacie.Zona n care se atinge aceast concentraia optim se numete zon de echivalen, n care nu mai exist antigene sau anticorpi liberi i are loc precipitarea complet a acestora.Anticorpii care particip la reacia de precipitare se numesc precipitine, iar antigenele, precipitinogene.Anticorpii cu eficien mai mare n reaciile de precipitare aparin claselor IgG, IgM i IgA, n timp ce IgE i IgD nu mediaz reacii de precipitare. Ca mecanism de producere, precipitarea are loc datorit divalenei anticorpilor ( structura Ig, fragmentul Fab), deci fiecare monomer are cel puin dou situsuri de legare pentru antigene; antigenele la rndul lor, au n majoritatea cazurilor mai muli epitopi, deci pot lega mai muli anticorpi.Se formeaz numeroase complexe antigen-anticorp, dispuse ntr- o reea care precipit n soluie. Formarea acestei reele depinde de concentraiile relative ale celor dou componente; dac anticorpii sunt n exces, fiecare antigen poate fi legat de mai muli anticorpi, astfel nct formarea reelei este compromis; dac antigenele sunt n exces, anticorpii nu sunt suficieni pentru a forma puni cu antigenele. Testele de precipitare pot fi calitative ( n mediu lichid i gelificat), i cantitative. Reacia de precipitare n inel este un test n mediu lichid, n care antigenul i anticorpii aflai n soluie, sunt pui n contact n tuburi nguste de precipitare; n zona de echivalen, la interfaa celor dou lichide se formeaz un inel de precipitare de culoare alburie; reacia era utilizat pentru determinarea grupelor de streptococi, dup tehnica Lancefield, i n medicina legal, pentru precizarea originii umane sau animale a unor pete de snge ( reacia Uhlenhuth). Difuzia simpl n gel const n ncorporarea anticorpilor n geloz, peste care se aplic soluia cu antigene, care vor difuza prin mediul gelificat (metoda Oudin, nu se mai utilizeaz n prezent) Dubla difuzie n gel const n introducerea ambelor componente n geloz; n metoda Oakley - Fulthorpe anticorpii sunt separai de antigene printr-un strat subire de geloz; aceasta va avea ca rezultat difuziunea celor dou soluii prin geloz i formarea unui inel de precipitare la locul de ntlnire n concentraie optim.Metoda Ouchterlony, folosit pentru detectarea de antigene sau anticorpi, este deosebit de util pentru detectarea mai multor antigene sau a mai multor anticorpi pe aceiai plac.Pentru aceasta se utilizeaz plcue speciale n care n stratul de geloz se decupeaz mai multe godeuri, n care sunt introduse antigenele i anticorpii; acestea vor difuza prin gel, i la locul de ntlnire dintre antigen-anticorp specific, n concentraie optim se formeaz linii de precipitare. Reacia are avantajul c permite identificarea unui complex antigen-anticorp dintr-un amestec de antigene i anticorpi. Se utilizeaz, de exemplu pentru determinarea unor enterotoxine n cazul toxiinfeciilor alimentare, sau pentru decelarea prezenei anticorpilor specifici n ser, n cazul unor infecii bacteriene( diagnostic indirect). Teste de precipitare cantitative. Imunodifuzia radial este folosit pentru determinarea cantitativ a proteinelor serice, a complementului, a numeroi anticorpi, etc. n metoda Mancini anticorpii sunt ncorporai n gel, iar antigenul introdus ntr-un godeu, este lsat s difuzeze prin gel.Alte godeuri conin diferite concentraii ale unui antigen standard cunoscut.n jurul fiecrui godeu se va forma un inel de precipitare, cu un diametru direct proporional cu concentraia antigenului din godeul

27

respectiv.Metoda permite determinarea unor antigene n concentraii de pn la aproximativ 1g/ ml. Diametrele antigenelor standard sunt reprezentate grafic sub forma unei funcii liniare, pe baza creia se determin valorile concentraiei antigenului necunoscut. Testul Mancini este folosit pentru determinarea concentraiei imunoglobulinelor serice. Imunoelectroforeza combin tehnica imunodifuziei cu electroforeza; migrarea moleculelor ncrcate electric se produce n geloz sau ntr-o matrice lichid de tipul acetatului de celuloz.Particolele ncrcate pozitiv vor migra spre catod, iar cele negative spre anod. Rata migrrii difer de la o substan la alta n funcie de ncrctura electric. Imunoelectroforeza se efectueaz n dou faze: nti ntr-un godeu decupat n geloz se introduce lichidul coninnd un antigen proteic, i seaplic n cmp electric; antigenul se va separa n componente distincte care vor migra de-a lungul unei linii paralele cu direcia curentului aplicat. Dup oprirea curentului electric, va ncepe difuzia radial a fiecrui component; paralel cu direcia de migrare electroforetic, se decupeaz un an n geloz, n care se introduce antiserul ( anticorpii) specific antigenului cercetat.Anticorpii vor migra prin gel, spre antigene, astfel nct la locul de ntlnire al celor dou componente, aflate n concentraia optim, se vor forma benzi de precipitare. Avantajul major al acestei metode este c ofer posibilitatea separrii unor componente antigenice aflate n amestecuri, ceea ce electroforeza simpl nu poate realiza, n cazul unor proteine cu mobilitate electroforetic identic; se pot astfel distinge pn la 39 de antigene separate dintr-un amestec.Tehnica are o larg aplicabilitate practic pentru determinarea componentelor proteice din ser, precum i pentru detectarea unor anomalii legate de imunoglobuline. Tehnica imunoelectric combin imunoelectroforeza cu imunodifuzia radial (Mancini), utiliznd viteza datorat electroforezei i cuantificarea antigenului prin tehnica Mancini.Sensibilitatea metodei este foarte mare, permind determinarea unor concentraii antigenice de numai 0,5 g/ ml i este utilizat pentru detectarea a diferii antigeni plasmatici, chiar i virali. Contraimunoelectroforeza este o tehnic care permite identificarea de antigene i/ sau anticorpi necunoscui care sunt forai s migreze n cmp electric unul spre cellalt. Plasai la polii opui ai cmpului electric, antigenele i anticorpii au ncrctur electric diferit, aa nct sub aciunea curentului electric ei vor migra spre polul electric opus, adic unul spre cellalt.La locul de ntlnire dintre antigene i anticorpii specifici, aflai n echivalen, va aprea o linie de precipitare. Tehnica este folosit n laboratoare de cercetare pentru aprecierea rspunsului imun n diferite mbolnviri, ca i pentru detectarea de diferite antigene bacteriene sau tisulare, anticorpi ( ntr-o or), sau pentru identificarea unor bacterii din mediile de cultur, dup o incubaie scurt. Este utilizat curent n diagnosticul hepatitelor virale de tip B.

28

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI Reacia de fixare a complementului ( RFC ) se bazeaz pe capacitatea unor anticorpi serici din clasele Ig M i IgG de a fixa (lega) complementul seric, n prezena antigenelor specifice.Complementul seric, notat C' , reprezint un complex de proteine serice, care pot fi fixate de anticorpii amintii n cursul reaciilor imune.Antigenele care determin formarea anticorpilor fixatori de complement pot fi de natur tisular, hormonal, enzimatic, bacterian sau viral. R.F.C. poate detecta concentraii foarte mici de antigen, de pn la aproximativ 1 g /ml, care nu produc o reacie vizibil prin alte mijloace, de exemplu teste de aglutinare sau de precipitare. Reacia i gsete o larg aplicabilitate practic n diagnosticul uno viroze, infecii cu fungi sau bacteriene, un exemplu n acest sens fiind RFC Wassermann utilizat larg n diagnosticul serologic al sifilisului. Reacia poate fi calitativ sau cantitativ i se poate desfura n tuburi, n plci mici de plastic pentru titrri de anticorpi, sau chiar n sisteme automatizate. n principiu, RFC se desfoar n 2 etape: - n prima etap se pun n contact antigenele cunoscute cu serul de cercetat i complementul, i se las la termostat la 37 C , 30 de minute sau mai mult.Serul de cercetat este n prealabil inclzit la 56C, 30 de minute, pentru inactivarea complementului propriu. n aceast etap reacia nu este vizibil, deoarece toate componentele sunt solubile. - n etapa a 2-a se adaug n reacie hematii de oaie sensibilizate (tratate cu anticorpi antihematii de oaie), care n prezena anticorpilor din serul de cercetat i a complementului sunt rapid lizate, ceea ce determin o reacie vizibil cu ochiul liber.Dac ns n prima etap complementul a fost consumat n reacia dintre antigene i anticorpii din serul de cercetat, n a doua etap nu va mai exista complement liber, i deci nu se mai produce hemoliza ( liza hematiilor de oaie). Ca urmare, interpretarea rezultatelor RFC, este urmtoarea: - prezena hemolizei la sfritul reaciei semnific un rezultat negativ, deci absena anticorpilor specifici n serul de cercetat - Absena hemolizei semnific un rezultat pozitiv, adic existena anticorpilor specifici n serul de cercetat TESTUL E.L.I.S.A.( enzyme-linked immunosorbent assays) Tehnica ELISA se bazeaz pe urmtoarele 2 principii: 1. Proprietatea anticorpilor i a unor antigene de a fi adsorbii pe suprafaa godeurilor plcilor de polistiren i n acelai timp de a-i pstra ntreaga capacitate imunologic. 2. Att antigenele ct i anticorpii pot fi legai de enzime i complexul format i pstreaz att proprietile imunologice ct i pe cele enzimatice.

29

FAMILIA MICROCOCCACEAE GENUL STAPHYLOCOCCUS

Familia Micrococcaceae cuprinde mai multe genuri, dintre care interes medical prezint genul Staphylococcus, cu speciile principale: - S. aureus, responsabil de majoritatea infeciilor stafilococice la om; - S. epidermidis, mai frecvent saprofit, dar poate da infecii cutanate, n condiii de scderea rezistenei organismului; - S. saprophyticus, rar incriminat n patologie, poate fi cauza unor cistite; Speciile genului Staphylococcus sunt foarte rspndite, ele sunt saprofite ale tegumentelor i mucoaselor, se gsesc n cavitile naturale ale omului ( buco-faringe, fose nazale, tub digestiv), dar i n mediul extern (aer, praful din ncperi, etc). Caractere morfologice i tinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu dimensiunile ntre 0,71,2 m, dispui n grmezi de forma ciorchinilor de strugure, n perechi sau izolai, imobili i necapsulai, aerobi i facultativ anaerobi. Caractere culturale: cresc pe medii uzuale cu adaos de NaCl, cum ar fi mediul Chapmann hiperclorurat; tulbur uniform mediile lichide,iar pe mediile solide dau colonii rotunde, bombate, opace, cremoase, lucioase, de 1-3 mm, cu suprafaa neted ( colonii tip S). - coloniile de S. aureus produc un pigment de culoare auriu-glbuie, care era considerat un criteriu de patogenitate.n prezent acest lucru nu mai este valabil, deoarece s-a constatat existena a numeroase colonii albe sau citrine patogene; pe geloza snge, produce de obicei hemoliz. - S. epidermidis crete sub form de colonii albe, rar hemolitice; - S. saprophyticus d colonii alb- murdare, nehemolitice; Structura antigenic este foarte complex, principalele antigene fiind: - antigene specifice de specie , de natur polizaharidic; - antigene celulare: o Capsula responsabil de virulena S.aureus; o Proteina A , determin producerea de anticorpi specifici, are rol antifagocitar i n mecanismele de agresivitate ale stafilococilor; o Factorul de aglutinare; - antigene extracelulare: o Coagulaza determin coagularea plasmei prin formarea unei substane asemntoare trombinei;dei rmne unul din testele de patogenitate cele mai importante pentru stafiloci, n prezent s-au identificat numeroase tulpini patogene coagulazo-negative; o Hemolizinele, de mai multe tipuri, sunt responsabile de zona de hemoliz produs pe gelozas snge (clar, de tip , respectiv tulbure, de tip ). o Leucocidina cu aciune citotoxic asupra neutrofilelor i macrofagelor. o Enterotoxinele, de 5 tipuri, notate cu majuscule de la A la E, determin toxiinfeciile alimentare stafilococice i enterocolite post-antibiotic. o Toxina 1 produce sindromul toxic stafilococic. o Toxina epidermolitic i exfoliant cu tropism cutanat, responsabil de sindromul pielii oprite.

30

o Enzime extracelulare : hialuronidaza, care favorizeaz penetrarea n esuturi, stafilokinaza, fosfolipaza, dezoxiribonucleaza, fibrinolizina, lipaze. Puterea patogen a stafilococilor.Dup mecanismul de producere, afeciunile produse de stafilococi se clasific n: 1. Afeciuni invazive , caracterizate prin abcese, cu localizri la nivelul: - tegumentelor i esut celular subcutanat: abcese, foliculite, furuncule, carbuncule, hidrosadenita ( infecia glandelor sudoripare din axil), mastite (infecia glandelor mamare); n toate aceste situaii, produsul patologic este puroiul, care se recolteaz prin puncionarea zonei celei mai confluente, cu un ac gros, steril. - sistemului osteo-articular i fanere: osteomielite, artrite, panariii; - seroaselor: pleurezii, artrite, sinusite. Produsul patologic este lichidul pleural, articular, sau tot puroiul, care se recolteaz prin puncionarea cavitilor respective; - sistemului nervos central: meningite (se recolteaz lichid cefalo-rahidian LCR prin puncie rahidian), abcese cerebrale; - aparatului uro-genital: cistite, septicemii post-partuum, septicemii post-abortum, alte infecii (metrite, salpingite, etc.). - sferei O.R.L. i al aparatului respirator: angine, faringite (rar), otite, sinusite, mastoidite, pneumonii i bronhopneumonii, abcese; - aparatului cardio- vascular: endo- i pericardite, flebite, septicemii . 2. Afeciuni toxigenice, produse de substanele extracelulare eliberate de stafilococii aurei: - toxiinfecia alimentar, determinat de enterotoxina stafilococic din alimente, care poate persista chiar dac bacteria a fost omort; produsele patologice sunt reprezentate de vomismente, materiile fecale, mostre din alimentele incriminate.Decelarea enterotoxinei se poate face prin teste de precipitare. - toxina epidermolitic i exfoliant este responsabil de sindromul exfoliativ, boala Lyell, stafilococia malign. - Sindromul toxico-septic stafilococic, determinat de toxina 1 a stafilococului, foarte grav, adesea cu sfrit letal. IMUNITATEA ANTIINFECIOAS.Aprarea celular se realizeaz prin fagocitz la poarta de intrare; aprarea umoral prin anticorpi specifici n infeciile stafilococice este de mic importan. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR. - se efectueaz la bolnavi i purttorii aparent sntoi i se bazeaz pe izolarea i identificarea stafilococilor n produsele patologice recoltate, urmat obligatoriu de demonstrarea patogenitii i testarea sensibilitii la antibiotice.Schematic, se parcurg urmtoarele etape: - recoltarea i transportul produselor patologice la laborator; - examenul macroscopic poate oferi unele indicaii orientative: puroiul stafilococic este galben-cremos, nchegat; - examenul microscopic prin frotiu colorat Gram, direct din produsul patologic; - izolarea pe mediile de cultur: dac produsul provine dintr-o colecie nchis, nsmnarea se poate face direct pe mediile uzuale ( bulion, geloza), pe care vor crete coloniile caracteristice descrise anterior.Dac puroiul provine dintr-o colecie deschis, deci a fost contaminat, se nsmneaz de mediul Chapmann hiperclorurat, care este un mediu lichid, de mbogire, de pe care se fac dup 24-48 de ore, treceri pe mediile uzuale.n cazul septicemiilor, se recolteaz snge, pentru hemocultur. - Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice ( frotiu colorat Gram efectuat din coloniile caracteristice) i culturale i este urmat obligatoriu de efectuarea testelor de

31

patogenitate: coagulaza, hemolizinele, fibrinolizina, catalaza, fermentarea manitei, demonstrarea toxigenezei (cnd este cazul). - Antibiograma este absolut necesar, n condiiile n care tratamentul infeciilor stafilococice este tot mai dificil, din cauza instalrii rapide a multichimiorezistenei.Este bine cunoscut rezistena la penicilin, datorit secreiei de penicilinaz, caracter care se transmite prin bacteriofagi translocatori, prin transfer de ADN. - fr a fi o regul, n general stafilococii sunt sensibili la Oxacilin, Dicloxacilin, Vancomicin, Meticilin, cefalosporine.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Streptococii sunt germeni cu o larg rspndire la om i la animale, avnd un numr mare de genuri, dintre care unele patogene pentru om, altele fcnd parte din flora normal a orofaringelui sau tractului gastro-intestinal.Cele mai importante specii patogene pentru om sunt: S. pyogenes, S. pneumoniae, S.faecalis, S. agalactiae, S. viridans. Caractere morfologice: coci Gram pozitiv, dispui n lanuri, sau n perechi, cu dimensiuni ntre 0,5 i 1m. Caractere culturale: streptococii cresc pe medii mbogite cu snge sau ser, cu adaos de glucoz; - pe mediile lichide, las mediul clar, cu depunere de grunji pe peretele eprubetei; pe geloza snge, dau colonii mici, pulverulente, mate, de culoare cenuiu-gri, i nconjurate de o zon de hemoliz foarte caracteristic anumitor tipuri: o alfa- hemoliza este incomplet, cu o tent verzuie, care apare mai ales la S.viridans i la pneumococi; o beta-hemoliza este foarte clar, fiind o hemoliz total, caracteristic S. pyogenes; o gamma-hemoliza nu este vizibil cu ochiul liber. Streptococii sunt aerobi i facultativ anaerobi, catalazo-negativi. S. pyogenes ( - hemolitic de grup A) Structura antigenic este foarte complex: polizaharidul C, determin specificitatea de grup (R. Lancefield, 1830), grupurile sunt notate cu majuscule, de la A la R; antigenele proteice M, prezente numai la grupul serologic A, responsabile de virulena acestora, au aciune antifagocitar, inhib migrarea leucocitar, este puternic imunogen.Pe baza acestui antigen, streptococii de grup A sunt mprii n tipuri ( n jur de 80 de tipuri). Antigenele proteice T, fr rol n virulen, cu importan epidemiologic; Antigene R cu rol biologic incomplet elucidat; Antigene extracelulare: o Streptolizina O (SLO), sintetizat de streptococii de grup A,C, i G, deosebit de important, cu efect cardiotoxic, leucotoxic i letal.Determin producerea n organism a anticorpilor specifici anti-streptolizin O, numii ASLO , al cror titru ridicat chiar de la nceputul complicaiilor reumatismale i renale sunt considerate ca avnd un rol important n patogenia lor; complexele SLO-ASLO pot precipita n esuturi, dnd fenomenul Arthus, sau se depun n

32

o o o o o

membrana glomerular i/ sau sinovial i mpreun cu complementul sunt responsabile de leziunile ce apar la acest nivel. Streptolizina S determin -hemoliza pe mediile de cultur, nu este antigenic; Toxina eritrogen Dick responsabil de erupia (rush) din scarlatin, este piretogen; Streptokinaza cu aciune fibrinolitic; Proteinaza determin leziuni ale miocardului i ale musculaturii scheletice; Hialuronidaza favorizeaz penetrarea esuturilor.

Puterea patogen. 1. infecii streptococice primare: - scarlatina, este o febr eruptiv, dat de toxina eritrogen, poarta de intrare pentru streptococ fiind faringele; - faringite, angine- sunt cele mai frecvente infecii streptococice; - infecii cutanate, de tip impetigo, intertrigo, erizipel, plgi infectate; - infecii genitale: febra puerperal, endometrite, etc. - infecii urinare; 2. complicaii poststreptococice precoce, supurative: limfadenit cervical, otit medie, sinusit, mastoidit, abcese peritonsilare, meningite, pneumonii, bronhopneumonii, endocardite severe. 3. complicaii poststreptococice tardive, nesupurative a. glomerulonefrita acut GNA- prin depunerea complexelor antigenanticorp la nivelul membranei bazale glomerulare; b. reumatismul articular acut RAA- prin mecanism de reacie ncruciat ntre anticorpii antistreptococici i fibrele striate ale miocardului (datorit asemnrii la nivel molecular a structurii antigenice). c. cardita reumatismal; d. coreea; e. eritemul nodos; f. purpura reumatoid; Imunitatea antiinfecioas este n special umoral, prin anticorpii antiprotein M i ASLO, care apar dup 7-8 zile de la debutul infeciei acute i ating un titru maxim la 3-4 sptmni.Dei valorile variaz n funcie de metoda folosit pentru titrare, n principiu, titruri de sub 200 uniti ASLO/ml semnific vindecare, n timp ce valori crescute care se menin n timp, nsoesc instalarea complicaiilor poststreptococice. - aprarea celular este puin important. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR se poate face direct prin izolarea i identificarea streptococilor n produsele patologice sau indirect, prin determinarea titrului de anticorpi ASLO, n dinamic. Diagnosticul direct (bacteriologic) parcurge schematic urmtoarele etape: prelevarea produsului patologic i efectuarea unui frotiu colorat Gram; izolarea pe medii de cultur cu adaos de glucoz; ( mediul special Pike pentru streptococi ), n cazul septicemiilor se face hemocultura; - identificarea se realizeaz pe baza mai multor caractere: morfologice i culturale, sensibilitatea la bacitracin, reacii de coaglutinare cu teste streptic. Diagnosticul indirect ( serologic) se bazeaz pe determinarea titrului de anticorpi ASLO n serul bolnavilor.Reacia este de tip cantitativ, folosind diluii succesive de ser peste care se

33

introduc cantiti fixe de streptolizin O. Titrul serului este dat de tubul cu diluia cea mai mare n care reacia de neutralizare dintre SLO i ASLO nc se mai produce. Antibiograma de regul nu este necesar, streptococii fiind n prezent nc sensibili la Penicilin. Streptococcus pneumoniae Este un germen condiionat patogen, cu habitat normal n cile respiratorii superioare ale omului, determinnd mbolnviri n condiii de scderea rezistenei organismului (favorizat de infecii respiratorii virale, alcoolism, diabet, subnutriie, obezitate, infecii cronice, boli consumptive, SIDA). Caractere morfologice: coci Gram pozitivi, dispui cte doi, cap la cap, n flacr de lumnare, ncapsulai (pe frotiul Gram, capsula apare sub forma unei zone clare n jurul bacteriei). Caractere culturale: pneumococii cresc pe medii cu adaos de ser sau snge i glucoz; (mediu special Truche). - tulbur uniform mediile lichide; - pe geloza snge, apar colonii n pictur de rou, translucide, cu o zon de hemoliz verzuie n jur. mbolnvirile mai frecvente sunt infecii ale aparatului respirator (pneumonia franc lobar acut, bronhopneumonii), infecii ORL, ale seroaselor (pleurezii, peritonite primare), i cutanate, de tipul abceselor. Structura antigenic i factorii de patogenitate sunt reprezentai de: - antigene somatice comune genului; - antigene capsulare, de natur plizaharidic, specifice tipului, i care sunt responsabile de virulena pneumococilor; - ali factori de patogenitate: hemolizina, hialuronidaza; Diagnosticul de laborator este direct, i const n izolarea i identificarea pneumococilor din produsele patologice; - examenul macroscopic al sputei poate fi foarte sugestiv, cnd este de culoare ruginie i are un aspect aerat; - pentru identificare, n afara caracterelor morfologice i culturale, se folosesc teste specifice: sensibilitatea la optochin, biloliza, fermentarea inulinei; - identificarea de tip se face pe baza antigenului capsular, printr-o reacie de aglutinare pe lam, cu seruri specifice de tip, reacie cunoscut i sub numele de umflare a capsulei. Antibiograma confirm n general sensibilitatea la peniciline.

34

FAMILIA NEISSERIACEAE GENUL NEISSERIA Genul Neisseria cuprinde coci Gram negativi, strict aerobi, dispui in diplo, reniformi, ca boabele de cafea aezate fa n fa, de obicei intracelulari, n citoplasma polimorfonuclearelor; pot prezenta capsul, sunt imobili i nesporulai.n cadrul familiei sunt descrise numeroase specii comensale, care fac parte din flora oportunist a organismului uman, i dou specii patogene specific umane: Neisseria meningitidis (meningococul) i Neisseria gonorrhoeae (gonococul). N. meningitidis Meningococul are habitatul n cile respiratorii superioare ale omului, aa nct el poate fi izolat din rino-faringele purttorilor sntoi, sau al bolnavilor de rino-faringit manifest.n condiii de scdere a rezistenei organismului, specii virulente traverseaz mucoasa faringian i pe cale sanguin ajung la nivelul meningelor, determinnd n principal urmtoarele dou manifestri clinice: - meningita cerebro-spinal acut epidemic; - septicemia meningococic ce evolueaz adesea cu oc endotoxinic, sau se complic cu o form de meningit deosebit de grav, cu evoluie fulminant i de obicei sfrit letal, numit meningita Waterhouse-Friedrichsen. n afara acestor forme clinice grave, meningococul mai poate fi incriminat n infecii rinofaringiene acute, infecii bronho-pulmonare, otite, sinusite, conjunctivite, mai rar pericardite. Structura antigenic este reprezentat de : - antigene poliozidice care dau specificitatea de grup; - proteina major parietal, responsabil de specificitatea de tip; - lipopolizaharidul LPS, care este o endotoxin cu aciune letal dac este injectat intravenos, i dermonecrotic, n injecii intradermice. Diagnosticul de laborator se bazeaz pe izolarea i identificarea meningococilor din produsele patologice; - se recolteaz LCR sau snge, din care se ntind frotiuri colorate Gram, prin care se evideniaz caracterele morfologice specifice genului.Aspectul macroscopic al LCR poate fi sugestiv pentru o meningit bacterian ( tulbure, hipertensiv, spre deosebire de meningitele virale i de etiologie tuberculoas, n care LCR este clar, limpede). - nsmnarea se face pe medii speciale n atmosfer de CO2 i pe geloz- snge,( colonii de tip S ). - identificarea se continu pn la identificarea de tip, prin reacii biochimice ( oxidaz, fermentarea unor zaharuri, etc), i / sau reacii serologice. Foarte important: LCR trebuie trimis i prelucrat la laborator n primele patru ore de la recoltare, deoarece meningococii sunt foarte sensibili i n mediul extern se autolizeaz.Transportul se realizeaz n termostat, la 37o C. Antibiograma se efectueaz ct mai repede posibil, dat fiind gravitatea n general ridicat a infeciilor meningococice.

Neisseria gonorrhoeae (gonococul) Gonococul este agentul patogen al gonoreii, boal cu transmitere sexual, cu importan deosebit n patologia uman.Evolueaz sub o form acut, care netratat, sau tratat incorect se cronicizeaz, dnd complicaii locale i la distan.

35

La brabai, se manifest sub form de uretrit gonococic, al crei principal semn clinic este secreia uretral, mai pronunat dimineaa.Evolueaz n timp spre epididimit, prostatit sau orhit. La femei, semnele clinice sunt uneori mai discrete, dar niciodat nu lipsesc complet.Evolueaz sub form de vaginit, metrit salpingite, anexite.Complicaiile posibile sunt sterilitatea secundar i sarcinile ectopice. Infecia gonococic a mamei se transmite ftului, care se va nate cu oftalmie gonococic, ce poate determina orbirea nou-nscutului.n mod profilactic, n materniti, se instileaz tuturor nou- nscuilor o pictur de nitrat de argint 1/ 00 n sacul conjunctival. Forme clinice maI rare de infecie gonococic, apar cnd gonococii traverseaz bariera epitelial i prin curentul sanguin ajung n membranele sinoviale ale articulaiilor determinnd artrite, sau ajung n diferite organe, determinnd abcese. Structura antigenic este reprezentat de : - un antigen capsular, cu efect antifagocitar - antigene proteice, care determin specificitatea de tip; - lipopolizaharidul; - lactamaza, care determin rezistena la peniciline. Diagnosticul de laborator. a. n uretrita gonococic acut , n general este suficient examinarea frotiurilor efectuate direct din secreia uretral.Recoltarea secreiilor trebuie fcut de un personal calificat, i este bine ca prelucrarea s se fac ct mai repede.Este indicat ca recoltarea s aib loc chiar n laborator (gonococii sunt foarte sensibili n mediul extern); la brbai se recolteaz pictura matinal, iar la femei secreia vaginal i din jurul colului uterin.Dac secreia este redus, se poate stimula prin injectarea n colul uterin a unei soluii hipertone de NaCl. - examenul macroscopic pune n eviden aspectul purulent, cremos, de culoare glbuie al secreiilor. - Frotiurile se ntind imediat i se coloreaz cu albastru de metilen, Gram sau cu una din coloraiile speciale (Pick-Jacobson, imunofluorescen).Aspectul frotiului n aceast faz acut este caracteristic, i de obicei suficient pentru diagnostic: diplococi Gram negativi, de forma boabelor de cafea care se privesc prin concavitile lor, dispui predominent intracelular , i cu absena altei flore bacteriene pe frotiu b. n uretrita gonococic cronic, diagnosticul este uneori dificil.Secreia uretral este frecvent mult redus, ceea ce ngreuneaz recoltarea ( este necesar stimularea secreiei prin diverse tehnici).Pe frotiu, apar gonococi dispui predominent extracelular, dar i intracelular, uneori cu morfologia modificat, necaracteristic. - se fac nsmnri pe medii speciale ( Peizzer-Steffen, Mueller- Hinton, geloz-chocolat, geloz cu adaos de snge sau ascit), i se incubeaz n atmosfer de CO2. Dup 24-48 de ore apar colonii de tip S, de 1- 1,5 mm. - Identificarea se face n continuare pe baza unor caractere biochimice, de metabolism i prin reacii serologice. Antibiograma pune deseori n eviden rezistena crescut la antibioticele uzuale. O gonoree cronic se consider vindecat dup 3 culturi negative, efectuate la interval de 3 sptmni.

BACILI AEROBI SPORULAI

36

Genul Bacillus cuprinde mai multe specii larg rspndite n natur, prezente deseori pe sol, dintre care cu importan deosebit n patologie este Bacillus anthracis (bacilul crbunos), agentul etiologic al crbunelui ( antraxului).Alte specii ale genului ( B. cereus) sunt incriminate n toxiinfecii alimentare, fiind productoare a unei exotoxine cu tropism intestinal, asemntoare celei produse de tulpinile enterotoxigene de B coli. Bacillus anthracis ( bacilul crbunos) A fost observat n 1850 sub forma unor filamente n sngele animalelor care mureau de antrax, dar a fost confirmat drept agent etiologic abia n 1863, iar n 1877, Pasteur a reuit s prepare un vaccin anticrbunos. Caractere morfologice i culturale. Este unul dintre cei mai mari bacili, avnd dimensiunile cuprinse ntre 1,5 / 4-8 , cu form de bastonae cu capetele tiate drept, Gram pozitiv, dispus izolat, sau n lanuri scurte, formator de spori, aerob, sau anaerob facultativ, imobil.Crete pe mediile uzuale, unde formeaz sporul, situat central, care nu deformeaz bacteria i este foarte virulent. - pe mediile lichide (bulion) formeaz un depozit floconos n mediul care rmne clar; - pe geloza-snge d colonii mari, mate, rugoase, de culoare glbuie (n cap de meduz). Structura antigenic este caracterizat prin: - antigen capsular de natur polipeptidic - antigen somatic polizaharidic - toxina proteic cu trei componente: antigenul protector, factorul letal i factorul de edem. Puterea patogen. Antraxul este o antropozoonoz ce evolueaz la ierbivore ( sub forma unei septicemii mortale), care se infecteaz prin sporii de pe sol, i care se poate transmite omului, frecvent ca boal profesional ( mcelari, tbcari, etc.) - contaminarea pe cale cutanat determin pustula malign, care apare ca o vezicul ce se infecteaz i se transform n pustul, nconjurat de o coroan de alte pustule, acoperite de o crust neagr.( de unde i denumirea bolii, de crbune), sau se poate produce edemul malign, care conine un exudat sanguinolent. - contaminarea respiratorie, prin inhalarea sporilor, determin crbunele pulmonar, manifestat sub forma unei pneumonii cu evoluie sever. - ptrunderea bacilului pe cale digestiv determin o enterit grav, cu diseminare pe cale sanguin (posibil n toate formele de crbune) i septicemie sau meningit. Patogenitatea este conferit de prezena capsulei, cu efect antifagocitar, care permite iniierea infeciei i difuzarea bacilului, iar semnele clinice sunt datorate prezenei toxinei , a crei concentraie n organism crete pe parcursul evoluiei, atingnd titrul maxim n momentul decesului. Diagnosticul de laborator se bazeaz pe izolarea i identificarea germenului n produsele patologice( pe baza caracterelor morfologice, culturale, biochimice) i pe o reacie serologic de precipitare cu ser anticrbunos, numit reacia Ascoli. Tratamentul se face cu Penicilin, n doze mari i ser anticrbunos administrat ct mai precoce, pentru neutralizarea toxinei crbunoase circulante. Profilaxia urmrete depistarea animalelor bolnave i izolarea lor, nu se recomand autopsierea cadavrelor de animale, care vor fi ngropate i acoperite cu var nestins.Persoanelor cu risc profesional li se poate administra vaccinul anticrbunos( conine anatoxin)

37

Familia Actinomycetaceae Genul Corynebacterium Specia Corynebacterium diphteriae

Genul Corynebacterium cuprinde mai multe specii comensale omului, prezente n faringe i pe tegumente (C.xerosis, C. hoffmanni, C.cutis communae), numii i bacili pseudodifterici, sau difteromorfi, datorit asemnrii morfologice cu bacilul difteric; acetia nu produc mbolnviri, dar pot determina confuzii de diagnostic, atunci cnd se izoleaz din produsele patologice.Ei trebuie difereniai de specia patogen, C. diphteriae, care este responsabil de toxiinfecia difteric, caracterizat prin: - cantonarea bacilului difteric la poarta de intrare- faringe-, unde se nmulete i produce toxina; - producerea de exotoxin, care difuzeaz n organism pe cale sanguin i este responsabil de fenomenele toxice la distan. Clinic, difteria, se manifest prin: - angina pseudomembranoas, caracterizat de prezena de false membrane fibrinoase, foarte aderente la faringe, pilierii amigdalieni, vlul palatin, evolueaz spre laringe,putnd poduce asfixia mecanic prin obstruarea cilor respiratorii; - toxemia difteric, cu leziuni la nivelul glandelor suprarenale, rinichi, miocard, i ale sistemului nervos periferic, cu paralizii. - Localizri mai puin frecvente sunt la nivelul mucoaselor nazale, conjunctivei, sau a plgilor chirurgicale i arsurilor. Complicaiile sunt foarte grave, reprezentate de miocardit,polinevrite, sindroame hemoragice, toate determinate de efectele toxinei difterice. Toxina difteric este puternic antigenic i determin n organism producerea de anticorpi antitoxin.Prin tratarea cu formol, nvechire i cldur, toxina i pierde toxicitatea, dar rmne antigenic, i se transform n anatoxin, care reprezint substratul pentru vaccinul antidifteric. Producerea de toxin de ctre bacilul difteric este condiionat de prezena unui bacteriofag temperat lizogen, care se ncorporeaz n cromozomul bacterian i codeaz proteina specific toxinei.Sub aciunea unor factori inductori (radiaii U.V.), fagul endogen trece din starea de profag n fag matur, virulent; bacteria se vindec de lizogenie, i pierde caracterul toxigen, iar eliberarea fagului din celul se face prin liza bacteriei. Diagnosticul de laborator se poate face labolnavii de difterie ct i la purttori. La bolnavi se recolteaz exudatul faringian i nazal, din care se fac frotiuri i nsmnri pe medii de cultur speciale. Frotiurile se coloreaz Gram, cu albastru de metilen sau cu coloraia specific DelVecchio.Bacilii difterici sunt Gram pozitivi la limit,dimensiuni de 4-6, mciucai, cu aspect specific de halter, datorit unor granulaii metacromatice care se dispun bipolar, i se dispun n frotiu formnd unghiuri ascuite, n forma majusculelor V, Y, W,M, ca beele de chibritaruncate pe mas, sau uneori imitnd literele chinezeti. Cutivarea bacilului difteric se face pe medii selective, cum sunt mediul Tinsdale, Gundel-Tietz, dar i pe geloza snge.Mediul de elecie este mediul Loffler.( conine ser coagulat de bou).n cazul unor produse patologice srace, sau la purttori, nsmnarea se face pe mediul de mbogire O.C.S.T. (ou, cistein, ser, telurit de potasiu);sunt bacili aerobi, microaerofili, cu creterea favorizat de adaosul n mediu a cisteinei i proteinelor serice.Aspectul caracteristic este pe mediul Tinsdale, unde coloniile sunt mici, cenuii-negre i nconjurate de un halou cafeniu , care permite

38

diferenierea lor de difteromorfi.Aspectul coloniilor pe bulion i pe mediul Gundel-Tietz, permite diferenierea tipurilor n cadrul speciei Corynebacterium diphteriae. Identificarea continu prin efectuarea testelor biochimice. Evidenierea toxigenezei este obligatorie pentru demonstrarea patogenitii, i se realizeaz in vitro, prin teste de precipitare n gel, cu ser antidifteric.(reacia Elek-Ouchterlony). Tratamentul se bazeaz pe administrarea ct mai precoce a serului antidifteric, care acioneaz ns numai asupra toxinei circulante, nu i asupra celei acumulate n esuturi. - antibioterapia se adreseaz bacilului cantonat la poarta de intrare, fiind indicate Eritromicina, Tetraciclina, Penicilina, Cloramfenicol. Profilaxia este asigurat prin vaccinarea populaiei receptive cu unul din vaccinurile: DTP ( anti-difteric, tetanic, pertussis), DT (difteric, tetanic), sau ADPA (anatoxin difteric purifiat i adsorbit). Receptivitatea la infecie este general, iar calea de transmitere este predominent respiratorie, sau uneori, mai rar, prin alimente.

39

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE Enterobacteriaceele cuprind un numr foarte mare de genuri de bacili Gram negativi, aerobi i anaerobi facultativ,cu un metabolism de tip respirator i fermentativ, care descompun glucoza n acid i gaz, i sunt nesporulai.Unele specii prezint cili peritrichi, i sunt deci mobile (E. Coli, Proteus, Salmonella). Principalele genuri cu interes medical, sunt:Escherichia ( cu specia E. Coli), Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Yersinia. Caractere morfologice i culturale: bacili Gram negativi, cu dimensiunile de 0,4-0,6 , nesporulai, necapsulai, cu excepia E.coli i Klebsiella, care prezint capsul; cresc pe mediile uzuale, tulbund uniform bulionul, iar pe geloza simpl dau colonii de tip S, rotunde, de 1-3 mm diametru, semitransparente.Unele specii,cum este Klebsiella, crete sub forma unor colonii mari, de tip mucos, iar Proteusul prezint fenomenul de invazie, cu o cretere n valuri, caracteristic, datorat mobilitii mari a acestei specii.Pentru diagnosticul infeciilor produse de Entrobacteriacee, se folosesc curent o serie de medii de mbogire ( Mller- Kauffmann, mediul cu selenit acid de sodiu, care inhib flora de asociaie), i medii selective, care n principiu, sunt medii lactozate la care se adaog un indicator de pH, care modific culoarea mediului n funcie de pH-ul acestuia, dintre care amintim: - geloza Mc. Conkey (conine geloz, lactoz, rou neutru- ca indicator de pH), culoarea mediului este roz, transparent.Bacteriile care fermenteaz lactoza, acidific mediul, i cresc sub form de colonii roii, uneori cu halou opalescent ( E. Coli, Klebsiella).Bacteriile nefermentative dau colonii transparente, de culoarea mediului. - Mediul Leifson sau ADCL ( agar, dzoxicolat, citrat, lactoz), tot de culoare roz, enterobacteriaceele fermentative dau colonii roii, cele lactozo-negative, cresc sub form de colonii transparente, uneori cu centrul negru, datorit producerii de H2S. - Mediul pentru Salmonella- Shigella - Mediul Istrati- Meitert, conine indicatorul de pH albastru de brom-tymol, care d mediului o culoare verde.Coloniile lactozo-pozitive sunt galbene i vireaz culoarea mediului de sub ele n galben, n timp ce cele lactozo-negative rmn transparente.Bacilii productori de H2S au centrul negru. - Geloza Wilson Blair, este selectiv pentru Salmonella, conine verde brilliant i citrat de bismut, care sub aciunea Salmonellelor se transform n sulfur de bismut, conferind coloniilor culoarea neagr, cu halou metalic. - Mediul AABTL ( agar, albastru de brom tymol, lactoz), de culoare verde-transparent, pe care coloniile lactozo-pozitive sunt galbene, iar cele lactozo- negative rmn transparente. Dintre speciile cu interes mdical amintite, Salmonella, Shigella i Proteus sunt lactozo-negative, n timp ce E.coli i Klebsiella fermenteaz lactoza. Caractere biochimice. Un numr foarte mare de teste biochimice ne stau astzi la dispoziie pentru identificarea precis a diferitelor specii de enterobacteriacee.Testarea acestor caractere se poate realiza fie pe medii politrope (multitest), sau prin procedee automatizate, care economisesc mult timp i ofer posibilitatea citirii unui numr foarte mare de teste, crescnd astfel mult fiabilitatea unui diagnostic precis.Dintre mediile politrope utilizate de rutin n laboratoarele noastre amintim: mediul TSI ( triple sugar , iron), pentru fermentarea lactozei,glucozei, zaharozei i producerea de H2S; - mediul MIU, pentru mobilitate, producere de indol i ureaz. - Mediul MILF, pentru mobilitate, indol, producere de lactic-dehidrogenaz, fenil-alanindehidrogenaz.

40

Caracterea antigenice. Enterobacteriaceele prezint o structur antigenic complex, pe baza creia au fost elaborate scheme de diagnostic pentru identificarea grupelor i tipurilor n cadrul speciei. 1. Antigenul somatic O , coninut n peretele bacterian, posed 2 componente: - lipidul B ; - componenta lipo-polizaharidic LPS cu 3 subcomponente: a. lipidul A b. miezul (core) c. lanurile polizaharidice specifice; Primele dou subcomponente alctuiesc endotoxina, responsabil de ocul endotoxinic, iar polizaharidele confer specificitatea de grup. Antigenul O se poate uni cu anticorpii corespunztori anti-O, dnd in vitro reacii de aglutinare de tip polar, cu grunji fini, care se desfac greu prin agitare. 3. Antigene de nveli K, ataate peretelui, nu sunt prezente la toate enterobacteriaceele; pot masca antigenul somatic, i tulpinile respctive nu aglutineaz cu serurile anti-O. - sunt de natur polizaharidic 4. Antigene flagelare H , prezente numai la germenii mobili, sunt de natur proteic i confer specificitate de tip.Aglutineaz cu serurile anti-H, n grunji mari,care se desfac uor prin agitare.

Puterea patogena a enterobacteriaceelor :

E. coli poate da infecii ale tubului digestiv, i anume : Tulpinile enterotoxigene dau forme uoare pn la forme grave de enterit, holeriforme; E. coli enteroinvaziv determin un sindrom diareic dizenteriform E. coli enteropatogen este responsabil de episoadele diareice la copii E. coli enterohemoragic determin diarei cu scaune la nceput apoase, care apoi devin hemoragice. - n afara infeciilor enterale, E. coli mai este implicat n infecii ale cilor urinare, colecistite, peritonite, septicemii i meningite, mai ales la copii. Shigella este agentul patogen al dizenteriei bacilare, forma cea mai grava fiind determinat de Shigella shiga; alte specii ale genului sunt responsabile de diarei epidemice de var, gastroenterite. Salmonelele sunt responsabile de : - Salmonella typhi i Salmonella paratyphi dau febra tifoida i respectiv febrele paratifoide; - Salmonella typhi murium i Salmonella enteritidis dau toxiinfecii alimentare n afar de acestea, Salmonelele mai pot da septicemii cu punct de plecare intestinul, gastroenterite, toxiinfecii alimentare date de alte salmonele dect cele amintite anterior. Germenii de genul Klebsiella dau : - K. pneumoniae d pneumonie i infecii bronhopulmonare - K. oxytoca i alte tipuri ncapsulate de K. pneumoniae dau boli diareice; - K. rhinoscleroma d rinoscleromul; - K. ozaenae d ozena i alte infecii cronice ale tractului respirator; Alte Klebsiele pot determina meningite, otite, sinusite, endocardite. Proteus ocup locul doi dup E. coli n etiologia infeciilor urinare, el populeaz tractul digestiv al bolnavilor tratai ndelung cu antibiotice, poate da meningite otogene la nou nscui, suprainfecii ale plgilor i arsurilor.

41

Bacilul pioceanic Aparine genului Pseudomonas, i este incriminat n urmtoarele infecii: - tegumentare, n special plgi chirurgicale, arsuri, fiind frecvent incriminat n etiologia infeciilor intraspitaliceti (nosocomiale) - urinare (alturi de E.coli i Proteus) - O.R.L. si oculare - bronho-pulmonare - digestive, mai ales la sugari i copiii mici - meningit la nou-nscui - septicemii Diagnosticul bacteriologic are scopul de a izola i identifica bacilul n produsele patologice: puroi i exudate purulente, urin,secreii otice, conjunctivale, sput, materii fecale, L.C.R., snge. - izolarea se face pe mediile uzuale, eventual A.A.B.T.L. - identificarea se face pe baza urmtoarelor criterii: o caracterele morfologice pe frotiuri colorate Gram, unde apar colorai n rou, dispui izolai, n perechi sau lanuri scurte, nesporulai, rar ncapsulai, mobili. o caracterele culturale: tulbur uniform bulionul simplu sau apa peptonat, cu formare de pelicul, i caracteristic, apare o culoare albastru- verde, datorat pigmentului pioceanin, elaborat de bacilul pioceanic, i mirosul de flori de tei; pe geloz, dau colonii de tip S sau R, colorate fluorescent, cu reflexe metalice, i cu mirosuri aromatice; caractere biochimice; Antibiograma este obligatorie, avnd n vedere multichimiorezistena pe care o dezvolt adesea acest bacil.

42

Mycobacterium tuberculosis Caractere morfologice. - este un bacil imobil, cu dimensiuni de aproximativ 2- 4/ 0,2- 0,3 microni necapsulat i nesporulat. Pe frotiuri se poate colora cu albastru de metilen sau Gram, dar prezint o proprietate tinctorial specific mycobacteriilor, i anume se coloreaz la cald cu fuxin i rein colorantul chiar dup decolorare cu alcool sau sau acizi. Aceast proprietate se numete acido-alcoolo rezisten, i este pus n eviden prin coloraia Ziehl-Nielsen, n care bacilii apar colorai n rou pe fondul albastru al preparatului. Aspectul pe frotiu este de bastonae cu capete rotunjite dispuse izolat sau n grmezi, cu granulaii citoplasmatice frcvente, iar pe frotiurile efectuate din culturi, apar forme filamentoase, sau ramificate; Aceste aspecte diferite sub care poate apare Micobacterium tuberculosis pe frotiuri, se descrie sub numele de pleiomorfism. Compoziia chimic este complex. a. Lipidele reprezint 20-45% din greutatea uscat a bacilului, dintre care 60% sunt n peretele bacterian , i au rolul demonstrat n patogenitate. Principalele lipide sunt: - acizii micolici, care confer acido-alcoolo rezistena; - fosfolipide; - glicolipide; - peptidoglicolipide, numite i ceara D, prezent mai ales la formele virulente; b. Proteinele reprezint suportul activitii tuberculinice; pot fi purificate i se folosesc pentru testarea rezistenei la infecia tuberculoas n preparatul PPD. c. Glucidele au structur complex i se leag cu lipidele i proteinele bacilului. Caractere culturale. - este aerob strict, crete la 37C i pH de 6,7- 6, 9, necesit adaos de factori de cretere n mediu : glicerin, ou, amidon, asparagin, sruri minerale. - pentru cultivarea Mycobacterium tuberculosis cel mai frecvent se folosete mediul Lowenstien-Jensen, care conine elemetele amintite, n plus malachit oxalat verde; mediul este solid, opac, de culoarea verde. Pe acest mediu creterea bacilului este caracteristic: crete lent, primele colonii apar dup 15-30 de zile, au aspect opac, culoare glbuie; n zilele umtoare au o cretere eugonic, adic foarte bogat, luxuriant, capt un aspect rugos, uscat, conopidiform, descris i ca ,, pesmet de pine; - acest aspect difer de cel al Mycobacterium bovis unde primele colonii apar dup 30 de zile, sunt mici, netede, disgonice adic cu o cretere srac, colonii puine; - tipul aviar se dezvolt n 2-3 zile, crete i pe medii uzuale; Rezistena la ageni fizici i chimici. Bacilul tuberculos este sensibil la lumina solar, raze X i U.V., dar rezistent la frig. Alcoolul de 90 l distruge n 5 minute. Puterea patogen la om. n ordinea frcvenei, principalele localizri ale tuberculozei la om sunt: - pleuro-pulmonar (90%) - uro-genital - peritoneal - osteo-articular - meningeal (meningita tbc) - ganglionar; Constituirea leziunilor iniiale n infecia tbc. Inhalarea bK are ca rezultat depunerea n alveole sau eliminarea prin exhalare. Pe suprafaa alveolar bacilii sunt fagocitai de

43

macrofagele alveolare, unde ei reuesc s se multiplice sau sunt distrui (n funcie de virulena bacililor i rezistena organismului). De obicei bK se multiplic n macrofage, care n aceast faz sunt ineficiente, i se edific treptat un focar pneumonic; bacilii invadeaz ganglionii loco-regionali, dnd o adenit satelit. Un numr de bacili ajung pe cale venoas dreapt (din canalul toracic) n zonele apicale pulmonare, sau pe calea circulaiei sistemice n diferite organe; n 6-8 sptmni, organismul reacioneaz prin apariia rspunsului imun (care corespunde pozitivrii PPD): crete foarte mult numrul de limfocite i macrofage n toate zonele unde exist mycobacterii( rolul limfocitelor T activate prin limfokine ), puterea fagocitar este mult crescut, i mycobacteriile sunt distruse. - focarul pneumonic de tip exudativ ( muli bacili i puine celule inflamatorii) trece ntrun focar de tip granulomatos, alctuit din numeroase macrofage, celule epiteloide la mijloc i celule gigante Langhans multinucleate la interior; la exterior granulomul tbc este nconjurat de o coroan de limfocite. n timp, granulomul se fibrozeaz, eventualele zone cazeificate se calcific. Concomitent sunt eradicate i focarele coexistente din toate organele. Astfel, complexul primar tuberculos se caracterizeaz prin: - vindecare spontan; - confer rezisten la reinfecie; - este inaparent clinic; - determin ,, virajul tuberculinic, adic pozitivarea intradermoreaciei la PPD. Aproximativ 5% din persoanele nou infectate nu reuesc s opreasc multiplicarea bacilului; la acetia primo-infecia nu are evoluia descris, ci evolueaz n lunile urmtoare spre boal Diagnosticul de laborator. 1. Recoltarea produselor patologice n funcie de localizarea tuberculozei: - tbc pleuro-pulmonar: sputa, lichid pleural, aspirat bronic, spltur bronic; - tbc uro-genital: urin, fragmente de biopsie de endometru; - tbc ganglionar: puncie/biopsie ganglionar; - tbc osteo-articular: lichid articular, fragmente de os; - tbc meningeal: LCR 2. Ex. Direct al frotiurilor efectuate din produsele patologice, colorate ZiehlNielsen; bK apare colorat n rou, pe fondul albastru al preparatului; examinare cu obiectiv cu imersie. 3. nsmnarea pe mediile speciale, uzual pe mediul Lowenstein Jensen, unde mycobacteriile dau coloniile caracteristice descrise anterior. 4. Antibiograma, este indicat repetarea periodic din cauza multichimiorezistenei pe care o dezvolt numeroi bacili. Testarea strii de sensibilitate la infecia cu Mycobacterium tuberculosis se face prin intradermoreacia la tuberculin (PPD). - reacia se citete dup 72 ore; dac la locul inoculrii nu apare nici o reacie, nseamn c individul nu a venit n contact niciodat cu Mycobacterium tuberculosis, deci el este sensibil, ca urmare trebuie vaccinat. - Dac la locul inoculrii apare un eritem cu diametrul ntre 10-15 mm, reacia se consider pozitiv, acest individ nu trebuie vaccinat, deoarece prezint rezisten la o nou infecie. - Dac eritemul depete 15 mm, semnificaia este a unui proces infecios evolutiv, individul se ndrum la ftiziologie. Vaccinarea se face cu o tulpin vie atenuat i se numete vaccinul BCG (bacil Calmette-Guerrin ); prima vaccinare se face la 4 zile dup natere, la toi nou-nscuii, fr testare prealabil; dup vrsta de 8 luni , se testeaz sensibilitatea prin IDR la PPD, i se vaccineaz numai cei sensibili la infecie.

44

45

BACTERIILE ANAEROBE STRICTE

Cuprind germeni care nu pot utiliza oxigenul i nici nu se pot dezvolta n prezena lui.n funcie de prezena sporului bacterian, au fost clasificate , astfel: 1. Bacterii anaerobe sporulate, aparin genului Clostridium, cuprinde germeni telurici, exogeni, cu excepia C. perfringens, care se gsete n cavitatea bucal. 2. Bacterii anaerobe nesporulate, mai frecvent saprofite, dar n asociere cu ali germeni, dau supuraii i septicemii GENUL CLOSTRIDIUM - cuprinde bacili Gram pozitivi, cu dimensiuni cuprinse ntre 3-4, pn la 14, necapsulai i mobili, cu excepia C. perfringens, care prezint capsul i este imobil.Toi reprezentanii genului prezint spori, care pot fi situai central, sau subterminal.Cu importan deosebit n patologia uman, sunt: - agenii patogeni ai gangrenei gazoase, o C. perfringens o C. septicum o C. oedematiens o C. histolyticum - agentul patogen al toxiinfeciei botulinice, o C. botulinum - bacilul tetanic, sau o C. tetani Clostridium perfringens se izoleaz cel mai frecvent, i poate fi gsit n cavitile naturale ale omului.Prezint mai muli factori toxici, cu aciune hemolitic, necrozant enzimatic i cardiotoxic, pe baza crora s-au identificat mai multe varieti, tipul A fiind cel mai toxic pentru om. Puterea patogen. - gangrena gazoas, manifestat clinic printr-un flegmon gazos, crepitant, hemoragic, extins i nsoit de alterarea grav a strii generale, icter.Dac nu se intervine rapid cu tratament antibiotic, seroterapie antiperfringens (pentru neutralizarea toxinei) i anatoxin, decesul poate surveni n cteva ore de la debut. n cadrul tratamentului chirurgical, se practic antisepsia foarte riguroas a plgii, i incizii largi, pentru a asigura oxigenarea plgii, care nu mai permite dezvoltarea n continuare a bacilului. - diferite viscerite, cum ar fi apendicita supraacut, enterita necrozant ; - septicemii, mai ales post-abortum, cu tendin la insuficien renal acut datorit hemolizei intravenoase determinate de toxina bacilului perfringens. Clostridium botulinum este rspndit n mediu sub forma sa sporulat (pe plante, legume, fructe, sol), dar i n unele alimente, mai ales conserve de carne i legume insuficient preparate termic. Consumul acestor conserve care conin bacilul botulinic i exotoxina pe care o secret, determin o toxiinfecie alimentar foarte grav, cunoscut sub numele de botulism. - n organism nu se poate pune n eviden bacilul, doar toxina sa. Punerea n eviden a bacilului este posibil doar n alimentul incriminat, unde se dezvolt n cuiburi, ceea ce explic uneori faptul c dintre mai multe persoane care consum aceeiai conserv, nu toi fac boala. - toxina botulinic este cea mai puternic otrav biologic, 1mg de toxin de tip A coninnd 32 de milioane de doze limit mortale la oareci; este de natur proteic, termolabil, fiind distrus n 10 minute la 100 0C, dar este acido rezistent (nu este distrus de sucurile gastrice).

46

Clinic, toxiinfecia botulinic se manifest prin: o vom i constipaie o strabism, prin paralizia de acomodare a muchilor oculomotori, datorit inhibiiei producerii de acetil-colin, cu aciune asupra plcilor neuro-musculare o paralizii ale muchilor buco-faringieni i exitus prin paralizie respiratorie. Diagnosticul de laborator const n evidenierea tipului de toxin (cel mai frecvent este incriminat tipul B), i identificarea sursei. Tratamentul urmrete administrarea precoce de ser antibotulinic ( pn la primirea rezultatului de lalaborator, se administreaz ser antibotulinic B), vaccin antibotulinic i antibiotice. Clostridium tetani produce tetanosul.Sporii si sunt rspndii n sol.Dac o plag cu potenial tetanigen este contaminat cu pmnt care conine spori, acetia se transform n forma vegetativ dac au condiii de anaerobioz i elibereaz exotoxina tetanic, responsabil de fenomenele generale ale bolii. - prin plag cu potenial tetanigen nelegem acele leziuni care au n general o poart de intrare de dimensiuni mici, care practic se nchide dup ndeprtarea agentului cauzal, i sunt n schimb profunde, crend astfel condiii de anaerobioz (plgi nepate, mucturi de animale, lezri cu unelte agricole,etc.). - toxina tetanic are aciune toxic, necrotic, cardiotoxic i determin sindromul tetanic (prin aciunea asupra lipidelor din SNC), manifestat n principal prin contractura generalizat a musculaturii scheletice, peste care se suprapun contracii paroxistice; faciesul este caracteristic, numit risus sardonicus, cu gura deschid ntr-un rnjet larg, fruntea este ncruntat.Bolnavul st n poziie de opistotonus, adic n decubit dorsal, sprijinit n ceaf i clcie. Tratamentul este de urgen i const n administrarea de ser antitetanic, care neutralizeaz toxina circulant (dar nu i pe cea fixat n esuturi), vaccinare cu anatoxin tetanic, terapie intensiv cu antibiotice (penicilin) i tratamentul chirurgical al plgii. Profilaxia tetanosului la orice plag este de o deosebit importan i pune probleme medicolegale, motiv pentru care se nregistreaz cu exactitate tratamentul efectuat, iar dac pacientul refuz tratamentul, acesta va semna n fia personal (sau bilet de trimitere,etc).n principiu, orice plag poate avea risc tetanigen, ca urmare se va administra vaccinul antitetanic (de preferin ATPAanatoxin tetanic purifiat i adsorbit) i 1500-3000 UAI de ser antitetanic. Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de Clostridii - produsele patologice (snge, secreii purulente, exudate, materii fecale) recoltate de la bolnavi se nclzesc la 70 0C timp de 30 minute pentru distrugerea formelor vegetative. - se pot efectua frotiuri direct din produsul patologic, sau preparate ntre lam i lamel; - nsmnarea se face pe medii anaerobe: bulion VF sau geloza VF, cu adaos de antibiotice, pe care clostridiile vor dezvolta colonii caracteristice. - tipizarea toxinei este important n special n cazul C.botulinum.

Familia Parvobacteriaceae
Cuprinde genurile: Francisella, Yersinia, Brucella, Haemophilus, Bordetella. Genul Haemophilus

47

Haemophilus influenzae este un comensal al cilor respiratorii, d infecii secundare, fiind responsabil de suprainfecii n grip, rujeol, tuse convulsiv, infecii pulmonare, precum i n etiologia altor boli, cum sunt: - meningita acut purulent la copii, cu prognostic sever; - laringite, pleurezii, pericardite, endocardite; Din punct de vedere morfologic, sunt bacili mici, Gram negativi, imobili, nesporulai, dispui izolai, n perechi, lanuri scurte, sau uneori ca elemente paralele, asemntoare bancurilor de peti.Prezena capsulei este considerat factor de virulen a bacteriei.Se cultiv pe medii cu adaos de factori de cretere, unde apare sub form de colonii de tip S. Alte bacterii aparinnd genului Haemophilus sunt: - H. ducreyi care determin ancrul moale, o boal veneric; - H. parainfluenzae, responsabil de infecii pulmonare i endocardite; - H. haemolythicus, nepatogen, poate fi uneori cauz de eroare n diagnosticul streptococilor pyogenes. Tratamentul se face conform antibiogramei (frecvent sensibil la Streptomicin, Ampicilin, Tetraciclin). Genul Bordetella Cuprinde speciile B.pertussis, care d tusea convulsiv, B.parapertussis i B.bronchiseptica, care dau sindroame asemntoare tusei convulsive. - sunt germeni care paraziteaz ntotdeauna omul sau animalele, nu se gsesc niciodat n stare liber n natur. - sunt bacili mici, Gram negativi, imobili, nesporulai, capsulai n unele faze de cultur; se coloreaz bipolar, poriunea central rmnnd clar; - se cultiv greu, pe mediul special Genjou Bordet, unde dup 2-4 zile, apar colonii n pictur de mercur, mici, rotunde, bombate, cu reflexe gri- metalice, care dup 3-4 zile dau o hemoliz tulbure. Puterea patogen:tusea convulsiv apare mai ales la copii, i se manifest n mai multe faze: - faza cataral, care este foarte contagioas - faza de tuse quintoas, spasmodic, de tuse mgreasc - convalescena este de lung durat. Bacilul se dezvolt la suprafaa epiteliului respirator, nu trece n snge; el elaboreaz o toxin responsabil de fenomenele generale din tusea convulsiv;modificrile epiteliului respirator predispun la suprainfecii, cu apriia frecvent a complicaiilor pulmonare. Diagnosticul de laborator const n izolarea n faza cataral i n perioada quintelor a bacilului din produsele patologice (sput, secreii nazale, exudat faringian). - diagnostic indirect prin imunofluorescen - tabloul hemo-leucocitarl indic leucocitoz cu limfocitoz, n jur de 60% Tratamentul se face cu Eritromicin n doze mari. Profilaxia este important, realizndu-se prin vaccinarea DTP (anti-difteric, tetanic, pertussis), dar trebuie subliniat aici, c vaccinul nu d rezisten fa de infeciile cu bacil parapertussis, care d un sindrom asemntor tusei convulsive.

SPIROCHETELE n aceast familie sunt cuprinse genurile: Treponema, Leptospira, Borrelia Spirochetele se caracterizeaz prin: - dispoziia helicoidal - flexibilitate

48

- mobilitate, datorit unui aparat locomotor intern, reprezentat de una sau mai multe fibrile, inserate egal la extermitile celulei; acestea se ntind pn la extermitatea opus a celulei, realiznd mai multe ture de spir n jurul corpului bacterian, dnd aspectul helicoidal al bacteriei. GENUL TREPONEMA Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului, boal veneric, specific uman.n afar de aceasta, mai exist i alte specii de interes medical care dau boli neveneriene, constituite n aa numitul grup al sifilisului tropical, precum i treponeme saprofite localizate mai ales la nivelul mucoasei bucale i genitale. Caractere morfologice. - Tr. Pallidum poate fi evideniat n stare vie n serozitatea de la nivelul ancrului, examinarea se face la microscopul cu fond ntunecat; are o form helicoidal, cu extremitile efilate, foarte mobil, prezentnd micri de rotaie, flexie,nurubare, translaie. - preparatele fixe se coloreaz prin metoda Fontana-Tribondeau de impregnare argentic, unde treponemele sunt argintii strlucitoare pe fondul nchis al preparatului. Caractere culturale.Pn n prezent nu s-a reuit cultivarea treponemelor patogene pe medii de cultur. Rezistena n mediul extern este foarte sczut, treponemele pierzndu-i practic virulena n afara organismului n aproximativ 2 ore. Structura antigenic este format din: - antigenul Wassermann, de natur lipidic, comun tuturor treponemelor (cardiolipidul); - un antigen proteic de grup, comun genului Treponema; - antigene proteice i antigene poliosidice specifice Tr. Pallidum. Puterea patogen.Sifilisul este o boal cu transmitere sexual, care se desfoar n trei etape succesive, dup o perioad de incubaie de aproximativ 3 sptmni de la contactul infectant. - faza primar, n care leziunea caracteristic este ancrul sifilitic (nedureros, bine circumscris, cu o baz de induraie), localizat predominent la nivelul mucoasi genitale, din care prin presiune se elimin o serozitate bogat n treponeme;se nsoete de adenopatie satelit.ancrul primar se vindec spontan, chiar n lipsa unui tratament, n aproximativ 3 sptmni, fr cicatrice, dnd bolnavului impresia iluzorie c s-a vindecat. - faza secundar se produce la 4- 6 sptmni de la apriia ancrului, prin leziuni maculopapuloase, numite rozeole sifilitice, rspndite n diferite zone ale corpului, i care de asemenea se vindec spontan; - faza teriar, se produce numai la aproximativ 50% din bolnavii infectai, tradus prin leziuni grave de necroz i scleroz distructiv, cunoscute sub numele de gome sifilitice, cu localizri mucoase, cutanate, osoase, vasculare, viscerale;se produc leziuni nervoase cu paralizie generalizat progresiv, afectarea mduvei spinrii (tabes), a aortei (anevrisme).n rest, 25% din cazri se vindec spontan, iar 25% au o evoluie lent, care poate dura toat viaa (bineneles, trecerea de la ofaz la alta are loc n absena unui tratament adecvat). - Sifilisul congenital rezult prin contaminarea transpalacentar a ftului, de obicei cnd infectarea mamei are loc n a 2-a jumtate a sarcinii; totui este posibil i naterea unui copil sntos, cu serologie pozitiv, prin transfer pasiv de IgG.Contaminarea n primele luni de sarcin, sau dac mama este bolnav n timpul concepiei determin avort sau naterea unui ft mort. Imunitatea. - imunitatea umoral este dat de anticorpii care apar nc din primele sptmni ale infeciei i se menin pe toat durata evoluui bolii, n absena unui tratament corect, sau al unuia instituit tardiv.Principalii anticorpi sunt: o de tip Wasseramann o antitreponemici: imobilizine (apar la 3-4 sptmni dup anticorpii tip Wassermann, dar i dispar ultimele) anticorpi de imunofluorescen (sunt primii care apar) antiproteici de grup Reiter (pe locul doi n ordinea apariiei).Anticorpii elaborai n sifilis nu confer protecie. - imunitatea de tip celular asigur o protecie mai eficient dect anticorpii.

49

Diagnosticul de laborator se poate face direct prin punerea n eviden a Tr, pallidum n perioada primar, i indirect, prin evidenierea anticorpilor, prin diferite reacii serologice. - evidenierea direct n serozitatea din ancrul primar, se poate face prin preparat nativ ntre lam i lamel, examinat apoi n cmp ntunecat, sau prin preparate fixate i colorate (Giemsa, impregnare argentic, etc).Testul de imunofluorescen direct pune n eviden treponemele direct n produsul patologic, i este de o mare specificitate. - diagnosticul serologic se bazeaz pe dou grupe de teste: o teste cu antigene cardiolipidice, obinute din cord de bou, care pun n eviden anticorpii antilipoidici, prin: - reacii de floculare de tip VDRL ( Veneral Disease Research Laboratory), care se pozitiveaz precoce, sunt sensibile, dar nu sufucient de specifice, putnd da rezultate fals pozitive.Se utilizeaz cu succes ca teste screening, de depistare n mas. - reacii de fixare a complementului, la cald (reacia Bordet-Wassermann RBW) i la rece, cu specificitate mare, dar puin sensibile.Se recomand ca pentru diagnosticul sifilisului s se efectueze concomitent o reacie de floculare i o RFC cu antigen cardiolipidic. o teste cu antigene treponemice specifice: imunofluorescun indirect, teste ELISA , i altele. Tratamentul este cu Penicilin, pn n prezent nu au fost selectate sue rezistente. Epidemiologie.Sursa de infecie este numai omul bolnav de sifilis, contagiozitatea fiind mai mare n primele dou faze ale bolii.Transmiterea este n principal sexual. FAMILIA RICKETTSIACEAE Genurile Rickettsia i Chlamydia Rickettsiozele reunesc mbolnviri diverse transmise de la animal la om, prin intermediul unui vector, care poate fi pduchele, puricele sau cpua.Cele mai frecvente sunt febrele tifo-exantematice, caracterizate prin prezena unui sindrom infecios sever i exantem (erupie cutanat). - rickettsiile se prezint n microscopia optic sub form de coci fini Gram-negativi sau bacili cu dispoziie filamentoas.Nu se cultiv pe mediile uzuale, dar cresc n sacul vitelin al oului embrionat, sau pe culturi celulare. Diagnosticul de laborator este n principal serologic, de cercetare a anticorpilor; cele mai cunoscute, sunt reacia Weil-Felix (de aglutinare, cantitativ) i reacia Kudicke-Steuer, de aglutinare pe lam, calitativ. Chlamydiile sunt germeni mici, care nu se coloreaz Gram, dar se coloreaz bine Giemsa; sunt parazii intracelulari obligatorii.Prezint aceleai caractere culturale ca i rickettsiile. Puterea patogen. - ornitoza i psittacoza uman, transmis de porumbei, respectivde papagali, produs de C. psittaci, se manifest ca o bronho-pneumopatie acut. - C.trachomatis produce la om boli oculare i genitale: trahomul, care duce la orbire, diferite conjunctivite, uretrita negonococic, mai rspndit dect uretritele gonococice, uneori pote urma sau coincide cu uretrita gonococic, ngreunnd mult tratamentul, limfogranulomatoza venerian.
Diagnosticul de laborator se bazeaz n special pe reaciile serologic. Tratamentul se face cu antibiotice cu spectru larg, dup antibiogram .

CANDIDA

50

Candida este o ciuperc levuriform, responsabil de producerea candidozelor umane, infecii a cror incident i spectru de manifestare clinic a crescut semnificativ n prezent, datorit antibioterapiei, a manoperelor medicale i a condiiilor de imunodepresie. Morfologie Candida este o ciuperc levuriform, mic, ovoid de 4-6 microni, perete subire. Se multiplic prin mugurire. Candida albicans prezint chlamidospori, caracter de identificare pe medii de cultur. Patogenitate Exist 150 de specii, dintre care 10 patogene la om. Candida albicans, krusei, quilliermondii, parapsilosis, tropicalis, glabrata, pseudotropicalis, lusitaniae. Candida albicans este o ciuperc comensal a organismului uman la nivelul cavitii bucale, tractului digestiv i a vaginului. Alte specii de candida se intlnesc pe mucoase sau tegumente sntoase. Candidele devin patogene n prezena factorilor favorizani. 1.Factori favorizani ai infeciilor endogene: Antibioterapia prelungit, contracepie oral. Scderea rezistenei organismului, la nou- nscui, n sarcin, diabet. Imunosupresie: terapie cu corticosteroizi, citostatice, dificit imun congenital, infecie HIV. 2. Factori favorizani ai infeviilor exogene: Manopere medicale: intervenii chirurgicale, aplicarea de cateter, perfuzii, sonde, injecii, proteze dentare, valvulare. Candidele ader la plastic. Transmiterea infeciei de la o persoan la alta prin contact sexual, sau de la mam la copil. Principalele localizri la om Candidoze Mucoase Candidoze digestive: cadidoza bucal, esofagita candidozic, gastrita candidozic, enterita candidoyic, colitele candidozice, anita candidozic. Candidoze urogenitale: volvovaghita candidozic, balano-prostatita, uretrita, cistita candidozic. Candidoze bronhopulmonare: bronite, laringite, epiglotite prin extensia candidozei bucale. Candidoze cutanate, unghiale Intertrigo: la pliurilr genitocrutale interfesiere, submamare. Intertrigo: digitopalmar sau digito plantar. Zabaluta ( la nivelul conisurilor bucale). Perionix ( periunghial). Candida mucocutanat cronic. Leziuni cutanate n candidoza diseminat: leziuni macronodulare, leziuni asemntoare cu ectima gangrenoas, leziuni asemntoare cu purpura fulminans. Septicemia candidozic Exogen- digestiv sau pulmonar Endogen- dup o intervenie cu leziuni vasculare Candidoze viscerale SNC Plmn Rinichi Cord Ochi - meningita candidozic - pneumonie candidozic - pielonefrita, microabcese renale - pericardita, miocardita, endocardita - endoftalmita candidozic

51

Sistem osteomuscular artrita, osteomelita, miozita Sistem vascular vasculita candidozic Peritoneu- peritonita candidozic Ap. urinar- candidoza urinar Candidoze alergice Produsii de metabolism ai Candidei pot genera reacii alergice, cauznd manifestrile alergice din candidoze. Alergia la metabolii ai Candidei este un fenomen indiscutabil, urmeaz un factor micotic iniial i poate conduce la tulburri diverse. Ca i tratament se folosesc antifungice pe cale general sau local. Ex. Nystadin, Miconazol, Clotrimazol, Ketokonazole, Amfotericina B, Fluconazol, 5 flourocytozina. Diagnosticarea se face direct din produse patologice, examen microscopic direct, cultivare, identificare i antifungigrama. Se mai poate folosi i diagnosticul serologic, detectare a antigenelor circulante sau diagnosticarea biologic.

52

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ECTOPARAZIILOR

Artropodele cu importan n patologia uman sunt cuprinse n 6 clase, dintre care unele produc mbolnviri prin aciunea direct, altele acioneaz ca vectori, transmind alte boli. Principalele artropode i ectoparazii implicai direct n patologia uman, prin traumatisme, secreia de veninuri sau inducerea de hipersensibilitate, sunt grupate n urmtoarele clase: 1. Annelida 2. Insecta: purecii ( Phtirus pubis, Phtirus corporis), pduchii ( Pediculus corporis, P. capitis) 3. Arachida: pienjeni, scorpioni, Sarcoptes scabiae ( responsabil de scabie- rie) 4. Chilipoda 5. Diplopoda 6. Pentastomida Artropodele considerate vectori sunt n principal cuprinse n clasa Insecta (mutele, insectele, purecii, cpuele), unele specii de Arachnida i Crustacea. Pduchii umani (Pediculus humanus) pot parazita pielea proas a capului, prul pubian sau corpul, ntre cele trei specii existnd doar diferene minore morfologice.Se hrnesc prin ataarea la tegumente cu ajutorul unei guri prevzut cu ventuze ( haustellum), dup care penetreaz pielea i sug snge cu ajutorul a 2 stilei.Dup fecundare, femela depune oul la rdcina firului de pr, ceea ce d un aspect caracteristic de cuib, ciclul complet de la ou la ou fiind de aoroximativ 16 zile. Transmiterea se face de obicei prin contact fizic apropiat, folosirea n comun a unor articole vestimentare, sau piepteni, perii de pr; frecvent poate avea caracter endemic n comuniti de copii.Pduchii de corp se dezvolt n special n condiii de igien precar, i n general nu sunt considerai vectori pentru alte boli, spre deosebire de purecii de corp, care sunt singurul vector pentru Rickettsia prowazeki ( agentul patogen al tifosului exantematic), Borrelia recurentis ( febra recurent). Tratamentul se face cu preparate pe baz de malathion, iar cuiburile sunt distruse prin cldur la 70C, 30 minute. Sarcoptes scabiae, responsabil de scabie(rie) la om face parte din subclasa Acarieni, este rspndit pe tot globul, incidena crescnd n condiii de mizerie, igien precar, dezastre naturale, rzboi; transmiterea se face prin contact direct.Adultul este de mici dimensiuni, cu corpul de form aplatizat, prevzut cu 6 picioare.Femelele fecundate ptrund n grosimea tegumentului, prefernd plicile ( ncheieturile minilor, axil, penis, scrot sau anul submamar); depun la acest nivel 25-30 de ou, din care n 4-5 zile apar larvele, apoi se transform n nimfe i n final n aduli.Ciclul biologic dureaz aproximativ 2-3 sptmni.tratamentul se face cu preparate pe baz de benzylbenzoat sau gamma-benzen hexaclorid. Cpuele paraziteaz mai frecvent animalele, crora le sug sngele, omul este infestat doar accidental.Ele rmn ataate de corpul organismului pe care l paraziteaz un timp variabil, ntre o noapte (cpua moale) sau mai multe zile( cpuele tari,

53

ixodidele).Sunt vectori ai unor afeciuni cum sunt rickettsiozele, febr recurent, febr butonoas, babetsioze, dar i infecii virale (flavivirusuri, bunyavirusuri), cu determinri meningo-encefalice.

54

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR VIRALE IZOLAREA I CULTIVAREA VIRUSURILOR PE CULTURI CELULARE

Prin culturi celulare nelegem meninerea n via i multiplicarea in vitro a unor celule de provenien animal sau uman, din esuturi normale sau maligne, adulte sau embrionare.Deosebim: - culturi primare, care provin direct dintr-un esut; - culturi secundare, obinute din culturile primare; - linii celulare care sunt culturi de celule adaptate cultivrii i multiplicrii indefinitein vitro; Cultivarea virusurilor pe culturi celulare comport 2 etape: 1. Obinerea culturii celulare 2. Inocularea virusului i urmrirea dezvoltrii acestuia Urmrirea culturilor inoculate i a modificrilor produse de virusuri asupra acestora. - culturile se urmresc zilnic, la microscop, cu obiectiv mic.Totalitatea modificrilor morfologice care apar la nivelul pnzei celulare i afecteaz celulele unei culturi monostrat, se numete efectul citopatogen ECP al virusului respectiv, i este un semn al dezvoltrii virale.Foarte rar este patognomonic pentru un anumit virus, dar orienteaz diagnosticul spre anumite grupe virale i spre alte investigaii utile n final diagnosticului. - apariia efectului citopatogen poate nsemna dezvoltarea unui virus n cultura celular respectiv, dar poate fi i efectul toxic al produsului inoculat.Meninerea efectului i n pasajul urmtor indic cu mare probabilitate o infecie viral.Exemple de modificri cellulare produse prin ECP sunt: o Rotunjirea i mrirea celulelor, ntr-o cultur fibroblastic din plmn uman, determinat de infecia cu adenovirus. o Apariia de incluziuni celulare, poate fi foarte caracteristic, de ex. corpusculii Babe- Negri, prezeni n citoplasma unor neuroni infectai cu virusul rabiei.Incluziunile pot aprea i intranuclear ( virusul herpetic).

Izolarea virusurilor pe ou embrionate

- se utilizeaz n laboratoarele de virusologie deoarece unele virusuri se dezvolt preferenial pe ou embrionate ( de ex. virusul gripal, rickettsii i pararickettsii), iar altele produc modificri foarte caracteristice ( de ex. pox-virusurile). Cele mai importante ci de inoculare sunt: pe membrana corioalantoid, n cavitatea alantoidian, n sacul amniotic i sacul vitelin.Datorit rspndirii largi a tehnicii de cultivare a virusurilor pe culturi celulare, oule embrionate se folosesc mai rar, mai ales pentru izolarea unor mixovirusuri ( virusurile gripale) i poxvirusuri ( v. variolei). n afar de izolarea i multiplicarea virusurilor, oule embrionate se folosesc i pentru efectuarea reaciei de neutralizare pentru virusurile gripale, precum i pentru prepararea de antigene i vaccinuri. Diagnosticul se completeaz cu teste chimice care permit clasificarea virusurilor pe baza acidului nucleic pe care-l conin ( ADN sau ARN), reacii de neutralizare, toate reaciile antigen-anticorp cunoscute ( R.F.C., reacia de hemaglutino-inhibare, de hemadsorbie i inhibare a hemadsorbiei, ELISA, precipitare n gel, imunofluorescen, etc.).

55