Biol. Cel. Sistema de endomembranas. Maestra en Biologa Experimental.

Prof. Leticia Bucio Ortiz

TCNICA WESTERN BLOT INTRODUCCIN Una parte importante en la investigacin es la purificacin e identificacin de diferentes molculas biolgicas, cmo las protenas. Las cuales deben de encontrarse libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuadamente. La primera etapa es el aislamiento de las protenas, habitualmente las protenas son liberadas de las clulas. El mtodo de eleccin depende del tejido de procedencia, as como la localizacin de las protenas en la clula. Si la protena se localiza en el citosol, su liberacin slo requiere la apertura de la clula por ruptura (lisis), es el mtodo ms sencillo y suave de efectuar. Ya separada la protena de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificacin. Existen diferentes mtodos de purificacin como por ejemplo la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa sobre papel, la cromatografa de afinidad, la cromatografa de resolucin elevada (HPLC), la electroforesis, etc. El Western Blot es un mtodo para identificar protenas en una mezcla compleja de protenas, transfiriendo las protenas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unin de las protenas para su anlisis. MATERIAL Y MTODOS. Extraccin de protena
Para realizar electroforesis 1 Cmara de electroforesis: Tubos ependorf de 2 ml y 600 l Centrfuga a 13000 rpm durante 10 min a 4C 1 Fuente de poder 1 Juego de micropipetas con puntas 1 Bao Mara 95 oC. Hielo 1 Jeringa Hamilton de 50 l Cmara multipozos o gradilla para ependorff Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 l. Para realizar el Western Blot Determinacin de protenas 1 Cmara de transferencia: 2 placas de plstico. 2 Cajas de plstico para contener la membrana de transferencia 8.5 X 5.5. cm 4-5 Cajas de plstico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones. 1 Fuente de poder Para realizar 2 geles: 1 Agitador de placas. 2 Viales con agitador magntico. Regla y lpiz 1 Parrilla con agitacin. Hielo Guantes Papel filtro Watman no. 3 2 juegos de vidrios limpios. 2 peines Membrana de Nitrocelulosa 1 Juego de micropipetas con puntas Tubos para centrfuga de 50 y 10 ml, Costar

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SOLUCIONES Extraccin de Protenas BUFFER DE LISIS Para 25 ml. TRIS-HCl 50 mM 0.197 g NaCl 120 mM 0.1753 g IGEPAL 0.5 % 0.125 l y aforar Ajustar pH 8.0 y agregar NaF 100 mM 0.105 g NaVO3 200M 0.006 g Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua) Preparacin del Gel Solucin Acrilamida-Bis Solucin 1.5 M tris-HCl pH 8.8 Acrilamida 14.6 g Tris-base 18.5 g Bis-acrilamida 0.4 g Agua desionizada 100 ml Agua desionizada 50 ml Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4 C SDS al 10 % Solucin 0.5 M tris-HCl pH 6.8 SDS 10 g Tris-base 6g Agua desionizada 100 ml Agua desionizadas 100 ml almacenar a temperatura ambiente Ajustar a pH 6.8 con HCl almacenar a 4 C Persulfato de Amonio al 10% Persulfato de amonio 1g Agua dest. 10 ml
(preparar slo lo necesario o guardar por 10 das a 4C)

Preparacin de las muestras de protenas Tris-HCl pH=6.8 (0.5 M) 0.6 ml del de 1.5 M glicerol 0.8 ml SDS al 10 % 1.6 ml del de 20% Azul de bromofenol 0.05 % 0.4 ml -mercaptoetanol 0.4 ml Agua desionizada 4.2 ml Almacenar a T ambiente. 8 .0 ml Electroforesis Buffer de corrida 1X 10 X . Tris Base 3 g 30 g Glicina 1.44 g 14.4 g SDS 1 g 10 g Agua desionizada 1 L 1L Transferencia Buffer de transferencia Tris-base 03.03 g Glicina 14.4 g Metanol 200 ml SDS 0.5 g Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8.3 Buffer para muestras 4X Metanol absoluto. TBS 2.42 g de Tris-HCl (20 mM) 8 g de NaCl (137 mM) Ajustar el pH a 7.6 Aforar a 1 litro Western Blot TBS-Tween 20 0.05% 1.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.

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Albmina 0.1% 0.4 g de albmina en 40 ml de TBS-Tween 20 DISEO EXPERIMENTAL

Leche al 5 % 2 g de leche descremadaen 40 ml de TBSTween 20

I.-Condiciones de cultivo y tratamiento de las clulas.

1. Se sembrarn 2.5 x 106 clulas en cajas de Petri de 6 cm2 con medio Williams-completo,
dejndolas estabilizar por 24 horas.

2. Despus de este tiempo se lavaran las clulas con PBS. Posteriormente se cambiar el
medio por uno libre de SFB por 3-24 horas, pasado este tiempo se retirar el medio y se remplazar con medio sin SFB junto con el reactivo para el tratamiento elegido (etanol, acetaldegdo, factores de crecimiento, etc.) y tiempo de exposicin. II.- Extraccin de Protenas

1. Las clulas se lavarn con PBS y se resuspendern en 250 l de buffer de lisis con inhibidores de
proteasas y se incubarn en hielo por 15 min.

2. Despus, las clulas

se cosecharan raspndolas y haciendo un homogenado celular, el cual se

centrifugar a 13000 rpm durante 10 min a 4C.

3. Recuperar el sobrenadante y tomar una alcuota para cuantificar la concentracin de protena total por
el mtodo de Bradford. III.- Cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford o el utilizado en cada laboratorio. Se requiere conocer en qu volumen de homogenado celular se tiene 50 g de protenas. IV.- Preparacin del Gel.

a) Limpiar cuidadosamente los vidrios para hacer los geles.

b) Considerar las cantidades indicadas en la siguiente tabla para la preparacin de 2 geles.

c) En un vial colocar los reactivos para hacer el gel de corrida, agitar suavemente, tener cuidado al
poner el persulfato casi inmediatamente vaciar la solucin ya que se inicia la gelificacin en algunos minutos, dejar reposar 10-15 min para gelificacin completa.

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d) Posteriormente, preparar en otro vial la solucin para el gel concentrador (cuidado al agregar el persulfato, ya que gelificar casi inmediatamente) y colocar el peine, dejar reposar de 10-15 min.

Elaboracin del gel de corrida y gel concentrador .

Reactivos Agua desionizada ml De Corrida 10 % 4.02 2.5 0.1 3.33 10 l Persulfato de amonio l Volumen total ml 50 10 50 10 15 % 2.34 2.50 0.1 5 10 Concentrador Agua desionizada ml 3.05 1.25 50 650 10 l Persulfato de amonio Volumen total l ml 25 5

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 ml SDS 10 % Archilamida-Bis TEMED ml ml

Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 ml SDS l Archilamida-Bis l TEMED 10 %

e) Una vez que est listo el gel, se recomienda hacer una corrida previa a 200 volts. durante 30 min,
antes de agregar las muestras de protenas para correr la electroforesis. V.-Preparacin de las Protenas.

1. Colocar en cada eppendorf de 200 l (tantos segn las muestras que se tengan) 10 l de buffer de
muestra. Considerar adems la muestra del estndar de protenas que llevar 10 l.

2. Agregar el volumen de la protena equivalente a 50 g . 3. Hervir en B.M. a 95oC por 5 min. 4. Hacer lo mismo con 8-10 l del estndar de P.M. con 20 l de buffer de muestra. 5. Cargar la muestra, con jeringa de 50 l, y lavarla con agua caliente en cada toma de muestra.
VI.- Electroforesis

1. Una ves hechos los geles, quitar los peines a cada uno, con mucho cuidado para mantener los carriles
de los pozos.

2. Colocar los geles en la cmara de electroforesis y llenar con el Buffer de Corrida en el interior y exterior
de los geles.
4

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3. Cargar cada una de las muestras en los carriles del gel, para ello utilizando la jerina Hamilton, cuidar
de lavarla cada que se coloque una nueva muestra.

4.

Si quedan carriles sin muestra, agregarles slo buffer de muestra.

5. Correr la electroforesis a 200 volts durante 60 min.

VII.-Transferencia:

1. En lo que corre la electroforesis, cortar la membrana de nitrocelulosa a la medida del gel aprox. 8.5 X
5.5 cm, adems cortar 4 papeles filtro (Watman No. 3) del mismo tamao. Hacerlo utilizando guantes.

2. Terminado el tiempo de la electroforesis, despegar el gel de los cristales, cortar el gel de concentracin
y con mucho cuidado sumergirlo en el buffer de transferencia.

3. Activar la membrana de nitrocelulosa sumergindola en metanol absoluto por 30 seg.,

membrana con agua desionizada y despus colocarla en el buffer de transferencia.

lavar la

4. Colocar todos los componentes en la unidad de transferencia, de la siguiente manera:

negro/fibra/2 papel filtro/gel/membrana/2 papel filtro/ fibra/blanco Las fibras y el papel filtro se mojan en el buffer de transferencia, antes de acomodarlos. Serrar

5. Una vez cerrada la placa de plstico, colocarla en la cmara de transferencia.

6. Llenar la cmara con buffer de transferencia y el depsito blanco con agua, cuidando que no se mezclen.

7. Poner la transferencia a 110 V durante 60 min. a 4 C, para ello se coloca la cmara en una tina con
hielo) o toda la noche a 30 volts. dentro del refrigerador y con agitacin constante del buffer de transferencia.

8. Una vez terminada la transferencia, sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla
con 15-20 ml de leche al 5% . 9. Lavar la membrana con solucin de TBS-Twen 20 y se puede dejar la membrana en esta solucin hasta el da siguiente para continuar. VIII.- Bloqueo, lavados y colocacin de los anticuerpos:

1. Terminada la transferencia, sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla con 1520 ml de leche al 5% en TBS-Tween 20, durante 15-60 min. en agitacin constnte.

2. Pasado este tiempo lavar con TBS-Tween 20 la membrana, 2 3 veces para eliminar el exceso de
leche, manejando la membrana con pinzas.

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3. Poner el anticuerpo primario policlonal o monoclonal de la protena que se desea visualizar,

generalmente diluda (1:200 o 1:500 o 1:1000) segn se indique, en 12 ml de la solucin de albmina en TBS-Tween 20 (para dos membranas), durante1 h o toda la noche en agitacin.

4. Lavar: 2 veces con TBS-Tween 20, por 15 min. 5. Poner 3 l del anticuerpo secundario, en 30 ml de la solucin de albmina en TBS-Tween 20 por 1 h.
6. Lavar 2 veces 10 min con TBS-Tween 20 y 1 vez por 5 min con TBS-solo.

7. Poner a la membrana 2 ml de sustrato luminiscente (Kit SuperSignal West Pico Substrate).

IX.- Revelado

1 Realizarlo en cuarto obscuro. Colocar la membrana en la placa reveladora cubierta con plstico y
exponerla a una pelcula Kodak por 30 seg.

2 Revelar y fijar la pelcula, Dependiendo de la intensidad de las bandas, exponer ms o menos tiempo. 3 Cuantificar por anlisis densitomtrico.
Nota: Para normalizar la cantidad de protena de las bandas, se estripea la membrana (se lava de las protenas adheridas) y se repiten los puntos del 3 al 7 del paso VIII, pero utilizando como anticuerpo primario a la Actina y como anticuerpo secundario

Solucin de estripeado Tris-Base 50 mM pH=2.0 X.- Estripeado. Lavar la membrana con Tris-Base pH= 2.0, por 2 h, cambiando la solucin cada 30 min. Nota: considerar siempre en que est hecho el anticuerpo primario para usar correctamente el anticuerpo secundario. Anticuerpo Primario policlonal de conejo, Sta. Cruz. Actina goat polyclonal Anticuerpo Secundario Goat anti-rabbit, Sta. Cruz Mouse anti-goat 6.057 g en 1 L de agua desionizada.

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